JP3945725B2

JP3945725B2 - 細胞分離方法

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Publication number: JP3945725B2
Application number: JP23326597A
Authority: JP
Inventors: 政哉澄田; 修司寺嶋
Original assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1997-08-15
Publication date: 2007-07-18
Anticipated expiration: 2017-08-15
Also published as: JPH1156352A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば造血幹細胞及び/または造血前駆細胞（以下、「造血幹細胞」と略す）やリンパ球などの有核細胞を含有する液体から有核細胞を分離する方法に関する。更に詳しくはヒトに移植する細胞等、検体分取が必要な細胞の分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臍帯血幹細胞は、ドナー侵襲皆無の造血幹細胞移植ソースとして注目を集めており、欧米諸国を中心にさかんに臨床応用が試みられている。臍帯血幹細胞は、他の造血幹細胞移植、即ち、骨髄移植或いは末梢血幹細胞移植のようにドナーから採取されてすぐ患者に移植されることはまれであるので、採取時から使用時まで保存しておくことが必要である（特に非血縁者間移植の場合）。特公平８−６９号公報には臍帯血を凍結保存後、解凍して移植に用いることが開示されている。ところで、臍帯血は凍結保存に際し、解凍後の破壊赤血球による副作用防止及び凍結保存時の体積を小さくする目的で、有核細胞を分離（赤血球を除去）すべきとされており現在はほとんどが分離保存が通常となっている（南江堂、「末梢血幹細胞移植」、１７３ページ）。事実、特公平８−６９号公報でもフィコールハイパキュー（比重液による遠心分離）で分離すること（以下フィコール法と略す）及びそのプロトコールの詳細が開示されている。更に、その後の凍害保護剤を添加して凍結保存する方法の詳細も開示されている。しかしながら、フィコール法は非常に煩雑で長時間を要する操作であるという問題がある。
ＷＯ９６／１７５１４公報にはヒドロキシエチルスターチを用いて赤血球を沈降分離し、有核細胞濃厚液を得るためのバッグシステム、方法が開示されている。本法はシステム化されているものの、遠心分離が２回必要であるため、やはり長時間作業となる。
ところで、造血幹細胞移植は白血球の血液型であるＨＬＡ（ヒト白血球抗原）の型を移植患者とドナーの間で合わせることが成功率を高めるカギとされている。どうしてもＨＬＡの一致したドナーが見つからない場合は、ＨＬＡ不適合移植も行われてはいるが、生着不全や、重篤な合併症である移植片対宿主病の起こる確率はＨＬＡ一致移植と比べ、はるかに高率となる。いずれにせよ、予め、ドナーと患者のＨＬＡタイピングは造血幹細胞移植においては必須である。ＨＬＡタイピングは、有核細胞から分離されるＤＮＡにより行われる。
臍帯血以外の造血幹細胞移植、即ち骨髄移植や末梢血幹細胞移植は移植用の骨髄や末梢血幹細胞採取に先立って、タイピング用血液をドナーの末梢血管から採取し、ＨＬＡタイピングが行われる。ところが、臍帯血の場合、ＨＬＡは母親ではなく新生児のものなので、事前に（出産前の胎児から）ＨＬＡタイピング用検体を採取することは不可能である。また、出産後の新生児から採取することも、倫理面・安全面で問題がある。そこで、臍帯血のＨＬＡタイピング用検体分取は採取された臍帯血から、以下の方法で行われている。即ち、１）有核細胞分離を行う前の全血から少量分取し、フィコール法により有核細胞を分離後、ＤＮＡを抽出する（残りの全血は有核細胞分離に供される）、２）ヒドロキシエチルスターチを用いる有核細胞分離後の、本来廃棄すべき赤血球層に混入する有核細胞を、フィコール法または塩化アンモニウムなどを用いる溶血法により分離回収しＤＮＡを抽出する、というものであるが、いずれも大変、手間と時間のかかる方法であった。尚、有核細胞分離後の細胞集団からＨＬＡタイピング用検体が分取されないのは、臍帯血から得られる細胞数は少ないため、有核細胞分離後の細胞は全て移植に使うことが望ましいためである。
