JP4587959B2

JP4587959B2 - 細胞濃縮物の調製方法および細胞組成物

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Publication number: JP4587959B2
Application number: JP2005514613A
Authority: JP
Inventors: 修司寺嶋; 幹智安武
Original assignee: Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd
Priority date: 2003-10-10
Filing date: 2004-10-08
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2024-10-08
Also published as: EP1683857A4; KR20070032263A; TWI349567B; EP1683857A1; JPWO2005035737A1; DE602004031446D1; WO2005035737A1; KR101098162B1; ATE498680T1; TW200515927A; EP1683857B1; US20070275459A1

Description

本発明は、細胞含有液中の有核細胞を分離、濃縮して凍結保存用の細胞浮遊液を作成するための細胞濃縮物の調製方法、細胞の凍結保存方法、細胞組成物および細胞凍結物に関する。更に詳しくは、本発明は、凍結保存用細胞浮遊液中の有核細胞の濃度を高め、凍結保存用の細胞浮遊液の容積を少なくするための細胞濃縮物の調製方法、細胞の凍結保存方法、細胞組成物および細胞凍結物に関する。

近年、白血病などの造血器腫瘍及び固形癌の化学療法における副作用である造血障害に対して、末梢血、骨髄、臍帯血の中の造血幹細胞を移植することが盛んに行われるようになった。そのほとんどの場合、細胞は移植前まで凍結保存されるが、凍結保存には莫大な費用がかかるため、通常凍結前に赤血球や血漿など移植に不要な成分を除去して保存容積を削減する処理が施される。例えば、臍帯血は胎盤と臍の緒から平均で１００ｍＬ程度採取できるが、多くの臍帯血バンクでは、臍帯血から赤血球、血漿などを除去して２０ｍＬに減容した後、凍害保護剤を５ｍＬ加えて２５ｍＬで凍結保存している。しかしながら、これらの臍帯血はドナーと患者のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致するまで長期間凍結保存されることが多く、保存費用削減のために、更に減容するニーズが高まっている。

従来、血液から治療に必要な成分を分離する方法として、比重遠心法、赤血球凝集法、バフィーコート法、抗体を用いたアフィニティ分離法などが行われてきた。しかしながら、比重遠心法は赤血球、血漿の除去率が高く、減容効果は大きいものの、比重液（例えばファルマシア社製Ｆｉｃｏｌｌ）に原料となる細胞浮遊液を重層させる際に液面を乱してはならないなど、非常に熟練を要する煩雑な操作である上、開放系で操作されるため雑菌混入のリスクが大きく、また目的細胞の回収率が低いなどの問題がある。赤血球凝集法では、ヒドロキシエチルスターチ等と混和して、赤血球の連銭形成により赤血球を凝集、沈降させ、上層の白血球層を分離するが（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９２，ｐｐ１０１１９−１０１２２（１９９５）、ＩｎｄｉａｎＪ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１０６，ｐｐ１６−１９（１９９７））、白血球の回収率を高めようとすると多くの赤血球が混入して減容の妨げとなり、逆に赤血球の混入を抑えようとすると白血球の回収率が低下するといったように、赤血球除去と白血球回収の両者を同時に十分満たすことができないといった問題がある。バフィーコート法では、血液が貯留されたバッグを強遠心して上層の血漿層、中間層の主に白血球と血小板からなるバフィーコート層、下層の赤血球層を形成させ、上層の血漿層と下層の赤血球層をバッグから追い出して中間層のバフィーコート層を回収するが（ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２３，ｐｐ５０５−５０９（１９９９））、やはり赤血球凝集法と同じ問題がある。抗体を用いたアフィニティ分離法では、特異性は高く減容効果は大きいものの、分離した細胞を回収するためには、結合した抗体分子を酵素処理するため、細胞の損傷、コスト高、操作の煩雑さなどの問題がある。

簡便で細胞の分離効率の比較的高い細胞分離法として、特開平１０−２０１４７０号公報、特開平１０−１３７５５７号公報、特開平１１−２０６８７５号公報、特開平１１−５６３５１号公報において、フィルター装置を用いる方法が開示されている。特に特開平１１−５６３５１号公報では、血液を濾過後、フィルター装置にリンス液を導入してフィルター装置内に残存する赤血球を洗い流した後、フィルター装置に回収液を導入してフィルター装置内に捕捉された目的細胞を回収するため、赤血球除去率、目的細胞回収率ともに高い。しかしながら、目的細胞の生存率や機能を高く維持するためにリンス液にアルブミンなどの蛋白を添加する必要があり、またリンス液を通液する際にフィルター装置に血液回路中のエアが入り込んで濾過不能（エアブロック）になったり、フィルター装置にエアが入らないように濾過前にリンス液でフィルター装置および血液回路をプライミングしておく必要があるなど、非常に煩雑な操作を余儀なくされる。

国際公開第９８／３２８４０号パンフレットでは、「細胞含有液としては、末梢血、骨髄、臍帯血、リンパ液及びこれらに遠心分離等何らかの処理を施したもの」との記載があるが、濾過する前の細胞含有液の処理によって有核細胞と不要細胞の分離効率を高められるとの記載は一切ない。

また、フィルター装置を用いて細胞の分離効率を高める方法として、国際公開第０２／０８７６６０号パンフレットにフィルター装置で血液を濾過する前に血液の貯留部において血球濃度勾配を形成した後、貯留部下層の血液から白血球除去フィルター装置で濾過する方法が開示されている。その中で開示された技術は、濾過初期におけるフィルター材はアルブミン等の血球粘着を抑制する血漿蛋白質で十分に覆われておらず、除去したい白血球が多く粘着し、一方比重の軽い血小板は不均質化した全血製剤の上層に多く存在し、血小板がフィルター材と接触する時にはフィルター材表面がアルブミン等の血漿蛋白質で覆われ血小板粘着が抑制され多くの血小板が回収されることにより、白血球と血小板の分離効率を高める技術である。即ち、本公報では、本発明のように、先に不要細胞に富む層を濾過してフィルター材に一部の有核細胞を捕捉し、不要細胞を流出させ、その時点でフィルター材に残留する不要細胞を、その後有核細胞に富む層で洗い流しながらフィルター材に有核細胞を捕捉し、その後回収液をフィルター装置に導入して有核細胞を回収する、という技術思想は全くない。

上述したように簡便で細胞の分離効率の比較的高い細胞分離法として、フィルター法が挙げられる。ところが、これらのフィルター法では、血液を濾過する際、血液中のフィブリン塊や破壊した血球などの凝集塊によるフィルター材の細孔の閉塞により、濾過流速が低下して濾過時間が延長する、或いは完全に目詰まりを起こして処理操作が不能になるといった問題があった。この対策として、濾過面積を広げて単位断面積あたりの濾過量を低減させる方法が取られる。上記フィルター法に開示されているように、一般的に、濾過時は目的細胞の捕捉不足を防ぐために低流速で血液をフィルター装置に導入し、一方回収時はフィルター材に捕捉された目的細胞を回収液の剪断力を利用して洗い流すために高流速で回収液をフィルター装置に導入する。濾過面積を広げた場合、回収時に高流速で回収液を導入すると回収液は濾過部に均一に広がらず、回収液導入部付近を優先的に流れ、目的細胞の回収率を高められない。即ち、濾過流速の確保と目的細胞の高回収率を両立できないという問題があった。

また、フィルター法の内、特開平１０−１３７５５７号公報や特開平１１−２０６８７５号公報においては、目的細胞の回収率を向上させることを狙って、回収時に濾過時よりも多孔質体の孔径を大きくさせてフィルター装置に回収液を導入し、フィルター材に捕捉された目的細胞を回収しているが、回収時にフィルター装置の内容積が大きくなるため、実態としては回収率を高く維持するためにフィルター装置に導入する回収液量を増やさねばならず、所望する容積にするために遠心濃縮の作業が必要となる上、材料費のコストアップにつながる問題があった。さらに、これらの方法では、フィルター材を圧縮したり圧縮を解除したりしてフィルター材の厚みを調節して孔径を変化させているが、操作が煩雑で正確なコントロールも難しく、目的細胞の回収率が安定しない問題があった。

末梢血、骨髄、臍帯血の中の造血幹細胞を移植する際、そのほとんどの場合、前記フィルター法などによって血液から治療に必要な成分を分離した後、細胞は移植前まで凍結保存される。分離した細胞は、凍結容器に移す前に血液バッグなど一旦別の容器に移送され、洗浄されたり、遠心分離で液性成分を除去して濃縮されたり、凍害保護剤を加えられるなどの処理が施される。しかしながら、細胞を別の容器に移し変える際、細菌汚染の問題や容器内部に細胞濃厚液が付着、残留して細胞のロスを招く問題があった。この問題を解決する方法として、特開昭５７−８３２８４号公報では、培養細胞を凍結保存する際の移し変えによる細胞のロス、細菌汚染を防ぐ目的で、培養瓶で培養された培養細胞を移し変えた凍結容器内で遠心分離、凍害保護剤を注入する技術が開示されている。しかしながら、当公報による技術は密閉系でなく細菌汚染の問題が十分解決できない、また凍結容器内の空気を排出する工程がなく、凍結容器内に残留する空気によって凍結保存容積を小さくできないだけでなく、凍結解凍時に凍結容器破損の問題がある。

また、前述の国際公開第９８／３２８４０号パンフレットでは、フィルター装置で分離された目的細胞を移送の手間を省くために凍結バッグで受ける方法が開示されているが、凍結バッグごと遠心分離し、有核細胞を濃縮することすることは一切記載されていない。

以上のように、細胞浮遊液から目的細胞を分離、濃縮する既存の技術には、改良すべき多くの課題が残されている。簡便な操作で、有核細胞と不要細胞を効率的に分離して凍結保存容積を削減する方法の確立が望まれている。

本発明の課題は、有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液をフィルター装置で濾過した後、フィルター装置に回収液を導入してフィルター材に捕捉されている有核細胞を回収する際、簡便な操作で細胞含有液から有核細胞と不要細胞を効率的に分離することにより、有核細胞を含む凍結保存用溶液の容積を少なくできる、細胞濃縮物の調製方法および細胞組成物を提供することにある。また、本発明の別の課題は、有核細胞と不要細胞を含む細胞含有液をフィルター装置で濾過した後、フィルター装置に回収液を導入してフィルター材に捕捉されている有核細胞を回収する際、血液中の凝集塊による濾過流速の低下を抑制しながら、有核細胞を高率に回収し、しかも、より少ない液量で目的の有核細胞を簡便に回収することができる細胞濃縮物の調製方法および細胞組成物を提供することにある。さらに、本発明の別の課題は、有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液から有核細胞を分離、濃縮、凍結保存する際、有核細胞のロス、細菌汚染、凍結容器破損のリスクを低減しながら凍結保存容積を削減できる細胞の凍結保存方法および細胞凍結物を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、少なくとも有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液をフィルター装置で濾過して有核細胞をフィルター材に捕捉し、不要細胞はフィルター装置から排出させた後、回収液をフィルター装置に導入してフィルター材に捕捉されている有核細胞を回収する方法において、細胞含有液をフィルター装置で濾過する前に有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離した後、不要細胞に富む層、有核細胞に富む層をこの順に濾過すると、有核細胞をフィルター材に捕捉しながらフィルター装置内に残存する不要細胞をフィルター装置から排出できるため、有核細胞の高回収と不要細胞の高除去を同時に達成でき、簡便な操作で細胞含有液を極めて小さな容積にできることを見出し、本発明を完成させるに至った。

