JPH1156352A

JPH1156352A - 細胞分離方法および細胞分離システム

Info

Publication number: JPH1156352A
Application number: JP9233265A
Authority: JP
Inventors: Masaya Sumida; 政哉澄田; Shuji Terajima; 修司寺嶋
Original assignee: Asahi Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1997-08-15
Publication date: 1999-03-02
Anticipated expiration: 2017-08-15
Also published as: JP3945725B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】安価且つ簡便・短時間操作で移植に必須のＨ
ＬＡタイピング用検体と移植用有核細胞が同時に得られ
る細胞分離方法及び細胞分離システムの提供。【解決手段】有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は
実質的に捕捉しない手段に有核細胞含有液を導入して有
核細胞は捕捉させ、核を持たない細胞は流出させた後、
該手段に回収液を導入して該手段に捕捉されている有核
細胞を回収する細胞分離方法において、複数回の回収液
導入を行い、複数の有核細胞成分を採取することを特徴
とする細胞分離方法及び細胞分離システム。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、例えば造血幹細胞
及び／または造血前駆細胞（以下、「造血幹細胞」と略
す）やリンパ球などの有核細胞を含有する液体から有核
細胞を分離する方法及び分離システムに関する。更に詳
しくはヒトに移植する細胞等、検体分取が必要な細胞の
分離方法及び分離システムに関する。

