KR20070032263A

KR20070032263A - 세포 농축물의 조제 방법 및 세포 조성물

Info

Publication number: KR20070032263A
Application number: KR1020067006704A
Authority: KR
Inventors: 슈지 테라시마; 미끼또모 야스다께
Original assignee: 아사히 카세이 메디칼 가부시키가이샤
Priority date: 2003-10-10
Filing date: 2004-10-08
Publication date: 2007-03-21
Also published as: EP1683857B1; JP4587959B2; WO2005035737A1; TWI349567B; TW200515927A; KR101098162B1; JPWO2005035737A1; ATE498680T1; EP1683857A1; DE602004031446D1; EP1683857A4; US20070275459A1

Abstract

유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을 유핵세포를 포착하고 불요 세포는 통과시키는 필터재를 포함하는 필터 장치에 도입해서 유핵세포를 포착하고 불요 세포를 배출시킨 후, 해당 필터 장치에 회수액을 도입해서 포착되어 있는 유핵세포를 회수하는 세포 농축물의 조제 방법에 있어서, 세포 함유액을 유핵세포가 풍부한 층과 불요 세포가 풍부한 층으로 분리한 후, 상기 필터 장치에 먼저 해당 불요 세포가 풍부한 층을 도입하고, 계속해서 해당 유핵세포가 풍부한 층을 도입해서 유핵세포를 해당 필터재에 포착시키면서 해당 필터 장치 내에 잔존하는 불요 세포를 배출시킨 후, 해당 필터 장치에 회수액을 도입해서 포착되어 있는 유핵세포를 회수함으로써, 간편한 조작으로 세포함유액으로부터 유핵세포와 불요세포를 효율적으로 분리할 수 있고 유핵세포를 함유하는 동결보존용 용액의 용적을 줄일 수 있다.

유핵세포, 불요 세포, 세포 함유액, 동결 보존용 용액, 세포 농축물, 필터 장치, 조혈 줄기 세포, 유핵세포 포착재, 회수액 정류화재

Description

세포 농축물의 조제 방법 및 세포 조성물{METHOD OF PREPARING CELL CONCENTRATE AND CELL COMPOSITION}

본 발명은 세포 함유액 중의 유핵세포를 분리, 농축하여 동결 보존용의 세포 부유액을 작성하기 위한 세포 농축물의 조제 방법, 세포의 동결 보존 방법, 세포 조성물 및 세포 동결물에 관한 것이다. 더욱 자세하게는 본 발명은 동결 보존용 세포 부유액 중의 유핵세포의 농도를 높여 동결 보존용의 세포 부유액의 용적을 줄이기 위한 세포 농축물의 조제 방법, 세포의 동결 보존 방법, 세포 조성물 및 세포 동결물에 관한 것이다.

최근 백혈병 등의 조혈기 종양 및 고형 암의 화학요법에 있어서의 부작용인 조혈 장애에 대해서 말초혈, 골수, 제대혈 중의 조혈 줄기세포를 이식하는 것이 활발히 행해지게 되었다. 그 대부분의 경우, 세포는 이식 전까지 동결 보존되는데, 동결 보존에는 막대한 비용이 들기 때문에 통상 동결 전에 적혈구나 혈장 등 이식에 불필요한 성분을 제거해서 보존 용적을 삭감하는 처리가 행해진다. 예를 들면 제대혈은 태반과 탯줄로부터 평균 100 ㎖ 정도 채취할 수 있는데, 대부분의 제대혈뱅크에서는 제대혈로부터 적혈구, 혈장 등을 제거해서 20 ㎖로 용적 축소한 후, 동해 보호제를 5 ㎖ 가해 25 ㎖로 동결 보존하고 있다. 그렇지만 이들 제대혈은 제 공자와 환자의 인간 백혈구 항원(HLA)이 일치할 때까지 장기간 동결 보존되는 경우가 많아 보존 비용 삭감을 위해 더욱 용적을 축소해야 하는 필요성이 높아지고 있다.

종래, 혈액으로부터 치료에 필요한 성분을 분리하는 방법으로서 비중 원심법, 적혈구 응집법, 버피코트(buffy coat)법, 항체를 이용한 어피니티 분리법 등이 행해져 왔다. 그렇지만 비중 원심법은 적혈구, 혈장의 제거율이 높고, 용적 축소 효과는 크기는 하지만, 비중액 (예를 들면 팔마시아사제 피콜)에 원료가 되는 세포 부유액을 중층 시킬 때에 액면을 흩뜨려서는 안 되는 등, 매우 숙련을 요하는 번잡한 조작인 데다가, 개방계로 조작되기 때문에 잡균 혼입의 위험이 크고, 또 목적 세포의 회수율이 낮은 등의 문제가 있다. 적혈구 응집법에서는 히드록시에틸스타치 등과 혼화하고, 적혈구의 연전(連錢) 형성에 의해 적혈구를 응집, 침강시켜 상층의 백혈구층을 분리하는데[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.92, pp10119-10122(1995), Indian J. Med. Res., Vol. 106, pp16-19(1997)], 백혈구의 회수율을 높이려고 하면 많은 적혈구가 혼입되어 용적 축소에 방해가 되고, 반대로 적혈구의 혼입을 억제하려고 하면 백혈구의 회수율이 저하된다고 하는 것처럼, 적혈구 제거와 백혈구 회수의 양자를 동시에 충분히 만족시킬 수 없다고 하는 문제가 있다. 버피코트법에서는 혈액이 저류된 백을 강 원심해서 상층의 혈장층, 중간층의 주로 백혈구와 혈소판을 포함하는 버피코트층, 하층의 적혈구층을 형성시키고, 상층의 혈장층과 하층의 적혈구층을 백으로부터 밀어내어 중간층의 버피코트층을 회수하는데[Bone Marrow Transplantation, Vol.23, pp505-509(1999)], 역시 적혈구 응집법 과 같은 문제가 있다. 항체를 이용한 어피니티 분리법에서는 특이성은 높고 용적 축소 효과는 크기는 하지만, 분리한 세포를 회수하기 위해서는 결합한 항체 분자를 효소 처리하기 때문에 세포의 손상, 고비용, 조작의 번잡함 등의 문제가 있다.

간편하고 세포의 분리 효율이 비교적 높은 세포 분리법으로서 일본 특허공개 평10-201470호 공보, 일본 특허공개 평10-137557호 공보, 일본 특허공개 평11-206875호 공보, 일본 특허공개 평11-56351호 공보에 있어서 필터 장치를 이용하는 방법이 개시되어 있다. 특히 일본 특허공개 평11-56351호 공보에서는 혈액을 여과 후, 필터 장치에 린스액을 도입해서 필터 장치 내에 잔존하는 적혈구를 씻어낸 후, 필터 장치에 회수액을 도입해서 필터 장치 내에 포착된 목적 세포를 회수하기 때문에 적혈구 제거율, 목적 세포 회수율 모두 높다. 그렇지만 목적 세포의 생존률이나 기능을 높게 유지하기 위해서 린스액에 알부민 등의 단백을 첨가할 필요가 있고, 또 린스액을 통액할 때에 필터 장치에 혈액 회로 중의 공기가 비집고 들어가 여과 불능(에어 블록)이 되거나 필터 장치에 공기가 들어가지 않게 여과 전에 린스액으로 필터 장치 및 혈액 회로를 프라이밍해 둘 필요가 있는 등, 매우 번잡한 조작을 피할 수 없게 된다.

국제 공개 제98/32840호 팜플렛에서는 「세포 함유액으로서는 말초혈, 골수, 제대혈, 림프액 및 이것들에 원심 분리 등 어떠한 처리를 한 것」이라는 기재가 있지만, 여과하기 전의 세포 함유액의 처리에 의해 유핵세포와 불요 세포의 분리 효율을 높일 수 있다고 하는 기재는 일절 없다.

또, 필터 장치를 이용해서 세포의 분리 효율을 높이는 방법으로서 국제 공개 제02/087660호 팜플렛에 필터 장치로 혈액을 여과하기 전에 혈액의 저류부에 있어서 혈구 농도 구배를 형성한 후, 저류부 하층의 혈액으로부터 백혈구 제거 필터 장치로 여과할 방법이 개시되어 있다. 그 중에 개시된 기술은 여과 초기에 있어서의 필터재는 알부민 등의 혈구 점착을 억제하는 혈장 단백질로 충분히 덮이지 않고, 제거하고 싶은 백혈구가 많이 점착되고, 한편 비중이 가벼운 혈소판은 불균질화한 전혈제제의 상층에 많이 존재하고, 혈소판이 필터재와 접촉할 때에는 필터재 표면이 알부민 등의 혈장 단백질로 덮여 혈소판 점착이 억제되어 많은 혈소판이 회수됨으로써 백혈구와 혈소판의 분리 효율을 높이는 기술이다. 즉, 본 공보에서는 본 발명과 같이, 먼저 불요 세포가 풍부한 층을 여과해서 필터재에 일부의 유핵세포를 포착하여 불요 세포를 유출시키고, 그 시점에서 필터재에 잔류하는 불요 세포를, 그 후 유핵세포가 풍부한 층으로 씻어내리면서 필터재에 유핵세포를 포착하고, 그 후 회수액을 필터 장치에 도입해서 유핵세포를 회수한다고 하는 기술 사상은 전혀 없다.

전술한 바와 같이 간편하고 세포의 분리 효율이 비교적 높은 세포 분리법으로서 필터법을 들 수 있다. 그런데 이들 필터법에서는 혈액을 여과할 때, 혈액 중의 피브린덩어리나 파괴한 혈구 등의 응집괴에 의한 필터재의 세공의 폐색에 의해 여과 유속이 저하되어 여과 시간이 연장되거나, 혹은 완전하게 눈 막힘을 일으켜 처리 조작이 불가능해진다고 하는 문제가 있었다. 이 대책으로서 여과 면적을 넓혀 단위 단면적당의 여과량을 저감 시키는 방법이 취해진다. 상기 필터법에 개시되어 있는 바와 같이 일반적으로 여과시에는 목적 세포의 포착 부족을 막기 위해서 저류속으로 혈액을 필터 장치에 도입하고, 한편 회수시에는 필터재에 포착된 목적 세포를 회수액의 전단력을 이용해서 씻어내리기 위해서 고유속으로 회수액을 필터 장치에 도입한다. 여과 면적을 넓혔을 경우, 회수시에 고유속으로 회수액을 도입하면 회수액은 여과부에 균일하게 퍼지지 않고, 회수액 도입부 부근을 우선적으로 흘러 목적 세포의 회수율을 높일 수 없다. 즉, 여과 유속의 확보와 목적 세포의 고 회수율을 양립할 수 없다고 하는 문제가 있었다.