ところで、フィコール法や赤血球凝集除去に代わる有核細胞分離方法も散見されるようになった。特開平８−１０４６４３号公報では赤血球は通過するフィルターに造血幹細胞を捕捉させた後、最初の通液方法とは逆方向の液流を惹起させて回収する方法が開示されている。しかしながら、回収操作を複数回行うことやＨＬＡタイピングに関しては一切記述されていない。一方、特開平８−２８０３８４号公報には有核細胞を吸着するが核を持たない細胞は吸着しない性質を有する物質を用いて、有核細胞を含む試料から有核細胞を吸着した後、有核細胞中の核酸または蛋白質を回収することが開示されている。しかしながら、同公報の技術課題は臨床検査用の検体採取であり、移植用細胞の調製の記述は一切無い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、安価で且つ簡便・短時間操作で、移植に必須のＨＬＡタイピング用検体と、移植用有核細胞が同時に得られる細胞分離方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、細胞をフィルターに捕捉させ、回収液をフィルターに導入し細胞を回収した場合、わずかではあるがフィルター内に捕捉されたまま回収されない細胞があることに着目し、更にもう一度回収液を導入することで、少量ではあるがＨＬＡタイピングには十分な量の細胞が回収できることを見出した。更に、ＨＬＡタイピング用細胞は移植用細胞と異なり細胞機能・形状を維持している必要が無いばかりでなく、細胞が溶解または破壊され、ＤＮＡで回収された方がより好ましいことから、生理的溶液であることが必要な移植用細胞回収液とは別の、細胞を溶解または破壊する性質を有する回収液を採用することで、移植用細胞とＤＮＡが同時に採取できることを見出し、本発明を完成させたものである。即ち、本発明は有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しない手段に有核細胞含有液を導入して有核細胞は捕捉させ、核を持たない細胞は流出させた後、該手段に回収液を導入して該手段に捕捉されている有核細胞を回収する細胞分離方法において、前記有核細胞含有液がヒト臍帯血であり、少なくとも生理的溶液と捕捉した細胞を溶解または破壊し得る溶液を含む複数の種類からなる回収液を複数回導入し、複数のＣＤ３４陽性細胞成分として細胞と細胞構成成分を同時に採取することを特徴とする細胞分離方法である。
【０００５】
以下本発明を詳細に説明する。本発明で言う有核細胞とは例えば、白血球のように核を持つ細胞のことであり、リンパ球、顆粒球、単球、造血幹細胞などがあげられる。本発明で言う核を持たない細胞とは赤血球、血小板などがあげられる。また、本発明で言う有核細胞含有液とは前記有核細胞を含有する液体のことであり、例えば末梢血、リンパ液、骨髄液、臍帯血、或いはこれらに何らかの処理を施した液体等があげられる。ここで、本発明は前述したように臍帯血を用いた場合に特にその有用性が発揮されるが、用途は臍帯血に限定されるものではない。本発明で言う有核細胞成分とは、有核細胞そのもの、または有核細胞を構成しているタンパク質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）などの成分を言う。
本発明における有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しない手段とは、例えば有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しない材料を充填した容器があげられる。有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しない材料とは通常の有核細胞捕捉材であればいかなる材料も使用できるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプリロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属があげられる。また、これらの捕捉材はこのままでも用いることができるが、血小板通過性を高める、或いは細胞の選択的捕捉を行う等の必要に応じ、表面改質を施したものでもよい。