【０００２】

【従来の技術】臍帯血幹細胞は、ドナー侵襲皆無の造血
幹細胞移植ソースとして注目を集めており、欧米諸国を
中心にさかんに臨床応用が試みられている。臍帯血幹細
胞は、他の造血幹細胞移植、即ち、骨髄移植或いは末梢
血幹細胞移植のようにドナーから採取されてすぐ患者に
移植されることはまれであるので、採取時から使用時ま
で保存しておくことが必要である（特に非血縁者間移植
の場合）。特公平８−６９号公報には臍帯血を凍結保存
後、解凍して移植に用いることが開示されている。とこ
ろで、臍帯血は凍結保存に際し、解凍後の破壊赤血球に
よる副作用防止及び凍結保存時の体積を小さくする目的
で、有核細胞を分離（赤血球を除去）すべきとされてお
り現在はほとんどが分離保存が通常となっている（南江
堂、「末梢血幹細胞移植」、１７３ページ）。事実、特
公平８−６９号公報でもフィコールハイパキュー（比重
液による遠心分離）で分離すること（以下フィコール法
と略す）及びそのプロトコールの詳細が開示されてい
る。更に、その後の凍害保護剤を添加して凍結保存する
方法の詳細も開示されている。しかしながら、フィコー
ル法は非常に煩雑で長時間を要する操作であるという問
題がある。ＷＯ９６／１７５１４公報にはヒドロキシエ
チルスターチを用いて赤血球を沈降分離し、有核細胞濃
厚液を得るためのバッグシステム、方法が開示されてい
る。本法はシステム化されているものの、遠心分離が２
回必要であるため、やはり長時間作業となる。ところ
で、造血幹細胞移植は白血球の血液型であるＨＬＡ（ヒ
ト白血球抗原）の型を移植患者とドナーの間で合わせる
ことが成功率を高めるカギとされている。どうしてもＨ
ＬＡの一致したドナーが見つからない場合は、ＨＬＡ不
適合移植も行われてはいるが、生着不全や、重篤な合併
症である移植片対宿主病の起こる確率はＨＬＡ一致移植
と比べ、はるかに高率となる。いずれにせよ、予め、ド
ナーと患者のＨＬＡタイピングは造血幹細胞移植におい
ては必須である。ＨＬＡタイピングは、有核細胞から分
離されるＤＮＡにより行われる。臍帯血以外の造血幹細
胞移植、即ち骨髄移植や末梢血幹細胞移植は移植用の骨
髄や末梢血幹細胞採取に先立って、タイピング用血液を
ドナーの末梢血管から採取し、ＨＬＡタイピングが行わ
れる。ところが、臍帯血の場合、ＨＬＡは母親ではなく
新生児のものなので、事前に（出産前の胎児から）ＨＬ
Ａタイピング用検体を採取することは不可能である。ま
た、出産後の新生児から採取することも、倫理面・安全
面で問題がある。そこで、臍帯血のＨＬＡタイピング用
検体分取は採取された臍帯血から、以下の方法で行われ
ている。即ち、１）有核細胞分離を行う前の全血から少
量分取し、フィコール法により有核細胞を分離後、ＤＮ
Ａを抽出する（残りの全血は有核細胞分離に供され
る）、２）ヒドロキシエチルスターチを用いる有核細胞
分離後の、本来廃棄すべき赤血球層に混入する有核細胞
を、フィコール法または塩化アンモニウムなどを用いる
溶血法により分離回収しＤＮＡを抽出する、というもの
であるが、いずれも大変、手間と時間のかかる方法であ
った。尚、有核細胞分離後の細胞集団からＨＬＡタイピ
ング用検体が分取されないのは、臍帯血から得られる細
胞数は少ないため、有核細胞分離後の細胞は全て移植に
使うことが望ましいためである。ところで、フィコール
法や赤血球凝集除去に代わる有核細胞分離方法も散見さ
れるようになった。特開平８−１０４６４３号公報では
赤血球は通過するフィルターに造血幹細胞を捕捉させた
後、最初の通液方法とは逆方向の液流を惹起させて回収
する方法が開示されている。しかしながら、回収操作を
複数回行うことやＨＬＡタイピングに関しては一切記述
されていない。一方、特開平８−２８０３８４号公報に
は有核細胞を吸着するが核を持たない細胞は吸着しない
性質を有する物質を用いて、有核細胞を含む試料から有
核細胞を吸着した後、有核細胞中の核酸または蛋白質を
回収することが開示されている。しかしながら、同公報
の技術課題は臨床検査用の検体採取であり、移植用細胞
の調製の記述は一切無い。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、安価
で且つ簡便・短時間操作で、移植に必須のＨＬＡタイピ
ング用検体と、移植用有核細胞が同時に得られる細胞分
離方法及び細胞分離システムを提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意検討した結果、細胞をフィルターに捕捉
させ、回収液をフィルターに導入し細胞を回収した場
合、わずかではあるがフィルター内に捕捉されたまま回
収されない細胞があることに着目し、更にもう一度回収
液を導入することで、少量ではあるがＨＬＡタイピング
には十分な量の細胞が回収できることを見出した。更
に、ＨＬＡタイピング用細胞は移植用細胞と異なり細胞
機能・形状を維持している必要が無いばかりでなく、細
胞が溶解または破壊され、ＤＮＡで回収された方がより
好ましいことから、生理的溶液であることが必要な移植
用細胞回収液とは別の、細胞を溶解または破壊する性質
を有する回収液を採用することで、移植用細胞とＤＮＡ
が同時に採取できることを見出し、本発明を完成させた
ものである。即ち、本発明は有核細胞は捕捉し、核を持
たない細胞は実質的に捕捉しない手段に有核細胞含有液
を導入して有核細胞は捕捉させ、核を持たない細胞は流
出させた後、該手段に回収液を導入して該手段に捕捉さ
れている有核細胞を回収する細胞分離方法において、複
数回の回収液導入を行い、複数の有核細胞成分を採取す
ることを特徴とする細胞分離方法であり、更には前記方
法において複数の有核細胞成分の用途がそれぞれ異なる
細胞分離方法であり、更に、複数回の回収液導入に用い
る回収液が複数の種類からなり、該複数の回収液は少な
くとも１）生理的溶液と、２）捕捉した細胞を溶解また
は破壊し得る溶液である細胞分離方法である。また、本
発明は有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実施的に
捕捉しない細胞捕捉手段１と、該細胞捕捉手段の入口以
前に接続される、原料細胞液を前記細胞捕捉手段に注入
する回路２と、前記細胞捕捉手段の出口以降に接続され
る、前記細胞捕捉手段の出口から流出する液体を排液す
る回路３と、前記細胞捕捉手段の出口以降に接続され
る、前記細胞捕捉手段に回収液を注入する回路４と、前
記細胞捕捉手段の入口以前に接続される、前記細胞捕捉
手段の入口側から細胞を回収する回路５からなり、回路
５内には流路切替え手段と複数の分岐を有することを特
徴とする細胞分離システムであり、更に細胞捕捉手段に
回収液を注入する回路４内に複数の分岐を有する細胞分
離システムである。