또, 필터법 중, 일본 특허공개 평10-137557호 공보나 일본 특허공개 평11-206875호 공보에 있어서는 목적 세포의 회수율을 향상시키는 것을 겨냥해서 회수시에 여과시보다도 다공질체의 구멍 직경을 크게 해서 필터 장치에 회수액을 도입하고, 필터재에 포착된 목적 세포를 회수하고 있는데, 회수시에 필터 장치의 내용적이 커지기 때문에 실태로서는 회수율을 높게 유지하기 위해서 필터 장치에 도입하는 회수액량을 늘려야만 해서, 원하는 용적으로 하기 위해서 원심 농축의 작업이 필요한데다가, 재료비의 비용 증가으로 연결되는 문제가 있었다. 또한 이들 방법에서는 필터재를 압축하거나 압축을 해제해서 필터재의 두께를 조절하여 구멍 직경을 변화시키고 있지만, 조작이 번잡하고 정확한 컨트롤도 어려워 목적 세포의 회수율이 안정되지 않는 문제가 있었다.

말초혈, 골수, 제대혈 중의 조혈 줄기세포를 이식할 때, 그 대부분의 경우, 상기 필터법 등에 의해 혈액으로부터 치료에 필요한 성분을 분리한 후, 세포는 이식 전까지 동결 보존된다. 분리한 세포는 동결 용기로 옮기기 전에 혈액 백 등 일단 다른 용기에 이송되어 세정되거나, 원심 분리로 액성 성분을 제거해서 농축되거 나, 동해 보호제가 가해지는 등의 처리가 행해진다. 그렇지만 세포를 다른 용기로 바꿔 옮길 때, 세균 오염의 문제나 용기 내부에 세포 농후액이 부착, 잔류해서 세포의 손실을 초래하는 문제가 있었다. 이 문제를 해결하는 방법으로서 일본 특허공개 소57-83284호 공보에서는 배양 세포를 동결 보존할 때의 바꿔 옮김에 의한 세포의 손실, 세균 오염을 막을 목적으로, 배양병에서 배양된 배양 세포를 바꿔 옮긴 동결 용기 내에서 원심 분리, 동해 보호제를 주입하는 기술이 개시되어 있다. 그렇지만 당 공보에 의한 기술은 밀폐계가 아니라 세균 오염의 문제를 충분히 해결할 수 없고, 또 동결 용기 내의 공기를 배출하는 공정이 없고, 동결 용기 내에 잔류하는 공기에 의해 동결 보존 용적을 작게 할 수 없을 뿐만 아니라, 동결 해동시에 동결 용기 파손의 문제가 있다.

또, 전술의 국제 공개 제98/32840호 팜플렛에서는 필터 장치로 분리된 목적 세포를 이송의 수고를 줄이기 위해서 동결 백에서 받는 방법이 개시되어 있지만, 동결 백마다 원심 분리하여 유핵세포를 농축하는 것은 일절 기재되어 있지 않다.

이상과 같이, 세포 부유액으로부터 목적 세포를 분리, 농축하는 기존의 기술에는 개량해야 할 많은 과제가 남아 있다. 간편한 조작으로 유핵세포와 불요 세포를 효율적으로 분리해서 동결 보존 용적을 삭감하는 방법의 확립이 요망되고 있다.

<발명이 해결하고자 하는 과제>

본 발명의 과제는 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을 필터 장치로 여과한 후, 필터 장치에 회수액을 도입해서 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수할 때, 간편한 조작으로 세포 함유액으로부터 유핵세포와 불요 세포를 효율적으로 분리함으로써 유핵세포를 포함하는 동결 보존용 용액의 용적을 줄일 수 있는, 세포 농축물의 조제 방법 및 세포 조성물을 제공하는 것에 있다. 또, 본 발명의 다른 과제는 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을 필터 장치로 여과한 후, 필터 장치에 회수액을 도입해서 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수할 때, 혈액 중의 응집괴에 의한 여과 유속의 저하를 억제하면서 유핵세포를 고율로 회수하고, 또한 보다 적은 액량으로 목적의 유핵세포를 간편하게 회수할 수 있는 세포 농축물의 조제 방법 및 세포 조성물을 제공하는 것에 있다. 또한 본 발명의 다른 과제는 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액으로부터 유핵세포를 분리, 농축, 동결 보존할 때, 유핵세포의 손실, 세균 오염, 동결 용기 파손의 위험을 저감시키면서 동결 보존 용적을 삭감할 수 있는 세포의 동결 보존 방법 및 세포 동결물을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 적어도 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을 필터 장치로 여과해서 유핵세포를 필터재에 포착하고, 불요 세포는 필터 장치로부터 배출시킨 후, 회수액을 필터 장치에 도입해서 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수하는 방법에 있어서, 세포 함유액을 필터 장치로 여과하기 전에 유핵세포가 풍부한 층과 불요 세포가 풍부한 층으로 층 분리한 후, 불요 세포가 풍부한 층, 유핵세포가 풍부한 층을 이 순서로 여과하면, 유핵세포를 필터재에 포착시키면서 필터 장치 내에 잔존하는 불요 세포를 필터 장치로부터 배출할 수 있기 때문에 유핵세포의 고 회수와 불요 세포의 고 제거를 동시에 달성할 수 있고, 간편한 조작으로 세포 함유액을 극히 작은 용적으로 할 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

또, 본 발명자들은 목적 세포를 분리 회수하는 방법에 있어서 회수액 정류화재를 유핵세포 포착재에 대해서 특정의 배열이 되도록 병용하고, 또한 필터재의 유효 여과막 면적과 충전 두께가 특정의 비율에 있는 비교적 편평한 필터재를 이용하면, 여과시의 유속 확보와 회수액의 균일 흐름에 의한 유핵세포의 고 회수라고 하는 과제를 양립할 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

또한 본 발명자 등은 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액으로부터 유핵세포를 분리, 저류, 원심 농축, 밀봉 및 동결 보존하는 일련의 작업에 있어서 유핵세포를 분리하는 이외의 공정을 밀폐계의 동일 용기 내에서 행하고, 적어도 저류로부터 동결 보존까지의 공정을 밀폐계로 행함으로써 유핵세포의 손실, 세균 오염의 위험을 저감시킬 수 있고, 또 공기를 포함하지 않는 상태로 밀봉함으로써 동결 보존 용적을 삭감 가능할 뿐만 아니라 동결 용기 파손의 위험을 저감시킬 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 의하면 이하의 발명이 제공된다.

(1) 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을, 유핵세포를 실질적으로 포착하고 불요 세포는 실질적으로 통과시키는 필터재를 포함하는 필터 장치에 도입해서 유핵세포를 해당 필터재에 포착하여 불요 세포를 배출시킨 후, 해당 필터 장치에 회수액을 도입해서 해당 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수하는 세포 농축물의 조제 방법에 있어서, 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을 유핵세포가 풍부한 층과 불요 세포가 풍부한 층으로 층 분리한 후, 상기 필터 장치에 먼저 해당 불요 세포가 풍부한 층을 도입하고, 계속해서 해당 유핵세포가 풍부한 층을 도입해서 유핵세포를 해당 필터재에 포착시키면서 해당 필터 장치 내에 잔존하는 불요 세포를 배출시킨 후, 해당 필터 장치에 회수액을 도입해서 해당 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 세포 농축물의 조제 방법.

(2) 불요 세포를 중력 또는 원심력에 의해 침강시킴으로써, 적어도 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을 유핵세포가 풍부한 층과 불요 세포가 풍부한 층으로 층 분리하는 (1)기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(3) 불요 세포를 응집시킨 후에 불요 세포를 중력 또는 원심력에 의해 침강시킴으로써, 적어도 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을 유핵세포가 풍부한 층과 불요 세포가 풍부한 층으로 층 분리하는 (1)기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(4) 상기 불요 세포가 적혈구인 (1) 내지 (3)중 어느 한 항 기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(5) 상기 유핵세포가 조혈 줄기세포인 (1) 내지 (4)중 어느 한 항 기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(6) 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액에 히드록시에틸스타치를 첨가함으로써 불요 세포를 응집시키는 (3)기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(7) 상기 유핵세포가 풍부한 층이 유핵세포 농후층과 유핵세포 희박층을 포함하고, 필터 장치에 유핵세포 희박층, 유핵세포 농후층의 순서로 도입하는 (1) 내지 (6)중 어느 한 항 기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(8) 상기 유핵세포가 풍부한 층이 유핵세포 농후층과 유핵세포 희박층을 포함하고, 필터 장치에 유핵세포 농후층, 유핵세포 희박층의 순서로 도입하는 (1) 내지 (5)중 어느 한 항 기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(9) 상기 유핵세포 희박층의 일부 또는 전부를 회수액의 적어도 일부로서 이용하는 (8)기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(10) 상기 필터 장치에 회수액을 도입해서 해당 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수한 후에, 다시 회수한 유핵세포 함유액을 원심 분리하여 상청을 제거함으로써 유핵세포를 농축하는 (1) 내지 (9)중 어느 한 항 기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(11) 상기 필터재가, 적어도 세포 함유액의 입구와 출구를 가지는 용기 내에 다공질체를 포함하는 유핵세포 포착재 및 회수액 정류화재가 세포 함유액의 입구측으로부터 출구측을 향해 이 순서로 충전되고, 해당 필터재의 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값이 15 내지 120㎝인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (10)중 어느 한 항 기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(12) 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을, 유핵세포를 실질적으로 포착하고 불요 세포는 실질적으로 통과시키는 필터재를 포함하는 필터 장치에 도입해서 유핵세포를 해당 필터재에 포착하고 불요 세포를 배출시킨 후, 해당 필터 장치에 회수액을 도입해서 해당 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수하는 세포 농축물의 조제 방법에 있어서, 다공질체를 포함하는 유핵세포 포착재 및 회수액 정류화재가 적층되는 필터재로서, 또한 해당 필터재의 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값이 15 내지 120㎝인 필터재가, 유핵세포 포착재가 세포 함유액의 입구측에 되도록 세포 함유액의 입구와 출구를 가지는 용기에 충전되는 필터 장치를 이용해서 세포 함유액의 입구로부터 세포 함유액을 필터 장치에 도입해서 유핵세포를 필터재에 포착시키고, 불요 세포를 해당 필터 장치로부터 배출시킨 후, 세포 함유액의 출구측으로부터 회수액을 도입해서 해당 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 세포 함유액의 입구측으로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 세포 농축물의 조제 방법.

