JP3614016B2 - 凍結細胞から有用細胞を回収する方法およびそのための器具 - Google Patents
凍結細胞から有用細胞を回収する方法およびそのための器具 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、凍結した細胞から有用細胞（赤血球、白血球、造血幹細胞または造血前駆細胞、卵母細胞、精子またはランゲルハンス細胞など）を回収する方法およびそのための器具に関する。さらに詳細には、解凍後の細胞をその活性を減少させることなく、該細胞から凍害保護剤等の有害物質を除去し、かつ、該細胞を含む溶液を輸液注入、細胞修飾（遺伝子導入など）、または培養などに適した浸透圧を有する溶液に調整する方法およびそのための器具に関する。
【０００２】
【従来の技術】
赤血球、白血球、造血幹細胞または造血前駆細胞、卵母細胞、精子またはランゲルハンス細胞などの有用細胞は、ヒトから採取された血液、子宮、精液、膵臓などから回収され、輸液注入、遺伝子導入、移植または培養などに利用される。このような有用細胞は、通常、血液、精液、膵臓などから回収された細胞を凍結した後、解凍し、再度、精製・回収される。
凍結した細胞は、一般的に３７〜４０℃の温浴槽で急速に解凍される。しかし、該細胞の解凍後から移植などに至る操作には様々な方法が行われており、（１）凍結細胞の洗浄を行わずに解凍後、直接、該解凍細胞を使用する方法と、（２）解凍細胞から凍害保護剤を除去し、更に浸透圧による細胞障害（ｄｉｌｕｔｉｏｎｓｈｏｃｋ）を緩和するために、該解凍細胞の洗浄を行ってから、該解凍細胞を使用する方法とに分けることができる。
【０００３】
上記（２）において、解凍細胞を洗浄後、再懸濁する方法には様々な方式が開発されており、その目的は凍害保護剤であるジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）、赤血球の溶血によるヘモグロビン、破壊された白血球などを解凍細胞の浮遊液から除き、解凍後の有用細胞の有害物質に対する感受性を低下させることにある。
一般に、浸透圧による細胞障害とは、細胞膜を介した細胞内と細胞外に浸透圧差を生じたとき発生するものである。その原理とは、発生した浸透圧差により、その浸透圧差を減少させるために、細胞内外の水を含めた物質が移動する。ところが、細胞膜は物質によって透過速度が異なり、凍害保護剤は水と比較すると低速度で移動するため、急激な浸透圧差により、水のみ細胞膜移動が起こり、細胞内体積が膨張する。この膨張により細胞膜が破壊され、細胞は障害を受けるのである。
【０００４】
該細胞障害は、細胞膜の透過性がＤＭＳＯより遅いグリセロールを凍害保護剤として用いた場合に顕著になる。また、ＤＭＳＯにおいても、有用細胞、造血幹細胞の回収率をよくするには、緩徐な希釈でもって、ＤＭＳＯを除くことがよいとされている。このため、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）液を、徐々に解凍細胞に添加し、最終１０倍まで希釈を行う方法（Ｒｅｖ．Ｅｕｒｏｐ． Ｅｔｕｄｅｓ． Ｃｌｉｎ． Ｅｔ Ｂｉｏｌ． １７ ： ４８３−４８８， １９７２）、または緩徐に、５倍希釈を行う方法（Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ１６ ： ２０１−２１０， １９７９）、段階的に１０倍希釈を行う方法（Ｃａｎｃｅｒ ４５： ３０７５−３０８５， １９８０）などが行われている。
【０００５】
このように凍結細胞の解凍後の調製法は、まず、最初に影響のない濃度まで、緩徐に凍害保護剤を希釈することから行われてきた。しかし、この方法では副作用物質である凍害保護剤の全体量は変わらず、また仮に濃度を薄くすることで、有用細胞への影響が全く無くなるとしても、全体容量が増加するため、非常に取り扱いに不便であった。
そこで、凍害保護剤の全体量を減少させる方法として、希釈が行われた後に、有用細胞をペレット化するために遠心分離を行い、上澄み液を除去し、そして有用細胞の再懸濁からなる１回以上のサイクルが行われる。
【０００６】
このような希釈遠心調製法として、例えば、室温で培地ＴＣ−１９９を等量、解凍細胞に添加、混合し、遠心分離した後、上清を除去し（臨床外科３９（４） ： ５０３−５１５， １９８４）、更に、これらの希釈液に有用細胞の膜保護の目的で、ヒト血清を加え、具体的には解凍した骨髄細胞に５％ＡＢ型血清を含むヘパリンを加えたＴＣ−１９９の培養液を等量、できるだけ、ゆっくり、よく攪拌しながら添加して、凍害保護剤を希釈し、遠心分離して洗浄した後、適当量のＴＣ−１９９培養液に、有用細胞を再浮遊する方法が実施されている（低温医学９（１） ： ３０−３８， １９８３）。このような方法は高価な遠心分離機を要することから、操作が複雑である。
【０００７】
また、２０％ＦＣＳ（牛胎児血清）／ＲＰＭＩを解凍細胞に緩徐に添加し、２回遠心分離して洗浄する法が実施されている（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ． ４（１） ： ２９−３６， １９９５）。そして、等量のデキストラン４０／アルブミン液を１０分間以上、解凍細胞に緩徐に添加し、さらに遠心分離（２５０Ｇ、１０分間、１０℃）した後、上清を除去し、デキストラン４０／アルブミン液で再懸濁する方法が実施されている（Ｂｌｏｏｄ８８（３） ： ７９５−８０２， １９９６）。このような方法も高価な遠心分離機を要することから、操作が複雑である。
【０００８】
更には、凍結保存された臍帯血の造血幹／前駆細胞の融解法として、下記方法が公知である（米国特許第５，００５，６８１号明細書、特公平８−６９号公報）。
液体窒素中から凍結細胞を収容した容器を取り出し、３７℃温浴中で少量の氷片が残るまで、該容器中の凍結細胞を融解して、細胞懸濁液を得る。無菌状態で、細胞懸濁溶液の容量が約２倍になるまで、冷却混合物、例えば５０％自己由来血清／ＲＰＭＩ−１６４０あるいは５０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地を、滴下毎に少し攪拌しながら、滴下する。この細胞懸濁物を遠心分離用チューブに移し、冷却混合物、例えば５０％血清／ＲＰＭＩ−１６４０を滴下毎に攪拌しながら加え、その容量を約６倍にする。
さらに、５０％血清／ＲＰＭＩ希釈液を増加分ごとに混合しながら滴下し、その容量を約１．５倍にする。次いで遠心処理によって、該細胞をペレット化し、上澄み液を吸引する。このペレットに対して、冷却混合物、例えば２０％自己由来血清／ＲＰＭＩ−１６４０をゆっくりと滴下し、再懸濁する。さらに、冷却混合物、例えば２０％自己由来血清／ＲＰＭＩを滴下毎に攪拌しながら加える。それから、遠心処理によって細胞をペレット化し、上澄み液を吸引する。冷却混合物、例えば２０％血清／ＲＰＭＩを用いて、再懸濁させる。このような方法は開封系であり、やはり高価な遠心分離機を必要とする。
【０００９】
また、臍帯血移植において良好な成績を挙げているＤｕｋｅ大学のＫｕｒｔｚｂｅｒｇら（Ｎ． Ｅｎｇｌ．Ｊ． Ｍｅｄ． ３３５（３） ： １５７−１６６， １９９６）は、ニューヨーク血液センターのＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎらが示した、５％デキストラン４０／２．５％ ヒトアルブミン液で、凍結臍帯血を洗浄する法を実施している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ ： １０１１９−１０１２２， １９９５）。しかし、このような方法も高価な遠心分離機を必要とする。
【００１０】