【０００５】以下本発明を詳細に説明する。本発明で言
う有核細胞とは例えば、白血球のように核を持つ細胞の
ことであり、リンパ球、顆粒球、単球、造血幹細胞など
があげられる。本発明で言う核を持たない細胞とは赤血
球、血小板などがあげられる。また、本発明で言う有核
細胞含有液とは前記有核細胞を含有する液体のことであ
り、例えば末梢血、リンパ液、骨髄液、臍帯血、或いは
これらに何らかの処理を施した液体等があげられる。こ
こで、本発明は前述したように臍帯血を用いた場合に特
にその有用性が発揮されるが、用途は臍帯血に限定され
るものではない。本発明で言う有核細胞成分とは、有核
細胞そのもの、または有核細胞を構成しているタンパク
質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）などの成分を言う。本発明
における有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的
に捕捉しない手段とは、例えば有核細胞は捕捉し、核を
持たない細胞は実質的に捕捉しない材料を充填した容器
があげられる。有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は
実質的に捕捉しない材料とは通常の有核細胞捕捉材であ
ればいかなる材料も使用できるが、成型性、滅菌性や細
胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポ
リエチレン、ポリプリロピレン、ポリスチレン、アクリ
ル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、
ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、ア
ガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キト
サン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパ
タイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ス
テンレス、チタン、アルミニウム等の金属があげられ
る。また、これらの捕捉材はこのままでも用いることが
できるが、血小板通過性を高める、或いは細胞の選択的
捕捉を行う等の必要に応じ、表面改質を施したものでも
よい。例えば、血小板通過性を高めるにはＷＯ８７／０
５８１２公報で提案されている非イオン性親水基と塩基
性含窒素官能基を有するポリマーのコートによる方法等
があげられ、細胞の選択的捕捉を行う場合、アミノ酸、
ペプチド、糖類、糖タンパク（抗体、接着分子等のバイ
オリガンドを含む）といった、特定の細胞に親和性のあ
るリガンドを、例えば特開平２−２６１８３３号公報で
提案されているハロアセトアミド法により固定する方法
等があげられる。また、捕捉材の形状としては粒状、繊
維塊、織布、不織布、スポンジ状多孔質体、平板等があ
げられるが、体積あたりの表面積が大きいという点で粒
状、繊維塊、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ま
しい。有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に
捕捉しない材料も充填する容器は、成型性、滅菌性や細
胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポ
リエチレン、ポリプリロピレン、ポリスチレン、アクリ
ル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、
ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の合
成高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミ
ナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アル
ミニウム等の金属があげられる。

