JPH10234361A

JPH10234361A - 造血幹細胞分離・保存システム

Info

Publication number: JPH10234361A
Application number: JP9054300A
Authority: JP
Inventors: Masaya Sumida; 政哉澄田; Shuji Terajima; 修司寺嶋
Original assignee: Asahi Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 1997-02-24
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 1998-09-08

Abstract

(57)【要約】【課題】簡便かつ短時間の操作で、赤血球と造血幹細
胞及び／または造血前駆細胞（以下、造血幹細胞と略
す）を含む細胞集団から造血幹細胞を含む単核球を分離
・保存できるシステムを提供する。【解決手段】少なくとも造血幹細胞を含む単核球は捕
捉し、赤血球は通過する細胞捕捉手段１と、該細胞捕捉
手段の入口以前に接続される、原料細胞液を細胞捕捉手
段に注入する回路２と、前記細胞捕捉手段の出口以降に
接続される、前記細胞捕捉手段の出口から流出する液体
を排液する回路３と、前記細胞捕捉手段の出口以降に接
続される、前記細胞捕捉手段に液体を注入する回路４
と、前記細胞捕捉手段の入口以前に接続される、前記細
胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する回路５からなる
造血幹細胞分離・保存システム。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は臍帯血などの、赤血
球と造血幹細胞及び／または造血前駆細胞（以下、造血
幹細胞と略す）を含む細胞集団から造血幹細胞を含む単
核球を分離し、保存する際に用いるシステムに関する。

【０００２】

【従来の技術】臍帯血幹細胞は、ドナー侵襲皆無の造血
幹細胞移植ソースとして注目を集めており、欧米諸国を
中心にさかんに臨床応用が試みられている。臍帯血幹細
胞は、他の造血幹細胞移植、即ち、骨髄移植あるいは末
梢血幹細胞移植のようにドナーから採取されてすぐ患者
に移植されることはまれであるので、採取時から使用時
まで保存しておくことが必要である（特に非血縁者間移
植の場合）。特公平８−６９号公報には臍帯血を凍結保
存後、解凍して移植に用いることが開示されている。と
ころで、臍帯血は凍結保存に際し、解凍後の破壊赤血球
による副作用防止及び凍結保存時の体積を小さくする目
的で、単核球に分離（赤血球を除去）すべきとされてお
り現在はほとんどが分離保存が通常となっている（南江
堂、「末梢血幹細胞移植」、１７３ページ）。事実、特
公平８−６９号公報でもフィコールハイパキュー（比重
液による遠心分離）で分離すること（以下フィコール法
と略す）及びそのプロトコールの詳細が開示されてい
る。しかしながら、フィコール法は非常に煩雑で長時間
を要する操作であるという問題がある。更に、凍害保護
剤を添加して凍結保存する方法の詳細も開示されている
が、これも非常に煩雑な操作である。