(13) 상기 유핵세포 포착재의 세포 함유액 입구측에 다시 응집괴 포착재가 충전되어 있는 (11) 또는 (12)기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(14) 필터재가 부직포인 (11) 내지 (13)중 어느 한 항 기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(15) 부직포를 포함하는 유핵세포 포착재 및 회수액 정류화재가 각각,

가) 평균섬유직경이 1.1 내지 3.0㎛, 충전 밀도가 0.1 내지 0.3g/㎤인 부직포를 포함하는 유핵세포 포착재,

나) 평균섬유직경이 0.5 내지 1.5㎛, 충전 밀도가 0.1 내지 0.3g/㎤인 부직포를 포함하는 회수액 정류화재이고, 유핵세포 포착재, 회수액 정류화재의 순서로 평균섬유직경이 작아지는 것을 특징으로 하는 (14)기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(16) 필터재가 스펀지상 구조체인 (11) 내지 (13)중 어느 한 항 기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(17) 스펀지상 구조체를 포함하는 유핵세포 포착재 및 회수액 정류화재가 각각,

가) 충전시의 평균구멍직경이 7 내지 25㎛, 충전시의 공극율이 55 내지 90%인 스펀지상 구조체를 포함하는 유핵세포 포착재,

나) 충전시의 평균구멍직경이 2 내지 10㎛, 충전시의 공극율이 55 내지 90%인 스펀지상 구조체를 포함하는 회수액 정류화재이고, 유핵세포 포착재, 회수액 정류화재의 순서로 평균구멍직경이 작아지는 것을 특징으로 하는 (16)기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(18) 필터재가 부직포와 스펀지상 구조체의 조합인 (11) 내지 (13)중 어느 한 항 기재의 세포 농축물의 조제 방법.

(19) (1) 내지 (18)중 어느 한 항 기재의 세포 농축물의 조제 방법 후에, 다시 이하의 공정을 설정하는 세포의 동결 보존 방법:

(b) 회수된 유핵세포를, 저류부에 설치한 유핵세포 도입구를 통해 해당 저류부와 동결 보존부를 가지는 저류 백으로 이행시켜 저류하는 세포 저류 공정,

(c) 저류된 유핵세포를 상기 저류 백 내에서, 동결 보존부를 회전 반경 상의 회전축으로부터 먼 위치에 배치시켜 원심 분리함으로써 유핵세포를 저류 백 내의 동결 보존부에 이동시키는 세포 농축 공정,

(d) 농축된 유핵세포를, 공기를 포함하지 않는 상태로 동결 보존부에 밀봉해서 용단 분리하는 용기 분리 공정, 및

(e) 유핵세포가 밀봉된 동결 보존부를 동결시켜 보존하는 동결 보존 공정을 차례로 행하고, 또한 상기 (b) 내지 (e)의 전 공정을 밀폐계로 행한다.

(20) 이하 (a) 내지 (e)를 적어도 포함하는 공정:

(a) 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을, 유핵세포를 실질적으로 포착하고 불요 세포는 실질적으로 통과시키는 필터재를 포함하는 필터 장치에 도입해서 유핵세포를 해당 필터재에 포착하고 불요 세포를 배출시킨 후, 해당 필터 장치에 회수액을 도입해서 해당 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수하는 세포 농축물의 조제 공정,

(d) 농축된 유핵세포를, 공기를 포함하지 않는 상태로 동결 보존부에 밀봉해서 용단 분리하는 용기 분리 공정,

(e) 유핵세포가 밀봉된 동결 보존부를 동결시켜 보존하는 동결 보존 공정을 차례로 행하고, 또한 상기 (b) 내지 (e)의 공정을 밀폐계로 행하는 세포의 동결 보존 방법.

(21) 상기 유핵세포의 저류부가, 동결 보존부로부터 협착부를 사이에 두고 서서히 단면적을 넓히는 확대부를 가지는 형상인 (19) 또는 (20)기재의 세포의 동결 보존 방법.

(22) 상기 유핵세포의 저류부는 협착부가 상기 (d)의 용기 분리 공정에 있어서 용단 분리부로서 이용되고, 동결 보존부가 상기 (e)의 동결 보존 공정에 있어서 유핵세포의 동결 보존용 용기로서 이용되는 것인 (19) 내지 (21)중 어느 한 항 기재의 세포의 동결 보존 방법.

(23) 상기 유핵세포의 동결 보존부가 유핵세포의 취출구를 가지는 (19) 내지 (22)중 어느 한 항 기재의 세포의 동결 보존 방법.

(24) 상기 유핵세포의 동결 보존부 및(또는) 상기 유핵세포의 저류부가 동해 보호제 도입부를 가지는 (19) 내지 (23)중 어느 한 항 기재의 세포의 동결 보존 방법.

(25) 상기 유핵세포의 저류부가 유핵세포의 저류 백 내의 공기 배출용 필터 장치를 가지는 (19) 내지 (24)중 어느 한 항 기재의 세포의 동결 보존 방법.

(26) 상기 유핵세포의 저류부가 유핵세포의 저류 백 내의 공기 배출용 도관을 유핵세포의 도관과는 독립해서 가지는 (19) 내지 (25)중 어느 한 항 기재의 세포의 동결 보존 방법.

(27) 상기 (d)의 용기 분리 공정 전에, 상기 동해 보호제 도입부로부터 동해 보호제를 첨가하는 (19) 내지 (26)중 어느 한 항 기재의 세포의 동결 보존 방법.

(28) 상기 (d)의 용기 분리 공정 후에, 상기 동해 보호제 도입부로부터 동해 보호제를 첨가하는 (19) 내지 (27)중 어느 한 항 기재의 세포의 동결 보존 방법.

(29) (19) 내지 (28) 중 어느 한 방법을 이용하는 세포 동결물의 제조 방법.

(30) (1) 내지 (18) 중 어느 한 방법에 의해 얻어지는 세포 조성물.

(31) 상기 세포 조성물을 다시 원심 분리하여 상청을 제거함으로써 유핵세포를 농축해서 얻어지는 (30)기재의 세포 조성물.

(32) 상기 불요 세포가 적혈구인 (30) 또는 (31)기재의 세포 조성물.

(33) 상기 유핵세포가 조혈 줄기세포인 (30) 또는 (31)기재의 세포 조성물.

(34) (19) 내지 (28) 중 어느 한 방법에 의해 조제되는 세포 동결물.

<발명의 효과>

본 발명의 세포 농축물의 조제 방법에 의하면, 간편한 조작으로 세포 함유액으로부터 유핵세포와 불요 세포를 효율적으로 분리할 수 있기 때문에 동결 보존 용적을 대폭 삭감할 수 있다. 또, 본 발명에 의해 세포 함유액의 여과 유속의 저하를 억제하면서 세포 함유액으로부터 유핵세포를 안정되게 고율로 회수하고, 또한 보다 적은 액량으로 간편하게 목적 세포를 회수할 수 있다. 또한 본 발명에 의해 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액으로부터 유핵세포를 분리, 저류, 원심 농축, 밀봉 및 동결 보존하는 일련의 작업에 있어서 유핵세포를 분리하는 공정 이외의 공정을 동일 용기 내에서 행하고, 적어도 저류로부터 동결 보존까지의 공정을 밀폐계로 행하기 때문에 유핵세포의 손실, 세균 오염의 위험을 저감시키면서 동결 보존 용적을 삭감할 수 있다. 또한, 유핵세포를 동결 용기에 공기를 포함하지 않는 상태로 밀봉하기 때문에 동결 보존 용적을 삭감 가능할 뿐만 아니라 동결 용기 파손의 위험을 저감시킬 수 있다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

본 발명에서 말하는 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액이란, 골수, 말초혈, G-CSF 등의 조혈 인자 투여에 의한 동원 말초혈, 제대혈, 혹은 이것들을 원심 분리 등에 의해 조 분리한 것, 생리 식염수, 세포 배양용 배지, 완충액, 항응고제 등으로 희석한 것 등을 들 수 있다.

유핵세포의 예로서는 백혈구, 단핵구, 림프구, 단구, 대식세포, 수상 세포, 과립구, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 혈관 내피 전구 세포, 유핵적혈구 등, 세포 치료, 진단 등에 유용하고 분리 회수를 필요로 하는 세포를 들 수 있다.

한편, 불요 세포의 예로서는 적혈구, 혈소판, 과립구 등, 회수를 필요로 하는 세포와 혼재하고 있으면 동결 해동시의 파괴 세포에 의한 수여자에의 부작용이나 회수를 필요로 하는 세포의 저 회수 등의 악영향을 가지는 세포를 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 유핵세포와 불요 세포의 조합의 예로서는 유핵세포가 단핵구이고, 불요 세포가 적혈구인 경우를 들 수 있다. 이 경우, 단핵구는 필터재에 포착되고, 한편으로 적혈구는 통과한다. 그 후, 회수액에서 필터재에 포착된 단핵구가 회수된다.

본 발명에서 말하는 「유핵세포가 풍부한 층」이란, 층 분리하기 전의 세포 함유액 중의 유핵세포의 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70%이상, 특히 바람직하게는 80% 이상이 포함되는 층을 말한다. 유핵세포의 비율이 50%를 하회했을 경우, 여과의 전반에 유핵세포가 필터재에 포착되고, 그 후에는 포착된 유핵세포를 계속해서 씻어내리게 되어 유핵세포의 회수율의 저하를 초래하기 때문에 바람직하지 않다.

또, 본 발명에서 말하는 「불요 세포가 풍부한 층」이란, 층 분리하기 전의 세포 함유액 중의 불요 세포의 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상이 포함되는 층을 말한다. 불요 세포의 비율이 60%를 하회했을 경우, 나중에 여과되는 유핵세포가 풍부한 층에 불요 세포가 많이 혼입되어 필터 장치 내에 불요 세포가 많이 잔존하게 되기 때문에 필터재에 포착된 유핵세포를 회수했을 때, 많은 불요 세포가 혼입되게 되므로 유핵세포 부유액의 체적을 줄이는 것이 어려워진다.