更に、凍結白血球系幹細胞の調製に使用する器具として、無菌バッグ、凍結バッグから無菌バッグへ凍結白血球幹細胞を移送する手段、および調製した幹細胞を患者へ輸液する手段から構成される器具が公知である（ＷＯ９８／３８９４０）。この器具は、解凍後の白血球系幹細胞の活性を高く維持したまま、次工程である輸液の際に、副作用物質と考えられる凍害保護剤が減少され、輸液に適した浸透圧に調製される。ところが、該器具の操作が非常に複雑であり、誤操作の可能性がある。また、操作に約３０分以上の時間を要することから、輸液後に、白血球の凝集塊が発生し、輸液された患者には悪寒、発熱、高血圧、徐脈、呼吸困難、胸骨圧迫感などの副作用を引き起こすとされている。また、遠心分離機などの高価な装置を常備している限られた施設でのみしか使用できないなどの問題点が挙げられる。更に、凍結用容器（凍結バッグ）内に容器形状および表面張力のため残留する細胞懸濁液を、それとは大きく異なる浸透圧である生理食塩水を添加して回収することから、細胞障害（ｄｉｌｕｔｉｏｎｓｈｏｃｋ）によるダメージを受けるものであった。また、遠心分離機を用いずにフィルターを使用する場合においても、フィルターに捕捉された白血球系幹細胞を回収するために、分離された凍害保護剤が混合した溶液を使用しなければならなく、副作用物質の除去能が低下したものとなった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、解凍後の凍結細胞の活性を高く維持したまま、次工程（輸注、細胞修飾、培養など）で影響のある副作用物質（凍害保護剤など）を有用細胞から効果的に除去し、かつ、次工程に適した浸透圧へ有用細胞内の浸透圧を調整することを、高価な装置（遠心分離機等）を必要とせず、かつ無菌的に短時間で容易に実施できることを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは種々鋭意検討の結果、解凍後の細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入した後、該フィルターに捕捉された有用細胞に浸透圧調整液を注入して、該有用細胞の浸透圧を調整して、課題を解決することを見出し、本発明に到達した。
【００１３】
すなわち、本発明は（１）容器に収容した凍結細胞を解凍し、（２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入し、（３）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整し、さらに、（４）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収することを特徴とする凍結細胞から有用細胞を回収する方法である。
【００１４】
また、本発明は（１）容器に収容した凍結細胞を解凍し、（２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入し、（３）解凍細胞を含む溶液を排出した容器にリンス用溶液を注入して、該容器の残留細胞を洗い流し、有用細胞回収フィルターへ移送し、次いで、（４）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整し、さらに、（５）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収することを特徴とする凍結細胞から有用細胞を回収する方法である。
【００１５】
さらに、本発明は下記構成を有する凍結細胞から有用細胞を回収する器具。
（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルター、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器、（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器、（Ｄ）フィルターを通過した液を回収する容器お解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器である。
【００１６】
【発明の実施の態様】
本発明において、凍結細胞を収容した容器としては、凍結バッグ、血液バッグなどが例示される。
また、凍結細胞としては、ヒトから採取された血液、体液、組織などから直接的または間接的に採取された細胞を凍結したものである。凍結条件は特に問わない。
該凍結細胞は、凍害保護剤を含む細胞である。凍害保護剤としては、ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはアルブミンであり、その使用濃度は、凍結細胞に対して、適宜選択される。
凍結細胞から回収される有用細胞としては、赤血球、白血球、造血幹細胞または造血前駆細胞、卵母細胞、精子またはランゲルハンス細胞などがある。これらの有用細胞は、次の工程において、ヒトへの輸液注入、遺伝子導入、移植または栄養培地にての培養に使用される。
【００１７】
有用細胞回収フィルターとしては、繊維性集合体または多孔性物質などが例示される。繊維性集合体としては、天然繊維または合成繊維から作製された不織布、織布、粉状体またはこれらの積層体などがあり、繊維直径は例えば、１．０〜２５．０μｍ、嵩密度は０．０５〜０．５０ｇ／ｃｍ３である。多孔性物質としては、天然物質または合成物質から製造された微粒子、膜状体、フィルム、シートまたはこれらの積層体などが例示される。多孔性物質の空孔率は、３０〜９５％である。これらのフィルターは種々の嵩密度または空孔率はその変更が可能である。
【００１８】
浸透圧調整液とは、捕捉された解凍細胞の浸透圧を目標の浸透圧に調整する溶液であり、具体的には、５％デキストラン４０、２．５％アルブミンおよび生理食塩水を含む。
該調整液は、解凍細胞に含まれる凍害保護剤より低濃度の凍害保護剤を含む溶液であることが好ましい。浸透圧調整液は、凍結容器内の残液を回収するためのリンス用溶液およびエアを含み、フィルターに捕捉された細胞の浸透圧を調整するための溶液であってもよい。
リンス用溶液は、毒性のない無菌のエアを含む溶液であることが好ましい。リンス用溶液は、解凍した細胞を含む溶液に含まれる凍害保護剤と実質的に同一濃度である凍害保護剤を含む溶液であることが好ましい。エアは、具体的には凍結バッグ容積と同一容積のものであり、大気中の空気組成のものである。
【００１９】
有用細胞回収液としては、デキストラン、ヒドロキシエチルまたはアルブミンなどを含む溶液がある。
【００２０】
本発明は、下記工程を有する。
（１）容器に収容した凍結細胞を解凍する。例えば、凍結バッグに収容された１０％ＤＭＳＯで凍害保護された凍結臍帯血を３７℃で急速解凍する。
（２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入する。具体的には、凍結バッグに当該器具の接続手段を用いて接続し、重力差で有用細胞回収フィルターに注入する。
（３）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整する。具体的にはフィルターに例えば、５％デキストラン４０／２５％アルブミン／生理食塩水を添加する。
（４）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収する。例えば、５％デキストラン溶液にて、逆洗浄、もしくはフィルター嵩密度を変更することにより回収する。
【００２１】
本発明は、また下記工程を有する。
（１）容器に収容した凍結細胞を解凍する。
（２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入する。
（３）解凍細胞を含む溶液を排出した容器にリンス用溶液を注入して、該容器の残留細胞を洗い流し、有用細胞回収フィルターへ移送する。例えば、１０％ＤＭＳＯ／生理食塩水を注入し、残留細胞を洗い出す。
（４）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整する。
（５）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収することを特徴とする凍結細胞から有用細胞を回収する。
【００２２】
有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整する工程において、浸透圧調整液が、凍害保護されていた有用細胞の浸透圧を最終目標とする有用細胞の浸透圧へ段階的に変化させることが好ましい。