例えば、血小板通過性を高めるにはＷＯ８７／０５８１２公報で提案されている非イオン性親水基と塩基性含窒素官能基を有するポリマーのコートによる方法等があげられ、細胞の選択的捕捉を行う場合、アミノ酸、ペプチド、糖類、糖タンパク（抗体、接着分子等のバイオリガンドを含む）といった、特定の細胞に親和性のあるリガンドを、例えば特開平２−２６１８３３号公報で提案されているハロアセトアミド法により固定する方法等があげられる。また、捕捉材の形状としては粒状、繊維塊、織布、不織布、スポンジ状多孔質体、平板等があげられるが、体積あたりの表面積が大きいという点で粒状、繊維塊、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ましい。有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しない材料も充填する容器は、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプリロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の合成高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属があげられる。
【０００６】
本発明における、前記細胞捕捉手段に導入して捕捉した細胞を回収する回収液は生理的溶液であればいかなるものも使用可能であるが、いくつか例示すると、生理食塩水、Ｄ−ＰＢＳやＨＢＳＳなどの緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０などの培地があげられる。これらの生理的溶液に、細胞保護、栄養補給、凍結保存時の凍害保護等の目的で必要に応じ、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、グルコース、サッカロース、トレハロース等を添加しても良い。本発明においては、細胞捕捉手段に複数回の回収液導入を行うが、通常、第１回目に回収される有核細胞成分が最も細胞数が多いので、これを移植用に用い、第２回目以降に回収される有核細胞成分を別用途に用いることが好ましい。別用途としては、前述したＨＬＡタイピングの他に、幹細胞増幅方法の研究用、遺伝子診断用などがあげられる。例えばＨＬＡタイピング用としては有核細胞で１×１０⁶あれば充分である。ところで、第２回目以降に回収される有核細胞成分をＨＬＡタイピングに用いる場合、細胞そのものを回収する必要はなく、むしろＤＮＡとして回収した方が手間が省けて好ましいので、回収液としては細胞を溶解または破壊させる液体を用いることが好ましい。例としてドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、トリトンＸ−１００などの界面活性剤、蒸留水、イオン交換水などの低張液があげられる。これらにより回収されたＤＮＡは公知のフェノール・クロロホルム法などにより精製し、ＨＬＡタイピングに供する。
本発明で言う有核細胞含有液を、有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しない手段に導入する方法としては、前記手段にチューブを介して有核細胞含有液を入れたバッグ或いはボトルを接続して落差、ローラーポンプ、バッグを押しつぶし液流を惹起させる、などにより導入するか、有核細胞含有液を入れたシリンジを接続し、手押しまたはシリンジポンプなどで送液して導入すればよい。
有核細胞を該手段に導入すると、有核細胞は該手段内に捕捉され、核を持たない細胞は該手段から流出するが、若干容器内にも残存する場合があるので、残存した核を持たない細胞を洗浄除去する目的で前記手段に洗浄液を導入して洗浄することが好ましい。洗浄液としては生理的溶液であればいかなるものも使用可能であるが、いくつか例示すると、生理食塩水、ダルベッコリン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）やハンクス液（ＨＢＳＳ）等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等の培地があげられる。これらの生理的溶液に、細胞保護、栄養補給等の目的で必要に応じ、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、アルブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレハロース等を添加しても良い。洗浄液の送液方向は有核細胞含有液を導入した方向と同一方向が好ましい。逆方向ではこの洗浄操作により、有核細胞が漏出してしまうおそれがある。