【０００３】一方、特開平７−１８４９９１号公報には
臍帯血採取器具が開示されている。ここでは、血液採取
容器の前に臍帯血中の異物であるマイクロアグリゲート
などの凝集塊、組織片、骨片、脂肪塊を除去するフィル
ターが開示されている。しかしながら、本フィルターは
前述の如く異物除去が目的であり、赤血球の除去を目的
としたものではない。また、凍結保存に関しては一切言
及されていない。特開平８−５２２０６号公報には採取
した臍帯血から造血幹細胞を分離できる臍帯血採取装置
が開示されており、同公報７ページには臍帯血採取容器
に凍結保存剤を添加しておくことが好ましいことが開示
されている。同公報によると膜型血漿分離器で造血幹細
胞は血漿成分に、非造血幹細胞（赤血球）は血球成分に
分離されるとしているが、造血幹細胞と赤血球は大きさ
がほぼ同じであることから、本分離法で期待する結果を
得るためには非常な困難を伴うと考えられる。一方、同
公報には別の分離法として密度勾配分離（即ち、フィコ
ール法）装置を接続して分離する方法も開示されてい
る。本法は先述したように、従来使用されている方法で
あるので、造血幹細胞の分離は可能であるが、同公報図
３からもわかるように非常に大掛かりな装置となる。ま
た、自動化された装置とは言え、フィコール法であるの
で、操作時間は長い。臍帯血は、採取時間、即ち出産時
間を事前に設定することは非常に困難であるので、細胞
処理操作が深夜にまで及ぶ可能性がある操作時間の長い
方法は、とうてい臨床現場でルーチンで採用できるもの
ではない。また、骨髄、末梢血の場合も非血縁者間移植
の場合は遠方から細胞液が、細胞処理が行われる移植施
設に運ばれることが常であるので、同様に操作時間の長
い方法は極めて不都合である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、簡便
かつ短時間の操作で、赤血球と造血幹細胞及び／または
造血前駆細胞（以下、造血幹細胞と略す）を含む細胞集
団から造血幹細胞を含む単核球を分離・保存できるシス
テムを提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の従
来技術の問題点を解決すべく鋭意検討した結果、造血幹
細胞は細胞捕捉手段に捕捉されやすいにもかかわらず、
逆方向からの送液により剥離されやすいという驚くべき
性質を見出し、本発明を完成させたものである。図１は
本発明のシステム概略図である。即ち、本発明は少なく
とも造血幹細胞を含む単核球は捕捉し、赤血球は通過す
る細胞捕捉手段１と、該細胞捕捉手段の入口以前に接続
される、原料細胞液を細胞捕捉手段に注入する回路２
と、前記細胞捕捉手段の出口以降に接続される、前記細
胞捕捉手段の出口から流出する液体を排液する回路３
と、前記細胞捕捉手段の出口以降に接続される、前記細
胞捕捉手段に液体を注入する回路４と、前記細胞捕捉手
段の入口以前に接続される、前記細胞捕捉手段の入口側
から細胞を回収する回路５からなる造血幹細胞分離・保
存システムである。更に、回路５が凍結融解に耐える材
質である造血幹細胞分離・保存システムであることが好
ましい。また、本発明は少なくとも造血幹細胞を含む単
核球は捕捉し、赤血球は通過する細胞捕捉手段１に該細
胞捕捉手段の入口以前に接続される回路２を通じて原料
細胞液を導入し、前記細胞捕捉手段の出口以降に接続さ
れる回路３を通じて赤血球含有液を排液した後、前記細
胞捕捉手段の出口以降に接続される回路４から造血幹細
胞の保存に使用されうる液体を前記細胞捕捉手段に導入
し、前記細胞捕捉手段に捕捉されている少なくとも造血
幹細胞を含む単核球を剥離し、前記細胞捕捉手段の入口
以前に接続される回路５により細胞を回収することを特
徴とする造血幹細胞分離・保存方法である。

【０００６】本発明でいう少なくとも造血幹細胞を含む
単核球は捕捉し、赤血球は通過する細胞捕捉手段１は、
水不溶性の造血幹細胞を含む単核球の捕捉材を容器に充
填したものである。造血幹細胞を含む単核球の捕捉材で
あればいかなる材質でも使用可能であるが、成型性、滅
菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示す
ると、ポリエチレン、ポリプリロピレン、ポリスチレ
ン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカー
ボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成
高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キ
チン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイド
ロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無
機材料、ステンレス、チタン等の金属があげられる。ま
た、これらの捕捉材はこのままでも用いることができる
が、血小板通過性を高める等の必要に応じ、表面改質を
行ってもよい。また、捕捉材の形状としては粒状、繊維
塊、織布、不織布、スポンジ等の多孔質体、平板等があ
げられるが、体積あたりの表面積が大きいという点で粒
状、繊維塊、織布、不織布、スポンジ等の多孔質体が好
ましい。

【０００７】本発明でいう細胞捕捉手段の入口以前に接
続される、原料細胞液を細胞捕捉手段に注入する回路２
は原料細胞液が貯留されている容器等に接続しうるも
の、または原料細胞液の存在する組織に接続されうるも
のである。前者の具体例をあげると、例えば、原料細胞
液を貯留している容器がバッグであれば、スパイク付チ
ューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チューブ、
あるいは無菌接続器による接続（以下「ＳＣＤ接続」と
いう）を行うのであれば単なるチューブ、といったよう
に適宜選択する。原料細胞を貯留している容器が針付シ
リンジであれば穿刺可能なセプタム付チューブ、針無し
でルアー口の場合はルアーアダプター（オス、メス）と
いうように適宜選択する。後者の具体例をあげると、例
えば臍帯血を対象とした場合、当該組織は胎盤及び／ま
たは臍帯であり、これらに穿刺可能な金属針付チューブ
があげられる。チューブの場合は途中に流量調整のため
のローラークランプ、凝集塊除去のためのメッシュチャ
ンバー等を有してもよい。また、シリンジの場合、チュ
ーブを介さず細胞捕捉手段の入口に直接接続してもよ
い。

【０００８】本発明でいう細胞捕捉手段の出口以降に接
続される、前記細胞捕捉手段の出口から流出する液体を
排液する回路３は、排液される液体をいかなる手段で収
集（または廃棄）するかにより、以下の様に分けられ
る。即ち、バッグに収集する場合は、予めバッグを接続
しておくか、バッグと接続可能な回路、即ち、スパイク
付チューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チュー
ブ、あるいはＳＣＤ接続を行うのであれば単なるチュー
ブというように適宜選択する。また、コニカルチューブ
に収集する場合や廃液ビンに廃棄、廃液チューブに廃棄
する場合は先端が開放されていればよく、ルアー口のシ
リンジで収集する場合はルアーアダプター（オス、メ
ス）を用いる。また、シリンジの場合、チューブを介さ
ず細胞捕捉手段の出口に直接接続してもよい。