このような浸透圧を段階的に変化させるには、例えば、１０％ＤＭＳＯで凍害保護されている場合、まず、第一に５％ＤＭＳＯをフィルターに注入し、次いで、ＤＭＳＯを含まない溶液（０％ＤＭＳＯ溶液）を注入すると可能である。あるいはフィルターに対して、上流位置に０％ＤＭＳＯ溶液を入れた容器、下流位置に１０％ＤＭＳＯ溶液を含む硬質容器を直列に配置する。そして、０％ＤＭＳＯ溶液を下流位置の１０％ＤＭＳＯ溶液容器から注入すると、０％ＤＭＳＯが注入された等量が、１０％ＤＭＳＯ溶液容器からフィルターに流入する。１０％ＤＭＳＯ溶液容器内は、次第にＤＭＳＯ濃度が低下していき、徐々に低濃度のＤＭＳＯ溶液がフィルターへ流入することにより、段階的に浸透圧を変化させることが可能である。または０％ＤＭＳＯ溶液を含む溶液と１０％ＤＭＳＯ溶液を含む容器を並列に配置することも可能である。１０％ＤＭＳＯ溶液容器を上部に０％ＤＭＳＯ溶液容器を下部に配置し、ともに開栓することで自重差により、徐々にＤＭＳＯ濃度が低濃度のものがフィルターへ供給され、段階的に浸透圧を変化させることが可能である。
【００２３】
本発明の凍結細胞から有用細胞を回収する器具は、下記構成を有する。
（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルター、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器、（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器、（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器。
【００２４】
（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターは、凍結細胞を収容した容器に接続する。また、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターは、フィルター密度が変更可能であることが好ましい。フィルター密度を変更可能な状態とするには、フィルターの嵩密度を変化させるか、フィルターの空孔率を変化させる方法などがある。
【００２５】
本発明の器具の一例は、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターの一方の端片に、凍結細胞を収容した容器、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器および（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器が連結し、他方の端片に、（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器が連結する。
また、本発明の別な例は、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターの一方の端片に、凍結細胞を収容した容器、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器および（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器が連結し、他方の端片に、（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器および（Ｃ）有用成分回収液を収容した容器が連結する。
【００２６】
本発明の器具は、さらに、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器を結合する手段、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器を連結する手段、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器を連結する手段および（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器を連結する手段を含む。
【００２７】
本発明では、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器と（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器が、同一容器であることが好ましい。
【００２８】
本発明では、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器が、異なる浸透圧を保持する調整液を含む複数の容器であってもよい。
浸透圧調整液は凍結容器内の残液を回収するためのリンス用溶液およびエアを含み、フィルターに捕捉された細胞の浸透圧を調整するための溶液であってもよい。
【００２９】
本発明の器具は、解凍された凍結細胞から凍害保護剤などの副作用物質を除去し、かつ細胞内の浸透圧調製を行う器具であって、その一例は、
▲１▼凍結用容器（凍結バッグ）から、無菌的に凍結細胞を取り出すために、凍結用容器（凍結バッグ）に接続するためのコネクター（連結手段）
▲２▼ 凍害保護剤等の副作用物質を通過させ、かつ目的の細胞を補足するフィルター（有用細胞回収フィルター、Ａ）
▲３▼ 上記フィルターで補足されない溶液を収納するための容器（フィルターを通過した回収液を収容する容器、Ｄ）
▲４▼ 凍結容器（凍結バッグ）内の残液を回収するためのリンス溶液およびエアを含む容器
▲５▼ フィルターに補足された細胞の浸透圧を調整するための調整液を含む容器（浸透圧調整液を収容した容器、Ｂ）
▲６▼ フィルターに補足された細胞をフィルターから脱離させるための溶液を含む容器（有用細胞回収液を収容した容器、Ｃ）
▲７▼ フィルターから脱離した細胞を含む溶液を収納し、外部（輸液セット、輸血セット、培養バッグなど）に接続するための接続部を有する容器（Ｅ）、該容器はフィルターを通過した浸透圧調整液を回収する容器（Ｂ）を兼用してもよい。
▲８▼ 各容器、フィルターを無菌的に接続するチューブ（連結手段）
▲９▼ 選択的に溶液を各容器、フィルター間へ移送するための手段（移送手段）
からなる。
【００３０】
本発明の器具の一例を、図１により詳細に説明する。図１中、１は接続コネクター、２はフィルター、３は廃液回収容器、４はリンス溶液およびエア収容容器、５は浸透圧調整液用容器、６は回収溶液収容容器、７はフィルターから解離した細胞を回収する溶液を回収する回収容器、８は凍結容器（凍結バッグ）を示す。
【００３１】
解凍された凍結細胞を収容した凍結バッグ８に、接続コネクター１を接続して、該解凍細胞を含む懸濁液をフィルター２へ通過させる。解凍細胞はフィルター２に捕捉され、凍害保護剤を含む溶液は廃液回収容器３に流れ込む。次に、凍結容器（凍結バッグ）内に残存している細胞懸濁液をフィルター２へ通過させるために、リンス溶液およびエア収容容器４からエアを凍結容器（凍結バッグ）内に注入することにより、凍結容器（凍結バッグ）内の細胞懸濁液の大部分は、フィルター２へ流出する。凍結容器の形状や表面張力により残存している解凍細胞を回収するために、必要により、凍害保護時と同等の組成を有するリンス溶液を、リンス溶液およびエア収容容器４から凍結容器（凍結バッグ）に添加し、凍結容器（凍結バッグ）内の細胞懸濁液をフィルター２へ流入させる。フィルター２に捕捉されないリンス溶液は廃液回収容器３に流れ込む。フィルター２に捕捉された細胞は、細胞内の浸透圧が依然、凍害保護時と同等であるため、細胞障害を起因させないように、浸透圧調整液を含む浸透圧調整液用容器５よりフィルター２へ段階的に、浸透圧を目標値に近くする調整液を流入させる。フィルター２内での該調整液と細胞との接触の間に、細胞は目標とする浸透圧へ細胞障害を起こすことなく調整される。そして、浸透圧が調整された細胞をフィルター２から有用細胞を解離して、回収するために、回収用溶液を含む回収溶液収容容器６からフィルター２に対して回収用溶液を流入する。フィルターから解離した細胞を回収する溶液を回収する回収容器７へ該回収液を回収する。該回収液から常法に従い、有用細胞を単離する。単離、回収された細胞は、輸液注入、遺伝子導入、移植ななどに使用される。
【００３２】
【実施例】
実施例を用いて、本発明を詳細に説明する。
実施例１
ヒト臍帯から採取した臍帯血２０ｍｌに凍害保護剤、５０％ＤＭＳＯ５ｍｌを添加して、凍結バッグ中に注入し、暖速凍結し、液体窒素中で、１ケ月間凍結した。該凍結バッグを３７℃温水浴中に、２分間保持して解凍した。次いで、図１に示される器具の有用成分回収フィルターの一方の端片に該凍結バッグを連結した。該端片には、浸透圧調整液を収容した容器および有用細胞回収液を収容した容器が連結され、他方の端片に、フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液を収容する廃液容器、フィルターを通過した浸透圧調整液を回収する容器およびフィルターを通過した回収液を収容する容器が連結されている。