본 발명에 의한 세포 농축물의 조제 방법을 예시하면, 도 1에 나타낸 시스템을 이용하는 방법을 들 수 있다. (11), (12), (13)은 혈액도관, (21), (22), (23)은 클램프, (31), (32)는 T자관, (40)은 유핵세포를 실질적으로 포착하고 불요 세포는 실질적으로 통과시키는 필터재(도시하지 않음)를 포함하는 세포 분리 필터 장치, (50)은 세포 분리 필터 장치(40)의 필터재에 포착된 유핵세포를 회수하는 회수 백, (60)은 회수액 주입구, (70)은 세포 분리 필터 장치로부터 배출된 불요 세포를 저류하는 배출 백이다. 우선, 세포 함유액을 저류한 혈액 백을 혈액도관(11)과 접속하고, 세포 함유액을 원심 등의 방법에 의해 유핵세포와 불요 세포로 층 분리한다. 다음에 클램프(21)과 (23)을 열어 세포 분리 필터 장치(40)에 먼저 불요 세포가 풍부한 층을 도입하고, 계속해서 유핵세포가 풍부한 층을 도입한다. 본 발명에 의해 유핵세포와 불요 세포가 효율적으로 분리될 수 있는 것은 불요 세포가 풍부한 층, 유핵세포가 풍부한 층을 이 순서로 여과함으로써, 유핵세포를 세포 분리 필터 장치(40)의 필터재에 포착시키면서 세포 분리 필터 장치(40)의 내부에 잔존하는 불요 세포를 필터 장치로부터 배출할 수 있기 때문이다. 예를 들면 세포 함유액을 층 분리한 후에 유핵세포가 풍부한 층만을 취출하여 세포 분리 필터 장치(40)로 여과했을 경우, 바꿔 옮김에 의한 세포 손실, 계면의 흐트러짐에 의한 불요 세포의 혼입의 문제가 있어 유핵세포의 고 회수와 불요 세포의 고 제거를 동시에 달성할 수 없다. 또, 층 분리하지 않고 세포 분리 필터 장치(40)로 여과했을 경우, 세포 분리 필터 장치(40) 내부에 불요 세포가 많이 잔류하여 불요 세포의 제거율을 충분히 높일 수 없다. 즉, 세포의 분리 효율을 높이기 위해서는 세포 함유액을 유핵세포가 풍부한 층과 불요 세포가 풍부한 층으로 층 분리하고, 우선 불요 세포가 풍부한 층으로부터, 계속해서 유핵세포가 풍부한 층을 세포 분리 필터 장치(40)에 도입하는 것이 바람직하다. 유핵세포가 풍부한 층과 불요 세포가 풍부한 층을 세포 분리 필터 장치(40)에 도입하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 낙차, 펌프, 혹은 백을 눌러 도입하는 방법을 들 수 있다. 이때, 혈액 백은 불요 세포가 풍부한 층에서는 출구를 향해 경사져 있으면 앞서 도입하는 불요 세포가 잔류하기 어렵기 때문에 바람직하다. 여과된 세포 함유액은 배출 백(70)에 저류된다. 혈액 백 내의 모든 세포 함유액이 세포 분리 필터 장치(40)에 도입된 후, 클램프(21, 23)를 닫는다. 다음에 클램프(22)를 열어 회수액 주입구(60)로부터 회수액을 세포 분리 필터 장치(40)에 도입하고, 회수 백(50)에 유핵세포를 회수한다.

본 발명에서 행하는 「적어도 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 부유액을 유핵세포가 풍부한 층과 불요 세포가 풍부한 층으로 층 분리하는」방법으로서는 세포 함유액의 저류부에서 양층을 형성할 수 있는 방법이면 어떠한 방법이라도 좋지만, 중력을 이용한 자연 낙하법(또는 정치 침전법), 또는 원심법이 비교적 간편하고 바람직하다. 또, 세포 함유액의 저류부의 형상으로서는 혈액 백, 원심관 등을 들 수 있는데, 필터 장치에의 도입의 용이함 때문에 혈액 백이 바람직하다.

또, 이 층 분리 전에 불요 세포를 응집시키면 층 분리의 시간 단축뿐만 아니라 유핵세포와 불요 세포의 분리 효율을 더욱 높일 수 있기 때문에 보다 바람직하다. 단, 응집한 것이 필터재를 통과하지 않으면 세포의 분리 효율이 크게 저하할 뿐만 아니라, 필터재의 눈 막힘을 유발할 우려도 있기 때문에 필터재의 구멍 직경보다 작거나, 혹은 필터재의 작은 구멍을 빠져나갈 수 있는 성질의 것인 것이 바람직하다. 불요 세포가 적혈구인 경우, 히드록시에틸스타치, 덱스트란 등으로 적혈구를 응집시키는 방법을 이용할 수 있다. 음성 하전의 적혈구 표면에 이들 고분자 용액이 부착되면 혈구 사이의 반발력이 감약해서 적혈구는 서로 겹쳐지고, 동전을 늘어 놓은 상태(연전 형성으로 불린다)가 되어 침강을 촉진한다. 그렇지만 적혈구끼리의 결합은 약하고, 물리적 충격에 의해 용이하게 응집은 분해되기 때문에 본 발명과 같이 응집, 침강시킨 후에 여과하는 경우에 바람직하다.

본 발명에서 말하는 유핵세포 농후층 및 유핵세포 희박층이란, 유핵세포가 풍부한 층에 포함되는 유핵세포의 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상이 유핵세포 농후층에, 나머지가 유핵세포 희박층에 포함되어 있는 것을 말한다. 예를 들면 혈액 중의 백혈구를 유핵세포, 적혈구를 불요 세포로 했을 경우, 혈액을 3000 G 이상의 강한 원심력으로 원심하면, 상층의 혈장층(유핵세포 희박층), 중간층의 백혈구가 풍부한 버피코트층(유핵세포 농후층), 하층의 적혈구층(불요 세포가 풍부한 층)의 3층으로 분리된다. 이 경우, 상층(유핵세포 희박층)의 혈장의 일부 또는 전부를 회수액의 적어도 일부로서 이용할 수 있다. 또, 예를 들면 혈액에 히드록시에틸스타치를 첨가해서 정치해 두면, 상층의 백혈구 농후층(유핵세포 농후층), 중간층의 백혈구 희박층(유핵세포 희박층), 하층의 적혈구층(불요 세포가 풍부한 층)의 3층으로 분리된다. 이 경우, 적혈구층, 백혈구 희박층, 백혈구 농후층의 순서로 필터 장치에 도입되므로, 여과의 후반에 고농도의 백혈구가 필터 장치에 도입된다. 그리고, 필터재의 상류에 의해 대부분의 백혈구가 포착되기 때문에 가장 회수가 용이해지는 상태이며 바람직하다. 또한 혈액에 대한 히드록시에틸스타치 첨가량으로서는 예를 들면 히드록시에틸스타치의 평균 분자량이 40만이고 10% 생리 식염수 용액의 경우, 혈액 1에 대해서 1/3 내지 1/10 량이 바람직하고, 또 정치하는 시간으로서는 10분 이상 80분 이하, 바람직하게는 20분 이상 50분 이하가 바람직하다. 히드록시에틸스타치 첨가량이 1/10 미만, 정치하는 시간이 10분 미만의 경우, 적혈구의 연전 형성이 불충분하고 층 분리가 불충분해져 바람직하지 않다. 한편, 히드록시에틸스타치 첨가량이 1/3보다 많고, 정치하는 시간이 80분보다 긴 경우, 층 분리가 급속히 진행되고, 백혈구도 침강해 온다. 그 경우, 백혈구는 여과의 전반부터 중반에 걸쳐 필터 장치에 도입되고, 필터재의 하층으로 들어가기 쉬워지기 때문에 회수가 어려워지기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명에서 말하는 필터재란, 유핵세포를 실질적으로 포착하고, 불요 세포는 실질적으로 통과하는 다공질의 필터재를 말한다. 본 발명에서 말하는 「유핵세포를 실질적으로 포착」이란, 세포 함유액 중의 유핵세포의 60% 이상(보다 바람직하게는 70% 이상)을 필터재에 포착하는 것을 말한다. 또, 본 발명에서 말하는 「불요 세포는 실질적으로 통과」란, 세포 함유액 중의 불요 세포의 60% 이상(보다 바람직하게는 70% 이상)이 필터재를 통과하는 것을 말한다.

본 발명에 이용하는 필터재는 수불용성이면 어떠한 재질에서도 사용 가능한데, 성형성, 감균성이 뛰어나고, 세포 독성이 낮다고 하는 점에서 바람직한 것을 예시하면, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 아크릴 수지, 나일론, 폴리에스테르, 폴리카르보네이트, 폴리아크릴아미드, 폴리우레탄 등의 합성 고분자, 아가 손실, 셀룰로오스, 아세트산 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 알긴산염 등의 천연 고분자, 하이드록시어퍼타이트, 유리, 알루미나, 티타니아 등의 무기 재료, 스테인레스, 티탄 등의 금속을 들 수 있다.

필터재의 형상으로서는 입상, 섬유괴, 직포, 부직포, 평판, 스펀지상 구조체등을 들 수 있는데, 체적당의 표면적이 크다고 하는 점에서 부직포, 스펀지상 구조체가 바람직하다.

필터재가 부직포인 경우, 평균섬유직경은 1.0 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하이고, 바람직하게는 1.0 ㎛ 이상 20 ㎛이하이고, 더욱 바람직하게는 1.5 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하이다. 1.0 ㎛ 미만에서는 유핵세포가 강고하게 포착되어 버려 회수 곤란해질 가능성이 있을 뿐만 아니라, 불요 세포의 통과, 특히 응집시켰을 경우의 통과를 곤란하게 한다. 또, 30 ㎛를 넘으면 유핵세포가 섬유에 포착되지 않고 그냥 지나칠 가능성이 높아진다. 어느 경우나 회수율의 저하로 이어질 우려가 있으므로 바람직하지 않다.

또, 스펀지상 구조체를 이용하는 경우, 평균구멍직경은 통상 2.0 ㎛ 이상 25 ㎛ 이하이고, 바람직하게는 3.0 ㎛ 이상 20 ㎛ 이하이고, 더욱 바람직하게는 4.0 ㎛ 이상 15 ㎛ 이하이다. 2.0 ㎛ 미만에서는 흐름성이 떨어져 불요 세포의 통과, 특히 응집시켰을 경우의 통과를 곤란하게 할 뿐만 아니라, 통액 자체가 곤란해질 우려가 있다. 또 25 ㎛를 넘으면 유핵세포의 포착률이 저하되어 회수율의 저하를 초래하므로 바람직하지 않다.

본 발명에 이용하는 필터재는 유핵세포 포착재에 회수액 정류화재가 적층된 것이 바람직하고, 필터 장치의 세포 함유액의 입구측으로부터 출구측을 향해 이 순서로 충전되어 있는 필터재가, 세포 함유액의 여과 유속의 저하를 억제하면서 세포 함유액으로부터 유핵세포를 안정되게 고율로 회수 가능하다.