【０００６】本発明における、前記細胞捕捉手段に導入
して捕捉した細胞を回収する回収液は生理的溶液であれ
ばいかなるものも使用可能であるが、いくつか例示する
と、生理食塩水、Ｄ−ＰＢＳやＨＢＳＳなどの緩衝液、
ＲＰＭＩ１６４０などの培地があげられる。これらの生
理的溶液に、細胞保護、栄養補給、凍結保存時の凍害保
護等の目的で必要に応じ、デキストラン、ヒドロキシエ
チルデンプン、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、グ
ルコース、サッカロース、トレハロース等を添加しても
良い。本発明においては、細胞捕捉手段に複数回の回収
液導入を行うが、通常、第１回目に回収される有核細胞
成分が最も細胞数が多いので、これを移植用に用い、第
２回目以降に回収される有核細胞成分を別用途に用いる
ことが好ましい。別用途としては、前述したＨＬＡタイ
ピングの他に、幹細胞増幅方法の研究用、遺伝子診断用
などがあげられる。例えばＨＬＡタイピング用としては
有核細胞で１×１０⁶あれば充分である。ところで、第
２回目以降に回収される有核細胞成分をＨＬＡタイピン
グに用いる場合、細胞そのものを回収する必要はなく、
むしろＤＮＡとして回収した方が手間が省けて好ましい
ので、回収液としては細胞を溶解または破壊させる液体
を用いることが好ましい。例としてドデシル硫酸ナトリ
ウム、ラウリル硫酸ナトリウム、トリトンＸ−１００な
どの界面活性剤、蒸留水、イオン交換水などの低張液が
あげられる。これらにより回収されたＤＮＡは公知のフ
ェノール・クロロホルム法などにより精製し、ＨＬＡタ
イピングに供する。本発明で言う有核細胞含有液を、有
核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しな
い手段に導入する方法としては、前記手段にチューブを
介して有核細胞含有液を入れたバッグ或いはボトルを接
続して落差、ローラーポンプ、バッグを押しつぶし液流
を惹起させる、などにより導入するか、有核細胞含有液
を入れたシリンジを接続し、手押しまたはシリンジポン
プなどで送液して導入すればよい。有核細胞を該手段に
導入すると、有核細胞は該手段内に捕捉され、核を持た
ない細胞は該手段から流出するが、若干容器内にも残存
する場合があるので、残存した核を持たない細胞を洗浄
除去する目的で前記手段に洗浄液を導入して洗浄するこ
とが好ましい。洗浄液としては生理的溶液であればいか
なるものも使用可能であるが、いくつか例示すると、生
理食塩水、ダルベッコリン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）やハ
ンクス液（ＨＢＳＳ）等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等
の培地があげられる。これらの生理的溶液に、細胞保
護、栄養補給等の目的で必要に応じ、デキストラン、ヒ
ドロキシエチルデンプン、アルブミン、グロブリン、グ
ルコース、サッカロース、トレハロース等を添加しても
良い。洗浄液の送液方向は有核細胞含有液を導入した方
向と同一方向が好ましい。逆方向ではこの洗浄操作によ
り、有核細胞が漏出してしまうおそれがある。本発明に
おける、前記捕捉手段に回収液を導入する方法として
は、該手段にチューブを介して回収液を入れたバッグ或
いはボトルを接続して落差、ローラーポンプ、バッグ押
しつぶしなどで送液するか、回収液を入れたシリンジを
接続し、手押しまたはシリンジポンプなどで送液すれば
よい。この際、回収液の送液方向としては、有核細胞含
有液を導入した方向と同一方向、その逆方向の２通りが
あるが、一般に細胞回収率は後者の方が高いので好まし
い。回収液の流速は早い方が回収率が高くなるので好ま
しい。次に本発明の細胞分離システムについて説明す
る。本発明で言う細胞捕捉手段の入口以前に接続され
る、原料細胞液を前記細胞捕捉手段に注入する回路２
は、原料細胞液が貯留されている容器等に接続し得るも
の、または原料細胞液の存在する組織に接続され得るも
のである。前者の具体例をあげると、例えば原料細胞液
を貯留している容器がバッグであれば、スパイク付チュ
ーブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チューブ、或
いは無菌接続器による接続（以下「ＳＣＤ接続」と言
う）を行うのであれば単なるチューブ、といったように
適宜選択する。原料細胞液を貯留している容器が針付シ
リンジであれば穿刺可能なセプタム付チューブ、針無し
でルアー口の場合はルアーアダプター（メス）というよ
うに適宜選択する。後者の具体例をあげると、例えば臍
帯血を対象とした場合、当該組織は胎盤及び／または臍
帯であり、これらに穿刺可能な金属針付チューブがあげ
られる。チューブの場合には途中に流量調整の為のロー
ラークランプ、凝集塊除去の為のメッシュチャンバー等
を有してもよい。また、シリンジの場合、チューブを介
さず細胞捕捉手段の入口に直接接続してもよい。本発明
でいう細胞捕捉手段の出口以降に接続される、前記細胞
捕捉手段から流出する液体を排液する回路３は、排液さ
れる液体をいかなる手段で収集（または廃棄）するかに
より、以下のように分けられる。即ち、バッグに収集す
る場合は、予めバッグを接続しておくか、バッグと接続
可能な回路、即ち、スパイク付チューブ、ルアーアダプ
ター（オス、メス）付チューブ、或いはＳＣＤ接続を行
うのであれば単なるチューブというように適宜選択す
る。また、コニカルチューブに収集する場合や廃液ビン
に廃棄、廃液チューブに廃棄する場合は先端が開放され
ていればよく、ルアー口のシリンジで収集する場合はル
アーアダプター（メス）を用いる。また、シリンジの場
合、チューブを介さず細胞捕捉手段の出口に直接接続し
てもよい。