【００３３】
該凍結バッグから解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入した。該フィルターは繊維直径３．５μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度０．１１ｇ／ｃｍ３である不織布６枚および繊維直径１．５μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度０．１５ｇ／ｃｍ３である不織布１４枚からなる積層体である。解凍した細胞を含む溶液は、嵩密度０．１５ｇ／ｃｍ３の不織布側から注入され、嵩密度０．１１ｇ／ｃｍ３の不織布側から流出した。次いで、該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液２００ｍｌを注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整した。浸透圧調整液は５％デキストラン４０、２．５％アルブミンおよび生理食塩水を含む。凍結時の１０％ＤＭＳＯの浸透圧は約２８００ｍＯｓＭ／ｋｇ・Ｈ２Ｏであり、該調整液にて浸透圧を約３００ｍＯｓＭ／ｋｇ・Ｈ２Ｏに調整した。
【００３４】
次いで、該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された白血球を回収した。有用細胞回収液は５％デキストラン４０を含む。回収液から造血前駆細胞を単離するには、嵩密度を半分にした。得られた造血前駆細胞の回収率は、メチルセルロースによるコロニー形成細胞の計測により、８０％であった。操作時間は１２分間であった。
【００３５】
実施例２
ヒト臍帯から採取した臍帯血２０ｍｌに凍害保護剤、５０％ＤＭＳＯ５ｍｌを添加して、凍結バッグ中に注入し、暖速凍結し、液体窒素中で、１ケ月間凍結した。該凍結バッグを３７℃浴中に、２分間保持して解凍した。次いで、図１に示される器具の有用細胞回収フィルターの一方の端片に該凍結バッグを連結した。該端片には、浸透圧調整液を収容した容器および有用細胞回収液を収容した容器が連結され、他方の端片に、フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液を収容する廃液容器、フィルターを通過した浸透圧調整液を回収する容器およびフィルターを通過した回収液を収容する容器が連結されている。
【００３６】
該凍結バッグから解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入した。該フィルターは繊維直径３．５μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度０．１１ｇ／ｃｍ３である不織布６枚および繊維直径１．５μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度０．１５ｇ／ｃｍ３である不織布１４枚からなる積層体である。解凍した細胞を含む溶液は、嵩密度０．１５ｇ／ｃｍ３の不織布側から注入され、嵩密度０．１１ｇ／ｃｍ３の不織布側から流出した。次いで、解凍細胞を含む溶液を排出した凍結バッグにリンス用溶液を注入して、該バッグの残留細胞を洗い流し、有用細胞回収フィルターへ移送した。該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液２００ｍｌを注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整した。凍結時の浸透圧は約２８００ｍＯｓＭ／ｋｇ・Ｈ２Ｏであり、該調整液にて調製ｓたい浸透圧は約３００ｍＯｓＭ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ であった。さらに、該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された造血前駆細胞を回収した。リンス用溶液は１０％ＤＭＳＯ／２．５％デキストラン４０／生理食塩水を含む。有用細胞回収液は５％デキストラン４０を含む。
得られた有用細胞回収液から造血前駆細胞を常法に従い、単離した。得られた造血前駆細胞の回収率は８５％であった。操作時間は１５分間であった。
【００３７】
比較例１
実施例１において、有用細胞回収フィルターに浸透圧調整液２００ｍｌを注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整する操作を実施することなく、実施例１と同様にして、臍帯血から造血前駆細胞を単離した。単離された造血前駆細胞の回収率は４０％であった。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、解凍後の凍結細胞の活性を高く維持したまま、次工程（輸注、細胞修飾、培養など）で影響のある副作用物質（凍害保護剤など）を効果的に除去し、かつ、次工程に適した浸透圧へ調製することを、高価な装置（遠心分離機等）を必要とせず、かつ無菌的に短時間で容易に実施できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の器具の一例を示す図である。
【符号の説明】
１ 接続コネクター
２ フィルター
３ 廃液回収容器
４ リンス溶液およびエア収容容器
５ 浸透圧調整液用容器
６ 回収溶液収容容器
７ 回収容器
８ 凍結バッグ
【発明の属する技術分野】
本発明は、凍結した細胞から有用細胞（赤血球、白血球、造血幹細胞または造血前駆細胞、卵母細胞、精子またはランゲルハンス細胞など）を回収する方法およびそのための器具に関する。さらに詳細には、解凍後の細胞をその活性を減少させることなく、該細胞から凍害保護剤等の有害物質を除去し、かつ、該細胞を含む溶液を輸液注入、細胞修飾（遺伝子導入など）、または培養などに適した浸透圧を有する溶液に調整する方法およびそのための器具に関する。
【０００２】
【従来の技術】
赤血球、白血球、造血幹細胞または造血前駆細胞、卵母細胞、精子またはランゲルハンス細胞などの有用細胞は、ヒトから採取された血液、子宮、精液、膵臓などから回収され、輸液注入、遺伝子導入、移植または培養などに利用される。このような有用細胞は、通常、血液、精液、膵臓などから回収された細胞を凍結した後、解凍し、再度、精製・回収される。
凍結した細胞は、一般的に３７〜４０℃の温浴槽で急速に解凍される。しかし、該細胞の解凍後から移植などに至る操作には様々な方法が行われており、（１）凍結細胞の洗浄を行わずに解凍後、直接、該解凍細胞を使用する方法と、（２）解凍細胞から凍害保護剤を除去し、更に浸透圧による細胞障害（ｄｉｌｕｔｉｏｎｓｈｏｃｋ）を緩和するために、該解凍細胞の洗浄を行ってから、該解凍細胞を使用する方法とに分けることができる。
【０００３】
上記（２）において、解凍細胞を洗浄後、再懸濁する方法には様々な方式が開発されており、その目的は凍害保護剤であるジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）、赤血球の溶血によるヘモグロビン、破壊された白血球などを解凍細胞の浮遊液から除き、解凍後の有用細胞の有害物質に対する感受性を低下させることにある。
一般に、浸透圧による細胞障害とは、細胞膜を介した細胞内と細胞外に浸透圧差を生じたとき発生するものである。その原理とは、発生した浸透圧差により、その浸透圧差を減少させるために、細胞内外の水を含めた物質が移動する。ところが、細胞膜は物質によって透過速度が異なり、凍害保護剤は水と比較すると低速度で移動するため、急激な浸透圧差により、水のみ細胞膜移動が起こり、細胞内体積が膨張する。この膨張により細胞膜が破壊され、細胞は障害を受けるのである。
【０００４】