본 발명에서 말하는 유핵세포 포착재란, 세포 함유액 중의 유핵세포를 포착하고 불요 세포는 통과시키는 기능을 가지는 다공질의 필터재를 말한다. 유핵세포 포착재가 부직포인 경우, 평균섬유직경이 1.1 내지 3.0 ㎛, 충전 밀도가 0.1 내지 0.3 g/㎤인 것이 바람직하다. 평균섬유직경이 1.1 ㎛를 하회하고 충전 밀도가 0.3 g/㎤를 상회하는 경우, 유핵세포가 유핵세포 포착재의 상류 부근에서만 포착되어 세공을 단시간에 폐색하기 때문에 여과 유속이 늦어지고, 또 유핵세포의 박리 효율이 저하되어 회수율의 저하를 초래하기 때문에 바람직하지 않다. 한편, 평균섬유직경이 3.0 ㎛를 상회하고 충전 밀도가 0.1 g/㎤를 하회하는 경우, 유핵세포를 충분히 포착할 수 없고, 여과 시 하류에 배치된 회수액 정류화재에 도달해서 세공을 폐색하기 때문에 여과 유속이 늦어지고, 또 유핵세포의 박리 효율이 저하되어 회수율의 저하를 초래하기 때문에 바람직하지 않다.

또, 유핵세포 포착재가 스펀지상 구조인 경우, 충전시의 평균구멍직경이 7 내지 25 ㎛, 충전시의 공극율이 55 내지 90%인 것이 바람직하다. 평균구멍직경이 7 ㎛를 하회하고 충전시의 공극율이 55%를 하회하는 경우, 유핵세포가 유핵세포 포착재의 상류 부근에서만 포착되고, 세공을 단시간에 폐색하기 때문에 여과 유속이 늦어지고, 또 유핵세포의 박리 효율이 저하되어 회수율의 저하를 초래하기 때문에 바람직하지 않다. 한편, 평균구멍직경이 25 ㎛를 상회하여 충전시의 공극율이 90%를 상회하는 경우, 유핵세포를 충분히 포착할 수 없고, 여과 시 하류에 배치된 회수액 정류화재에 도달해서 세공을 폐색하기 때문에 여과시의 세포 함유액의 유속이 늦어지고, 또 유핵세포의 박리 효율이 저하되어 회수율의 저하를 초래하기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명에서 말하는 회수액 정류화재란, 회수액을 필터 장치에 도입할 때, 여과 저항에 의해 세포 함유액을 필터 장치의 여과부에 균일하게 퍼지게 하는 기능을 가지는 다공질의 필터재를 말한다. 회수액 정류화재가 부직포인 경우, 평균섬유직경이 0.5 내지 1.5 ㎛, 충전 밀도가 0.1 내지 0.3 g/㎤인 것이 바람직하다. 평균섬유직경이 0.5 ㎛를 하회하고 충전 밀도가 0.3 g/㎤를 상회하는 경우, 여과 저항이 커져 회수액의 유속이 저하되기 때문에 포착된 유핵세포의 박리율이 저하되어 회수율이 저하되기 때문에 바람직하지 않다. 한편, 평균섬유직경이 1.5 ㎛를 상회하고 충전 밀도가 0.1 g/㎤를 하회하는 경우, 여과 저항이 작고 회수액이 균일하게 퍼지지 않기 때문에 유핵세포의 회수율이 저하되기 때문에 바람직하지 않다.

또, 회수액 정류화재가 스펀지상 구조체인 경우, 충전시의 평균구멍직경이 2 내지 10 ㎛, 충전시의 공극율이 55 내지 90%인 것이 바람직하다. 평균구멍직경이 2 ㎛를 하회하고 충전시의 공극율이 55%를 하회하는 경우, 여과 저항이 커져 회수액의 유속이 저하되기 때문에 포착된 유핵세포의 박리율이 저하되어 회수율이 저하되기 때문에 바람직하지 않다. 한편, 평균구멍직경이 10 ㎛를 상회하여 충전시의 공극율이 90%를 상회하는 경우, 여과 저항이 작고 회수액이 균일하게 퍼지지 않고 유핵세포의 회수율이 저하하기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명에 있어서는 유핵세포 포착재와 회수액 정류화재를 특정 방향으로 배치해서 병용하는 것이 특히 중요하고, 상기의 유핵세포 포착재와 회수액 정류화재가, 필터 장치의 세포 함유액의 입구측으로부터 출구측을 향해 이 순서로 충전되어 있는 것이 필요하다. 이것에 의해 회수액의 흐름이 균일해져 포착 세포의 회수 효율을 높일 수 있다.

또, 본 발명에 있어서는 필터재로서 상기 2종의 재 외에 응집괴 포착재를 추가하는 것도 바람직하고, 필터 장치의 세포 함유액의 가장 입구측에 응집괴 포착재를 충전해서 이용할 수 있다.

본 발명에서 말하는 응집괴 포착재란, 유핵세포 포착재의 세포 함유액 입구측에 충전되어 세포 함유액 중의 피브린덩어리, 혈병, 활성화 혈소판이나 파괴된 과립구 등의 세포 응집물을 포착하여 여과시의 유속 저하와 유핵세포 회수율 저하를 억제하는 기능을 가지는 다공질의 필터재를 말한다. 응집괴 포착재로서의 다공질체가 부직포인 경우, 평균섬유직경이 5 내지 20 ㎛, 충전 밀도가 0.1 내지 0.3 g/㎤인 것이 바람직하다. 평균섬유직경이 5 ㎛를 하회하고 충전 밀도가 0.3 g/㎤를 상회하는 경우, 응집괴뿐만 아니라 유핵세포나 불요 세포도 포착되어 세공을 폐색하기 때문에 여과 유속이 느려지고, 또 유핵세포는 응집괴에 거둬 들여져 회수율의 저하를 초래하기 때문에 바람직하지 않다. 한편, 평균섬유직경이 20 ㎛를 상회하고 충전 밀도가 0.1 g/㎤를 하회하는 경우, 응집괴를 충분히 포착할 수 없고, 응집괴가 여과 시 하류에 배치된 유핵세포 포착재에 도달해서 유핵세포 포착재의 세공을 폐색하기 때문에 여과 유속이 느려지고, 또 유핵세포는 응집괴에 취입되어 회수율의 저하를 초래하기 때문에 바람직하지 않다.

또, 응집괴 포착재가 스펀지상 구조체인 경우, 충전시의 평균구멍직경이 60 내지 150 ㎛, 충전시의 공극율이 55 내지 90%인 것이 바람직하다. 평균구멍직경이 60 ㎛를 하회하고 충전시의 공극율이 55%를 하회하는 경우, 응집괴뿐만 아니라 유핵세포나 불요 세포도 포착되어 세공을 폐색하기 때문에 여과시의 세포 함유액의 유속이 느려지고, 또 유핵세포는 응집괴에 취입되어 회수율의 저하를 초래하기 때문에 바람직하지 않다. 한편, 평균구멍직경이 150 ㎛를 상회하여 충전시의 공극율이 90%를 상회하는 경우, 응집괴를 충분히 포착할 수 없고, 응집괴가 여과 시 하류에 배치된 유핵세포 포착재에 도달해서 유핵세포 포착재의 세공을 폐색하기 때문에 여과 유속이 느려지고, 또 유핵세포는 응집괴에 취입되어 회수율의 저하를 초래하기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명에 있어서의 평균섬유직경이란, 이하의 순서에 따라 구해지는 값을 말한다. 즉 필터재를 구성하는, 실질적으로 균일하다고 인정되는 필터재(예를 들면 유핵세포 포착재, 회수액 정류화재, 응집괴 포착재)의 일부를 샘플링하고. 주사형 전자현미경 등을 이용해서 1000 내지 3000배의 배율로 사진을 찍는다. 샘플링할 때에는 필터재의 유효 여과 단면적 부분을, 한 변이 0.5 내지 1 ㎝의 정방형에 의해 구분하고, 그 중에서 3 곳 이상, 바람직하게는 5 곳 이상을 랜덤 샘플링한다. 랜덤 샘플링하기 위해서는 예를 들면 상기 각 구분에 번지를 지정한 후, 난수표를 사용하는 등 방법으로, 필요 개소 이상의 구분을 선택할 수 있다. 또 샘플링 한 각 구분에 대해서 3 곳 이상, 바람직하게는 5 곳 이상을 사진 찍는다. 이와 같이 해서 얻은 사진에 대해서 찍혀 있는 모든 섬유의 직경을 측정한다. 여기서 직경이란, 섬유 축에 대해서 직각 방향의 섬유의 폭을 말한다. 측정한 모든 섬유의 직경의 합을 섬유의 수로 나눈 값을 평균섬유직경으로 한다. 단, 복수의 섬유가 서로 겹쳐 있고, 다른 섬유의 뒤쪽에 있어 그 폭을 측정할 수 없는 경우, 또 복수의 섬유가 용융(熔融)하는 등 해서 굵은 섬유가 되어 있는 경우, 또한 현저하게 직경이 다른 섬유가 혼재하고 있는 경우 등의 경우에는 이들 데이터는 삭제한다. 이상의 방법에 의해 500개 이상, 바람직하게는 1000개 이상의 데이터에 의해 평균섬유직경을 구한다.

본 발명에 있어서의 평균구멍직경이란, 필터재 표면으로부터 재의 두께 방향에 대해서 0.5 ㎜이하의 부분에서 혈액의 흐름 방향에 대해서 가능한 한 수직으로 절단한 어떤 두께를 가진 검체를 수은 압입법(시마즈 제작소, 포아사이자 9320)으로 측정하여 수은이 필터재의 세공에 전혀 들어가 있지 않은 상태를 수은 압입량0%, 다공질 소자의 모든 세공에 들어가 있는 상태를 수은 압입량 100%로 했을 때, 수은 압입량 50%에 해당되는 점이 본 발명에서 말하는 평균구멍직경이다. 또한, 수은 세공측정기(porosimeter)에서의 측정은 1 내지 1000 psia의 압력 범위에서 측정한다. 매우 유연하기 때문에 그대로는 수은 세공측정기로 측정할 때에 변형을 받아 세공을 검출할 수 없는 것 같은 필터재라도 세공이 압변형되지 않도록 고정화하는 등의 예비 조정을 행함으로써 상기 측정이 가능해지는 필터재도 본 발명에 포함된다.

