JP4587959B2 - 細胞濃縮物の調製方法および細胞組成物 - Google Patents
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Description
(1) 有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を、有核細胞を実質的に捕捉し不要細胞は実質的に通過するフィルター材を含んでなるフィルター装置に導入して有核細胞を該フィルター材に捕捉し不要細胞を排出させた後、該フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収する細胞濃縮物の調製方法において、有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離した後、上記フィルター装置に先ず該不要細胞に富む層を導入し、続いて該有核細胞に富む層を導入して有核細胞を該フィルター材に捕捉しながら該フィルター装置内に残存する不要細胞を排出させた後、該フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収することを特徴とする細胞濃縮物の調製方法。
(3) 不要細胞を凝集させた後に不要細胞を重力または遠心力によって沈降させることによって、少なくとも有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離する(1)記載の細胞濃縮物の調製方法。
(5) 前記有核細胞が造血幹細胞である(1)乃至(4)の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
(7) 前記有核細胞に富む層が有核細胞濃厚層と有核細胞希薄層からなり、フィルター装置に有核細胞希薄層、有核細胞濃厚層の順で導入する(1)乃至(6)の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
(8) 前記有核細胞に富む層が有核細胞濃厚層と有核細胞希薄層からなり、フィルター装置に有核細胞濃厚層、有核細胞希薄層の順で導入する(1)乃至(5)の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
(10) 前記フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収した後に、更に回収した有核細胞含有液を遠心分離し、上清を除くことにより有核細胞を濃縮する(1)乃至(9)の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
(14) フィルター材が不織布である(11)乃至(13)の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
(15) 不織布からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が、夫々、
ア)平均繊維径が1.1〜3.0μm、充填密度が0.1〜0.3g/cm3である不織布からなる有核細胞捕捉材、
イ)平均繊維径が0.5〜1.5μm、充填密度が0.1〜0.3g/cm3である不織布からなる回収液整流化材、
であり、有核細胞捕捉材、回収液整流化材の順番に平均繊維径が細くなることを特徴とする(14)記載の細胞濃縮物の調製方法。
(17) スポンジ状構造体からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が、夫々、
ア)充填時の平均孔径が7〜25μm、充填時の空隙率が55〜90%であるスポンジ状構造体からなる有核細胞捕捉材、
イ)充填時の平均孔径が2〜10μm、充填時の空隙率が55〜90%であるスポンジ状構造体からなる回収液整流化材、
であり、有核細胞捕捉材、回収液整流化材の順番に平均孔径が小さくなることを特徴とする(16)記載の細胞濃縮物の調製方法。
(18) フィルター材が不織布とスポンジ状構造体との組み合せである(11)乃至(13)の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
(b)回収された有核細胞を、貯留部に設けた有核細胞導入口を介して、該貯留部と凍結保存部を有する貯留バッグに移行させ貯留する細胞貯留工程、
(c)貯留された有核細胞を、前記貯留バッグ内で、凍結保存部を回転半径上の回転軸から遠い位置に配置させて遠心分離することにより有核細胞を貯留バッグ内の凍結保存部に移動させる細胞濃縮工程、
(d)濃縮された有核細胞を、空気を含まない状態で凍結保存部に密封し溶断分離する容器分離工程、および
(e)有核細胞が密封された凍結保存部を凍結し保存する凍結保存工程;
を順番に行い、且つ前記(b)〜(e)の全工程を密閉系で行う。
(a)有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を、有核細胞を実質的に捕捉し不要細胞は実質的に通過するフィルター材を含んでなるフィルター装置に導入して有核細胞を該フィルター材に捕捉し不要細胞を排出させた後、該フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収する細胞濃縮物の調製工程、