該細胞障害は、細胞膜の透過性がＤＭＳＯより遅いグリセロールを凍害保護剤として用いた場合に顕著になる。また、ＤＭＳＯにおいても、有用細胞、造血幹細胞の回収率をよくするには、緩徐な希釈でもって、ＤＭＳＯを除くことがよいとされている。このため、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）液を、徐々に解凍細胞に添加し、最終１０倍まで希釈を行う方法（Ｒｅｖ．Ｅｕｒｏｐ． Ｅｔｕｄｅｓ． Ｃｌｉｎ． Ｅｔ Ｂｉｏｌ． １７ ： ４８３−４８８， １９７２）、または緩徐に、５倍希釈を行う方法（Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ１６ ： ２０１−２１０， １９７９）、段階的に１０倍希釈を行う方法（Ｃａｎｃｅｒ ４５： ３０７５−３０８５， １９８０）などが行われている。
【０００５】
このように凍結細胞の解凍後の調製法は、まず、最初に影響のない濃度まで、緩徐に凍害保護剤を希釈することから行われてきた。しかし、この方法では副作用物質である凍害保護剤の全体量は変わらず、また仮に濃度を薄くすることで、有用細胞への影響が全く無くなるとしても、全体容量が増加するため、非常に取り扱いに不便であった。
そこで、凍害保護剤の全体量を減少させる方法として、希釈が行われた後に、有用細胞をペレット化するために遠心分離を行い、上澄み液を除去し、そして有用細胞の再懸濁からなる１回以上のサイクルが行われる。
【０００６】
このような希釈遠心調製法として、例えば、室温で培地ＴＣ−１９９を等量、解凍細胞に添加、混合し、遠心分離した後、上清を除去し（臨床外科３９（４） ： ５０３−５１５， １９８４）、更に、これらの希釈液に有用細胞の膜保護の目的で、ヒト血清を加え、具体的には解凍した骨髄細胞に５％ＡＢ型血清を含むヘパリンを加えたＴＣ−１９９の培養液を等量、できるだけ、ゆっくり、よく攪拌しながら添加して、凍害保護剤を希釈し、遠心分離して洗浄した後、適当量のＴＣ−１９９培養液に、有用細胞を再浮遊する方法が実施されている（低温医学９（１） ： ３０−３８， １９８３）。このような方法は高価な遠心分離機を要することから、操作が複雑である。
【０００７】
また、２０％ＦＣＳ（牛胎児血清）／ＲＰＭＩを解凍細胞に緩徐に添加し、２回遠心分離して洗浄する法が実施されている（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ． ４（１） ： ２９−３６， １９９５）。そして、等量のデキストラン４０／アルブミン液を１０分間以上、解凍細胞に緩徐に添加し、さらに遠心分離（２５０Ｇ、１０分間、１０℃）した後、上清を除去し、デキストラン４０／アルブミン液で再懸濁する方法が実施されている（Ｂｌｏｏｄ８８（３） ： ７９５−８０２， １９９６）。このような方法も高価な遠心分離機を要することから、操作が複雑である。
【０００８】
更には、凍結保存された臍帯血の造血幹／前駆細胞の融解法として、下記方法が公知である（米国特許第５，００５，６８１号明細書、特公平８−６９号公報）。
液体窒素中から凍結細胞を収容した容器を取り出し、３７℃温浴中で少量の氷片が残るまで、該容器中の凍結細胞を融解して、細胞懸濁液を得る。無菌状態で、細胞懸濁溶液の容量が約２倍になるまで、冷却混合物、例えば５０％自己由来血清／ＲＰＭＩ−１６４０あるいは５０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地を、滴下毎に少し攪拌しながら、滴下する。この細胞懸濁物を遠心分離用チューブに移し、冷却混合物、例えば５０％血清／ＲＰＭＩ−１６４０を滴下毎に攪拌しながら加え、その容量を約６倍にする。
さらに、５０％血清／ＲＰＭＩ希釈液を増加分ごとに混合しながら滴下し、その容量を約１．５倍にする。次いで遠心処理によって、該細胞をペレット化し、上澄み液を吸引する。このペレットに対して、冷却混合物、例えば２０％自己由来血清／ＲＰＭＩ−１６４０をゆっくりと滴下し、再懸濁する。さらに、冷却混合物、例えば２０％自己由来血清／ＲＰＭＩを滴下毎に攪拌しながら加える。それから、遠心処理によって細胞をペレット化し、上澄み液を吸引する。冷却混合物、例えば２０％血清／ＲＰＭＩを用いて、再懸濁させる。このような方法は開封系であり、やはり高価な遠心分離機を必要とする。
【０００９】
また、臍帯血移植において良好な成績を挙げているＤｕｋｅ大学のＫｕｒｔｚｂｅｒｇら（Ｎ． Ｅｎｇｌ．Ｊ． Ｍｅｄ． ３３５（３） ： １５７−１６６， １９９６）は、ニューヨーク血液センターのＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎらが示した、５％デキストラン４０／２．５％ ヒトアルブミン液で、凍結臍帯血を洗浄する法を実施している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ ： １０１１９−１０１２２， １９９５）。しかし、このような方法も高価な遠心分離機を必要とする。
【００１０】
更に、凍結白血球系幹細胞の調製に使用する器具として、無菌バッグ、凍結バッグから無菌バッグへ凍結白血球幹細胞を移送する手段、および調製した幹細胞を患者へ輸液する手段から構成される器具が公知である（ＷＯ９８／３８９４０）。この器具は、解凍後の白血球系幹細胞の活性を高く維持したまま、次工程である輸液の際に、副作用物質と考えられる凍害保護剤が減少され、輸液に適した浸透圧に調製される。ところが、該器具の操作が非常に複雑であり、誤操作の可能性がある。また、操作に約３０分以上の時間を要することから、輸液後に、白血球の凝集塊が発生し、輸液された患者には悪寒、発熱、高血圧、徐脈、呼吸困難、胸骨圧迫感などの副作用を引き起こすとされている。また、遠心分離機などの高価な装置を常備している限られた施設でのみしか使用できないなどの問題点が挙げられる。更に、凍結用容器（凍結バッグ）内に容器形状および表面張力のため残留する細胞懸濁液を、それとは大きく異なる浸透圧である生理食塩水を添加して回収することから、細胞障害（ｄｉｌｕｔｉｏｎｓｈｏｃｋ）によるダメージを受けるものであった。また、遠心分離機を用いずにフィルターを使用する場合においても、フィルターに捕捉された白血球系幹細胞を回収するために、分離された凍害保護剤が混合した溶液を使用しなければならなく、副作用物質の除去能が低下したものとなった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、解凍後の凍結細胞の活性を高く維持したまま、次工程（輸注、細胞修飾、培養など）で影響のある副作用物質（凍害保護剤など）を有用細胞から効果的に除去し、かつ、次工程に適した浸透圧へ有用細胞内の浸透圧を調整することを、高価な装置（遠心分離機等）を必要とせず、かつ無菌的に短時間で容易に実施できることを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは種々鋭意検討の結果、解凍後の細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入した後、該フィルターに捕捉された有用細胞に浸透圧調整液を注入して、該有用細胞の浸透圧を調整して、課題を解決することを見出し、本発明に到達した。
【００１３】
すなわち、本発明は（１）容器に収容した凍結細胞を解凍し、（２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入し、（３）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整し、さらに、（４）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収することを特徴とする凍結細胞から有用細胞を回収する方法である。
【００１４】
また、本発明は（１）容器に収容した凍結細胞を解凍し、（２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入し、（３）解凍細胞を含む溶液を排出した容器にリンス用溶液を注入して、該容器の残留細胞を洗い流し、有用細胞回収フィルターへ移送し、次いで、（４）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整し、さらに、（５）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収することを特徴とする凍結細胞から有用細胞を回収する方法である。
【００１５】
さらに、本発明は下記構成を有する凍結細胞から有用細胞を回収する器具。