본 발명에 있어서는 유핵세포 포착재와 회수액 정류화재를 특정 방향으로 충전한 필터 장치를 사용하는 것이 바람직한데, 동시에, 필터재의 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값이 15 내지 120 ㎝인 필터재를 이용하는 것도 바람직하다. 이 값이 120 ㎝를 넘는 경우, 유핵세포 포착재의 두께에 대해서 유효 여과 면적이 너무 넓어 회수시에 회수액이 여과부에 균일하게 퍼지지 않고, 유핵세포의 회수율 저하를 초래하기 때문에 바람직하지 않다. 한편, 이 값이 15 ㎝를 하회하는 경우, 유효 여과 면적이 좁고 유핵세포 포착재가 두껍기 때문에 여과시의 유속 저하를 초래한다. 또, 회수액을 필터 장치에 도입할 때의 저항이 크기 때문에 회수액의 유속이 저하되어 유핵세포의 회수율 저하를 초래하기 때문에 바람직하지 않다.

또, 이들 필터재는 이대로도 이용되지만, 필요에 따라 아미노산, 펩티드, 당단백(항체, 접착 분자 등의 바이오리간드를 포함한다)이라고 하는, 특정의 세포에 친화성이 있는 리간드를 고정할 수 있다. 또한 필터재에 혈소판 통과성을 부여하는 경우, 예를 들면 일본 특허공고 평6-51060호 공보에 제안되어 있는 바와 같이 히드록시에틸메타크릴레이트를 주성분으로 하는 합성 고분자 등으로 필터재 표면을 개질할 수 있다.

또, 필터 장치의 용기로서는 특별히 한정은 없지만, 예를 들면 일본 특허공고 평2-13588호 공보에 보여지는 백혈구 제거 필터 장치의 형상과 같은 용기를 이용할 수 있다. 또, 이들에 있어서 세포 함유액의 입구와 출구 이외에 회수액의 입구와 출구를 별도로 설치할 수 있다.

용기의 재질로서는 수불용성이고, 성형성, 멸균성이 뛰어나고, 세포 독성이 낮은 것이 바람직하다. 또한 여과시에 세포 함유액을 필터 장치에 도입하는 경우나, 회수시에 회수액을 필터 장치에 도입하는 경우에, 필터 장치 내부에 부하되는 압력에 의해 실질적으로 팽창하지 않는 단단한 재질이 바람직하다. 여과시에 필터 장치의 용기가 팽창하면 회수액의 유속이 저하되어 필터재에 포착된 유핵세포를 씻어 내는 전단력이 저하되기 때문에 또 많은 회수액이 잔류하여 회수율이 저하되기 때문에 바람직하지 않다. 또, 용기의 용착부의 파손 우려도 있다. 바람직한 재질로서는 폴리카르보네이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등을 들 수 있는데, 경질이면서 의료용도에 적절한 것이면 이것들로 한정되지 않는다.

본 발명에서 이용하는 회수액으로서는 유핵세포의 손상이 적고, 또한 고율로 회수 가능한 것이 바람직하다. 바람직한 것을 예시하면, 시판되는 생리 식염액, PBS(인산 완충액)나 HBSS(핸크스액) 등의 완충액, RPMI1640 등의 세포 배양용 배지, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올 등의 합성 고분자 용액, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 히드록시에틸스타치, 덱스트란, 키틴 유도체, 콜라겐, 피블로넥틴, 알부민, 글로블린 등의 천연 고분자 용액, 글루코오스, 사카로오스, 말토오스, 소르비톨, 글리세린, 디메틸술폭시드 등의 유기물 용액, 및 이들의 혼합물을 들 수 있다. 또, 2가 양이온을 제거해서 세포 박리를 용이하게 할 목적으로 킬레이트제가 함유되어 있을 수 있다. 덱스트란이나 히드록시에틸스타치 등의 고분자 용액은 동해 보호제로서도 기능하기 때문에 그대로 혹은 DMSO 등의 동해 보호제를 더 첨가함으로써 동결 보존도 가능한데다가, 생식 등에 비해 점성을 높일 수 있고, 회수시의 전단력을 향상할 수 있기 때문에 우리의 평가에서는 좋은 결과를 얻고 있어 회수액으로서 보다 바람직하다. 또, 전술한 바와 같이 세포 함유액을 층 분리할 때 얻어지는 유핵세포 희박층의 일부 또는 전부는 회수액의 적어도 일부로서 이용할 수 있다. 이 경우, 자기 유래 성분이기 때문에 유핵세포에의 손상이 없고, 또 바이러스 감염의 위험도 없기 때문에 바람직하다.

본 발명에서 행하는 회수 방법으로서는 특별히 한정하지 않지만, 회수액의 유속은 전단력을 높여 유핵세포를 고율로 회수하기 위해서 가능한 한 고속이 바람직한데, 내압 상승에 의한 필터 장치와 튜브 등의 접속부의 탈락이나, 유핵세포에의 손상을 일으키지 않는 유속으로 제어하는 것이 바람직하다. 또, 회수액을 필터 장치에 도입하는 수단은 실린지 펌프, 블래드 펌프, 페리스타 펌프 등의 장치를 이용하는 것이나, 간편법으로서 실린지를 손으로 누르는 방법, 액체를 저류한 백을 눌러 액류를 야기하는 방법, 낙차 처리 등을 들 수 있다. 또한 유핵세포의 회수율을 보다 높이기 위해서 필터 장치에 진동을 가한다든가, 흐름 정지(stopped-flow) 등을 행할 수 있다. 회수액을 필터 장치에 도입할 방향은 세포 함유액을 도입한 방향과 동일 방향 또는 역방향이 있는데, 일반적으로 후자가 세포 회수율이 높기 때문에 바람직하다.

본 발명에 있어서 불요 세포를 보다 많이 제거하기 위해서 여과 후에 필터 장치를 린스할 수 있다. 린스액으로서는 유핵세포가 누설되기 어렵고, 불요 세포가 씻어 내어지는 것이 바람직하다. 예를 들면 시판되는 생리 식염액 또는 D-PBS (다르베콜린산 완충액)나 HBSS (핸크스액) 등의 완충액을 들 수 있고, 그것들에 알부민 등의 단백질이 함유되어 있을 수 있다. 또, 린스할 때의 유속은 특별히 한정하지 않지만, 유핵세포를 필터재의 상류측에 고정시켜 두고, 또 세공의 안쪽으로의 혼입을 막기 위해서 가능한 한 저속이 바람직하다.

또, 필터 장치에 회수액을 도입해서 유핵세포를 회수 후에, 다시 회수한 유핵세포 함유액을 원심해서 상청을 제거함으로써, 더욱 유핵세포를 농축할 수 있으므로 바람직하다.

본 발명은 상기 세포 농축물의 조제 방법에 의해 얻어진 세포 조성물을 동결 보존하는 공정도 또 포함한다. 그리고, 상기 조제 방법에 의해 높은 회수율로 얻을 수 있고, 또한 적혈구 용량이 적은 단핵구 획분을 효율적으로 동결 보존하기 위해서는 저류 백의 형상이나 동결 보존 공정에도 연구를 집중시키는 것이 바람직하기 때문에 그것들에 대해서 이하에 설명한다.

먼저, 본 발명에 의한 세포의 동결 보존 방법의 일례를, 도 1에 나타낸 시스템을 이용해서 세포 분리를 행했을 경우에 대해서 설명한다. 또한 이 예에 있어서는 도 1의 (50)은 동결 보존부를 가지는 저류 백으로, 그 저류 백은 도 2의 동결 보존부(120)를 가지는 저류부(100)를 이용하고 있다.

우선, 클램프(21)과 (22)를 닫아 세포 함유액 백과 혈액도관(11)을 접속한다. 다음에 클램프(21)를 열어 유핵세포를 포착하고 불요 세포는 통과시키는 필터재를 조립한 세포 분리 필터 장치(40)에 세포 함유액을 도입하고, 불요 세포를 필터 장치로부터 배출시킨다. 이와 같이 세포 함유액 백 내의 모든 세포 함유액이 세포 분리 필터 장치(40)에 도입되고, 여과한 세포 함유액은 배출 백(70)로 배출된 후, 클램프(21, 23)를 닫는다. 다음에 클램프(22)를 열어 회수액 주입구(60)로부터 회수액을 세포 분리 필터 장치(40)에 도입하고, 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수하면서 혈액도관구에 접속한 저류 백(50)의 유핵세포 도입구(80)를 통해 저류 백(50)에 이행시켜 저류시킨다. 저류 백(50)에 유핵세포가 저류될 때, 공기 배출용 필터 장치(90)로부터 저류 백(50) 내의 공기를 배출한다. 다음에 저류 백(50)의 유핵세포 도입구(80)를 열 봉합하여 저류 백(50)을 세포 분리 시스템으로부터 용단 분리한다. 이렇게 떼어낸 저류 백(50)을, 동결 보존부(120)가 원심 컵의 저면에 오도록 고정하고 원심 분리한다. 원심 분리에 의해 유핵세포를 동결 보존부(120)에 농축한 후, 용단 분리부(110)을 열 봉합기로 용단 분리하여 동결 보존부(120)를 밀폐 상태로 분리한다. 다음에 동해 보호제 도입부(130)로부터 동해 보호제를 도입하고, 그 후 동결 보존부(120)를 동결 보존한다.

상기 동결 보존 방법으로, 동결 보존할 때의 세포 부유액 중의 불요 세포의 혼입량으로서는 동결 보존 용적을 작게 하기 위해서도 가능한 한 적은 것이 바람직하다. 구체적으로는 동해 보호액을 가하기 직전의 유핵세포 농축액의 용적에 대한 혼입 불요 세포의 용적의 비율은 65% 이하가 바람직하고, 45% 이하가 보다 바람직하다. 65%를 넘는 경우, 후술하는 용기 분리 공정에 있어서 유핵세포를 원심 농축 후, 상청을 제거할 때의 액면 혹은 유핵세포 농축액을 밀봉할 때의 용단면 근처까지 유핵세포가 접근하여 유핵세포를 잃을 가능성이 높아진다.

본 발명에서 말하는 「저류 백」이란, 동결 보존부와 저류부 및 그것들을 사이에 둔 협착부를 포함하고, 또한 상기 저류부에는 유핵세포의 도입구가 장착되어 있으며, 유핵세포가 협착부를 통해 유통 가능한 형상을 가진다. 저류 백 형상의 일례를 도 2 내지 도 4에 나타낸다. 도 2 내지 도 4에 있어서 (80)은 유핵세포 도입구, (90)은 공기 배출 필터 장치, (100)은 저류부, (110)은 협착부(용단 분리부), (120)은 동결 보존부, (130)은 동해 보호제 도입부, (140)은 유핵세포의 취출구이다.