本発明における、前記捕捉手段に回収液を導入する方法としては、該手段にチューブを介して回収液を入れたバッグ或いはボトルを接続して落差、ローラーポンプ、バッグ押しつぶしなどで送液するか、回収液を入れたシリンジを接続し、手押しまたはシリンジポンプなどで送液すればよい。この際、回収液の送液方向としては、有核細胞含有液を導入した方向と同一方向、その逆方向の２通りがあるが、一般に細胞回収率は後者の方が高いので好ましい。回収液の流速は早い方が回収率が高くなるので好ましい。
次に本発明の細胞分離システムについて説明する。本発明で言う細胞捕捉手段の入口以前に接続される、原料細胞液を前記細胞捕捉手段に注入する回路２は、原料細胞液が貯留されている容器等に接続し得るもの、または原料細胞液の存在する組織に接続され得るものである。前者の具体例をあげると、例えば原料細胞液を貯留している容器がバッグであれば、スパイク付チューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チューブ、或いは無菌接続器による接続（以下「ＳＣＤ接続」と言う）を行うのであれば単なるチューブ、といったように適宜選択する。
原料細胞液を貯留している容器が針付シリンジであれば穿刺可能なセプタム付チューブ、針無しでルアー口の場合はルアーアダプター（メス）というように適宜選択する。後者の具体例をあげると、例えば臍帯血を対象とした場合、当該組織は胎盤及び／または臍帯であり、これらに穿刺可能な金属針付チューブがあげられる。チューブの場合には途中に流量調整の為のローラークランプ、凝集塊除去の為のメッシュチャンバー等を有してもよい。また、シリンジの場合、チューブを介さず細胞捕捉手段の入口に直接接続してもよい。
本発明でいう細胞捕捉手段の出口以降に接続される、前記細胞捕捉手段から流出する液体を排液する回路３は、排液される液体をいかなる手段で収集（または廃棄）するかにより、以下のように分けられる。即ち、バッグに収集する場合は、予めバッグを接続しておくか、バッグと接続可能な回路、即ち、スパイク付チューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チューブ、或いはＳＣＤ接続を行うのであれば単なるチューブというように適宜選択する。また、コニカルチューブに収集する場合や廃液ビンに廃棄、廃液チューブに廃棄する場合は先端が開放されていればよく、ルアー口のシリンジで収集する場合はルアーアダプター（メス）を用いる。また、シリンジの場合、チューブを介さず細胞捕捉手段の出口に直接接続してもよい。
【０００７】
本発明でいう前記細胞捕捉手段の出口以降に接続される、前記細胞捕捉手段に回収液を注入する回路４は、細胞捕捉手段に注入する回収液を入れた容器を予め接続しておくか、後から接続可能とするか、また回収液の注入手段により以下のように分けられる。即ち、細胞捕捉手段に注入する回収液を入れた容器を予め接続しておく場合は、バッグ付チューブ、シリンジとなる。バッグの場合、細胞捕捉手段に回収液を注入する方法としては、落差による方法、バッグを押しつぶす方法、ローラーポンプを用いる方法があげられる。細胞捕捉手段に注入する回収液を入れた容器を後から接続する場合、シリンジを用いる場合はシリンジが接続可能である穿刺可能なセプタム付チューブ、ルアーアダプター（メス）付チューブ、三方活栓付チューブなどがあげられる。バッグを用いる場合はバッグと接続可能な回路、即ち、スパイク付チューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チューブ、或いはＳＣＤ接続を行うのであれば単なるチューブというように適宜選択する。また、シリンジの場合、チューブを介さず細胞捕捉手段の出口に直接接続してもよい。また、回路４内には回収操作を複数回行う際に、それぞれ別々の回収液を用いる場合の為に複数の分岐を設けることが好ましい。具体的には三方活栓、四方活栓を用いる方法、クランプを用いる方法、シリンジ接続可能な三つ又分岐管を用いる方法（要時にシリンジを接続）がある。また、前述の、シリジンを直接、チューブを介さずに細胞捕捉手段の出口に接続した場合は、回収液毎にシリンジを交換することで対応すればよい。