（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルター、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器、（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器、（Ｄ）フィルターを通過した液を回収する容器お解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器である。
【００１６】
【発明の実施の態様】
本発明において、凍結細胞を収容した容器としては、凍結バッグ、血液バッグなどが例示される。
また、凍結細胞としては、ヒトから採取された血液、体液、組織などから直接的または間接的に採取された細胞を凍結したものである。凍結条件は特に問わない。
該凍結細胞は、凍害保護剤を含む細胞である。凍害保護剤としては、ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはアルブミンであり、その使用濃度は、凍結細胞に対して、適宜選択される。
凍結細胞から回収される有用細胞としては、赤血球、白血球、造血幹細胞または造血前駆細胞、卵母細胞、精子またはランゲルハンス細胞などがある。これらの有用細胞は、次の工程において、ヒトへの輸液注入、遺伝子導入、移植または栄養培地にての培養に使用される。
【００１７】
有用細胞回収フィルターとしては、繊維性集合体または多孔性物質などが例示される。繊維性集合体としては、天然繊維または合成繊維から作製された不織布、織布、粉状体またはこれらの積層体などがあり、繊維直径は例えば、１．０〜２５．０μｍ、嵩密度は０．０５〜０．５０ｇ／ｃｍ３である。多孔性物質としては、天然物質または合成物質から製造された微粒子、膜状体、フィルム、シートまたはこれらの積層体などが例示される。多孔性物質の空孔率は、３０〜９５％である。これらのフィルターは種々の嵩密度または空孔率はその変更が可能である。
【００１８】
浸透圧調整液とは、捕捉された解凍細胞の浸透圧を目標の浸透圧に調整する溶液であり、具体的には、５％デキストラン４０、２．５％アルブミンおよび生理食塩水を含む。
該調整液は、解凍細胞に含まれる凍害保護剤より低濃度の凍害保護剤を含む溶液であることが好ましい。浸透圧調整液は、凍結容器内の残液を回収するためのリンス用溶液およびエアを含み、フィルターに捕捉された細胞の浸透圧を調整するための溶液であってもよい。
リンス用溶液は、毒性のない無菌のエアを含む溶液であることが好ましい。リンス用溶液は、解凍した細胞を含む溶液に含まれる凍害保護剤と実質的に同一濃度である凍害保護剤を含む溶液であることが好ましい。エアは、具体的には凍結バッグ容積と同一容積のものであり、大気中の空気組成のものである。
【００１９】
有用細胞回収液としては、デキストラン、ヒドロキシエチルまたはアルブミンなどを含む溶液がある。
【００２０】
本発明は、下記工程を有する。
（１）容器に収容した凍結細胞を解凍する。例えば、凍結バッグに収容された１０％ＤＭＳＯで凍害保護された凍結臍帯血を３７℃で急速解凍する。
（２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入する。具体的には、凍結バッグに当該器具の接続手段を用いて接続し、重力差で有用細胞回収フィルターに注入する。
（３）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整する。具体的にはフィルターに例えば、５％デキストラン４０／２５％アルブミン／生理食塩水を添加する。
（４）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収する。例えば、５％デキストラン溶液にて、逆洗浄、もしくはフィルター嵩密度を変更することにより回収する。
【００２１】
本発明は、また下記工程を有する。
（１）容器に収容した凍結細胞を解凍する。
（２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入する。
（３）解凍細胞を含む溶液を排出した容器にリンス用溶液を注入して、該容器の残留細胞を洗い流し、有用細胞回収フィルターへ移送する。例えば、１０％ＤＭＳＯ／生理食塩水を注入し、残留細胞を洗い出す。
（４）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整する。
（５）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収することを特徴とする凍結細胞から有用細胞を回収する。
【００２２】
有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整する工程において、浸透圧調整液が、凍害保護されていた有用細胞の浸透圧を最終目標とする有用細胞の浸透圧へ段階的に変化させることが好ましい。
このような浸透圧を段階的に変化させるには、例えば、１０％ＤＭＳＯで凍害保護されている場合、まず、第一に５％ＤＭＳＯをフィルターに注入し、次いで、ＤＭＳＯを含まない溶液（０％ＤＭＳＯ溶液）を注入すると可能である。あるいはフィルターに対して、上流位置に０％ＤＭＳＯ溶液を入れた容器、下流位置に１０％ＤＭＳＯ溶液を含む硬質容器を直列に配置する。そして、０％ＤＭＳＯ溶液を下流位置の１０％ＤＭＳＯ溶液容器から注入すると、０％ＤＭＳＯが注入された等量が、１０％ＤＭＳＯ溶液容器からフィルターに流入する。１０％ＤＭＳＯ溶液容器内は、次第にＤＭＳＯ濃度が低下していき、徐々に低濃度のＤＭＳＯ溶液がフィルターへ流入することにより、段階的に浸透圧を変化させることが可能である。または０％ＤＭＳＯ溶液を含む溶液と１０％ＤＭＳＯ溶液を含む容器を並列に配置することも可能である。１０％ＤＭＳＯ溶液容器を上部に０％ＤＭＳＯ溶液容器を下部に配置し、ともに開栓することで自重差により、徐々にＤＭＳＯ濃度が低濃度のものがフィルターへ供給され、段階的に浸透圧を変化させることが可能である。
【００２３】
本発明の凍結細胞から有用細胞を回収する器具は、下記構成を有する。
（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルター、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器、（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器、（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器。
【００２４】
（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターは、凍結細胞を収容した容器に接続する。また、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターは、フィルター密度が変更可能であることが好ましい。フィルター密度を変更可能な状態とするには、フィルターの嵩密度を変化させるか、フィルターの空孔率を変化させる方法などがある。
【００２５】
本発明の器具の一例は、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターの一方の端片に、凍結細胞を収容した容器、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器および（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器が連結し、他方の端片に、（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器が連結する。
また、本発明の別な例は、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターの一方の端片に、凍結細胞を収容した容器、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器および（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器が連結し、他方の端片に、（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器および（Ｃ）有用成分回収液を収容した容器が連結する。