본 발명에서 말하는 「저류부」는 가요성(可撓性)의 재질을 포함하는 유핵세포를 저류 가능한 부분이다. 유핵세포 도입구(80)는 저류 백의 어느 위치에 부착되어 있을 수 있지만, 조작 상의 이유로 저류부(100)에 붙어 있는 것이 바람직하다.

상기 저류 백은 그 내부 형상이 중요하다. 즉, 도시한 것처럼, 동결 보존부(120)로부터 협착부(용단 분리부)(110)를 사이에 두고 서서히 단면적을 넓히는 확대부를 가지는 형상(저류부(100)의 일부에 있어서 단면적이 변화하는 형상)이면, a의 방향으로 원심력을 부하했을 때에 동결 보존부(120)를 협착부(110)에서 용단 분리하기 쉽고 또한 저류부(100)의 유핵세포를 효율적으로 동결 보존부(120)로 유도하기 위해 바람직하다. 여기서, 서서히 단면적을 넓히는 확대부의 각도(도 2 내지 4의 b)로서는 20도 이상 150도 이하가 바람직하고, 45도 이상 120도 이하가 보다 바람직하다. 20도 미만의 경우, 저류부(100)가 직사각형의 장변 방향이 길어져 원심 분리시에 저류 백이 원심 컵에 들어가지 않는 등 취급성이 나빠진다. 한편, 150도보다 큰 경우, 유핵세포가 확대부에 축적되어 동결 보존부(120)로 충분히 유도되지 못하고 세포의 손실을 초래한다. 또, 저류부(100) 및 동결 보존부(120)는 분리된 유핵세포액이 저류되지 않는 상태에서도 공간을 확보하도록 입체 성형되어 있을 수 있다.

본 발명에서 말하는 「동결 보존부」란, 내저온성을 가지는 가요성의 성질로, 세포 함유액으로부터 분리된 유핵세포가 저류부와 함께 일단 저류된 후, 원심 분리로 농축된 유핵세포를 수용 가능한 부분이다. 내저온성을 가지는 재질로서는 폴리에틸렌, 에틸렌아세트산 비닐 공중합체(EVA), 퍼플루오로에틸렌프로필렌(FEP) 등의 불소 수지, 폴리이미드 등을 들 수 있는데, 이것들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 말하는 「저류된 유핵세포를 저류 백 내에서, 동결 보존부를 회전 반경 상의 회전축으로부터 먼 위치에 배치시켜 원심 분리하는 세포 농축 공정」이란, 저류 백으로 이행된 유핵세포를, 동결 보존부(120)에 농축시키기 위해서 강한 원심력이 부하 되도록, 유핵세포가 저류된 저류 백을 고정하고 원심 분리하는 것이다. 구체적으로는 원심 시에 원심 컵의 저면측에 동결 보존부(120)를 배향하여, 고정하고 원심 분리하는 것이다.

본 발명에서 말하는 「농축된 유핵세포를, 공기를 포함하지 않는 상태로 동결 보존부에 밀봉해서 용단 분리하는 용기 분리 공정」이란, 동결 보존부(120)의 공기를 저류부(100)측으로 밀어내면서, 동결 보존부 내에 침강한 유핵세포를 동결 보존부 외부로 누출되지 않도록 열 봉합기로 동결 용기 재질의 융점 이상의 열을 주어 유핵세포를 봉입한 후, 가위나 커터 등을 이용해서 동결 보존부(120)를 저류부(100)로부터 떼어내는 것을 말한다. 동결 보존부(120) 내의 공기를 밀어내는 방법으로서는 저류부(100)와 동결 보존부(120) 사이에 있는 협착부(110)를 위로 향해 동결 보존부(120)의 공기가 있는 부분을 손가락으로 집거나 또는 손가락으로 튕겨 저류부(100)측으로 밀어 넣는 방법을 들 수 있다. 또한 상청을 빼내지 않고 그대로 세공부에서 열 봉합을 행하면 공기가 들어가기 어렵고, 또 동결 보존부(120) 내의 액의 움직임이 억제되어 유핵세포가 손실되기 어렵기 때문에 바람직하다.

본 발명에서 말하는 「유핵세포의 취출구」란, 동결 보존부(120)의 내부와 외부 공간을 연통 가능한 내저온성의 유통부이고, 동결 보존부(120)를 해동 처리 후, 내부의 유핵세포를 꺼내는 기능을 가지고 있는 것을 말한다. 예를 들면 루어 어댑터에 스크루 캡으로 닫혀진 것, 고무마개 등이 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 말하는 「동해 보호제 도입부」란, 동결 보존부(120)의 내부와 외부 공간을 연통 가능한 내저온성의 유통부이고, 저류부(100) 또는 동결 보존부(120)에 동해 보호제를 도입 가능한 기능을 가지고 있는 것을 말한다. 예를 들면 루어 어댑터에 스크루 캡으로 닫혀진 것, 고무마개 등이 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다. 또, 이 동해 보호제 도입부는 동해 보호제를 저류부(100) 또는 동결 보존부(120)에 도입 후에는 열 봉합기 등으로 용단 분리해서 떼어내면, 동결 보존부(120)로부터 돌기물을 없앨 수 있어 파손의 위험을 저감시킬 수 있다.

동해 보호제는 디메틸술폭시드(DMSO), 글리세린, 덱스트란, 히드록시에틸스타치(HES), 폴리비닐피롤리돈(PVP) 등을 들 수 있는데, 이것들로 한정되는 것은 아니다. 또한 동해 보호제를 저류부 또는 동결 보존부에 도입하는 시점으로서는 용기 분리 공정의 전후가 도입량을 줄일 수 있기 때문에 바람직하다. 일반적으로 잘 사용되는 디메틸술폭시드는 상온에서는 독성을 가지기 때문에 세포 농축 공정보다 전의 경우, 동해 보호제와의 접촉 시간이 길어져 세포에 손상을 주기 때문에 특히 바람직하지 않다.

본 발명에서 말하는 「공기 배출용 필터 장치」란, 저류부(100)에 구비되어 저류부(100) 내의 공기를 저류부(100) 밖으로 배출하는 부분으로서, 내부의 공기는 외부로 배출할 수 있지만 외부로부터의 오염물의 침입은 저지하는 기능을 가진다. 저류 백에 있어서, 분리된 유핵세포를 저류부(100)로 이행할 때, 저류부(100) 내에는 유핵세포액뿐만 아니라 원래 저류부(100)에 존재하고 있던 공기나 유핵세포의 이행시에 수반해 온 공기가 존재하게 되어, 저류부(100) 및 동결 보존부(120)가 부풀어 파열의 위험성이 있다. 그 때문에 공기 배출용 필터 장치를 저류부(100)에 구비함으로써, 파열을 방지할 수 있기 때문에 바람직하다. 필터재가 제균작용을 가지는 다공질막은 저류부(100) 내에 세균의 유입을 방지할 수 있고, 바람직하다. 이 다공질막은 통기가 용이하고 박테리아나 바이러스의 유입을 방지 가능한 구멍 직경을 가지는 것으로, 0.1 내지 0.6 ㎛의 구멍 직경이 바람직하다. 또, 만일 세포 함유액에 접촉해도 습기 차지 않고 통기가 가능한 소수성의 것이 바람직하다. 또, 같은 목적으로 저류부(100)에 「공기 배출용 도관」을 유핵세포의 도관과는 별도로 설치할 수 있다. 이 도관은 폐쇄계에서 저류부(100) 내의 공기를 혈액 백이나 세포 분리하는 공정에서 사용한 시스템과 연결하여 배출할 수 있다.

본 발명에서 말하는 「유핵세포가 밀봉된 동결 보존부를 동결시켜 보존하는 동결 보존 공정」이란, 세포의 동결 보존 방법으로서 일반적으로 행해지고 있는 방법이면 특별히 한정은 없지만, 낙하 등의 충격에 의한 파손을 막기 때문에, 동결 보존부(120)는 금속제의 캐니스터(canister)에 넣어 보호하는 편이 바람직하고, 세포에의 손상을 저감시키기 위해서 액체 질소 보존 전에 프로그램 냉각기로 동결 보존하는 편이 바람직하다. 액체 질소에서의 동결 보존은 기상 또는 액상 어느 쪽으로도 행할 수 있다.

본 발명에 의한 세포의 동결 보존 방법에 있어서는 세포 부유액으로부터 유핵세포를 분리한 후의 동결 보존하는 것까지의 처리를 동일 용기 내에서 밀폐계로 행하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 말하는 「밀폐계」란, 유핵세포의 손실, 세균 오염의 위험을 저감시킬 수 있도록 외계에 대해서 폐쇄되어 있는 계이면 임의의 구성을 취할 수 있고, 바람직하게는 공정 (b) 내지 (e) 사이에, 유핵세포가 외계의 공기와 접촉하지 않도록 하는 구성을 채용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 예를 들면 필터법에 의한 세포 분리 시스템과 동결 보존 용기를 연결해 두면 세포 분리로부터 동결 보존까지의 전 공정을 밀폐계로 행하여 세균 오염의 위험이 현격히 낮아진다.

이하에 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

이하의 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 4는 제대혈로부터 단핵구를 분리, 농축하여 최종 용적을 4 ㎤로 하는 방법에 대해서 예시한다. 이 경우의 불요 세포는 적혈구이다.