本発明でいう前記細胞捕捉手段の入口以前に接続される、前記細胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する回路５は、細胞捕捉手段から流出した細胞をいかなる容器で回収するかにより、以下のように分けられる。即ち、バッグに回収する場合は、予めバッグを接続しておくか、バッグと接続可能な回路、即ち、スパイク付チューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チューブ、或いはＳＣＤ接続を行うのであれば単なるチューブというように適宜選択する。また、コニカルチューブに収集する場合は先端が開放されていればよく、ルアー口のシリンジで回収する場合にはルアーアダプター（メス）、三方活栓などを用いる。また、シリンジの場合、チューブを介さず細胞捕捉手段の入口に直接接続してもよい。ここで、細胞を該細胞捕捉手段から流出させる回収液が、その後の細胞保存に用いられるものである場合は、細胞を回収する容器も細胞保存用のものであることが最も好ましい。凍結保存容器の例をあげると、「クリオサイト」（バクスター社製）、「セルフリーズバッグ」（チャーターメド社製）等の凍結バッグがあげられる。また、回路５内には流路切替え手段と複数の分岐を有する。これは回収操作を複数回行い、それぞれの有核細胞成分を別々に回収するためのものであるが、具体的には三方活栓、四方活栓を用いる方法、クランプを用いる方法がある。また、前述の、シリジンを直接、チューブを介さずに細胞捕捉手段の入口に接続した場合は、回収液毎にシリンジを交換することで対応すればよい。
【０００８】
本発明による細胞分離システムは、細胞捕捉手段に捕捉された細胞を該細胞捕捉手段から回収する前に、該細胞捕捉手段に残存する核を持たない細胞を洗浄するためのリンス回路（図示しない）を設けることがより好ましい。リンス回路はリンス液を入れた容器を予め接続しておくか、後から接続可能とするか、また液体の注入手段により以下のように分けられる。即ち、リンス液を入れた容器を予め接続しておく場合は、バッグ付チューブ、シリンジとなる。リンス液を入れた容器を後から接続する場合、シリンジを用いる場合はシリンジが接続可能である穿刺可能なセプタム付チューブ、ルアーアダプター（メス）付チューブがあげられる。バッグを用いる場合はバッグと接続可能な回路、即ち、スパイク付チューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チューブ、或いはＳＣＤ接続を行うのであれば単なるチューブというように適宜選択する。また、シリンジの場合チューブを介さず細胞捕捉手段の出口に直接接続してもよい。
リンス回路の、細胞捕捉手段への接続位置としては、入口側、出口側のいずれも可能であるが、入口側が操作の簡便さという点でより好ましい。
【０００９】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
▲１▼細胞分離器
容器外寸（縦×横×厚み）４１×４１×１８ｍｍで液体流出口と液体流入口を対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側に平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布１２枚を、出口側に平均繊維径２．３μｍのポリエステル不織布２５枚を充填した。尚、充填密度は０．２ｇ／ｃｍ³、有効濾過面積１２．２５ｃｍ²、有効濾過長１２．４ｍｍであった。
また、このフィルターに血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（ヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートのモル比で９７：３）の１％エタノール溶液を該フィルターの入口側から通液した後、窒素ガスを通して乾燥させた。
▲２▼細胞分離システム