(b)回収された有核細胞を、貯留部に設けた有核細胞導入口を介して、該貯留部と凍結保存部を有する貯留バッグに移行させ貯留する細胞貯留工程、
(c)貯留された有核細胞を、前記貯留バッグ内で、凍結保存部を回転半径上の回転軸から遠い位置に配置させて遠心分離することにより有核細胞を貯留バッグ内の凍結保存部に移動させる細胞濃縮工程、
(d)濃縮された有核細胞を、空気を含まない状態で凍結保存部に密封し溶断分離する容器分離工程、
(e)有核細胞が密封された凍結保存部を凍結し保存する凍結保存工程、
を順番に行い、且つ前記(b)〜(e)の工程を密閉系で行う細胞の凍結保存方法。
(22) 前記有核細胞の貯留部は、狭窄部が前記(d)の容器分離工程において溶断分離部として用いられ、凍結保存部が前記(e)の凍結保存工程において有核細胞の凍結保存用容器として用いられるものである(19)乃至(21)の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
(24) 前記有核細胞の凍結保存部または/および前記有核細胞の貯留部が凍害保護剤導入部を有する(19)乃至(23)の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
(26) 前記有核細胞の貯留部が有核細胞の貯留バッグ内のエア排出用導管を有核細胞の導管とは独立して有する(19)乃至(25)の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
(28) 前記(d)の容器分離工程の後に、前記凍害保護剤導入部から凍害保護剤を添加する(19)乃至(27)の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
(29) (19)乃至(28)の何れかの方法を用いる細胞凍結物の製造方法。
(31) 前記細胞組成物を更に遠心分離し、上清を除くことにより有核細胞を濃縮して得られる(30)記載の細胞組成物。
(32) 前記不要細胞が赤血球である(30)または(31)記載の細胞組成物。
(33) 前記有核細胞が造血幹細胞である(30)または(31)記載の細胞組成物。
(34) (19)乃至(28)の何れかの方法によって調製される細胞凍結物。
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦43mm、横43mm、高さ2.9mm(有効濾過断面積18.5cm2、内容積7cm3)で液体流出口と液体流入口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側から、第1層目に凝集塊捕捉材として平均繊維径12μmのポリエステル不織布0.14gを、第2層目に有核細胞捕捉材として1.7μmのポリエステル不織布1.28gを、第3層目に回収液整流化材として平均繊維径1.1μmのポリエステル不織布0.19gからなるフィルター材を充填した。尚、第1層目、第2層目および第3層目の充填密度はそれぞれ0.20g/cm3、 0.24g/cm3および0.20g/cm3であった。また、該フィルター材に血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体(モル比で97:3)の1%エタノール溶液を該細胞分離フィルター装置の液体流入口から通液し、窒素ガスで余分なポリマー溶液をパージした後、60℃で8時間以上真空乾燥機で乾燥させた。
図1の細胞分離システムを使用した。
事前にクランプ21、22を閉じておいた。200cm3血液バッグに貯留されたCPD加ヒト臍帯血100cm3(ヘマトクリット値27.8%)に、6%ヒドロキシエチルスターチ(菱山製薬「HES40(赤血球沈降剤)」)を20cm3添加して、10分間混和した。次に、血液バッグと血液導管11を接続し、血液バッグを吊り下げ、1時間静置した。血液バッグ内の赤血球が沈降し、上層の白血球層と下層の赤血球層の界面が明確になったことを確認後、クランプ21を開け、落差により濾過を開始した。この時、下層の赤血球層から細胞分離フィルター装置40に流れ、続いて上層の白血球層が流れていき、細胞分離フィルター装置40内に残留する赤血球が洗い流される様子が観察された。濾過された血液はドレインバッグ70に貯留した。血液バッグ内の全ての血液が細胞分離フィルター装置40に導入されたことを確認後、クランプ21、23を閉じた。次に、10%デキストラン生理食塩水溶液(小林製薬「デキストラン40注」)にヒト血清アルブミンを最終濃度3%になるように添加した液体19cm3とエア18cm3をシリンジに充填した。次に、クランプ22を開けて回収液注入口60から、液体、気体の順に手動で通液し、回収バッグ50に単核球を回収した(回収単核球液1)。この場合の回収された細胞液量は23cm3、ヘマトクリット値は3.5%、回収に要した時間は2秒(流速570cm3/分)であった。更にこの後、回収された単核球をコニカルチューブに移し、400G×15分の遠心条件で遠心分離した。最終容積が4cm3になるように上清を除去した後、転倒混和して沈さをほぐした(回収単核球液2)。
本細胞濃縮操作での細胞数のカウントは多項目自動血球分析装置(シスメックス社SF3000)を用いて測定し、回収単核球液1の赤血球容積、単核球回収率1、単核球回収率2を以下の計算式にて算出した。