また、本発明者らは、目的細胞を分離回収する方法において、回収液整流化材を有核細胞捕捉材に対して特定の配列となるように併用し、かつ、フィルター材の有効濾過膜面積と充填厚みが特定の比率にある比較的扁平なフィルター材を用いると、濾過時の流速確保と回収液の均一流れによる有核細胞の高回収という課題を両立できることを見出し、本発明を完成するに至った。

さらに本発明者らは、有核細胞と不要細胞を含む細胞含有液から有核細胞を分離、貯留、遠心濃縮、密封および凍結保存する一連の作業において、有核細胞を分離する以外の工程を密閉系の同一容器内で行い、少なくとも貯留から凍結保存までの工程を密閉系で行うことにより、有核細胞のロス、細菌汚染のリスクを低減でき、また空気を含まない状態で密封することにより、凍結保存容積を削減可能なだけでなく、凍結容器破損のリスクを低減できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を、有核細胞を実質的に捕捉し不要細胞は実質的に通過するフィルター材を含んでなるフィルター装置に導入して有核細胞を該フィルター材に捕捉し不要細胞を排出させた後、該フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収する細胞濃縮物の調製方法において、有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離した後、上記フィルター装置に先ず該不要細胞に富む層を導入し、続いて該有核細胞に富む層を導入して有核細胞を該フィルター材に捕捉しながら該フィルター装置内に残存する不要細胞を排出させた後、該フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収することを特徴とする細胞濃縮物の調製方法。

（２）不要細胞を重力または遠心力によって沈降させることによって、少なくとも有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離する（１）記載の細胞濃縮物の調製方法。
（３）不要細胞を凝集させた後に不要細胞を重力または遠心力によって沈降させることによって、少なくとも有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離する（１）記載の細胞濃縮物の調製方法。

（４）前記不要細胞が赤血球である（１）乃至（３）の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
（５）前記有核細胞が造血幹細胞である（１）乃至（４）の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。

（６）有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液にヒドロキシエチルスターチを添加することによって不要細胞を凝集させる（３）記載の細胞濃縮物の調製方法。
（７）前記有核細胞に富む層が有核細胞濃厚層と有核細胞希薄層からなり、フィルター装置に有核細胞希薄層、有核細胞濃厚層の順で導入する（１）乃至（６）の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
（８）前記有核細胞に富む層が有核細胞濃厚層と有核細胞希薄層からなり、フィルター装置に有核細胞濃厚層、有核細胞希薄層の順で導入する（１）乃至（５）の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。

（９）前記有核細胞希薄層の一部または全部を回収液の少なくとも一部として用いる（８）記載の細胞濃縮物の調製方法。
（１０）前記フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収した後に、更に回収した有核細胞含有液を遠心分離し、上清を除くことにより有核細胞を濃縮する（１）乃至（９）の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。

（１１）前記フィルター材が、少なくとも細胞含有液の入口と出口を有する容器内に多孔質体からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が細胞含有液の入口側から出口側に向かってこの順に充填され、該フィルター材の有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値が１５〜１２０ｃｍであることを特徴とする（１）乃至（１０）の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。

（１２）有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を、有核細胞を実質的に捕捉し不要細胞は実質的に通過するフィルター材を含んでなるフィルター装置に導入して有核細胞を該フィルター材に捕捉し不要細胞を排出させた後、該フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収する細胞濃縮物の調製方法において、多孔質体からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が積層されてなるフィルター材であって、且つ該フィルター材の有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値が１５〜１２０ｃｍであるフィルター材が、有核細胞捕捉材が細胞含有液の入り口側になるように細胞含有液の入口と出口を有する容器に充填されてなるフィルター装置を用い、細胞含有液の入口から細胞含有液をフィルター装置に導入して有核細胞をフィルター材に捕捉させ、不要細胞を該フィルター装置から排出させた後、細胞含有液の出口側から回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を細胞含有液の入口側から回収することを特徴とする細胞濃縮物の調製方法。

（１３）前記有核細胞捕捉材の細胞含有液入口側に更に凝集塊捕捉材が充填されている（１１）または（１２）記載の細胞濃縮物の調製方法。
（１４）フィルター材が不織布である（１１）乃至（１３）の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
（１５）不織布からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が、夫々、
ア）平均繊維径が１．１〜３．０μｍ、充填密度が０．１〜０．３ｇ／ｃｍ³である不織布からなる有核細胞捕捉材、
イ）平均繊維径が０．５〜１．５μｍ、充填密度が０．１〜０．３ｇ／ｃｍ³である不織布からなる回収液整流化材、
であり、有核細胞捕捉材、回収液整流化材の順番に平均繊維径が細くなることを特徴とする（１４）記載の細胞濃縮物の調製方法。

（１６）フィルター材がスポンジ状構造体である（１１）乃至（１３）の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
（１７）スポンジ状構造体からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が、夫々、
ア）充填時の平均孔径が７〜２５μｍ、充填時の空隙率が５５〜９０％であるスポンジ状構造体からなる有核細胞捕捉材、
イ）充填時の平均孔径が２〜１０μｍ、充填時の空隙率が５５〜９０％であるスポンジ状構造体からなる回収液整流化材、
であり、有核細胞捕捉材、回収液整流化材の順番に平均孔径が小さくなることを特徴とする（１６）記載の細胞濃縮物の調製方法。
（１８）フィルター材が不織布とスポンジ状構造体との組み合せである（１１）乃至（１３）の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。

（１９）（１）乃至（１８）の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法の後に、さらに以下の工程を設ける細胞の凍結保存方法：
（ｂ）回収された有核細胞を、貯留部に設けた有核細胞導入口を介して、該貯留部と凍結保存部を有する貯留バッグに移行させ貯留する細胞貯留工程、
（ｃ）貯留された有核細胞を、前記貯留バッグ内で、凍結保存部を回転半径上の回転軸から遠い位置に配置させて遠心分離することにより有核細胞を貯留バッグ内の凍結保存部に移動させる細胞濃縮工程、
（ｄ）濃縮された有核細胞を、空気を含まない状態で凍結保存部に密封し溶断分離する容器分離工程、および
（ｅ）有核細胞が密封された凍結保存部を凍結し保存する凍結保存工程；
を順番に行い、且つ前記（ｂ）〜（ｅ）の全工程を密閉系で行う。

（２０）以下（ａ）〜（ｅ）を少なくとも含む工程：
（ａ）有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を、有核細胞を実質的に捕捉し不要細胞は実質的に通過するフィルター材を含んでなるフィルター装置に導入して有核細胞を該フィルター材に捕捉し不要細胞を排出させた後、該フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収する細胞濃縮物の調製工程、
（ｂ）回収された有核細胞を、貯留部に設けた有核細胞導入口を介して、該貯留部と凍結保存部を有する貯留バッグに移行させ貯留する細胞貯留工程、
（ｃ）貯留された有核細胞を、前記貯留バッグ内で、凍結保存部を回転半径上の回転軸から遠い位置に配置させて遠心分離することにより有核細胞を貯留バッグ内の凍結保存部に移動させる細胞濃縮工程、
（ｄ）濃縮された有核細胞を、空気を含まない状態で凍結保存部に密封し溶断分離する容器分離工程、
（ｅ）有核細胞が密封された凍結保存部を凍結し保存する凍結保存工程、
を順番に行い、且つ前記（ｂ）〜（ｅ）の工程を密閉系で行う細胞の凍結保存方法。

（２１）前記有核細胞の貯留部が、凍結保存部から狭窄部を介して徐々に断面積を広める拡大部を有する形状である（１９）または（２０）記載の細胞の凍結保存方法。
（２２）前記有核細胞の貯留部は、狭窄部が前記（ｄ）の容器分離工程において溶断分離部として用いられ、凍結保存部が前記（ｅ）の凍結保存工程において有核細胞の凍結保存用容器として用いられるものである（１９）乃至（２１）の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。

（２３）前記有核細胞の凍結保存部が有核細胞の取出し口を有する（１９）乃至（２２）の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
（２４）前記有核細胞の凍結保存部または／および前記有核細胞の貯留部が凍害保護剤導入部を有する（１９）乃至（２３）の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。

（２５）前記有核細胞の貯留部が有核細胞の貯留バッグ内のエア排出用フィルター装置を有する（１９）乃至（２４）の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
（２６）前記有核細胞の貯留部が有核細胞の貯留バッグ内のエア排出用導管を有核細胞の導管とは独立して有する（１９）乃至（２５）の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。

（２７）前記（ｄ）の容器分離工程の前に、前記凍害保護剤導入部から凍害保護剤を添加する（１９）乃至（２６）の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
（２８）前記（ｄ）の容器分離工程の後に、前記凍害保護剤導入部から凍害保護剤を添加する（１９）乃至（２７）の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
（２９）（１９）乃至（２８）の何れかの方法を用いる細胞凍結物の製造方法。

（３０）（１）乃至（１８）の何れかの方法によって得られる細胞組成物。
（３１）前記細胞組成物を更に遠心分離し、上清を除くことにより有核細胞を濃縮して得られる（３０）記載の細胞組成物。
（３２）前記不要細胞が赤血球である（３０）または（３１）記載の細胞組成物。
（３３）前記有核細胞が造血幹細胞である（３０）または（３１）記載の細胞組成物。
（３４）（１９）乃至（２８）の何れかの方法によって調製される細胞凍結物。

本発明の細胞濃縮物の調製方法によれば、簡便な操作で細胞含有液から有核細胞と不要細胞を効率的に分離できるため、凍結保存容積を大幅に削減できる。また、本発明により、細胞含有液の濾過流速の低下を抑制しながら、細胞含有液から有核細胞を安定して高率に回収し、しかも、より少ない液量で簡便に目的細胞を回収することができる。さらに、本発明により、有核細胞と不要細胞を含む細胞含有液から有核細胞を分離、貯留、遠心濃縮、密封および凍結保存する一連の作業において、有核細胞を分離する工程以外の工程を同一容器内で行い、少なくとも貯留から凍結保存までの工程を密閉系で行うため、有核細胞のロス、細菌汚染のリスクを低減しながら凍結保存容積を削減できる。さらにまた、有核細胞を凍結容器に空気を含まない状態で密封するため、凍結保存容積を削減可能なだけでなく、凍結容器破損のリスクを低減できる。

本発明で言う有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液とは、骨髄、末梢血、Ｇ−ＣＳＦなどの造血因子投与による動員末梢血、臍帯血、あるいはこれらを遠心分離等により粗分離したもの、生理食塩水、細胞培養用培地、緩衝液、抗凝固剤などで希釈したものなどが挙げられる。