【０００７】本発明でいう前記細胞捕捉手段の出口以降
に接続される、前記細胞捕捉手段に回収液を注入する回
路４は、細胞捕捉手段に注入する回収液を入れた容器を
予め接続しておくか、後から接続可能とするか、また回
収液の注入手段により以下のように分けられる。即ち、
細胞捕捉手段に注入する回収液を入れた容器を予め接続
しておく場合は、バッグ付チューブ、シリンジとなる。
バッグの場合、細胞捕捉手段に回収液を注入する方法と
しては、落差による方法、バッグを押しつぶす方法、ロ
ーラーポンプを用いる方法があげられる。細胞捕捉手段
に注入する回収液を入れた容器を後から接続する場合、
シリンジを用いる場合はシリンジが接続可能である穿刺
可能なセプタム付チューブ、ルアーアダプター（メス）
付チューブ、三方活栓付チューブなどがあげられる。バ
ッグを用いる場合はバッグと接続可能な回路、即ち、ス
パイク付チューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付
チューブ、或いはＳＣＤ接続を行うのであれば単なるチ
ューブというように適宜選択する。また、シリンジの場
合、チューブを介さず細胞捕捉手段の出口に直接接続し
てもよい。また、回路４内には回収操作を複数回行う際
に、それぞれ別々の回収液を用いる場合の為に複数の分
岐を設けることが好ましい。具体的には三方活栓、四方
活栓を用いる方法、クランプを用いる方法、シリンジ接
続可能な三つ又分岐管を用いる方法（要時にシリンジを
接続）がある。また、前述の、シリジンを直接、チュー
ブを介さずに細胞捕捉手段の出口に接続した場合は、回
収液毎にシリンジを交換することで対応すればよい。本
発明でいう前記細胞捕捉手段の入口以前に接続される、
前記細胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する回路５
は、細胞捕捉手段から流出した細胞をいかなる容器で回
収するかにより、以下のように分けられる。即ち、バッ
グに回収する場合は、予めバッグを接続しておくか、バ
ッグと接続可能な回路、即ち、スパイク付チューブ、ル
アーアダプター（オス、メス）付チューブ、或いはＳＣ
Ｄ接続を行うのであれば単なるチューブというように適
宜選択する。また、コニカルチューブに収集する場合は
先端が開放されていればよく、ルアー口のシリンジで回
収する場合にはルアーアダプター（メス）、三方活栓な
どを用いる。また、シリンジの場合、チューブを介さず
細胞捕捉手段の入口に直接接続してもよい。ここで、細
胞を該細胞捕捉手段から流出させる回収液が、その後の
細胞保存に用いられるものである場合は、細胞を回収す
る容器も細胞保存用のものであることが最も好ましい。
凍結保存容器の例をあげると、「クリオサイト」（バク
スター社製）、「セルフリーズバッグ」（チャーターメ
ド社製）等の凍結バッグがあげられる。また、回路５内
には流路切替え手段と複数の分岐を有する。これは回収
操作を複数回行い、それぞれの有核細胞成分を別々に回
収するためのものであるが、具体的には三方活栓、四方
活栓を用いる方法、クランプを用いる方法がある。ま
た、前述の、シリジンを直接、チューブを介さずに細胞
捕捉手段の入口に接続した場合は、回収液毎にシリンジ
を交換することで対応すればよい。