【０００９】本発明でいう前記細胞捕捉手段の出口以降
に接続される、前記細胞捕捉手段に液体を注入する回路
４は、細胞捕捉手段に注入する液体を入れた容器を予め
接続しておくか、後から接続可能とするか、また液体の
注入手段により以下の様に分けられる。即ち、細胞捕捉
手段に注入する液体を入れた容器を予め接続しておく場
合は、バッグ付チューブ、シリンジとなる。バッグの場
合、細胞捕捉手段に液体を注入する方法としては、落差
による方法、バッグを押しつぶす方法、ローラーポンプ
を用いる方法があげられる。細胞捕捉手段に注入する液
体を入れた容器を後から接続する場合、シリンジを用い
る場合はシリンジが接続可能である穿刺可能なセプタム
付チューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チュー
ブ、三方活栓付チューブなどがあげられる。バッグを用
いる場合はバッグと接続可能な回路、即ち、スパイク付
チューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チュー
ブ、あるいはＳＣＤ接続を行うのであれば単なるチュー
ブというように適宜選択する。また、シリンジの場合、
チューブを介さず細胞捕捉手段の出口に直接接続しても
よい。ここで、細胞捕捉手段に液体を注入するのは、細
胞捕捉手段に捕捉されている造血幹細胞を含む単核球を
剥離回収するためであるが、当該溶液がその後の凍結保
存あるいは液体保存において用いられるものであれば、
細胞を回収後、あらたに保存液を添加する手間がはぶけ
最も好ましい。

【００１０】本発明でいう前記細胞捕捉手段の入口以前
に接続される、前記細胞捕捉手段の入口側から細胞を回
収する回路５は、細胞捕捉手段から流出した細胞をいか
なる容器で回収するかにより、以下の様に分けられる。
即ち、バッグに回収する場合は、予めバッグを接続して
おくか、バッグと接続可能な回路、即ち、スパイク付チ
ューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チューブ、
あるいはＳＣＤ接続を行うのであれば単なるチューブと
いうように適宜選択する。また、コニカルチューブに収
集する場合は先端が開放されていればよく、ルアー口の
シリンジで収集する場合はルアーアダプター（オス、メ
ス）、三方活栓などを用いる。また、シリンジの場合、
チューブを介さず細胞捕捉手段の出口に直接接続しても
よい。ここで、細胞を該細胞捕捉手段から流出させる液
体がその後の細胞保存に用いられるものである場合は、
細胞を回収する容器も細胞保存用のものであることが最
も好ましい。凍結保存容器の例をあげると、「クリオサ
イト」（バクスター社製）、「セルフリーズバッグ」
（チャーターメド社製）等の凍結保存バッグがあげられ
る。