赤血球容積(cm3)=回収単核球液1のヘマトクリット値×回収単核球液1の液量÷100
単核球回収率1(%)=100×(回収単核球液1の単核球数/臍帯血の単核球数)
単核球回収率2(%)=100×(回収単核球液2の単核球数/臍帯血の単核球数)
本細胞濃縮操作での赤血球容積は0.8cm3、単核球回収率1は85%、単核球回収率2は82%であった。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
実施例1と同じものを使用した。
(2)細胞分離システム
図1の細胞分離システムを使用した。
事前に図1の細胞分離システムのクランプ21、22、23を閉じておいた。CPD加ヒト臍帯血100cm3(ヘマトクリット値31.1%)を貯留した200cm3血液バッグと血液導管11を接続し、血液バッグが垂直に立った状態で遠心カップに固定し、3000Gで12分間、10℃で遠心した。次に遠心カップから血液バッグと細胞分離システムを静かに取り出し、血液バッグを吊り下げた。この時血液バッグ内は、上層の血漿層、中間層のバフィーコート層、下層の赤血球層の三層に層分離していた。界面を乱さないように上層の血漿層から回収液用にシリンジに19cm3採取し、クランプ21と23を開け、落差により濾過した。この時、下層の赤血球層から細胞分離フィルター装置40に流れ、続いて中間層のバフィーコート層、最後に上層の血漿層が流れていき、細胞分離フィルター装置40内に残留する赤血球が洗い流される様子が観察された。濾過された血液はドレインバッグ70に貯留した。血液バッグ内の全ての血液が細胞分離フィルター装置40に導入されたことを確認後、クランプ21、23を閉じた。その後、先にシリンジに採取しておいた血漿にエア18cm3を加え、クランプ22を開けた後、回収液注入口60から液体、気体の順に手動で通液し、回収バッグ50に単核球を回収した(回収単核球液1)。この場合の回収された細胞液量は23cm3、ヘマトクリット値0.12%、回収に要した時間は2秒(流速570cm3/分)であった。更にこの後、回収された単核球をコニカルチューブに移し、400G×15分の遠心条件で遠心分離した。最終容積が4cm3になるように上清を除去した後、転倒混和して沈さを解した(回収単核球液2)。
本細胞濃縮操作での赤血球容積は0.5cm3、単核球回収率1は87%、単核球回収率2は84%であった。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
実施例1と同じものを使用した。
(2)細胞分離システム
図1の細胞分離システムを使用した。
100cm3の臍帯血(ヘマトクリット値28.2%)を層分離せずにそのまま細胞分離フィルター装置40に導入し、それ以降は実施例1と同様の操作を行った。回収された細胞液量は23cm3で、ヘマトクリット値は9.1%、回収に要した時間は2秒(流速570cm/分)であった。
本細胞濃縮操作での赤血球容積は2.1cm3、単核球回収率1は85%、単核球回収率2は60%であった。
200cm3血液バッグに貯留されたCPD加ヒト臍帯血100cm3(ヘマトクリット値29.6%)に、6%ヒドロキシエチルスターチ(菱山製薬「HES40(赤血球沈降剤)」)を20cm3添加して、10分間混和した。この血液バッグを垂直に立つように遠心カップに固定して、50G×5分、10℃で遠心した。次に、分離スタンドで血液バッグを押さえてできるだけ赤血球層を吸い上げないように上層の白血球層60cm3を採取し(単核球回収液1)、コニカルチューブに移し変えた。単核球回収率1のヘマトクリット値は2.5%であった。更に、400G×10分、10℃で遠心後、沈さ4mlを残して上清を除去し、転倒混和して沈さを解した(単核球回収液2)。本細胞濃縮操作での赤血球容積は1.5cm3、単核球回収率1は66%、単核球回収率2は58%であった。
200cm3血液バッグに貯留されたCPD加ヒト臍帯血100cm3(ヘマトクリット値33.3%)に、6%ヒドロキシエチルスターチ(菱山製薬「HES40(赤血球沈降剤)」)を20cm3添加して、10分間混和した。この血液バッグを垂直に立つように遠心カップに固定して、50G×5分、10℃で遠心した。次に、分離スタンドで血液バッグを押さえて下層の赤血球層を含め上層の白血球層65cm3を採取し(単核球回収液1)、コニカルチューブに移し変えた。単核球回収率1のヘマトクリット値は10%であった。更に、400G×10分、10℃で遠心後、沈さ4mlを残して上清を除去した(単核球回収液2)。本細胞濃縮操作での赤血球容積は6.5cm3、単核球回収率1は85%、単核球回収率2は32%であった。