▲１▼で作製した細胞分離器を回路に組み込み図１の細胞分離システムとした。このシステムは、原料細胞バッグと本発明システム本体、細胞捕捉手段の出口から流出する液体を回収するバッグと本発明システム本体との接続をいずれもスパイクで行い、細胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する回路には移植用細胞回収用凍結バッグとＨＬＡタイピング用にコニカルチューブに回収するための先端がスパイクになっているチューブを設け、クランプで流路を切替えるものである。また、細胞捕捉手段に液体を流入する、オスルアー口を有するシリンジを接続する三方活栓を設けたものである。図１において１は有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しない細胞捕捉手段である。２は原料細胞を細胞捕捉手段に注入する回路であり、スパイク６、クランプ７、チューブ８からなる。３は細胞捕捉手段１の出口から流出する液体を排液する回路であり、スパイク９とチューブ１０からなる。４は細胞捕捉手段１の出口側から該細胞捕捉手段に回収液を注入する回路であり、チューブ１０は回路３と共用しており、シリンジを接続する三方活栓１１を有する。５は細胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する回路であり、Ｙ字管１２、クランプ１３、１４、凍結バッグ１５、スパイク１６、チューブ１７、１８からなる。
▲３▼細胞分離操作
図１の細胞分離システムを用いて細胞分離を行った。
予めクランプ７は閉、三方活栓１１はシリンジ接続方向のみ閉、クランプ１３、１４は閉にしておく。
ヒト新鮮臍帯血（抗凝固剤ＣＰＤ）５０ｍｌを入れた血液バッグにスパイク６を刺し、空のバッグにスパイク９を刺す。次いで、クランプ７を開けると、原料細胞液は回路２のチューブ８を通り、細胞捕捉手段に供給され、有核細胞は捕捉され、核を持たない細胞は回路３のチューブ１０を通って空バッグに排液される。原料細胞液を処理し終えた後、クランプ７を閉じ、原料細胞液の入ったバッグからスパイク６を抜き、市販の生理食塩水ボトルに刺す。クランプ７を開けると、生理食塩水は細胞捕捉手段１をリンスし、回路３を通じて核を持たない細胞が入っているバッグに排液される。リンス終了後クランプ７を閉じる。次に、三方活栓１１に市販のデキストラン４０生理食塩水溶液（ヒト血清アルブミンを４％含む）２５ｍｌを入れたシリンジを接続し、三方活栓１１をシリンジと細胞捕捉手段１のみが連通する方向に回し、クランプ１３を開く。シリンジを押して凍結バッグ１５に細胞を回収した。次に三方活栓１１からシリンジをはずし、生理食塩水２５ｍｌの入った別のシリンジを接続する。クランプ１３を閉じ、クランプ１４を開け、スパイク１６の下にコニカルチューブを置き、シリンジを押して細胞をコニカルチューブに回収した。
▲４▼分析
有核細胞数、、赤血球数、血小板数は自動血球計算機にて測定、有核細胞中のＣＤ３４陽性率はＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体を用い、ＳＳＣ−ＦＩＴＣに展開するフローサイトメトリー法（宮崎、他：日常診療と血液、第５巻２号、２１〜２４ページ、１９９５年）を用いて測定した。
なお、回収率、除去率の算出方法は以下のとおりである。
回収率（％）＝１００×（回収後細胞数／原料血液中の細胞数）
除去率（％）＝１００−１００×（回収後細胞数／原料血液中の細胞数）
▲５▼結果
結果のまとめを表１に示す。第１回有核細胞成分で得られた細胞液には有核細胞、ＣＤ３４陽性細胞が高率に回収できており、赤血球、血小板が高率に除去されている。第２回有核細胞成分で得られた細胞液中にもＨＬＡタイピングには充分の有核細胞が回収できていることがわかる。

【００１０】
【実施例２】
（１）細胞分離器
実施例１と同様の細胞分離器を用いた。
（２）細胞分離システム
（１）の細胞分離器を回路に組み込み図２の細胞分離システムとした。このシステムは、原料細胞バッグと本発明システム本体、細胞捕捉手段の出口から流出する液体を回収するバッグと本発明システム本体との接続をいずれもスパイクで行い、細胞捕捉手段の出口側から液体を注入する回路に分岐を設け、その先端にはオスルアー口を有するシリンジを接続する三方活栓を設けたものである。また、細胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する回路には移植用細胞回収用凍結バッグとＨＬＡタイピング用にコニカルチューブに回収するための先端がスパイクになっているチューブを設け、クランプで流路を切替えるものである。図２において１は有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しない細胞捕捉手段である。２は原料細胞を細胞捕捉手段に注入する回路であり、スパイク６、クランプ７、チューブ８からなる。３は細胞捕捉手段１の出口から流出する液体を排液する回路であり、スパイク９とチューブ１０からなる。４は細胞捕捉手段１の出口側から該細胞捕捉手段に回収液を注入する回路であり、チューブ１０は回路３と共用しており、三方活栓１１、チューブ１９、三方活栓２０からなる。５は細胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する回路であり、Ｙ字管１２、クランプ１３、１４、凍結バッグ１５、スパイク１６、チューブ１７、１８からなる。