有核細胞の例としては、白血球、単核球、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、造血幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮前駆細胞、有核赤血球など、細胞治療、診断等に有用で分離回収を必要とする細胞が挙げられる。

一方、不要細胞の例としては、赤血球、血小板、顆粒球など、回収を必要とする細胞と混在していると凍結解凍時の破壊細胞によるレシピエントへの副作用や回収を必要とする細胞の低回収等の悪影響を持つ細胞が挙げられる。

本発明における有核細胞と不要細胞の組み合わせの例としては、有核細胞が単核球で、不要細胞が赤血球のケースが挙げられる。この場合、単核球はフィルター材に捕捉され、一方で赤血球は通過する。その後、回収液にてフィルター材に捕捉された単核球が回収される。

本発明で言う「有核細胞に富む層」とは、層分離する前の細胞含有液中の有核細胞の５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上が含まれる層のことを言う。有核細胞の割合が５０％を下回った場合、濾過の前半に有核細胞がフィルター材に捕捉され、その後は捕捉された有核細胞を洗い続けることになり、有核細胞の回収率の低下を招くため好ましくない。

また、本発明で言う「不要細胞に富む層」とは、層分離する前の細胞含有液中の不要細胞の６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上が含まれる層のことを言う。不要細胞の割合が６０％を下回った場合、後から濾過される有核細胞に富む層に不要細胞が多く混入して、フィルター装置内に不要細胞が多く残存することになるため、フィルター材に捕捉された有核細胞を回収した際、多くの不要細胞が混入してくるので、有核細胞浮遊液の体積を減らすことが難しくなる。

本発明による細胞濃縮物の調製方法を例示すると、図１に示したシステムを用いる方法が挙げられる。１１、１２、１３は血液導管、２１、２２、２３はクランプ、３１、３２はＴ字管、４０は有核細胞を実質的に捕捉し不要細胞は実質的に通過するフィルター材（図示せず）を含んでなる細胞分離フィルター装置、５０は細胞分離フィルター装置４０のフィルター材に捕捉された有核細胞を回収する回収バッグ、６０は回収液注入口、７０は細胞分離フィルター装置から排出された不要細胞を貯留するドレインバッグである。まず、細胞含有液を貯留した血液バッグを血液導管１１と接続し、細胞含有液を遠心などの方法により有核細胞と不要細胞に層分離する。次にクランプ２１と２３を開け、細胞分離フィルター装置４０に先ず不要細胞に富む層を導入し、続いて有核細胞に富む層を導入する。本発明によって有核細胞と不要細胞が効率的に分離できるのは、不要細胞に富む層、有核細胞に富む層をこの順に濾過することにより、有核細胞を細胞分離フィルター装置４０のフィルター材に捕捉しながら細胞分離フィルター装置４０の内部に残存する不要細胞をフィルター装置から排出できるためである。例えば、細胞含有液を層分離した後に有核細胞に富む層だけを取り出して細胞分離フィルター装置４０で濾過した場合、移し変えによる細胞ロス、界面の乱れによる不要細胞の混入の問題があり有核細胞の高回収と不要細胞の高除去を同時に達成できない。また、層分離せずに細胞分離フィルター装置４０で濾過した場合、細胞分離フィルター装置４０内部に不要細胞が多く残留し、不要細胞の除去率を十分高められない。即ち、細胞の分離効率を高めるためには、細胞含有液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離し、先ず不要細胞に富む層から、続いて有核細胞に富む層を細胞分離フィルター装置４０に導入することが好ましい。有核細胞に富む層と不要細胞に富む層を細胞分離フィルター装置４０に導入する方法は特に限定はないが、落差、ポンプ、あるいはバッグを押しつぶして導入する方法が挙げられる。この際、血液バッグは、不要細胞に富む層では出口に向かって傾斜していると先に導入する不要細胞が残留しにくいため好ましい。濾過された細胞含有液はドレインバッグ７に貯留する。血液バッグ内の全ての細胞含有液が細胞分離フィルター装置４０に導入された後、クランプ２１、２３を閉じる。次に、クランプ２２を開けて回収液注入口６０から回収液を細胞分離フィルター装置４０に導入し、回収バッグ５０に有核細胞を回収する。

本発明で行う「少なくとも有核細胞と不要細胞を含む細胞浮遊液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離する」方法としては、細胞含有液の貯留部で両層を形成できる方法であればいかなる方法でもよいが、重力を利用した自然落下法（静置沈殿法、ともいうべきか）、または遠心法が比較的簡便で好ましい。また、細胞含有液の貯留部の形状としては、血液バッグ、遠心管などが挙げられるが、フィルター装置への導入の容易さから血液バッグが好ましい。

また、この層分離の前に不要細胞を凝集させると層分離の時間短縮だけでなく、有核細胞と不要細胞の分離効率を更に高められるためより好ましい。但し、凝集したものがフィルター材を通過しないと細胞の分離効率が大きく低下するだけでなく、フィルター材の目詰まりを誘発する恐れもあるため、フィルター材の孔径より小さいか、あるいはフィルター材の小孔をすり抜けられる性質のものであることが好ましい。不要細胞が赤血球の場合、ヒドロキシエチルスターチ、デキストランなどで赤血球を凝集させる方法を用いることができる。陰性荷電の赤血球表面にこれら高分子溶液が付着すると血球間の反発力が減弱して赤血球は重なり合い、銭を連ねた状態（連銭形成と呼ばれる）になり、沈降を促進する。しかしながら、赤血球同士の結合は弱く、物理的衝撃により容易に凝集は分解するため、本発明のように凝集、沈降させた後に濾過する場合に好ましい。

本発明で言う有核細胞濃厚層および有核細胞希薄層とは、有核細胞に富む層に含まれる有核細胞の７０％以上、好ましくは８０％以上が有核細胞濃厚層に、残りが有核細胞希薄層に含まれていることをいう。例えば、血液中の白血球を有核細胞、赤血球を不要細胞とした場合、血液を３０００Ｇ以上の強い遠心力で遠心すると、上層の血漿層（有核細胞希薄層）、中間層の白血球に富むバフィーコート層（有核細胞濃厚層）、下層の赤血球層（不要細胞に富む層）の三層に分離される。この場合、上層（有核細胞希薄層）の血漿の一部または全部を回収液の少なくとも一部として用いることができる。また、例えば、血液にヒドロキシエチルスターチを添加して静置しておくと、上層の白血球濃厚層（有核細胞濃厚層）、中間層の白血球希薄層（有核細胞希薄層）、下層の赤血球層（不要細胞に富む層）の三層に分離される。この場合、赤血球層、白血球希薄層、白血球濃厚層の順にフィルター装置に導入されるので、濾過の後半に高濃度の白血球がフィルター装置に導入される。そして、フィルター材の上流により多くの白血球が捕捉されるため、最も回収が容易となる状態であり好ましい。なお、血液に対するヒドロキシエチルスターチ添加量としては、例えばヒドロキシエチルスターチの平均分子量が４０万で１０％生理食塩水溶液の場合、血液１に対して、１／３〜１／１０量が好ましく、また静置する時間としては１０分以上８０分以下、好ましくは２０分以上５０分以下が好ましい。ヒドロキシエチルスターチ添加量が１／１０未満、静置する時間が１０分未満の場合、赤血球の連銭形成が不十分で層分離が不十分となり好ましくない。一方、ヒドロキシエチルスターチ添加量が１／３より多く、静置する時間が８０分より長い場合、層分離が急速に進み、白血球も沈降してくる。その場合、白血球は濾過の前半から中盤にかけてフィルター装置に導入され、フィルター材の下層に潜り込みやすくなるため、回収が難しくなるため好ましくない。

本発明で言うフィルター材とは、有核細胞を実質的に捕捉し、不要細胞は実質的に通過する多孔質のフィルター材を言う。本発明で言う「有核細胞を実質的に捕捉」とは、細胞含有液中の有核細胞の６０％以上（より好ましくは７０％以上）をフィルター材に捕捉することを言う。また、本発明で言う「不要細胞は実質的に通過」とは、細胞含有液中の不要細胞の６０％以上（より好ましくは７０％以上）がフィルター材を通過することを言う。

本発明に用いるフィルター材は、水不溶性であればいかなる材質でも使用可能であるが、成形性、滅菌性に優れ、細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属があげられる。

フィルター材の形状としては、粒状、繊維塊、織布、不織布、平板、スポンジ状構造体等があげられるが、体積あたりの表面積が大きいという点で不織布、スポンジ状構造体が好ましい。

フィルター材が不織布の場合、平均繊維径は１．０μｍ以上３０μｍ以下であり、好ましくは１．０μｍ以上２０μｍ以下であり、さらにより好ましくは１．５μｍ以上１０μｍ以下である。１．０μｍ未満では有核細胞が強固に捕捉されてしまい回収困難となる可能性があるだけでなく、不要細胞の通過、特に凝集させた場合の通過を困難にする。また、３０μｍを超えると有核細胞が繊維に捕捉されず素通りする可能性が高くなる。いずれの場合も回収率の低下につながるおそれがあるので好ましくない。

また、スポンジ状構造体を用いる場合、平均孔径は通常２．０μｍ以上２５μｍ以下であり、好ましくは３．０μｍ以上２０μｍ以下であり、さらにより好ましくは４．０μｍ以上１５μｍ以下である。２．０μｍ未満では流れ性が劣り、不要細胞の通過、特に凝集させた場合の通過を困難にするだけでなく、通液自体が困難になるおそれがある。また２５μｍを超えると有核細胞の捕捉率が低下し、回収率の低下を招くので好ましくない。

本発明に用いるフィルター材は、有核細胞捕捉材に回収液整流化材が積層されたものが好ましく、フィルター装置の細胞含有液の入口側から出口側に向かってこの順に充填されているフィルター材が、細胞含有液の濾過流速の低下を抑制しながら、細胞含有液から有核細胞を安定して高率に回収可能である。

本発明で言う有核細胞捕捉材とは、細胞含有液中の有核細胞を捕捉し、不要細胞は通過させる機能を有する多孔質のフィルター材を言う。有核細胞捕捉材が不織布の場合、平均繊維径が１．１〜３．０μｍ、充填密度が０．１〜０．３ｇ／ｃｍ³であることが好ましい。平均繊維径が１．１μｍを下回り充填密度が０．３ｇ／ｃｍ³を上回る場合、有核細胞が有核細胞捕捉材の上流付近だけで捕捉され、細孔を短時間で閉塞するため、濾過流速が遅くなり、また有核細胞の剥離効率が低下して回収率の低下を招くため好ましくない。一方、平均繊維径が３．０μｍを上回り充填密度が０．１ｇ／ｃｍ³を下回る場合、有核細胞を十分捕捉できず、濾過時下流に配置された回収液整流化材に到達して細孔を閉塞するため、濾過流速が遅くなり、また有核細胞の剥離効率が低下して回収率の低下を招くため好ましくない。