上部と下部にそれぞれ抜き取り用の導管を有する200cm3血液バッグにCPD加ヒト臍帯血100cm3(ヘマトクリット値27.3%)を貯留し、垂直に立つように遠心カップに固定して、3000G×12分、10℃で遠心した。分離スタンドで血液バッグを押さえつけ、血液バッグの上から上層の血漿層を、血液バッグの下から下層の赤血球層を追い出し、血液バッグ内にバフィーコート層を含め30cm3残るようにした(単核球回収液1)。単核球回収液1のヘマトクリット値は40%であった。次にコニカルチューブに移し変え、400G×10分、10℃で遠心後、沈さ4mlを残して上清を除去した(単核球回収液2)。本細胞濃縮操作での赤血球容積は12.0cm3、単核球回収率1は95%、単核球回収率2は21%であった。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦43mm、横43mm、高さ2.9mm(有効濾過断面積18.5cm2、内容積7cm3)で液体流出口と液体流入口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側から、第1層目に有核細胞捕捉材として平均繊維径1.7μmのポリエステル不織布1.37gを、第2層目に回収液整流化材として平均繊維径1.1μmのポリエステル不織布0.19gからなるフィルター材を、上容器と下容器の周辺で挟み込むように充填して容器入口側空間と出口側空間に分離した。尚、第一層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ2.5mm及び0.24g/cm3、第2層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ0.4mm及び0.20g/cm3であり、有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は74cmであった。また、該フィルター材に血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体(モル比で97:3)の1%エタノール溶液を該細胞分離フィルター装置の液体流入口から通液し、窒素ガスで余分なポリマー溶液をパージした後、60℃で8時間以上真空乾燥機で乾燥させた。
図1の細胞分離システムを使用した。
細胞分離フィルター装置に、CPD加ヒト臍帯血100cm3を細胞含有液の入口から落差により通液して単核球を捕捉した。濾過した血液はドレインボトルに回収した。その後、市販の10%デキストラン生理食塩水溶液(小林製薬「デキストラン40注」)にヒト血清アルブミンを3%になるように添加した液体19cm3とエア18cm3をシリンジに充填し、細胞含有液の出口から手動で通液し、細胞含有液の入口から単核球を回収した。この場合の回収された細胞液量は23cm3、回収に要した時間は2秒(流速570cm3/分)であった。
本細胞分離操作での細胞数のカウントは多項目自動血球分析装置(シスメックス社SF3000)を用いて測定し、単核球回収率を以下の計算式にて算出した。
単核球回収率(%)=100×(回収細胞液中の単核球数/臍帯血中の単核球数)
本細胞分離操作での単核球回収率は85%、濾過時間は6分であった。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦30mm、横30mm、高さ12.4mm(有効濾過断面積9cm2、内容積11cm3)で液体流出口と液体流入口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側から、第1層目に有核細胞捕捉材として平均繊維径2.3μmのポリエステル不織布1.32gを、第2層目に回収液整流化材として平均繊維径1.1μmのポリエステル不織布0.19gからなるフィルター材を、上容器と下容器の周辺で挟み込むように充填して容器入口側空間と出口側空間に分離した。尚、第1層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ5.4mm及び0.20g/cm3、第2層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ7mm及び0.20g/cm3であり、有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は16.7cmであった。また、実施例1と同様に、不織布に親水性ポリマーのコーティングを行った。
図1の細胞分離システムを使用した。
実施例3と同様の細胞分離を行った。回収された細胞液量は21cm3で、回収に要した時間は3秒(流速380cm3/分)であった。
本細胞分離操作での単核球回収率は75%、濾過時間は10分(流速10cm3/分)であった。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
容器は実施例3と同じものを用いた。容器の入口側から、第1層目に凝集塊捕捉材として平均繊維径12μmのポリエステル不織布0.14gを、第2層目に有核細胞捕捉材として1.7μmのポリエステル不織布1.28gを、第3層目に回収液整流化材として平均繊維径1.1μmのポリエステル不織布0.19gからなるフィルター材を充填した。尚、第1層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ0.3mm及び0.20g/cm3、第2層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ2.2mm及び0.24g/cm3、第3層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ0.4mm及び0.20g/cm3であり、有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は84.1cmであった。また、実施例3同様不織布に親水性ポリマーのコーティングを行った。
図1の細胞分離システムを使用した。