【０００８】本発明による細胞分離システムは、細胞捕
捉手段に捕捉された細胞を該細胞捕捉手段から回収する
前に、該細胞捕捉手段に残存する核を持たない細胞を洗
浄するためのリンス回路（図示しない）を設けることが
より好ましい。リンス回路はリンス液を入れた容器を予
め接続しておくか、後から接続可能とするか、また液体
の注入手段により以下のように分けられる。即ち、リン
ス液を入れた容器を予め接続しておく場合は、バッグ付
チューブ、シリンジとなる。リンス液を入れた容器を後
から接続する場合、シリンジを用いる場合はシリンジが
接続可能である穿刺可能なセプタム付チューブ、ルアー
アダプター（メス）付チューブがあげられる。バッグを
用いる場合はバッグと接続可能な回路、即ち、スパイク
付チューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付チュー
ブ、或いはＳＣＤ接続を行うのであれば単なるチューブ
というように適宜選択する。また、シリンジの場合チュ
ーブを介さず細胞捕捉手段の出口に直接接続してもよ
い。リンス回路の、細胞捕捉手段への接続位置として
は、入口側、出口側のいずれも可能であるが、入口側が
操作の簡便さという点でより好ましい。

【０００９】

【実施例】以下に実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。

【実施例１】細胞分離器容器外寸（縦×横×厚み）４１×４１×１８ｍｍで液体
流出口と液体流入口を対角線上にもつポリカーボネート
製容器の入口側に平均繊維径１２μｍのポリエステル不
織布１２枚を、出口側に平均繊維径２．３μｍのポリエ
ステル不織布２５枚を充填した。尚、充填密度は０．２
ｇ／ｃｍ³、有効濾過面積１２．２５ｃｍ²、有効濾過長
１２．４ｍｍであった。また、このフィルターに血小板
通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティン
グを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・
ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（ヒドロ
キシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタ
クリレートのモル比で９７：３）の１％エタノール溶液
を該フィルターの入口側から通液した後、窒素ガスを通
して乾燥させた。細胞分離システムで作製した細胞分離器を回路に組み込み図１の細胞分
離システムとした。このシステムは、原料細胞バッグと
本発明システム本体、細胞捕捉手段の出口から流出する
液体を回収するバッグと本発明システム本体との接続を
いずれもスパイクで行い、細胞捕捉手段の入口側から細
胞を回収する回路には移植用細胞回収用凍結バッグとＨ
ＬＡタイピング用にコニカルチューブに回収するための
先端がスパイクになっているチューブを設け、クランプ
で流路を切替えるものである。また、細胞捕捉手段に液
体を流入する、オスルアー口を有するシリンジを接続す
る三方活栓を設けたものである。図１において１は有核
細胞は捕捉し、核を持たない細胞は実質的に捕捉しない
細胞捕捉手段である。２は原料細胞を細胞捕捉手段に注
入する回路であり、スパイク６、クランプ７、チューブ
８からなる。３は細胞捕捉手段１の出口から流出する液
体を排液する回路であり、スパイク９とチューブ１０か
らなる。４は細胞捕捉手段１の出口側から該細胞捕捉手
段に回収液を注入する回路であり、チューブ１０は回路
３と共用しており、シリンジを接続する三方活栓１１を
有する。５は細胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する
回路であり、Ｙ字管１２、クランプ１３、１４、凍結バ
ッグ１５、スパイク１６、チューブ１７、１８からな
る。細胞分離操作図１の細胞分離システムを用いて細胞分離を行った。予
めクランプ７は閉、三方活栓１１はシリンジ接続方向の
み閉、クランプ１３、１４は閉にしておく。ヒト新鮮臍
帯血（抗凝固剤ＣＰＤ）５０ｍｌを入れた血液バッグに
スパイク６を刺し、空のバッグにスパイク９を刺す。次
いで、クランプ７を開けると、原料細胞液は回路２のチ
ューブ８を通り、細胞捕捉手段に供給され、有核細胞は
捕捉され、核を持たない細胞は回路３のチューブ１０を
通って空バッグに排液される。原料細胞液を処理し終え
た後、クランプ７を閉じ、原料細胞液の入ったバッグか
らスパイク６を抜き、市販の生理食塩水ボトルに刺す。
クランプ７を開けると、生理食塩水は細胞捕捉手段１を
リンスし、回路３を通じて核を持たない細胞が入ってい
るバッグに排液される。リンス終了後クランプ７を閉じ
る。次に、三方活栓１１に市販のデキストラン４０生理
食塩水溶液（ヒト血清アルブミンを４％含む）２５ｍｌ
を入れたシリンジを接続し、三方活栓１１をシリンジと
細胞捕捉手段１のみが連通する方向に回し、クランプ１
３を開く。シリンジを押して凍結バッグ１５に細胞を回
収した。次に三方活栓１１からシリンジをはずし、生理
食塩水２５ｍｌの入った別のシリンジを接続する。クラ
ンプ１３を閉じ、クランプ１４を開け、スパイク１６の
下にコニカルチューブを置き、シリンジを押して細胞を
コニカルチューブに回収した。分析有核細胞数、、赤血球数、血小板数は自動血球計算機に
て測定、有核細胞中のＣＤ３４陽性率はＦＩＴＣ標識抗
ＣＤ３４抗体を用い、ＳＳＣ−ＦＩＴＣに展開するフロ
ーサイトメトリー法（宮崎、他：日常診療と血液、第５
巻２号、２１〜２４ページ、１９９５年）を用いて測定
した。なお、回収率、除去率の算出方法は以下のとおり
である。回収率（％）＝１００×（回収後細胞数／原料血液中の
細胞数）除去率（％）＝１００−１００×（回収後細胞数／原料
血液中の細胞数）結果結果のまとめを表１に示す。第１回有核細胞成分で得ら
れた細胞液には有核細胞、ＣＤ３４陽性細胞が高率に回
収できており、赤血球、血小板が高率に除去されてい
る。第２回有核細胞成分で得られた細胞液中にもＨＬＡ
タイピングには充分の有核細胞が回収できていることが
わかる。