【００２６】
本発明の器具は、さらに、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器を結合する手段、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器を連結する手段、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器を連結する手段および（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器を連結する手段を含む。
【００２７】
本発明では、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器と（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器が、同一容器であることが好ましい。
【００２８】
本発明では、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器が、異なる浸透圧を保持する調整液を含む複数の容器であってもよい。
浸透圧調整液は凍結容器内の残液を回収するためのリンス用溶液およびエアを含み、フィルターに捕捉された細胞の浸透圧を調整するための溶液であってもよい。
【００２９】
本発明の器具は、解凍された凍結細胞から凍害保護剤などの副作用物質を除去し、かつ細胞内の浸透圧調製を行う器具であって、その一例は、
▲１▼凍結用容器（凍結バッグ）から、無菌的に凍結細胞を取り出すために、凍結用容器（凍結バッグ）に接続するためのコネクター（連結手段）
▲２▼ 凍害保護剤等の副作用物質を通過させ、かつ目的の細胞を補足するフィルター（有用細胞回収フィルター、Ａ）
▲３▼ 上記フィルターで補足されない溶液を収納するための容器（フィルターを通過した回収液を収容する容器、Ｄ）
▲４▼ 凍結容器（凍結バッグ）内の残液を回収するためのリンス溶液およびエアを含む容器
▲５▼ フィルターに補足された細胞の浸透圧を調整するための調整液を含む容器（浸透圧調整液を収容した容器、Ｂ）
▲６▼ フィルターに補足された細胞をフィルターから脱離させるための溶液を含む容器（有用細胞回収液を収容した容器、Ｃ）
▲７▼ フィルターから脱離した細胞を含む溶液を収納し、外部（輸液セット、輸血セット、培養バッグなど）に接続するための接続部を有する容器（Ｅ）、該容器はフィルターを通過した浸透圧調整液を回収する容器（Ｂ）を兼用してもよい。
▲８▼ 各容器、フィルターを無菌的に接続するチューブ（連結手段）
▲９▼ 選択的に溶液を各容器、フィルター間へ移送するための手段（移送手段）
からなる。
【００３０】
本発明の器具の一例を、図１により詳細に説明する。図１中、１は接続コネクター、２はフィルター、３は廃液回収容器、４はリンス溶液およびエア収容容器、５は浸透圧調整液用容器、６は回収溶液収容容器、７はフィルターから解離した細胞を回収する溶液を回収する回収容器、８は凍結容器（凍結バッグ）を示す。
【００３１】
解凍された凍結細胞を収容した凍結バッグ８に、接続コネクター１を接続して、該解凍細胞を含む懸濁液をフィルター２へ通過させる。解凍細胞はフィルター２に捕捉され、凍害保護剤を含む溶液は廃液回収容器３に流れ込む。次に、凍結容器（凍結バッグ）内に残存している細胞懸濁液をフィルター２へ通過させるために、リンス溶液およびエア収容容器４からエアを凍結容器（凍結バッグ）内に注入することにより、凍結容器（凍結バッグ）内の細胞懸濁液の大部分は、フィルター２へ流出する。凍結容器の形状や表面張力により残存している解凍細胞を回収するために、必要により、凍害保護時と同等の組成を有するリンス溶液を、リンス溶液およびエア収容容器４から凍結容器（凍結バッグ）に添加し、凍結容器（凍結バッグ）内の細胞懸濁液をフィルター２へ流入させる。フィルター２に捕捉されないリンス溶液は廃液回収容器３に流れ込む。フィルター２に捕捉された細胞は、細胞内の浸透圧が依然、凍害保護時と同等であるため、細胞障害を起因させないように、浸透圧調整液を含む浸透圧調整液用容器５よりフィルター２へ段階的に、浸透圧を目標値に近くする調整液を流入させる。フィルター２内での該調整液と細胞との接触の間に、細胞は目標とする浸透圧へ細胞障害を起こすことなく調整される。そして、浸透圧が調整された細胞をフィルター２から有用細胞を解離して、回収するために、回収用溶液を含む回収溶液収容容器６からフィルター２に対して回収用溶液を流入する。フィルターから解離した細胞を回収する溶液を回収する回収容器７へ該回収液を回収する。該回収液から常法に従い、有用細胞を単離する。単離、回収された細胞は、輸液注入、遺伝子導入、移植ななどに使用される。
【００３２】
【実施例】
実施例を用いて、本発明を詳細に説明する。
実施例１
ヒト臍帯から採取した臍帯血２０ｍｌに凍害保護剤、５０％ＤＭＳＯ５ｍｌを添加して、凍結バッグ中に注入し、暖速凍結し、液体窒素中で、１ケ月間凍結した。該凍結バッグを３７℃温水浴中に、２分間保持して解凍した。次いで、図１に示される器具の有用成分回収フィルターの一方の端片に該凍結バッグを連結した。該端片には、浸透圧調整液を収容した容器および有用細胞回収液を収容した容器が連結され、他方の端片に、フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液を収容する廃液容器、フィルターを通過した浸透圧調整液を回収する容器およびフィルターを通過した回収液を収容する容器が連結されている。
【００３３】
該凍結バッグから解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入した。該フィルターは繊維直径３．５μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度０．１１ｇ／ｃｍ３である不織布６枚および繊維直径１．５μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度０．１５ｇ／ｃｍ３である不織布１４枚からなる積層体である。解凍した細胞を含む溶液は、嵩密度０．１５ｇ／ｃｍ３の不織布側から注入され、嵩密度０．１１ｇ／ｃｍ３の不織布側から流出した。次いで、該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液２００ｍｌを注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整した。浸透圧調整液は５％デキストラン４０、２．５％アルブミンおよび生理食塩水を含む。凍結時の１０％ＤＭＳＯの浸透圧は約２８００ｍＯｓＭ／ｋｇ・Ｈ２Ｏであり、該調整液にて浸透圧を約３００ｍＯｓＭ／ｋｇ・Ｈ２Ｏに調整した。
【００３４】
次いで、該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された白血球を回収した。有用細胞回収液は５％デキストラン４０を含む。回収液から造血前駆細胞を単離するには、嵩密度を半分にした。得られた造血前駆細胞の回収率は、メチルセルロースによるコロニー形成細胞の計測により、８０％であった。操作時間は１２分間であった。
【００３５】
実施例２
ヒト臍帯から採取した臍帯血２０ｍｌに凍害保護剤、５０％ＤＭＳＯ５ｍｌを添加して、凍結バッグ中に注入し、暖速凍結し、液体窒素中で、１ケ月間凍結した。該凍結バッグを３７℃浴中に、２分間保持して解凍した。次いで、図１に示される器具の有用細胞回収フィルターの一方の端片に該凍結バッグを連結した。該端片には、浸透圧調整液を収容した容器および有用細胞回収液を収容した容器が連結され、他方の端片に、フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液を収容する廃液容器、フィルターを通過した浸透圧調整液を回収する容器およびフィルターを通過した回収液を収容する容器が連結されている。
【００３６】