また、有核細胞捕捉材がスポンジ状構造の場合、充填時の平均孔径が７〜２５μｍ、充填時の空隙率が５５〜９０％であることが好ましい。平均孔径が７μｍを下回り充填時の空隙率が５５％を下回る場合、有核細胞が有核細胞捕捉材の上流付近だけで捕捉され、細孔を短時間で閉塞するため、濾過流速が遅くなり、また有核細胞の剥離効率が低下して回収率の低下を招くため好ましくない。一方、平均孔径が２５μｍを上回り充填時の空隙率が９０％を上回る場合、有核細胞を十分捕捉できず、濾過時下流に配置された回収液整流化材に到達して細孔を閉塞するため、濾過時の細胞含有液の流速が遅くなり、また有核細胞の剥離効率が低下して回収率の低下を招くため好ましくない。

本発明で言う回収液整流化材とは、回収液をフィルター装置に導入する際、濾過抵抗により細胞含有液をフィルター装置の濾過部に均一に広がらせる機能を有する多孔質のフィルター材を言う。回収液整流化材が不織布の場合、平均繊維径が０．５〜１．５μｍ、充填密度が０．１〜０．３ｇ／ｃｍ³であることが好ましい。平均繊維径が０．５μｍを下回り充填密度が０．３ｇ／ｃｍ³を上回る場合、濾過抵抗が大きくなり回収液の流速が低下するため捕捉された有核細胞の剥離率が低下し、回収率が低下するため好ましくない。一方、平均繊維径が１．５μｍを上回り充填密度が０．１ｇ／ｃｍ³を下回る場合、濾過抵抗が小さく回収液が均一に広がらないため有核細胞の回収率が低下するため好ましくない。

また、回収液整流化材がスポンジ状構造体の場合、充填時の平均孔径が２〜１０μｍ、充填時の空隙率が５５〜９０％であることが好ましい。平均孔径が２μｍを下回り充填時の空隙率が５５％を下回る場合、濾過抵抗が大きくなり回収液の流速が低下するため捕捉された有核細胞の剥離率が低下し、回収率が低下するため好ましくない。一方、平均孔径が１０μｍを上回り充填時の空隙率が９０％を上回る場合、濾過抵抗が小さく回収液が均一に広がらず有核細胞の回収率が低下するため好ましくない。

本発明においては、有核細胞捕捉材と回収液整流化材とを特定の方向に配置して併用することが特に重要であり、上記の有核細胞捕捉材と回収液整流化材が、フィルター装置の細胞含有液の入口側から出口側に向かってこの順に充填されていることが必要である。これにより、回収液の流れが均一となり、捕捉細胞の回収効率を高めることができる。

また、本発明においては、フィルター材として、前記二種の材の他に凝集塊捕捉材を加えることも好ましく、フィルター装置の細胞含有液のもっとも入口側に凝集塊捕捉材を充填して用いることができる。

本発明で言う凝集塊捕捉材とは、有核細胞捕捉材の細胞含有液入口側に充填され、細胞含有液中のフィブリン塊、血餅、活性化血小板や破壊した顆粒球などの細胞凝集物を捕捉し、濾過時の流速低下と有核細胞回収率低下を抑制する機能を有する多孔質のフィルター材を言う。凝集塊捕捉材としての多孔質体が不織布の場合、平均繊維径が５〜２０μｍ、充填密度が０．１〜０．３ｇ／ｃｍ³であることが好ましい。平均繊維径が５μｍを下回り充填密度が０．３ｇ／ｃｍ³を上回る場合、凝集塊だけでなく有核細胞や不要細胞も捕捉され、細孔を閉塞するため、濾過流速が遅くなり、また有核細胞は凝集塊に取り込まれて回収率の低下を招くため好ましくない。一方、平均繊維径が２０μｍを上回り充填密度が０．１ｇ／ｃｍ³を下回る場合、凝集塊を十分捕捉できず、凝集塊が濾過時下流に配置された有核細胞捕捉材に到達して有核細胞捕捉材の細孔を閉塞するため、濾過流速が遅くなり、また有核細胞は凝集塊に取り込まれて回収率の低下を招くため好ましくない。

また、凝集塊捕捉材がスポンジ状構造体の場合、充填時の平均孔径が６０〜１５０μｍ、充填時の空隙率が５５〜９０％であることが好ましい。平均孔径が６０μｍを下回り充填時の空隙率が５５％を下回る場合、凝集塊だけでなく有核細胞や不要細胞も捕捉され、細孔を閉塞するため、濾過時の細胞含有液の流速が遅くなり、また有核細胞は凝集塊に取り込まれて回収率の低下を招くため好ましくない。一方、平均孔径が１５０μｍを上回り充填時の空隙率が９０％を上回る場合、凝集塊を十分捕捉できず、凝集塊が濾過時下流に配置された有核細胞捕捉材に到達して有核細胞捕捉材の細孔を閉塞するため、濾過流速が遅くなり、また有核細胞は凝集塊に取り込まれて回収率の低下を招くため好ましくない。

本発明における平均繊維径とは、以下の手順に従って求められる値をいう。即ちフィルター材を構成する、実質的に均一と認められるフィルター材（例えば、有核細胞捕捉材、回収液整流化材、凝集塊捕捉材）の一部をサンプリングし、走査型電子顕微鏡などを用いて、１０００〜３０００倍の倍率で写真に撮る。サンプリングに際しては、フィルター材の有効濾過断面積部分を、一辺が０．５〜１ｃｍの正方形によって区分し、その中から３ヶ所以上、好ましくは５ヶ所以上をランダムサンプリングする。ランダムサンプリングするには、例えば上記各区分に番地を指定した後、乱数表を使うなどの方法で、必要箇所以上の区分を選べばよい。またサンプリングした各区分について、３ヶ所以上、好ましくは５ヶ所以上を写真に撮る。このようにして得た写真について、写っている全ての繊維の直径を測定する。ここで直径とは、繊維軸に対して直角方向の繊維の幅をいう。測定した全ての繊維の直径の和を、繊維の数で割った値を平均繊維径とする。但し、複数の繊維が重なり合っており、他の繊維の陰になってその幅が測定できない場合、また複数の繊維が溶融するなどして、太い繊維になっている場合、更に著しく直径の異なる繊維が混在している場合、等々の場合には、これらのデータは削除する。以上の方法により、500本以上、好ましくは1000本以上のデータにより平均繊維径を求める。

本発明における平均孔径とは、フィルター材表面から材の厚み方向に対して０．５ｍｍ以下の部分で血液の流れ方向に対しできるだけ垂直に切断したある厚みを持った検体を水銀圧入法（島津製作所、ポアサイザ９３２０）で測定し、水銀がフィルター材の細孔に全く入っていない状態を水銀圧入量０％、多孔質素子のすべての細孔に入っている状態を水銀圧入量１００％とした時、水銀圧入量５０％に当たる点が本発明でいう平均孔径である。尚、水銀ポロシメーターでの測定は１〜１０００ｐｓｉａの圧力範囲で測定する。非常に柔軟なためそのままでは水銀ポロシメーターで測定する際に変形を受け、細孔が検出できないようなフィルター材であっても、細孔が圧変形されないように固定化する等の予備調整を施すことにより上記測定が可能となるフィルター材も本発明に含まれる。

本発明においては、有核細胞捕捉材と回収液整流化材を特定方向に充填したフィルター装置を使用することが好ましいが、同時に、フィルター材の有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値が１５〜１２０ｃｍであるフィルター材を用いることも好ましい。この値が１２０ｃｍを超える場合、有核細胞捕捉材の厚みに対して有効濾過面積が広すぎて回収時に回収液が濾過部に均一に広がらず、有核細胞の回収率低下を招くため好ましくない。一方、この値が１５ｃｍを下回る場合、有効濾過面積が狭く有核細胞捕捉材が厚いため濾過時の流速低下を招く。また、回収液をフィルター装置に導入する際の抵抗が大きいため、回収液の流速が低下して有核細胞の回収率低下を招くため好ましくない。

また、これらのフィルター材はこのままでも用いられるが、必要に応じ、アミノ酸、ペプチド、糖タンパク（抗体、接着分子等のバイオリガンドを含む）といった、特定の細胞に親和性のあるリガンドを固定してもよい。さらに、フィルター材に血小板通過性を付与する場合、例えば特公平６−５１０６０号公報で提案されているように、ヒドロキシエチルメタクリレートを主成分とする合成高分子等でフィルター材表面を改質してもよい。

また、フィルター装置の容器としては特に限定はないが、例えば、特公平２‐１３５８８号公報に示される白血球除去フィルター装置の形状のような容器を用いることができる。また、これらにおいて細胞含有液の入口と出口以外に回収液の入口と出口を別に設けてもよい。

容器の材質としては、水不溶性で、成形性、滅菌性に優れ、細胞毒性が低いものが好ましい。さらに、濾過時に細胞含有液をフィルター装置に導入する場合や、回収時に回収液をフィルター装置に導入する場合に、フィルター装置内部に負荷される圧力によって実質的に膨張しない硬い材質が好ましい。濾過時にフィルター装置の容器が膨張すると回収液の流速が低下してフィルター材に捕捉された有核細胞を洗い流す剪断力が低下するため、また多くの回収液が残留して回収率が低下するため好ましくない。また、容器の溶着部の破損のおそれもある。好ましい材質としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等が挙げられるが、硬質かつ医療用途に適したものであればこれらに限定されない。

本発明で用いる回収液としては、有核細胞の損傷が少なく、且つ高率に回収可能なものが好ましい。好ましいものを例示すると、市販の生理食塩液、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）やＨＢＳＳ（ハンクス液）等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等の細胞培養用培地、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子溶液、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルスターチ、デキストラン、キチン誘導体、コラーゲン、フィブロネクチン、アルブミン、グロブリン等の天然高分子溶液、グルコース、サッカロース、マルトース、ソルビトール、グリセリン、ジメチルスルホキシド等の有機物溶液及びこれらの混合物が挙げられる。また、２価カチオンを除去して細胞剥離を容易にする目的でキレート剤が含有されていてもよい。デキストランやヒドロキシエチルスターチ等の高分子溶液は凍害保護剤としても機能するため、そのまま或いはＤＭＳＯ等の凍害保護剤を更に添加することで凍結保存も可能である上、生食等に比し粘性を上げることができ、回収時の剪断力を向上できるため、我々の評価では好結果を得ており、回収液としてより好ましい。また、前述したように細胞含有液を層分離する際得られる有核細胞希薄層の一部または全部は、回収液の少なくとも一部として用いることができる。この場合、自己由来成分であるため有核細胞へのダメージがなく、またウィルス感染のリスクもないため好ましい。

本発明で行う回収方法としては、特に限定しないが、回収液の流速は剪断力を高め、有核細胞を高率で回収するためにできるだけ高速が好ましいが、内圧上昇によるフィルター装置とチューブ等の接続部のはずれや、有核細胞へのダメージを起こさない流速に制御することが好ましい。また、回収液をフィルター装置に導入する手段は、シリンジポンプ、ブラッドポンプ、ペリスタポンプ等の装置を用いるものや、簡便法としてシリンジを手で押す方法、液体を貯留したバッグを押しつぶして液流を惹起する方法、落差処理等が挙げられる。更に、有核細胞の回収率をより高めるために、フィルター装置に振動を加えるとか、ストップドフロー等を行ってもよい。回収液をフィルター装置に導入する方向は、細胞含有液を導入した方向と同方向または逆方向があるが、一般的に後者の方が細胞回収率が高いので好ましい。