（３）細胞分離操作
図２の細胞分離システムを用いて細胞分離を行った。
予めクランプ７は閉、三方活栓１１はチューブ１９方向のみ閉、クランプ１３、１４は閉にしておく。
ヒト新鮮臍帯血（抗凝固剤ＣＰＤ）５０ｍｌを入れた血液バッグにスパイク６を刺し、空のバッグにスパイク９を刺す。次いで、クランプ７を開けると、原料細胞液は回路２のチューブ８を通り、細胞捕捉手段に供給され、有核細胞は捕捉され、核を持たない細胞は回路３のチューブ１０を通って空バッグに排液される。原料細胞液を処理し終えた後、クランプ７を閉じ、原料細胞液の入ったバッグからスパイク６を抜き、市販の生理食塩水ボトルに刺す。クランプ７を開けると、生理食塩水は細胞捕捉手段１をリンスし、回路３を通じて核を持たない細胞が入っているバッグに排液される。リンス終了後クランプ７を閉じる。次に、三方活栓２０に市販のデキストラン４０生理食塩水溶液（ヒト血清アルブミンを４％含む）２５ｍｌを入れたシリンジと注射用蒸留水５ｍｌを入れたシリンジを接続し、三方活栓１１をチューブ１９と細胞捕捉手段１のみが連通する方向に、三方活栓２０をデキストラン４０生理食塩水溶液の入ったシリンジとチューブ１９のみが連通する方向に回す。クランプ１３を開き、シリンジを押して凍結バッグ１５に細胞を回収した。次に三方活栓２０を注射用蒸留水の入ったシリンジとチューブ１９のみが連通する方向に回し、クランプ１３を閉じ、クランプ１４を開け、スパイク１８の下にコニカルチューブを置き、シリンジを押して注射用蒸留水を細胞捕捉手段１に導入し、捕捉されている細胞を破壊し、その中の粗ＤＮＡをコニカルチューブに回収した。回収した粗ＤＮＡを常法であるプロテナーゼＫによる除タンパクとフェノール・クロロホルム法により精製した。
（４）分析
細胞の回収率、除去率は実施例１と同様の方法で分析した。また、精製後のＤＮＡ量を分光光度計により２６０ｎｍの吸光度を測定する常法（中山、他：細胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」（１）分子生物学実験の基礎、１９９５年）で測定した。
（５）結果
結果のまとめを表２に示す。第１回有核細胞成分で得られた細胞液には有核細胞、ＣＤ３４陽性細胞が高率に回収できており、赤血球、血小板が高率に除去されている。また、第２回有核細胞成分を精製して得られたＤＮＡはＨＬＡタイピングに充分な量である約１０μｇが得られていることが分かる。
表２

【００１１】
【発明の効果】
以上示したように、本発明によれば安価で且つ簡便・短時間操作で、移植に必須のＨＬＡタイピング用検体と、移植用有核細胞を同時に得ることが可能となるので、臨床現場での省力化に貢献するところ大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で用いた細胞分離システムの模式図である。
【図２】実施例２で用いた細胞分離システムの模式図である。
【符号の説明】
１細胞分離器（細胞捕捉手段）
２回路
３回路
４回路
５回路
６スパイク
７クランプ
８チューブ
９スパイク
１０チューブ
１１三方活栓
１２Ｙ字管
１３クランプ
１４クランプ
１５凍結バッグ
１６スパイク
１７チューブ
１８チューブ
１９チューブ
２０三方活栓

Claims

有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しない手段に有核細胞含有液を導入して有核細胞は捕捉させ、核を持たない細胞は流出させた後、該手段に回収液を導入して該手段に捕捉されている有核細胞を回収する細胞分離方法において、前記有核細胞含有液がヒト臍帯血であり、少なくとも生理的溶液と捕捉した細胞を溶解または破壊し得る溶液を含む複数の種類からなる回収液を複数回導入し、複数のＣＤ３４陽性細胞成分として細胞と細胞構成成分を同時に採取することを特徴とする細胞分離方法。