【００１０】

【実施例２】細胞分離器実施例１と同様の細胞分離器を用いた。細胞分離システムの細胞分離器を回路に組み込み図２の細胞分離システ
ムとした。このシステムは、原料細胞バッグと本発明シ
ステム本体、細胞捕捉手段の出口から流出する液体を回
収するバッグと本発明システム本体との接続をいずれも
スパイクで行い、細胞捕捉手段の出口側から液体を注入
する回路に分岐を設け、その先端にはオスルアー口を有
するシリンジを接続する三方活栓を設けたものである。
また、細胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する回路に
は移植用細胞回収用凍結バッグとＨＬＡタイピング用に
コニカルチューブに回収するための先端がスパイクにな
っているチューブを設け、クランプで流路を切替えるも
のである。図２において１は有核細胞は捕捉し、核を持
たない細胞は実質的に捕捉しない細胞捕捉手段である。
２は原料細胞を細胞捕捉手段に注入する回路であり、ス
パイク６、クランプ７、チューブ８からなる。３は細胞
捕捉手段１の出口から流出する液体を排液する回路であ
り、スパイク９とチューブ１０からなる。４は細胞捕捉
手段１の出口側から該細胞捕捉手段に回収液を注入する
回路であり、チューブ１０は回路３と共用しており、三
方活栓１１、チューブ１９、三方活栓２０からなる。５
は細胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する回路であ
り、Ｙ字管１２、クランプ１３、１４、凍結バッグ１
５、スパイク１６、チューブ１７、１８からなる。細胞分離操作図２の細胞分離システムを用いて細胞分離を行った。予
めクランプ７は閉、三方活栓１１はチューブ１９方向の
み閉、クランプ１３、１４は閉にしておく。ヒト新鮮臍
帯血（抗凝固剤ＣＰＤ）５０ｍｌを入れた血液バッグに
スパイク６を刺し、空のバッグにスパイク９を刺す。次
いで、クランプ７を開けると、原料細胞液は回路２のチ
ューブ８を通り、細胞捕捉手段に供給され、有核細胞は
捕捉され、核を持たない細胞は回路３のチューブ１０を
通って空バッグに排液される。原料細胞液を処理し終え
た後、クランプ７を閉じ、原料細胞液の入ったバッグか
らスパイク６を抜き、市販の生理食塩水ボトルに刺す。
クランプ７を開けると、生理食塩水は細胞捕捉手段１を
リンスし、回路３を通じて核を持たない細胞が入ってい
るバッグに排液される。リンス終了後クランプ７を閉じ
る。次に、三方活栓２０に市販のデキストラン４０生理
食塩水溶液（ヒト血清アルブミンを４％含む）２５ｍｌ
を入れたシリンジと注射用蒸留水５ｍｌを入れたシリン
ジを接続し、三方活栓１１をチューブ１９と細胞捕捉手
段１のみが連通する方向に、三方活栓２０をデキストラ
ン４０生理食塩水溶液の入ったシリンジとチューブ１９
のみが連通する方向に回す。クランプ１３を開き、シリ
ンジを押して凍結バッグ１５に細胞を回収した。次に三
方活栓２０を注射用蒸留水の入ったシリンジとチューブ
１９のみが連通する方向に回し、クランプ１３を閉じ、
クランプ１４を開け、スパイク１８の下にコニカルチュ
ーブを置き、シリンジを押して注射用蒸留水を細胞捕捉
手段１に導入し、捕捉されている細胞を破壊し、その中
の粗ＤＮＡをコニカルチューブに回収した。回収した粗
ＤＮＡを常法であるプロテナーゼＫによる徐タンパクと
フェノール・クロロホルム法により精製した。分析細胞の回収率、除去率は実施例１と同様の方法で分析し
た。また、精製後のＤＮＡ量を分光光度計により２６０
ｎｍの吸光度を測定する常法（中山、他：細胞工学別冊
「バイオ実験イラストレイテッド」分子生物学実験の
基礎、１９９５年）で測定した。結果結果のまとめを表２に示す。第１回有核細胞成分で得ら
れた細胞液には有核細胞、ＣＤ３４陽性細胞が高率に回
収できており、赤血球、血小板が高率に除去されてい
る。また、第２回有核細胞成分を精製して得られたＤＮ
ＡはＨＬＡタイピングに充分な量である約１０μｇが得
られていることが分かる。