実施例3と同様の細胞分離を行った。回収された細胞液量は23cmで、回収に要した時間は2秒(流速570cm3/分)であった。
本細胞分離操作での単核球回収率は88%、濾過時間は4分(流速25cm3/分)であった。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
容器は実施例3と同じものを用いた。容器の入口側から、第1層目に有核細胞捕捉材として充填時の平均孔径12μmのポリウレタン多孔質体を、第2層目に回収液整流化材として充填時の平均孔径6μmのポリウレタン多孔質体からなるフィルター材を充填した。尚、第1層目の充填時厚み及び充填時空隙率はそれぞれ2.2mm及び60%、第2層目の充填時厚み及び充填時空隙率はそれぞれ0.7mm及び60%であった。有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は74であった。また、実施例3同様ポリウレタン多孔質体に親水性ポリマーのコーティングを行った。
図1の細胞分離システムを使用した。
実施例3と同様の細胞分離を行った。回収された細胞液量は23cmで、回収に要した時間は3秒(流速380cm3/分)であった。
本細胞分離操作での単核球回収率は84%、濾過時間は6分(流速16.7cm3/分)であった。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
容器は実施例3と同じものを用いた。フィルター材としては有核細胞捕捉材として1.7μmのポリエステル不織布1.67gを充填した。尚、フィルター材の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ2.9mm及び0.25g/cm3であり、有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は62.1cmであった。また、実施例3同様不織布に親水性ポリマーのコーティングを行った。
図1の細胞分離システムを使用した。
実施例3と同様の細胞分離を行った。回収された細胞液量は23cm3で、回収に要した時間は3秒(流速380cm3/分)であった。
本細胞分離操作での単核球回収率は65%、濾過時間は7分(流速14.3cm3/分)であった。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦22mm、横22mm、高さ12.4mm(有効濾過断面積5.3cm2、内容積7cm3)で液体流出口と液体流入口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側から、第1層目に有核細胞捕捉材として平均繊維径1.7μmのポリエステル不織布1.50gを、第2層目に回収液整流化材として1.1μmのポリエステル不織布0.30gからなるフィルター材を充填した。尚、第一層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ10mm及び0.24g/cm3、 第2層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ2.4mm及び0.20g/cm3であり、有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は5.3cmであった。また、実施例3同様不織布に親水性ポリマーのコーティングを行った。
図1の細胞分離システムを使用した。
実施例3と同様の細胞分離を行ったが、濾過開始後急激に流速が低下し、30分を過ぎたところで1時間以上経過しても濾過が完了しなかった。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦74.2mm、横74.2mm、高さ3mm(有効濾過断面積55cm2、内容積16cm3)で液体流出口と液体流入口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側から、第1層目に有核細胞捕捉材として平均繊維径1.7μmのポリエステル不織布3.61gを、第2層目に回収液整流化材として1.1μmのポリエステル不織布0.58gからなるフィルター材を充填した。尚、第一層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ2.5mm及び0.24g/cm3、 第2層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ0.5mm及び0.20g/cm3であり、有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は220cmであった。また、実施例3同様不織布に親水性ポリマーのコーティングを行った。
図1の細胞分離システムを使用した。
実施例3と同様の細胞分離を行った。回収された細胞液量は21cm3で、回収に要した時間は3秒(流速380cm3/分)であった。
本細胞分離操作での単核球回収率は55%、濾過時間は4分(流速33.3cm3/分)であった。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