該凍結バッグから解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入した。該フィルターは繊維直径３．５μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度０．１１ｇ／ｃｍ３である不織布６枚および繊維直径１．５μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度０．１５ｇ／ｃｍ３である不織布１４枚からなる積層体である。解凍した細胞を含む溶液は、嵩密度０．１５ｇ／ｃｍ３の不織布側から注入され、嵩密度０．１１ｇ／ｃｍ３の不織布側から流出した。次いで、解凍細胞を含む溶液を排出した凍結バッグにリンス用溶液を注入して、該バッグの残留細胞を洗い流し、有用細胞回収フィルターへ移送した。該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液２００ｍｌを注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整した。凍結時の浸透圧は約２８００ｍＯｓＭ／ｋｇ・Ｈ２Ｏであり、該調整液にて調製ｓたい浸透圧は約３００ｍＯｓＭ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ であった。さらに、該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された造血前駆細胞を回収した。リンス用溶液は１０％ＤＭＳＯ／２．５％デキストラン４０／生理食塩水を含む。有用細胞回収液は５％デキストラン４０を含む。
得られた有用細胞回収液から造血前駆細胞を常法に従い、単離した。得られた造血前駆細胞の回収率は８５％であった。操作時間は１５分間であった。
【００３７】
比較例１
実施例１において、有用細胞回収フィルターに浸透圧調整液２００ｍｌを注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整する操作を実施することなく、実施例１と同様にして、臍帯血から造血前駆細胞を単離した。単離された造血前駆細胞の回収率は４０％であった。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、解凍後の凍結細胞の活性を高く維持したまま、次工程（輸注、細胞修飾、培養など）で影響のある副作用物質（凍害保護剤など）を効果的に除去し、かつ、次工程に適した浸透圧へ調製することを、高価な装置（遠心分離機等）を必要とせず、かつ無菌的に短時間で容易に実施できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の器具の一例を示す図である。
【符号の説明】
１ 接続コネクター
２ フィルター
３ 廃液回収容器
４ リンス溶液およびエア収容容器
５ 浸透圧調整液用容器
６ 回収溶液収容容器
７ 回収容器
８ 凍結バッグ
Claims (16)
- （１）容器に収容した凍結細胞を解凍し、（２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入し、（３）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整し、さらに、（４）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収することを特徴とする凍結細胞から有用細胞を回収する方法。
- （１）容器に収容した凍結細胞を解凍し、（２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルターに注入し、（３）解凍細胞を含む溶液を排出した容器にリンス用溶液を注入して、該容器の残留細胞を洗い流し、有用細胞回収フィルターへ移送し、次いで、（４）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整し、さらに、（５）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収することを特徴とする凍結細胞から有用細胞を回収する方法。
- 凍結細胞が、凍害保護剤を含む細胞である請求項１または２記載の方法。
- 有用細胞が、赤血球、白血球、造血幹細胞または造血前駆細胞、卵母細胞、精子またはランゲルハンス細胞である請求項１または２記載の方法。
- 浸透圧調整液が、凍結細胞に含まれる凍害保護剤より低濃度の凍害保護剤を含む溶液である請求項１または２記載の方法。
- 浸透圧調整液が、凍結容器内の残液を回収するためのリンス用溶液およびエアを含み、フィルターに捕捉された細胞の浸透圧を調整するための溶液である請求項１または２記載の方法。
- 有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整する工程において、浸透圧調整液が、凍害保護されていた有用細胞の浸透圧を、最終目標とする有用細胞の浸透圧へ段階的に変化させる請求項１または２記載の方法。
- リンス用溶液が、解凍した細胞を含む溶液に含まれる凍害保護剤と実質的に同一濃度である凍害保護剤を含む溶液である請求項２記載の方法。
- 下記構成を有する凍結細胞から有用細胞を回収する器具。
（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルター、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器、（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器、（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通過した回収液および有用細胞を収容する容器。 - （Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターは、凍結細胞を収容した容器に接続する請求項９記載の器具。
- （Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターは、フィルター密度が変更可能である請求項９記載の器具。
- （Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターの一方の端片に、凍結細胞を収容した容器、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器および（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器が連結し、他方の端片に、（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通過した回収液および有用細胞を収容する容器が連結された請求項９記載の器具。
- （Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターの一方の端片に、凍結細胞を収容した容器、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器および（Ｅ）フィルターを通過した回収液および有用細胞を収容する容器が連結し、他方の端片に、（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する容器および（Ｃ）有用成分回収液を収容した容器が連結された請求項９記載の器具。
- さらに、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器を結合する手段、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器を連結する手段、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した回収液を収容する容器を連結する手段を含む請求項９記載の器具。
- （Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器と（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器が、同一容器である請求項９記載の器具。
- （Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器が、異なる浸透圧を保持する調整液を含む複数の容器である請求項９記載の器具。
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