【００１１】

【発明の効果】以上示したように、本発明によれば安価
で且つ簡便・短時間操作で、移植に必須のＨＬＡタイピ
ング用検体と、移植用有核細胞を同時に得ることが可能
となるので、臨床現場での省力化に貢献するところ大で
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で用いた細胞分離システムの模式図で
ある。

【図２】実施例２で用いた細胞分離システムの模式図で
ある。

【符号の説明】

１細胞分離器（細胞捕捉手段）２回路３回路４回路５回路６スパイク７クランプ８チューブ９スパイク１０チューブ１１三方活栓１２Ｙ字管１３クランプ１４クランプ１５凍結バッグ１６スパイク１７チューブ１８チューブ１９チューブ２０三方活栓

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は
実質的に捕捉しない手段に有核細胞含有液を導入して有
核細胞は捕捉させ、核を持たない細胞は流出させた後、
該手段に回収液を導入して該手段に捕捉されている有核
細胞を回収する細胞分離方法において、複数回の回収液
導入を行い、複数の有核細胞成分を採取することを特徴
とする細胞分離方法。
【請求項２】複数の有核細胞成分の用途がそれぞれ異
なることを特徴とする請求項１記載の細胞分離方法。
【請求項３】複数回の回収液導入に用いる回収液が複
数の種類からなり、該複数の回収液は少なくとも１）生
理的溶液と、２）捕捉した細胞を溶解または破壊し得る
溶液であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載
の細胞分離方法。
【請求項４】有核細胞は捕捉し、核を持たない細胞は
実質的に捕捉しない細胞捕捉手段１と、該細胞捕捉手段
の入口以前に接続される、原料細胞液を前記細胞捕捉手
段に注入する回路２と、前記細胞捕捉手段の出口以降に
接続される、前記細胞捕捉手段の出口から流出する液体
を排液する回路３と、前記細胞捕捉手段の出口以降に接
続される、前記細胞捕捉手段に回収液を注入する回路４
と、前記細胞捕捉手段の入口以前に接続される、前記細
胞捕捉手段の入口側から細胞を回収する回路５からな
り、回路５内には流路切替え手段と複数の分岐を有する
ことを特徴とする細胞分離システム。
【請求項５】細胞捕捉手段に回収液を注入する回路４
内に複数の分岐を有することを特徴とする請求項４記載
の細胞分離システム。