軟質塩化ビニール製の液体流入口を有するシート一枚と液体流出口を有するシート一枚で、液体流入口側から、第1層目に有核細胞捕捉材として平均繊維径1.7μmのポリエステル不織布1.37gを、第2層目に回収液整流化材として平均繊維径1.1μmのポリエステル不織布0.19gからなるフィルター材を挟み、有効濾過断面積が18.5cm2になるように周辺を高周波溶着して袋状のフィルター装置を作成した。第1層目の不織布が2.2mmになるようにこのフィルター装置を二枚のアクリル板で挟み、厚みを調節した。不織布の厚みの調節は、同様に作成したフィルター装置を用いて別途キャリブレーションし、二枚のアクリル板の間隔により調節した。この場合の内容積は7cm3であった。有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は74であった。また、ここで使用した不織布はフィルター装置作成前に実施例1と同じ親水性ポリマーのエタノールに浸漬し、60℃で8時間以上真空乾燥機で乾燥させた後、使用した。
図1の細胞分離システムを使用した。
濾過は実施例3と同様に行った。一方、回収時は、フィルター装置を挟んでいた二枚のアクリル板の間隔を広げて、前記キャリブレーションにより有核細胞捕捉材の厚みを3.5mmになるように調整した後(内容積11ml、有核細胞捕捉材の充填密度0.17g/cm3)、10%デキストラン生理食塩水溶液にヒト血清アルブミンを3%になるように添加した液体23cm3とエア18cm3をシリンジに充填し、細胞含有液の出口から手動で通液し、細胞含有液の入口から単核球を回収した。この場合のフィルター材の有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は51.4cmであった。回収された細胞液量は22cm3で、回収に要した時間は5秒(流速276cm3/分)であった。
本細胞分離操作での単核球回収率は45%、濾過時間は6分(流速16.7cm3/分)であった。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
比較例8と同じフィルター装置を用いた。
図1の細胞分離システムを使用した。
10%デキストラン生理食塩水溶液にヒト血清アルブミンを3%になるように添加した液体95cm3とエア18cm3を回収液とした以外は比較例8と同じ操作を行った。回収された細胞液量は100cm3で、回収に要した時間は1分(流速100cm3/分)であった。
本細胞分離操作での単核球回収率は85%、濾過時間は6分(流速16.7cm3/分)であった。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
実施例1と同じものを使用した。
図1の細胞分離システムを使用した。
図2のタイプの貯留バッグを使用した。貯留部の内容積は40cm3で、凍結保存部の内容積は5cm3。材質はエチレン酢酸ビニル共重合体(EVA)のものを使用した。
事前にクランプ21、22、23を閉じておいた。200cm3の細胞含有液バッグに貯留されたCPD加ヒト臍帯血100cm3と血液導管11を接続した。クランプ21と23を開け、落差により濾過を開始した。濾過された血液はドレインバッグ70に貯留した。細胞含有液バッグ内の全ての血液が細胞分離フィルター装置40に導入されたことを確認後、クランプ21、23を閉じた。次に、10%デキストラン生理食塩水溶液(小林製薬「デキストラン40注」)にヒト血清アルブミンを最終濃度3%になるように添加した液体19cm3とエア18cm3をシリンジに充填した。次に、クランプ22を開けて回収液注入口60から手動で通液し、凍結保存部5を有する貯留バッグに単核球を回収した。この場合の回収された細胞液量は23cm3であった。ヒートシーラーを用いて細胞分離システムから貯留バッグを切り離した後、凍結保存部120を遠心カップの底面側にして1000G×15分の遠心条件で遠心分離した。狭窄部(溶断分離部)110までの上清を除去し、凍結保存部120の空気を追い出しながらヒートシーラーを用いて溶断分離部110で溶断し、貯留部100から切り離した。次に凍結保存部120を指で押さえながら沈さをほぐした。凍結保存部120の表面を冷剤で冷やしながら凍害保護剤導入部130から50%ジメチルスルホキシドをシリンジポンプを用いて0.3cm3/分の流速で1cm3加えた。最終容積は5cm3であった。その後、−80℃中で2時間静置し、液体窒素の気相で凍結保存した。
凍結保存前に有核細胞の取り出し口140からサンプリングし、元の臍帯血と合わせて多項目自動血球分析装置(シスメックス社SF3000)を用いて単核球数を測定し、回収率を計算した。
本細胞濃縮操作での単核球回収率は85%で、凍結解凍後、凍結保存部120の破損は見られなかった。
フィルター法で分離された単核球をコニカルチューブに移し変えて遠心濃縮し、更に単核球濃縮液を貯留バッグに移し変えて凍結保存した。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
実施例7と同じものを使用した。
図1の細胞分離システムで、貯留バッグの代わりに、本発明でいう狭窄部110や凍結保存部120を有さない通常の血液バッグを用いた。
実施例7と同じものを使用した。