本発明において、不要細胞をより多く除去するために濾過後にフィルター装置をリンスしてもよい。リンス液としては、有核細胞が漏洩しにくく、不要細胞が洗い流されるものが好ましい。例えば、市販の生理食塩液またはＤ−ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝液）やＨＢＳＳ（ハンクス液）等の緩衝液が挙げられ、それらにアルブミン等の蛋白質が含有されていてもよい。また、リンスする際の流速は特に限定しないが、有核細胞をフィルター材の上流側に留めておき、また細孔の奥への入り込みを防ぐために、できるだけ低速が好ましい。

また、フィルター装置に回収液を導入して有核細胞を回収後に、さらに回収した有核細胞含有液を遠心して上清を除くことにより、さらに有核細胞を濃縮できるので好ましい。

本発明は、前記細胞濃縮物の調製方法により得られた細胞組成物を凍結保存する工程もさらに含む。そして、前記調製方法により高い回収率で得られ、しかも赤血球容量が少ない単核球画分を効率よく凍結保存するためには、貯留バッグの形状や凍結保存工程にも工夫を凝らすことが好ましいので、それらについて以下に説明する。

先ず、本発明による細胞の凍結保存方法の一例を、図１に示したシステムを用いて細胞分離を行った場合について説明する。なお、この例においては、図１の５０は凍結保存部を有する貯留バッグで、その貯留バッグは図２の凍結保存部１２０を有する貯留部１００を用いている。

まず、クランプ２１と２２を閉じ、細胞含有液バッグと血液導管１１を接続する。次に、クランプ２１を開け、有核細胞を捕捉し不要細胞は通過させるフィルター材を組み込んだ細胞分離フィルター装置４０に細胞含有液を導入し、不要細胞をフィルター装置から排出させる。このように細胞含有液バッグ内の全ての細胞含有液が細胞分離フィルター装置４０に導入され、濾過した細胞含有液はドレインバッグ７０に排出された後、クランプ２１、２３を閉じる。次に、クランプ２２を開けて回収液注入口６０から回収液を細胞分離フィルター装置４０に導入し、フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収しつつ、血液導管口に接続した貯留バッグ５０の有核細胞導入口８０を介して、貯留バッグ５０に移行させ、貯留させる。貯留バッグ５０に有核細胞が貯留される際、エア排出用フィルター装置９０から貯留バッグ５０内のエアを排出する。次に、貯留バッグ５０の有核細胞導入口８０をヒートシールして、貯留バッグ５０を細胞分離システムから溶断分離する。このように切り離した貯留バッグ５０を、凍結保存部１２０が遠心カップの底面に来るように固定して遠心分離する。遠心分離によって有核細胞を凍結保存部１２０に濃縮した後、溶断分離部１１０をヒートシーラーで溶断分離し、凍結保存部１２０を密閉状態で分離する。次に凍害保護剤導入部１３０から凍害保護剤を導入し、その後凍結保存部１２０を凍結保存する。

前記凍結保存方法に、凍結保存する際の細胞浮遊液中の不要細胞の混入量としては、凍結保存容積を小さくするためにもできるだけ少ない方が好ましい。具体的には、凍害保護液を加える直前の有核細胞濃縮液の容積に対する混入不要細胞の容積の比率は、６５％以下が好ましく、４５％以下がより好ましい。６５％を超える場合、後述する容器分離工程において、有核細胞を遠心濃縮後、上清を除去する際の液面或いは有核細胞濃縮液を密封する際の溶断面近くまで有核細胞が接近し、有核細胞を失う可能性が高くなる。

本発明で言う「貯留バッグ」とは、凍結保存部と貯留部およびそれらを介する狭窄部からなり、さらに、前記貯留部には有核細胞の導入口が取り付けられていて、有核細胞が狭窄部を介して流通可能な形状を有する。貯留バッグの形状の一例を図２〜図４に示す。図２〜図４において、８０は有核細胞導入口、９０はエア排出フィルター装置、１００は貯留部、１１０は狭窄部（溶断分離部）、１２０は凍結保存部、１３０は凍害保護剤導入部、１４０は有核細胞の取り出し口である。

本発明で言う「貯留部」は、可撓性の材質からなる有核細胞を貯留可能な部分である。有核細胞導入口８０は、貯留バッグのいずれの位置に取り付けられていてもよいが、操作上の理由から貯留部１００に付いていることが好ましい。

前記貯留バッグはその内部形状が重要である。すなわち、図示したように、凍結保存部１２０から狭窄部（溶断分離部）１１０を介して徐々に断面積を広める拡大部を有する形状（貯留部１００の一部において断面積が変化する形状）であると、ａの方向に遠心力を負荷した時に凍結保存部１２０を狭窄部１１０で溶断分離しやすく且つ貯留部１００の有核細胞を効率的に凍結保存部１２０に導くために好ましい。ここで、徐々に断面積を広げる拡大部の角度（図２〜４のｂ）としては、２０度以上１５０度以下が好ましく、４５度以上１２０度以下がより好ましい。２０度未満の場合、貯留部１００が長方形の長辺方向が長くなり、遠心分離時に貯留バッグが遠心カップに入らないなど取扱性が悪くなる。一方、１５０度より大きい場合、有核細胞が拡大部に蓄積して凍結保存部１２０に十分導くことができず細胞のロスを招く。また、貯留部１００および凍結保存部１２０は分離された有核細胞液が貯留されない状態でも空間を確保するように立体成型されていてもよい。

本発明で言う「凍結保存部」とは、耐低温性を有する可撓性の性質で、細胞含有液から分離された有核細胞を貯留部と共に一旦貯留し、その後、遠心分離で濃縮された有核細胞を収容可能な部分である。耐低温性を有する材質としては、ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ）、パーフルオロエチレンプロピレン（ＦＥＰ）などのフッ素樹脂、ポリイミド等が挙げられるが、これらに限定するものではない。

本発明で言う「貯留された有核細胞を貯留バッグ内で、凍結保存部を回転半径上の回転軸から遠い位置に配置させて遠心分離する細胞濃縮工程」とは、貯留バッグに移行された有核細胞を、凍結保存部１２０に濃縮させるために強い遠心力が負荷されるよう、有核細胞が貯留された貯留バッグを固定して遠心分離することである。具体的には遠心時に遠心カップの底面側に凍結保存部１２０を配向し、固定して遠心分離することである。

本発明で言う「濃縮された有核細胞を、空気を含まない状態で凍結保存部に密封し溶断分離する容器分離工程」とは、凍結保存部１２０の空気を貯留部１００側に追い出しながら、凍結保存部内に沈降した有核細胞を凍結保存部外部に漏出しないようにヒートシーラーで凍結容器材質の融点以上の熱を与えて有核細胞を封じ込めた後、ハサミやカッターなどを用いて凍結保存部１２０を貯留部１００から切り離すことを言う。凍結保存部１２０内の空気を追い出す方法としては、貯留部１００と凍結保存部１２０を介する狭窄部１１０を上に向けて凍結保存部１２０の空気がある部分を指でつまむまたは指ではじいて貯留部１００側へ追いやる方法が挙げられる。更に、上清を抜かずにそのまま細孔部でヒートシールを行うと空気が入りにくく、また凍結保存部１２０内の液の動きが抑えられて有核細胞がロスしにくいため好ましい。

本発明で言う「有核細胞の取り出し口」とは、凍結保存部１２０の内部と外部空間とを連通可能な耐低温性の流通部であり、凍結保存部１２０を解凍処理後、内部の有核細胞を取り出す機能を有しているものを言う。例えば、ルアアダプターにスクリューキャップで閉じられたもの、ラバー栓などがあるが、これらに限定されるものではない。

本発明で言う「凍害保護剤導入部」とは、凍結保存部１２０の内部と外部空間とを連通可能な耐低温性の流通部であり、貯留部１００または凍結保存部１２０に凍害保護剤を導入可能な機能を有しているものを言う。例えば、ルアアダプターにスクリューキャップで閉じられたもの、ラバー栓などがあるが、これらに限定されるものではない。また、この凍害保護剤導入部は凍害保護剤を貯留部１００または凍結保存部１２０に導入後はヒートシーラー等で溶断分離して切り離すと、凍結保存部１２０から突起物をなくすことができ破損のリスクを低減できる。

凍害保護剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に凍害保護剤を貯留部または凍結保存部に導入するタイミングとしては、容器分離工程の前後が導入量を少なくできるため好ましい。一般によく使用されるジメチルスルホキシドは常温では毒性を有するため、細胞濃縮工程より前の場合、凍害保護剤との接触時間が長くなり、細胞にダメージを与えるため特に好ましくない。

本発明で言う「エア排出用フィルター装置」とは、貯留部１００に具備され、貯留部１００内のエアを貯留部１００外へ排出する部分であり、内部のエアは外部に排出できるが外部からの汚染物の侵入を阻止する機能を有する。貯留バッグにおいて、分離された有核細胞を貯留部１００に移行する際、貯留部１００内は有核細胞液だけでなく元々貯留部１００に存在していたエアや有核細胞の移行時に伴ってきたエアが存在することになり、貯留部１００および凍結保存部１２０が膨れて破裂の危険性がある。そのため、エア排出用フィルター装置を貯留部１００に具備することにより、破裂を防止できるため好ましい。フィルター材が除菌作用を有する多孔質膜は貯留部１００内に細菌の流入を防止でき好ましい。この多孔質膜は、通気が容易でバクテリアやウィルスの流入を防止可能な孔径を有するもので、０．１〜０．６μｍの孔径が好ましい。また、万一細胞含有液に接触しても湿らず通気が可能な疎水性のものが好ましい。また、同じ目的で貯留部１００に「エア排出用導管」を有核細胞の導管とは別に設けてもよい。この導管は閉鎖系で貯留部１００内のエアを血液バッグや細胞分離する工程で使用したシステムと連結して、排出することができる。

本発明で言う「有核細胞が密封された凍結保存部を凍結し保存する凍結保存工程」とは、細胞の凍結保存方法として一般に行われている方法であれば特に限定はないが、落下などの衝撃による破損を防ぐため、凍結保存部１２０は金属製のキャニスターに入れて保護した方が好ましく、細胞へのダメージを低減するために液体窒素保存前にプログラムフリーザーで凍結保存した方が好ましい。液体窒素での凍結保存は気相または液相のどちらで行ってもよい。

本発明による細胞の凍結保存方法においては、細胞浮遊液から有核細胞を分離した後の凍結保存するまでの処理を同一容器内で密閉系で行うことが好ましい。本発明でいう「密閉系」とは、有核細胞のロス、細菌汚染のリスクを低減できるように、外界に対して閉鎖されている系であれば任意の構成をとることができ、好ましくは、工程（ｂ）〜（ｅ）の間に、有核細胞が外界の空気と接触しないような構成を採用することができる。さらに好ましくは、例えばフィルター法による細胞分離システムと凍結保存容器をつないでおけば、細胞分離から凍結保存までの全工程を密閉系で行え、細菌汚染のリスクが格段に低くなる。
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