【００１１】本発明による造血幹細胞分離・保存システ
ムは、細胞捕捉手段に捕捉された細胞を該細胞捕捉手段
から剥離回収する前に、該細胞捕捉手段に残存する赤血
球を洗流するためにリンス回路６（図示しない）を設け
ることがより好ましい。リンス回路６はリンス液を入れ
た容器を予め接続しておくか、後から接続可能とする
か、また液体の注入手段により以下の様に分けられる。
即ち、リンス液を入れた容器を予め接続しておく場合
は、バッグ付チューブ、シリンジとなる。リンス液を入
れた容器を後から接続する場合、シリンジを用いる場合
はシリンジが接続可能である穿刺可能なセプタム付チュ
ーブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チューブがあ
げられる。バッグを用いる場合はバッグと接続可能な回
路、即ち、スパイク付チューブ、ルアーアダプター（オ
ス、メス）付チューブ、あるいはＳＣＤ接続を行うので
あれば単なるチューブというように適宜選択する。ま
た、シリンジの場合、チューブを介さず細胞捕捉手段の
出口に直接接続してもよい。リンス回路の、細胞捕捉手
段への接続位置としては、入口側、出口側のいずれも可
能であるが、入口側が操作の簡便さという点でより好ま
しい。本発明で用いる原料細胞液としては、臍帯血、末
梢血、骨髄及びこれらを遠心分離器により粗分離し、必
要に応じ抗凝固剤等の添加剤を添加したもの等が含まれ
る。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下本発明の実施態様を図面によ
り説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。図１は本発明の実施態様の一例であり、原料細胞バ
ッグと本発明システム本体、細胞捕捉手段の出口から流
出する液体を回収するバッグと本発明システム本体、細
胞捕捉手段の入口側から細胞を回収するバッグと本発明
システム本体との接続をいずれもスパイクで行い、ま
た、細胞捕捉手段に液体を注入する、オスルアー口を有
するシリンジを接続する三方活栓を設けたものである。
図１において１は少なくとも造血幹細胞を含む単核球は
捕捉し、赤血球は通過する細胞捕捉手段である。２は原
料細胞液を細胞捕捉手段に注入する回路であり、スパイ
ク２−１、クランプ２−２、チューブ２−３からなる。
３は細胞捕捉手段１の出口から流出する液体を排液する
回路であり、スパイク３−１とチューブ３−２からな
る。４は細胞捕捉手段１の出口側から該細胞捕捉手段に
液体を注入する回路であり、チューブは回路３と共用し
ており、シリンジを接続する三方活栓４−１を有する。
５は細胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する回路であ
り、スパイク５−１、クランプ５−２、チューブ５−３
からなる。また、チューブ５−３までは回路２のチュー
ブ２−３と共用している。次に使用方法を説明する。予
め、クランプ２−２は閉、三方活栓４−１はシリンジ接
続方向のみ閉、クランプ５−２は閉にしておく。次に、
原料細胞の入ったバッグにスパイク２−１を刺し、空の
バッグにスパイク３−１を刺す。次いで、クランプ２−
２を開けると、原料細胞液は回路２のチューブ２−３を
通り、細胞捕捉手段１に供給され、造血幹細胞を含む単
核球は捕捉され、赤血球は回路３のチューブ３−２を通
って空バッグに収集される。原料細胞液を処理し終えた
後、クランプ２−２を閉じ、原料細胞の入ったバッグか
らスパイク２−１を抜き、市販の生理食塩水ボトルに刺
す。クランプ２−２を開けると、生理食塩水は細胞捕捉
手段１をリンスし、回路３を通じ、赤血球が収集されて
いるバッグに収集される。リンス終了後クランプ２−２
を閉じる。次に、三方活栓４−１に回収後の細胞保存に
も使用される液体の入ったシリンジを接続し、スパイク
５−１を細胞回収兼保存バッグに刺す。三方活栓をシリ
ンジと細胞捕捉手段１のみが通過する方向に回し、クラ
ンプ５−２を開いた後、シリンジを押し、液体を細胞捕
捉手段１の出口側から注入し、細胞捕捉手段に捕捉され
ている細胞を回路５を通じて細胞回収兼保存バッグに回
収する。回収された細胞はこのまま、あるいは必要に応
じタンパク質等を添加した後、保存される。

【００１３】

【発明の効果】上述の様に、本発明によれば赤血球と造
血幹細胞を含む細胞集団から造血幹細胞を含む単核球の
分離から保存までの処理が簡便な短時間の操作で一括処
理が可能となるので、臨床現場での省力化に貢献すると
ころ大である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の「造血幹細胞分離・保存システム」の
概略図である。

【符号の説明】

１細胞捕捉手段２回路２−１スパイク２−２クランプ２−３チューブ３回路３−１スパイク３−２チューブ４回路４−１三方活栓５回路５−１スパイク５−２クランプ５−３チューブ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも造血幹細胞を含む単核球は捕
捉し、赤血球は通過する細胞捕捉手段１と、該細胞捕捉
手段の入口以前に接続される、原料細胞液を細胞捕捉手
段に注入する回路２と、前記細胞捕捉手段の出口以降に
接続される、前記細胞捕捉手段の出口から流出する液体
を排液する回路３と、前記細胞捕捉手段の出口以降に接
続される、前記細胞捕捉手段に液体を注入する回路４
と、前記細胞捕捉手段の入口以前に接続される、前記細
胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する回路５からなる
造血幹細胞分離・保存システム。
【請求項２】回路５が凍結融解に耐える材質である請
求項１に記載の造血幹細胞分離・保存システム。
【請求項３】細胞補族手段１の入口以前または出口以
降に接続されるリンス回路６を有する請求項１または２
に記載の造血幹細胞分離・保存システム。
【請求項４】少なくとも造血幹細胞を含む単核球は捕
捉し、赤血球は通過する細胞捕捉手段１に該細胞捕捉手
段の入口以前に接続される回路２を通じて原料細胞液を
導入し、前記細胞捕捉手段の出口以降に接続される回路
３を通じて赤血球含有液を排液した後、前記細胞捕捉手
段の出口以降に接続される回路４から造血幹細胞の保存
に使用されうる液体を前記細胞捕捉手段に導入し、前記
細胞捕捉手段に捕捉されている少なくとも造血幹細胞を
含む単核球を剥離し、前記細胞捕捉手段の入口以前に接
続される回路５により細胞を回収することを特徴とする
造血幹細胞分離・保存方法。