実施例7と同様に図1の細胞分離システムで臍帯血を処理し、本発明でいう狭窄部110や凍結保存部120を有さない通常の血液バッグに有核細胞を回収した。回収された有核細胞液23cm3を14cm3コニカルチューブ2本に移し変えて1000G×15分の遠心条件で遠心分離した。容積が4cm3となるように上清を除去し沈さを再浮遊させた後に、50%ジメチルスルホキシド1cm3を冷剤で冷やしながら0.3cm3/分の流速で加えた。その後、この細胞濃縮物を図2のタイプの貯留バッグに移し変え、実施例7と同様の方法で凍結保存した。
本細胞濃縮操作での単核球回収率は50%であった。凍結解凍後、凍結保存部120の破損は見られなかった。
実施例7において、凍結保存部120内の空気を抜く操作を行わずに凍結保存した。
(1)細胞分離フィルター装置の作製
実施例7と同じものを使用した。
図1の細胞分離システムを使用した。
実施例7と同じものを使用した。
凍結保存部120に2cm3のエアを封入して凍結保存した以外は実施例7と同様に処理した。
本細胞濃縮操作での単核球回収率は85%であったが、凍結解凍後、凍結保存部5の破損が見られた。
Claims (28)
- 有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を、有核細胞を実質的に捕捉し不要細胞は実質的に通過するフィルター材を含んでなるフィルター装置に導入して有核細胞を該フィルター材に捕捉し不要細胞を排出させた後、該フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収する細胞濃縮物の調製方法において、有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離した後、上記フィルター装置に先ず該不要細胞に富む層を導入し、続いて該有核細胞に富む層を導入して有核細胞を該フィルター材に捕捉しながら該フィルター装置内に残存する不要細胞を排出させた後、該フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収し、前記不要細胞が赤血球であることを特徴とする細胞濃縮物の調製方法。
- 不要細胞を重力または遠心力によって沈降させることによって、少なくとも有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離する請求項1記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 不要細胞を凝集させた後に不要細胞を重力または遠心力によって沈降させることによって、少なくとも有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離する請求項1記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 前記有核細胞が造血幹細胞である請求項1乃至3の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 前記有核細胞が単核球である請求項1乃至3の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液にヒドロキシエチルスターチを添加することによって不要細胞を凝集させる請求項3記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 前記有核細胞に富む層が有核細胞濃厚層と有核細胞希薄層からなり、フィルター装置に有核細胞希薄層、有核細胞濃厚層の順で導入する請求項1乃至6の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 前記有核細胞に富む層が有核細胞濃厚層と有核細胞希薄層からなり、フィルター装置に有核細胞濃厚層、有核細胞希薄層の順で導入する請求項1乃至5の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 前記有核細胞希薄層の一部または全部を回収液の少なくとも一部として用いる請求項8記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 前記フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収した後に、更に回収した有核細胞含有液を遠心分離し、上清を除くことにより有核細胞を濃縮する請求項1乃至9の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 前記フィルター材が、少なくとも細胞含有液の入口と出口を有する容器内に多孔質体からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が細胞含有液の入口側から出口側に向かってこの順に充填され、該フィルター材の有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値が15〜120cmであることを特徴とする請求項1乃至10の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 多孔質体からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が積層されてなるフィルター材であって、且つ該フィルター材の有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値が15〜120cmであるフィルター材が、有核細胞捕捉材が細胞含有液の入り口側になるように細胞含有液の入口と出口を有する容器に充填されてなるフィルター装置を用い、細胞含有液の入口から細胞含有液をフィルター装置に導入して有核細胞をフィルター材に捕捉させ、不要細胞を該フィルター装置から排出させた後、細胞含有液の出口側から回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を細胞含有液の入口側から回収することを特徴とする請求項1に記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 前記有核細胞捕捉材の細胞含有液入口側に更に凝集塊捕捉材が充填されている請求項11または12記載の細胞濃縮物の調製方法。