以下の実施例１〜２及び比較例１〜４は臍帯血から単核球を分離、濃縮し、最終容積を４ｃｍ³にする方法について例示する。この場合の不要細胞は赤血球である。

〔実施例１〕赤血球凝集剤で臍帯血を層分離したものを濾過する方法
（１）細胞分離フィルター装置の作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦４３ｍｍ、横４３ｍｍ、高さ２．９ｍｍ（有効濾過断面積１８．５ｃｍ²、内容積７ｃｍ³）で液体流出口と液体流入口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側から、第１層目に凝集塊捕捉材として平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布０．１４ｇを、第２層目に有核細胞捕捉材として１．７μｍのポリエステル不織布１．２８ｇを、第３層目に回収液整流化材として平均繊維径１．１μｍのポリエステル不織布０．１９ｇからなるフィルター材を充填した。尚、第１層目、第２層目および第３層目の充填密度はそれぞれ０．２０ｇ／ｃｍ³、０．２４ｇ／ｃｍ³および０．２０ｇ／ｃｍ³であった。また、該フィルター材に血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（モル比で９７：３）の１％エタノール溶液を該細胞分離フィルター装置の液体流入口から通液し、窒素ガスで余分なポリマー溶液をパージした後、６０℃で８時間以上真空乾燥機で乾燥させた。

（２）細胞分離システム
図１の細胞分離システムを使用した。

（３）細胞濃縮操作
事前にクランプ２１、２２を閉じておいた。２００ｃｍ³血液バッグに貯留されたＣＰＤ加ヒト臍帯血１００ｃｍ³（ヘマトクリット値２７．８％）に、６％ヒドロキシエチルスターチ（菱山製薬「ＨＥＳ４０（赤血球沈降剤）」）を２０ｃｍ³添加して、１０分間混和した。次に、血液バッグと血液導管１１を接続し、血液バッグを吊り下げ、1時間静置した。血液バッグ内の赤血球が沈降し、上層の白血球層と下層の赤血球層の界面が明確になったことを確認後、クランプ２１を開け、落差により濾過を開始した。この時、下層の赤血球層から細胞分離フィルター装置４０に流れ、続いて上層の白血球層が流れていき、細胞分離フィルター装置４０内に残留する赤血球が洗い流される様子が観察された。濾過された血液はドレインバッグ７０に貯留した。血液バッグ内の全ての血液が細胞分離フィルター装置４０に導入されたことを確認後、クランプ２１、２３を閉じた。次に、１０％デキストラン生理食塩水溶液（小林製薬「デキストラン４０注」）にヒト血清アルブミンを最終濃度３％になるように添加した液体１９ｃｍ³とエア１８ｃｍ³をシリンジに充填した。次に、クランプ２２を開けて回収液注入口６０から、液体、気体の順に手動で通液し、回収バッグ５０に単核球を回収した（回収単核球液１）。この場合の回収された細胞液量は２３ｃｍ³、ヘマトクリット値は３．５％、回収に要した時間は２秒（流速５７０ｃｍ³／分）であった。更にこの後、回収された単核球をコニカルチューブに移し、４００Ｇ×１５分の遠心条件で遠心分離した。最終容積が４ｃｍ³になるように上清を除去した後、転倒混和して沈さをほぐした（回収単核球液２）。

（４）分析
本細胞濃縮操作での細胞数のカウントは多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定し、回収単核球液１の赤血球容積、単核球回収率１、単核球回収率２を以下の計算式にて算出した。
赤血球容積（ｃｍ³）＝回収単核球液１のヘマトクリット値×回収単核球液１の液量÷１００
単核球回収率１（％）＝１００×（回収単核球液１の単核球数／臍帯血の単核球数）
単核球回収率２（％）＝１００×（回収単核球液２の単核球数／臍帯血の単核球数）

（５）結果
本細胞濃縮操作での赤血球容積は０．８ｃｍ³、単核球回収率１は８５％、単核球回収率２は８２％であった。

〔実施例２〕強遠心で臍帯血を層分離したものを濾過する方法
（１）細胞分離フィルター装置の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）細胞分離システム
図１の細胞分離システムを使用した。

（３）細胞分離操作
事前に図１の細胞分離システムのクランプ２１、２２、２３を閉じておいた。ＣＰＤ加ヒト臍帯血１００ｃｍ³（ヘマトクリット値３１．１％）を貯留した２００ｃｍ³血液バッグと血液導管１１を接続し、血液バッグが垂直に立った状態で遠心カップに固定し、３０００Ｇで１２分間、１０℃で遠心した。次に遠心カップから血液バッグと細胞分離システムを静かに取り出し、血液バッグを吊り下げた。この時血液バッグ内は、上層の血漿層、中間層のバフィーコート層、下層の赤血球層の三層に層分離していた。界面を乱さないように上層の血漿層から回収液用にシリンジに１９ｃｍ³採取し、クランプ２１と２３を開け、落差により濾過した。この時、下層の赤血球層から細胞分離フィルター装置４０に流れ、続いて中間層のバフィーコート層、最後に上層の血漿層が流れていき、細胞分離フィルター装置４０内に残留する赤血球が洗い流される様子が観察された。濾過された血液はドレインバッグ７０に貯留した。血液バッグ内の全ての血液が細胞分離フィルター装置４０に導入されたことを確認後、クランプ２１、２３を閉じた。その後、先にシリンジに採取しておいた血漿にエア１８ｃｍ³を加え、クランプ２２を開けた後、回収液注入口６０から液体、気体の順に手動で通液し、回収バッグ５０に単核球を回収した（回収単核球液１）。この場合の回収された細胞液量は２３ｃｍ³、ヘマトクリット値０．１２％、回収に要した時間は２秒（流速５７０ｃｍ³／分）であった。更にこの後、回収された単核球をコニカルチューブに移し、４００Ｇ×１５分の遠心条件で遠心分離した。最終容積が４ｃｍ³になるように上清を除去した後、転倒混和して沈さを解した（回収単核球液２）。

（４）結果
本細胞濃縮操作での赤血球容積は０．５ｃｍ³、単核球回収率１は８７％、単核球回収率２は８４％であった。

〔比較例１〕臍帯血を層分離せずに濾過する方法
（１）細胞分離フィルター装置の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）細胞分離システム
図１の細胞分離システムを使用した。

（３）細胞分離操作
１００ｃｍ³の臍帯血（ヘマトクリット値２８．２％）を層分離せずにそのまま細胞分離フィルター装置４０に導入し、それ以降は実施例１と同様の操作を行った。回収された細胞液量は２３ｃｍ³で、ヘマトクリット値は９．１％、回収に要した時間は２秒（流速５７０ｃｍ／分）であった。

（４）結果
本細胞濃縮操作での赤血球容積は２．１ｃｍ³、単核球回収率１は８５％、単核球回収率２は６０％であった。

〔比較例２〕臍帯血を赤血球凝集法で単核球分離する方法１
２００ｃｍ³血液バッグに貯留されたＣＰＤ加ヒト臍帯血１００ｃｍ³（ヘマトクリット値２９．６％）に、６％ヒドロキシエチルスターチ（菱山製薬「ＨＥＳ４０（赤血球沈降剤）」）を２０ｃｍ３添加して、１０分間混和した。この血液バッグを垂直に立つように遠心カップに固定して、５０Ｇ×５分、１０℃で遠心した。次に、分離スタンドで血液バッグを押さえてできるだけ赤血球層を吸い上げないように上層の白血球層６０ｃｍ３を採取し（単核球回収液１）、コニカルチューブに移し変えた。単核球回収率１のヘマトクリット値は２．５％であった。更に、４００Ｇ×１０分、１０℃で遠心後、沈さ４ｍｌを残して上清を除去し、転倒混和して沈さを解した（単核球回収液２）。本細胞濃縮操作での赤血球容積は１．５ｃｍ³、単核球回収率１は６６％、単核球回収率２は５８％であった。

〔比較例３〕臍帯血を赤血球凝集法で単核球分離する方法２
２００ｃｍ³血液バッグに貯留されたＣＰＤ加ヒト臍帯血１００ｃｍ³（ヘマトクリット値３３．３％）に、６％ヒドロキシエチルスターチ（菱山製薬「ＨＥＳ４０（赤血球沈降剤）」）を２０ｃｍ³添加して、１０分間混和した。この血液バッグを垂直に立つように遠心カップに固定して、５０Ｇ×５分、１０℃で遠心した。次に、分離スタンドで血液バッグを押さえて下層の赤血球層を含め上層の白血球層６５ｃｍ³を採取し（単核球回収液１）、コニカルチューブに移し変えた。単核球回収率１のヘマトクリット値は１０％であった。更に、４００Ｇ×１０分、１０℃で遠心後、沈さ４ｍｌを残して上清を除去した（単核球回収液２）。本細胞濃縮操作での赤血球容積は６．５ｃｍ³、単核球回収率１は８５％、単核球回収率２は３２％であった。

〔比較例４〕強遠心で臍帯血を層分離して単核球分離する方法
上部と下部にそれぞれ抜き取り用の導管を有する２００ｃｍ³血液バッグにＣＰＤ加ヒト臍帯血１００ｃｍ³（ヘマトクリット値２７．３％）を貯留し、垂直に立つように遠心カップに固定して、３０００Ｇ×１２分、１０℃で遠心した。分離スタンドで血液バッグを押さえつけ、血液バッグの上から上層の血漿層を、血液バッグの下から下層の赤血球層を追い出し、血液バッグ内にバフィーコート層を含め３０ｃｍ³残るようにした（単核球回収液１）。単核球回収液１のヘマトクリット値は４０％であった。次にコニカルチューブに移し変え、４００Ｇ×１０分、１０℃で遠心後、沈さ４ｍｌを残して上清を除去した（単核球回収液２）。本細胞濃縮操作での赤血球容積は１２．０ｃｍ³、単核球回収率１は９５％、単核球回収率２は２１％であった。

実施例及び比較例の結果を表１にまとめた。表１の結果から分かるように、本発明の実施例の方法によれば、赤血球容量を削減できると同時に、高い単核球回収率を達成することができる。

以下の実施例３〜６、比較例５〜９は、臍帯血から単核球を分離、濃縮する方法について例示する。この場合の不要細胞は赤血球である。

〔実施例３〕
（１）細胞分離フィルター装置の作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦４３ｍｍ、横４３ｍｍ、高さ２．９ｍｍ（有効濾過断面積１８．５ｃｍ²、内容積７ｃｍ³）で液体流出口と液体流入口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側から、第１層目に有核細胞捕捉材として平均繊維径１．７μｍのポリエステル不織布１．３７ｇを、第２層目に回収液整流化材として平均繊維径１．１μｍのポリエステル不織布０．１９ｇからなるフィルター材を、上容器と下容器の周辺で挟み込むように充填して容器入口側空間と出口側空間に分離した。尚、第一層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ２．５ｍｍ及び０．２４ｇ／ｃｍ³、第２層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ０．４ｍｍ及び０．２０ｇ／ｃｍ³であり、有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は７４ｃｍであった。また、該フィルター材に血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（モル比で９７：３）の１％エタノール溶液を該細胞分離フィルター装置の液体流入口から通液し、窒素ガスで余分なポリマー溶液をパージした後、６０℃で８時間以上真空乾燥機で乾燥させた。