- フィルター材が不織布である請求項11乃至13の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 不織布からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が、夫々、
ア)平均繊維径が1.1〜3.0μm、充填密度が0.1〜0.3g/cm3である不織布からなる有核細胞捕捉材、
イ)平均繊維径が0.5〜1.5μm、充填密度が0.1〜0.3g/cm3である不織布からなる回収液整流化材、
であり、有核細胞捕捉材、回収液整流化材の順番に平均繊維径が細くなることを特徴とする請求項14記載の細胞濃縮物の調製方法。 - フィルター材がスポンジ状構造体である請求項11乃至13の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
- スポンジ状構造体からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が、夫々、
ア)充填時の平均孔径が7〜25μm、充填時の空隙率が55〜90%であるスポンジ状構造体からなる有核細胞捕捉材、
イ)充填時の平均孔径が2〜10μm、充填時の空隙率が55〜90%であるスポンジ状構造体からなる回収液整流化材、
であり、有核細胞捕捉材、回収液整流化材の順番に平均孔径が小さくなることを特徴とする請求項16記載の細胞濃縮物の調製方法。 - フィルター材が不織布とスポンジ状構造体との組み合せである請求項11乃至13の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
- 請求項1乃至18の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法の後に、さらに以下の工程を設ける細胞の凍結保存方法:
(b)回収された有核細胞を、貯留部に設けた有核細胞導入口を介して、該貯留部と凍結保存部を有する貯留バッグに移行させ貯留する細胞貯留工程、
(c)貯留された有核細胞を、前記貯留バッグ内で、凍結保存部を回転半径上の回転軸から遠い位置に配置させて遠心分離することにより有核細胞を貯留バッグ内の凍結保存部に移動させる細胞濃縮工程、
(d)濃縮された有核細胞を、空気を含まない状態で凍結保存部に密封し溶断分離する容器分離工程、および
(e)有核細胞が密封された凍結保存部を凍結し保存する凍結保存工程;
を順番に行い、且つ前記(b)〜(e)の全工程を密閉系で行う。 - 前記有核細胞の貯留部が、凍結保存部から狭窄部を介して徐々に断面積を広める拡大部を有する形状である請求項19記載の細胞の凍結保存方法。
- 前記有核細胞の貯留部は、狭窄部が前記(d)の容器分離工程において溶断分離部として用いられ、凍結保存部が前記(e)の凍結保存工程において有核細胞の凍結保存用容器として用いられるものである請求項19または20に記載の細胞の凍結保存方法。
- 前記有核細胞の凍結保存部が有核細胞の取出し口を有する請求項19乃至21の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
- 前記有核細胞の凍結保存部または/および前記有核細胞の貯留部が凍害保護剤導入部を有する請求項19乃至22の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
- 前記有核細胞の貯留部が有核細胞の貯留バッグ内のエア排出用フィルター装置を有する請求項19乃至23の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
- 前記有核細胞の貯留部が有核細胞の貯留バッグ内のエア排出用導管を有核細胞の導管とは独立して有する請求項19乃至24の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
- 前記(d)の容器分離工程の前に、前記凍害保護剤導入部から凍害保護剤を添加する請求項19乃至25の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
- 前記(d)の容器分離工程の後に、前記凍害保護剤導入部から凍害保護剤を添加する請求項19乃至26の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
- 請求項19乃至27の何れかの方法を用いる細胞凍結物の製造方法。
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