（３）細胞分離操作
細胞分離フィルター装置に、ＣＰＤ加ヒト臍帯血１００ｃｍ³を細胞含有液の入口から落差により通液して単核球を捕捉した。濾過した血液はドレインボトルに回収した。その後、市販の１０％デキストラン生理食塩水溶液（小林製薬「デキストラン４０注」）にヒト血清アルブミンを３％になるように添加した液体１９ｃｍ³とエア１８ｃｍ³をシリンジに充填し、細胞含有液の出口から手動で通液し、細胞含有液の入口から単核球を回収した。この場合の回収された細胞液量は２３ｃｍ³、回収に要した時間は２秒（流速５７０ｃｍ³／分）であった。

（４）分析
本細胞分離操作での細胞数のカウントは多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定し、単核球回収率を以下の計算式にて算出した。
単核球回収率（％）＝１００×（回収細胞液中の単核球数／臍帯血中の単核球数）

（５）結果
本細胞分離操作での単核球回収率は８５％、濾過時間は６分であった。

〔実施例４〕
（１）細胞分離フィルター装置の作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦３０ｍｍ、横３０ｍｍ、高さ１２．４ｍｍ（有効濾過断面積９ｃｍ²、内容積１１ｃｍ³）で液体流出口と液体流入口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側から、第１層目に有核細胞捕捉材として平均繊維径２．３μｍのポリエステル不織布１．３２ｇを、第２層目に回収液整流化材として平均繊維径１．１μｍのポリエステル不織布０．１９ｇからなるフィルター材を、上容器と下容器の周辺で挟み込むように充填して容器入口側空間と出口側空間に分離した。尚、第１層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ５．４ｍｍ及び０．２０ｇ／ｃｍ³、第２層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ７ｍｍ及び０．２０ｇ／ｃｍ³であり、有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は１６．７ｃｍであった。また、実施例1と同様に、不織布に親水性ポリマーのコーティングを行った。

（３）細胞分離操作
実施例３と同様の細胞分離を行った。回収された細胞液量は２１ｃｍ³で、回収に要した時間は３秒（流速３８０ｃｍ³／分）であった。

（４）結果
本細胞分離操作での単核球回収率は７５％、濾過時間は１０分（流速１０ｃｍ³／分）であった。

〔実施例５〕
（１）細胞分離フィルター装置の作製
容器は実施例３と同じものを用いた。容器の入口側から、第１層目に凝集塊捕捉材として平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布０．１４ｇを、第２層目に有核細胞捕捉材として１．７μｍのポリエステル不織布１．２８ｇを、第３層目に回収液整流化材として平均繊維径１．１μｍのポリエステル不織布０．１９ｇからなるフィルター材を充填した。尚、第１層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ０．３ｍｍ及び０．２０ｇ／ｃｍ³、第２層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ２．２ｍｍ及び０．２４ｇ／ｃｍ³、第３層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ０．４ｍｍ及び０．２０ｇ／ｃｍ³であり、有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は８４．１ｃｍであった。また、実施例３同様不織布に親水性ポリマーのコーティングを行った。

（３）細胞分離操作
実施例３と同様の細胞分離を行った。回収された細胞液量は２３ｃｍで、回収に要した時間は２秒（流速５７０ｃｍ³／分）であった。

（４）結果
本細胞分離操作での単核球回収率は８８％、濾過時間は４分（流速２５ｃｍ³／分）であった。

〔実施例６〕
（１）細胞分離フィルター装置の作製
容器は実施例３と同じものを用いた。容器の入口側から、第１層目に有核細胞捕捉材として充填時の平均孔径１２μｍのポリウレタン多孔質体を、第２層目に回収液整流化材として充填時の平均孔径６μｍのポリウレタン多孔質体からなるフィルター材を充填した。尚、第１層目の充填時厚み及び充填時空隙率はそれぞれ２．２ｍｍ及び６０％、第２層目の充填時厚み及び充填時空隙率はそれぞれ０．７ｍｍ及び６０％であった。有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は７４であった。また、実施例３同様ポリウレタン多孔質体に親水性ポリマーのコーティングを行った。

（３）細胞分離操作
実施例３と同様の細胞分離を行った。回収された細胞液量は２３ｃｍで、回収に要した時間は３秒（流速３８０ｃｍ³／分）であった。

（４）結果
本細胞分離操作での単核球回収率は８４％、濾過時間は６分（流速１６．７ｃｍ³／分）であった。

〔比較例５〕
（１）細胞分離フィルター装置の作製
容器は実施例３と同じものを用いた。フィルター材としては有核細胞捕捉材として１．７μｍのポリエステル不織布１．６７ｇを充填した。尚、フィルター材の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ２．９ｍｍ及び０．２５ｇ／ｃｍ³であり、有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は６２．１ｃｍであった。また、実施例３同様不織布に親水性ポリマーのコーティングを行った。

（３）細胞分離操作
実施例３と同様の細胞分離を行った。回収された細胞液量は２３ｃｍ³で、回収に要した時間は３秒（流速３８０ｃｍ³／分）であった。

（４）結果
本細胞分離操作での単核球回収率は６５％、濾過時間は７分（流速１４．３ｃｍ³／分）であった。

〔比較例６〕
（１）細胞分離フィルター装置の作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦２２ｍｍ、横２２ｍｍ、高さ１２．４ｍｍ（有効濾過断面積５．３ｃｍ²、内容積７ｃｍ³）で液体流出口と液体流入口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側から、第１層目に有核細胞捕捉材として平均繊維径１．７μｍのポリエステル不織布１．５０ｇを、第２層目に回収液整流化材として１．１μｍのポリエステル不織布０．３０ｇからなるフィルター材を充填した。尚、第一層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ１０ｍｍ及び０．２４ｇ／ｃｍ³、第２層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ２．４ｍｍ及び０．２０ｇ／ｃｍ³であり、有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は５．３ｃｍであった。また、実施例３同様不織布に親水性ポリマーのコーティングを行った。

（３）細胞分離操作
実施例３と同様の細胞分離を行ったが、濾過開始後急激に流速が低下し、３０分を過ぎたところで１時間以上経過しても濾過が完了しなかった。

〔比較例７〕
（１）細胞分離フィルター装置の作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦７４．２ｍｍ、横７４．２ｍｍ、高さ３ｍｍ（有効濾過断面積５５ｃｍ²、内容積１６ｃｍ³）で液体流出口と液体流入口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側から、第１層目に有核細胞捕捉材として平均繊維径１．７μｍのポリエステル不織布３．６１ｇを、第２層目に回収液整流化材として１．１μｍのポリエステル不織布０．５８ｇからなるフィルター材を充填した。尚、第一層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ２．５ｍｍ及び０．２４ｇ／ｃｍ³、第２層目の充填時厚み及び充填密度はそれぞれ０．５ｍｍ及び０．２０ｇ／ｃｍ³であり、有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は２２０ｃｍであった。また、実施例３同様不織布に親水性ポリマーのコーティングを行った。

（４）結果
本細胞分離操作での単核球回収率は５５％、濾過時間は４分（流速３３．３ｃｍ³／分）であった。

〔比較例８〕
（１）細胞分離フィルター装置の作製
軟質塩化ビニール製の液体流入口を有するシート一枚と液体流出口を有するシート一枚で、液体流入口側から、第１層目に有核細胞捕捉材として平均繊維径１．７μｍのポリエステル不織布１．３７ｇを、第２層目に回収液整流化材として平均繊維径１．１μｍのポリエステル不織布０．１９ｇからなるフィルター材を挟み、有効濾過断面積が１８．５ｃｍ²になるように周辺を高周波溶着して袋状のフィルター装置を作成した。第１層目の不織布が２．２ｍｍになるようにこのフィルター装置を二枚のアクリル板で挟み、厚みを調節した。不織布の厚みの調節は、同様に作成したフィルター装置を用いて別途キャリブレーションし、二枚のアクリル板の間隔により調節した。この場合の内容積は７ｃｍ³であった。有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は７４であった。また、ここで使用した不織布はフィルター装置作成前に実施例１と同じ親水性ポリマーのエタノールに浸漬し、６０℃で８時間以上真空乾燥機で乾燥させた後、使用した。

（３）細胞分離操作
濾過は実施例３と同様に行った。一方、回収時は、フィルター装置を挟んでいた二枚のアクリル板の間隔を広げて、前記キャリブレーションにより有核細胞捕捉材の厚みを３．５ｍｍになるように調整した後（内容積１１ｍｌ、有核細胞捕捉材の充填密度０．１７ｇ／ｃｍ³）、１０％デキストラン生理食塩水溶液にヒト血清アルブミンを３％になるように添加した液体２３ｃｍ³とエア１８ｃｍ³をシリンジに充填し、細胞含有液の出口から手動で通液し、細胞含有液の入口から単核球を回収した。この場合のフィルター材の有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値は５１．４ｃｍであった。回収された細胞液量は２２ｃｍ³で、回収に要した時間は５秒（流速２７６ｃｍ³／分）であった。

（４）結果
本細胞分離操作での単核球回収率は４５％、濾過時間は６分（流速１６．７ｃｍ³／分）であった。

〔比較例９〕
（１）細胞分離フィルター装置の作製
比較例８と同じフィルター装置を用いた。

（３）細胞分離操作
１０％デキストラン生理食塩水溶液にヒト血清アルブミンを３％になるように添加した液体９５ｃｍ³とエア１８ｃｍ³を回収液とした以外は比較例８と同じ操作を行った。回収された細胞液量は１００ｃｍ³で、回収に要した時間は１分（流速１００ｃｍ³／分）であった。

（４）結果
本細胞分離操作での単核球回収率は８５％、濾過時間は６分（流速１６．７ｃｍ³／分）であった。

実施例及び比較例の結果を表２にまとめた。

以下の実施例７及び比較例１０〜１１は臍帯血から単核球をフィルター装置で分離した後、遠心濃縮し、凍結保存する方法について例示する。この場合の不要細胞は赤血球である。

〔実施例７〕
（１）細胞分離フィルター装置の作製
実施例１と同じものを使用した。

（３）貯留バッグ
図２のタイプの貯留バッグを使用した。貯留部の内容積は４０ｃｍ³で、凍結保存部の内容積は５ｃｍ³。材質はエチレン酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ）のものを使用した。

（４）細胞濃縮操作
事前にクランプ２１、２２、２３を閉じておいた。２００ｃｍ³の細胞含有液バッグに貯留されたＣＰＤ加ヒト臍帯血１００ｃｍ³と血液導管１１を接続した。クランプ２１と２３を開け、落差により濾過を開始した。濾過された血液はドレインバッグ７０に貯留した。細胞含有液バッグ内の全ての血液が細胞分離フィルター装置４０に導入されたことを確認後、クランプ２１、２３を閉じた。次に、１０％デキストラン生理食塩水溶液（小林製薬「デキストラン４０注」）にヒト血清アルブミンを最終濃度３％になるように添加した液体１９ｃｍ³とエア１８ｃｍ³をシリンジに充填した。次に、クランプ２２を開けて回収液注入口６０から手動で通液し、凍結保存部５を有する貯留バッグに単核球を回収した。この場合の回収された細胞液量は２３ｃｍ³であった。ヒートシーラーを用いて細胞分離システムから貯留バッグを切り離した後、凍結保存部１２０を遠心カップの底面側にして１０００Ｇ×１５分の遠心条件で遠心分離した。狭窄部（溶断分離部）１１０までの上清を除去し、凍結保存部１２０の空気を追い出しながらヒートシーラーを用いて溶断分離部１１０で溶断し、貯留部１００から切り離した。次に凍結保存部１２０を指で押さえながら沈さをほぐした。凍結保存部１２０の表面を冷剤で冷やしながら凍害保護剤導入部１３０から５０％ジメチルスルホキシドをシリンジポンプを用いて０．３ｃｍ³／分の流速で１ｃｍ³加えた。最終容積は５ｃｍ³であった。その後、−８０℃中で２時間静置し、液体窒素の気相で凍結保存した。

（５）分析
凍結保存前に有核細胞の取り出し口１４０からサンプリングし、元の臍帯血と合わせて多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて単核球数を測定し、回収率を計算した。

（６）結果
本細胞濃縮操作での単核球回収率は８５％で、凍結解凍後、凍結保存部１２０の破損は見られなかった。

〔比較例１０〕
フィルター法で分離された単核球をコニカルチューブに移し変えて遠心濃縮し、更に単核球濃縮液を貯留バッグに移し変えて凍結保存した。
（１）細胞分離フィルター装置の作製
実施例７と同じものを使用した。

（２）細胞分離システム
図１の細胞分離システムで、貯留バッグの代わりに、本発明でいう狭窄部１１０や凍結保存部１２０を有さない通常の血液バッグを用いた。

（３）貯留バッグ
実施例７と同じものを使用した。

（４）細胞分離操作
実施例７と同様に図１の細胞分離システムで臍帯血を処理し、本発明でいう狭窄部１１０や凍結保存部１２０を有さない通常の血液バッグに有核細胞を回収した。回収された有核細胞液２３ｃｍ³を１４ｃｍ³コニカルチューブ２本に移し変えて１０００Ｇ×１５分の遠心条件で遠心分離した。容積が４ｃｍ³となるように上清を除去し沈さを再浮遊させた後に、５０％ジメチルスルホキシド１ｃｍ³を冷剤で冷やしながら０．３ｃｍ³／分の流速で加えた。その後、この細胞濃縮物を図２のタイプの貯留バッグに移し変え、実施例７と同様の方法で凍結保存した。

（５）結果
本細胞濃縮操作での単核球回収率は５０％であった。凍結解凍後、凍結保存部１２０の破損は見られなかった。

〔比較例１１〕
実施例７において、凍結保存部１２０内の空気を抜く操作を行わずに凍結保存した。
（１）細胞分離フィルター装置の作製
実施例７と同じものを使用した。

（３）貯留バッグ
実施例７と同じものを使用した。

（４）細胞分離操作
凍結保存部１２０に２ｃｍ³のエアを封入して凍結保存した以外は実施例７と同様に処理した。

（５）結果
本細胞濃縮操作での単核球回収率は８５％であったが、凍結解凍後、凍結保存部５の破損が見られた。

本発明による細胞濃縮物の調製方法は、細胞の凍結保存の前処理手段として用いられ、簡便に骨髄、臍帯血、末梢血等の細胞含有液から単核球等の有核細胞を赤血球等の不要細胞から効率的に分離でき、有核細胞の凍結保存溶液の容積を大幅に小さく出来るので有核細胞の凍結保存に有用な方法であり、保存コストを低く抑えるのに有効な手段として用いることができる。また、本発明の細胞の凍結保存方法は、骨髄、臍帯血、末梢血等の細胞含有液から単核球等の有核細胞を赤血球等の不要細胞から分離し、凍結保存するために使用でき、有核細胞のロス、細菌汚染のリスク、凍結容器破損のリスクを低減するのに有効な手段として用いることができる。

図１は、本発明による細胞濃縮物の調製方法を行うためのシステムの一例を示す模式図である。図２は、本発明の貯留バッグの形状の一例を示す模式図である。図３は、本発明の貯留バッグの形状の別の例を示す模式図である。図４は、本発明の貯留バッグの形状のさらに別の例を示す模式図である。

Claims

有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を、有核細胞を実質的に捕捉し不要細胞は実質的に通過するフィルター材を含んでなるフィルター装置に導入して有核細胞を該フィルター材に捕捉し不要細胞を排出させた後、該フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収する細胞濃縮物の調製方法において、有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離した後、上記フィルター装置に先ず該不要細胞に富む層を導入し、続いて該有核細胞に富む層を導入して有核細胞を該フィルター材に捕捉しながら該フィルター装置内に残存する不要細胞を排出させた後、該フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収し、前記不要細胞が赤血球であることを特徴とする細胞濃縮物の調製方法。
不要細胞を重力または遠心力によって沈降させることによって、少なくとも有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離する請求項１記載の細胞濃縮物の調製方法。
不要細胞を凝集させた後に不要細胞を重力または遠心力によって沈降させることによって、少なくとも有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液を有核細胞に富む層と不要細胞に富む層に層分離する請求項１記載の細胞濃縮物の調製方法。
前記有核細胞が造血幹細胞である請求項１乃至３の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
前記有核細胞が単核球である請求項１乃至３の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液にヒドロキシエチルスターチを添加することによって不要細胞を凝集させる請求項３記載の細胞濃縮物の調製方法。
前記有核細胞に富む層が有核細胞濃厚層と有核細胞希薄層からなり、フィルター装置に有核細胞希薄層、有核細胞濃厚層の順で導入する請求項１乃至６の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
前記有核細胞に富む層が有核細胞濃厚層と有核細胞希薄層からなり、フィルター装置に有核細胞濃厚層、有核細胞希薄層の順で導入する請求項１乃至５の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
前記有核細胞希薄層の一部または全部を回収液の少なくとも一部として用いる請求項８記載の細胞濃縮物の調製方法。
前記フィルター装置に回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を回収した後に、更に回収した有核細胞含有液を遠心分離し、上清を除くことにより有核細胞を濃縮する請求項１乃至９の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
前記フィルター材が、少なくとも細胞含有液の入口と出口を有する容器内に多孔質体からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が細胞含有液の入口側から出口側に向かってこの順に充填され、該フィルター材の有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値が１５〜１２０ｃｍであることを特徴とする請求項１乃至１０の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
多孔質体からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が積層されてなるフィルター材であって、且つ該フィルター材の有効濾過面積を充填時の有核細胞捕捉材の厚みで除した値が１５〜１２０ｃｍであるフィルター材が、有核細胞捕捉材が細胞含有液の入り口側になるように細胞含有液の入口と出口を有する容器に充填されてなるフィルター装置を用い、細胞含有液の入口から細胞含有液をフィルター装置に導入して有核細胞をフィルター材に捕捉させ、不要細胞を該フィルター装置から排出させた後、細胞含有液の出口側から回収液を導入して該フィルター材に捕捉されている有核細胞を細胞含有液の入口側から回収することを特徴とする請求項１に記載の細胞濃縮物の調製方法。
前記有核細胞捕捉材の細胞含有液入口側に更に凝集塊捕捉材が充填されている請求項１１または１２記載の細胞濃縮物の調製方法。
フィルター材が不織布である請求項１１乃至１３の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
不織布からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が、夫々、
ア）平均繊維径が１．１〜３．０μｍ、充填密度が０．１〜０．３ｇ／ｃｍ³である不織布からなる有核細胞捕捉材、
イ）平均繊維径が０．５〜１．５μｍ、充填密度が０．１〜０．３ｇ／ｃｍ³である不織布からなる回収液整流化材、
であり、有核細胞捕捉材、回収液整流化材の順番に平均繊維径が細くなることを特徴とする請求項１４記載の細胞濃縮物の調製方法。
フィルター材がスポンジ状構造体である請求項１１乃至１３の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
スポンジ状構造体からなる有核細胞捕捉材および回収液整流化材が、夫々、
ア）充填時の平均孔径が７〜２５μｍ、充填時の空隙率が５５〜９０％であるスポンジ状構造体からなる有核細胞捕捉材、
イ）充填時の平均孔径が２〜１０μｍ、充填時の空隙率が５５〜９０％であるスポンジ状構造体からなる回収液整流化材、
であり、有核細胞捕捉材、回収液整流化材の順番に平均孔径が小さくなることを特徴とする請求項１６記載の細胞濃縮物の調製方法。
フィルター材が不織布とスポンジ状構造体との組み合せである請求項１１乃至１３の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法。
請求項１乃至１８の何れかに記載の細胞濃縮物の調製方法の後に、さらに以下の工程を設ける細胞の凍結保存方法：
（ｂ）回収された有核細胞を、貯留部に設けた有核細胞導入口を介して、該貯留部と凍結保存部を有する貯留バッグに移行させ貯留する細胞貯留工程、
（ｃ）貯留された有核細胞を、前記貯留バッグ内で、凍結保存部を回転半径上の回転軸から遠い位置に配置させて遠心分離することにより有核細胞を貯留バッグ内の凍結保存部に移動させる細胞濃縮工程、
（ｄ）濃縮された有核細胞を、空気を含まない状態で凍結保存部に密封し溶断分離する容器分離工程、および
（ｅ）有核細胞が密封された凍結保存部を凍結し保存する凍結保存工程；
を順番に行い、且つ前記（ｂ）〜（ｅ）の全工程を密閉系で行う。
前記有核細胞の貯留部が、凍結保存部から狭窄部を介して徐々に断面積を広める拡大部を有する形状である請求項１９記載の細胞の凍結保存方法。
前記有核細胞の貯留部は、狭窄部が前記（ｄ）の容器分離工程において溶断分離部として用いられ、凍結保存部が前記（ｅ）の凍結保存工程において有核細胞の凍結保存用容器として用いられるものである請求項１９または２０に記載の細胞の凍結保存方法。
前記有核細胞の凍結保存部が有核細胞の取出し口を有する請求項１９乃至２１の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
前記有核細胞の凍結保存部または／および前記有核細胞の貯留部が凍害保護剤導入部を有する請求項１９乃至２２の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
前記有核細胞の貯留部が有核細胞の貯留バッグ内のエア排出用フィルター装置を有する請求項１９乃至２３の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
前記有核細胞の貯留部が有核細胞の貯留バッグ内のエア排出用導管を有核細胞の導管とは独立して有する請求項１９乃至２４の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
前記（ｄ）の容器分離工程の前に、前記凍害保護剤導入部から凍害保護剤を添加する請求項１９乃至２５の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
前記（ｄ）の容器分離工程の後に、前記凍害保護剤導入部から凍害保護剤を添加する請求項１９乃至２６の何れかに記載の細胞の凍結保存方法。
請求項１９乃至２７の何れかの方法を用いる細胞凍結物の製造方法。