〔실시예 1〕적혈구 응집제로 제대혈을 층 분리한 것을 여과하는 방법

(1) 세포 분리 필터 장치의 제작

상 용기와 하 용기를 포함하여 조립한 후 내 치수가 세로 43 ㎜, 가로 43 ㎜, 높이 2.9 ㎜(유효 여과 단면적 18.5 ㎠, 내용적 7 ㎤)로 액체 유출구와 액체 유입구를 최장 대각선상에 가지는 폴리카르보네이트제 용기의 입구측으로부터, 제1층째에 응집괴 포착재로서 평균섬유직경 12 ㎛의 폴리에스테르 부직포 0.14 g을, 제2층째에 유핵세포 포착재로서 1.7 ㎛의 폴리에스테르 부직포 1.28 g을, 제3층째에 회수액 정류화재로서 평균섬유직경 1.1 ㎛의 폴리에스테르 부직포 0.19 g을 포함하는 필터재를 충전했다. 또한, 제1층째, 제2층째 및 제3층째의 충전 밀도는 각각 0.20 g/㎤, 0.24 g/㎤ 및 0.20 g/㎤였다. 또, 해당 필터재에 혈소판 통과성을 부여할 목적으로, 친수성 폴리머 코팅을 행했다. 즉, 히드록시에틸메타크릴레이트·디메틸아미노에틸메타크릴레이트 공중합체(몰비로 97:3)의 1% 에탄올 용액을 해당 세포 분리 필터 장치의 액체 유입구로부터 통액시켜 질소 가스로 여분의 폴리머 용 액을 퍼지한 후, 60℃로 8시간 이상 진공 건조기로 건조시켰다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)세포 농축 조작

사전에 클램프(21, 22)를 닫아 두었다. 200 ㎤ 혈액 백에 저류된 CPD 첨가 인간 제대혈 100 ㎤(헤마토크리트 값 27.8%)에, 6% 히드록시에틸스타치(히시야마제약 「HES40(적혈구 침강제)」)를 20 ㎤ 첨가하고, 10분간 혼화했다. 다음에 혈액 백과 혈액도관(11)을 접속하고, 혈액 백을 매달아 1시간 정치했다. 혈액 백 내의 적혈구가 침강하여, 상층의 백혈구층과 하층의 적혈구층의 계면이 명확하게 된 것을 확인 후, 클램프(21)를 열어 낙차에 의해 여과를 개시했다. 이때, 하층의 적혈구층부터 세포 분리 필터 장치(40)에 흐르고, 계속해서 상층의 백혈구층이 흘러가서 세포 분리 필터 장치(40) 내에 잔류하는 적혈구가 씻어 내려지는 모습이 관찰되었다. 여과된 혈액은 배출 백(70)에 저류했다. 혈액 백 내의 모든 혈액이 세포 분리 필터 장치(40)에 도입된 것을 확인 후, 클램프(21, 23)를 닫았다. 다음에 10% 덱스트란 생리 식염수 용액 (고바야시 제약 「덱스트란 40주」)에 인간 혈청 알부민을 최종 농도 3%가 되도록 첨가한 액체 19 ㎤와 공기 18 ㎤를 실린지에 충전했다. 다음에 클램프(22)를 열어 회수액 주입구(60)로부터, 액체, 기체의 순서로 수동으로 통액시켜 회수 백(50)에 단핵구를 회수했다(회수 단핵구 액 1). 이 경우의 회수된 세포액량은 23 ㎤, 헤마토크리트 값은 3.5%, 회수에 요한 시간은 2초(유속 570 ㎤/분)였다. 다시 이 후, 회수된 단핵구를 원뿔형 튜브로 옮겨, 400 G×15 분의 원심 조건으로 원심 분리했다. 최종 용적이 4 ㎤가 되도록 상청을 제거한 후, 전도 혼화해서 침전물을 풀었다(회수 단핵구 액 2).

(4)분석

본 세포 농축 조작에서의 세포수의 계수는 다 항목 자동 혈구 분석 장치(시스멕스사 SF3000)를 이용해서 측정하여 회수 단핵구 액 1의 적혈구 용적, 단핵구 회수율 1, 단핵구 회수율 2를 이하의 계산식으로 산출했다.

적혈구 용적(㎤) = 회수 단핵구 액 1의 헤마토크리트 값×회수 단핵구 액 1의 액량÷100

단핵구 회수율 1(%) = 100×(회수 단핵구 액 1의 단핵구 수/제대혈의 단핵구 수)

단핵구 회수율 2(%) = 100×(회수 단핵구 액 2의 단핵구 수/제대혈의 단핵구 수)

(5)결과

본 세포 농축 조작에서의 적혈구 용적은 0.8 ㎤, 단핵구 회수율 1은 85%, 단핵구 회수율 2는 82%였다.

〔실시예 2〕강 원심으로 제대혈을 층 분리한 것을 여과하는 방법

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

실시예 1과 같은 것을 사용했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)세포 분리 조작

사전에 도 1의 세포 분리 시스템의 클램프(21, 22, 23)를 닫아 두었다. CPD 첨가 인간 제대혈 100 ㎤(헤마토크리트 값 31.1%)을 저류한 200 ㎤ 혈액 백과 혈액도관(11)을 접속하고, 혈액 백이 수직으로 선 상태로 원심 컵에 고정하고, 3000 G로 12분간, 10℃로 원심했다. 다음에 원심 컵으로부터 혈액 백과 세포 분리 시스템을 차분하게 꺼내고, 혈액 백을 매달았다. 이때 혈액 백 안은 상층의 혈장층, 중간층의 버피코트층, 하층의 적혈구층의 3층으로 층 분리되어 있었다. 계면을 흐트러지지 않도록 상층의 혈장층으로부터 회수액용으로 실린지에 19 ㎤ 채취하고, 클램프(21과 23)를 열어 낙차에 의해 여과했다. 이때, 하층의 적혈구층부터 세포 분리 필터 장치(40)에 흐르고, 계속해서 중간층의 버피코트층, 마지막에 상층의 혈장층이 흘러가서 세포 분리 필터 장치(40) 내에 잔류하는 적혈구가 씻어 내려지는 모습이 관찰되었다. 여과된 혈액은 배출 백(70)에 저류했다. 혈액 백 내의 모든 혈액이 세포 분리 필터 장치(40)에 도입된 것을 확인 후, 클램프(21, 23)를 닫았다. 그 후, 먼저 실린지에 채취해 둔 혈장에 공기 18 ㎤를 가하고, 클램프(22)를 연 후, 회수액 주입구(60)로부터 액체, 기체의 순서로 수동으로 통액시켜 회수 백(50)에 단핵구를 회수했다(회수 단핵구 액 1). 이 경우의 회수된 세포액량은 23 ㎤, 헤마토크리트 값 0.12%, 회수에 요한 시간은 2초(유속 570 ㎤/분)였다. 다시 이 후, 회수된 단핵구를 원뿔형 튜브로 옮겨, 400 G×15분의 원심 조건으로 원심 분리했다. 최종 용적이 4 ㎤가 되도록 상청을 제거한 후, 전도 혼화해서 침전물을 풀었다(회수 단핵구 액 2).

(4)결과

본 세포 농축 조작에서의 적혈구 용적은 0.5 ㎤, 단핵구 회수율 1은 87%, 단핵구 회수율 2는 84%였다.

〔비교예 1〕제대혈을 층 분리하지 않고 여과하는 방법

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

실시예 1과 같은 것을 사용했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)세포 분리 조작

100 ㎤의 제대혈(헤마토크리트 값 28.2%)을 층 분리하지 않고 그대로 세포 분리 필터 장치(40)에 도입하고, 그 이후에는 실시예 1과 같은 조작을 행했다. 회수된 세포액량은 23 ㎤이고, 헤마토크리트 값은 9.1%, 회수에 요한 시간은 2초(유속 570 ㎝/분)였다.

(4)결과

본 세포 농축 조작에서의 적혈구 용적은 2.1 ㎤, 단핵구 회수율 1은 85%, 단핵구 회수율 2는 60%였다.

〔비교예 2〕제대혈을 적혈구 응집법으로 단핵구 분리하는 방법 1

200 ㎤ 혈액 백에 저류된 CPD 첨가 인간제대혈 100 ㎤(헤마토크리트 값 29.6%)에, 6% 히드록시에틸스타치 (히시야마제약 「HES40(적혈구 침강제)」)를 20 ㎤ 첨가하고, 10분간 혼화했다. 이 혈액 백을 수직으로 서도록 원심 컵에 고정하 고, 50 G×5분, 10℃로 원심했다. 다음에 분리 스탠드로 혈액 백을 눌러 가능한 한 적혈구층을 빨아올리지 않도록 상층의 백혈구층 60 ㎤를 채취하고(단핵구 회수액 1), 원뿔형 튜브로 바꿔 옮겼다. 단핵구 회수율 1의 헤마토크리트 값은 2.5%였다. 또한 400 G×10분 10℃로 원심 후, 침전물 4 ㎖를 남기고 상청을 제거하고, 전도 혼화해서 침전물을 풀었다(단핵구 회수액 2). 본 세포 농축 조작에서의 적혈구 용적은 1.5㎤, 단핵구 회수율 1은 66%, 단핵구 회수율 2는 58%였다.

〔비교예 3〕제대혈을 적혈구 응집법으로 단핵구 분리하는 방법 2

200 ㎤ 혈액 백에 저류된 CPD 첨가 인간 제대혈 100 ㎤(헤마토크리트 값 33.3%)에, 6% 히드록시에틸스타치 (히시야마제약 「HES40(적혈구 침강제)」)를 20 ㎤ 첨가하고, 10분간 혼화했다. 이 혈액 백을 수직으로 서도록 원심 컵에 고정하고, 50 G×5분 10℃로 원심했다. 다음에 분리 스탠드로 혈액 백을 눌러 하층의 적혈구층을 포함해서 상층의 백혈구층 65 ㎤를 채취하고(단핵구 회수액 1), 원뿔형 튜브로 바꿔 옮겼다. 단핵구 회수율 1의 헤마토크리트 값은 10%였다. 또한 400 G×10분, 10℃로 원심 후, 침전물 4 ㎖를 남기고 상청을 제거했다(단핵구 회수액 2). 본 세포 농축 조작에서의 적혈구 용적은 6.5 ㎤, 단핵구 회수율 1은 85%, 단핵구 회수율 2는 32%였다.

〔비교예 4〕강 원심으로 제대혈을 층 분리해서 단핵구 분리하는 방법

상부와 하부에 각각 발취용 도관을 가지는 200 ㎤ 혈액 백에 CPD 첨가 인간 제대혈 100 ㎤(헤마토크리트 값 27.3%)를 저류하고, 수직으로 서도록 원심 컵에 고정하고, 3000 G×12분 10℃로 원심했다. 분리 스탠드로 혈액 백을 꽉 눌러, 혈액 백 위로부터 상층의 혈장층을, 혈액 백 아래로부터 하층의 적혈구층을 밀어내어, 혈액 백 내에 버피코트층을 포함해서 30 ㎤ 남도록 했다(단핵구 회수액 1). 단핵구 회수액 1의 헤마토크리트 값은 40%였다. 다음에 원뿔형 튜브로 바꿔 옮기고, 400 G×10분 10℃로 원심 후, 침전물 4 ㎖를 남기고 상청을 제거했다(단핵구 회수액 2). 본 세포 농축 조작에서의 적혈구 용적은 12.0 ㎤, 단핵구 회수율 1은 95%, 단핵구 회수율 2는 21%였다.

실시예 및 비교예의 결과를 표 1에 종합했다. 표 1의 결과로부터 알 수 있듯이, 본 발명의 실시예의 방법에 의하면 적혈구 용량을 삭감할 수 있음과 동시에, 높은 단핵구 회수율을 달성할 수 있다.

	적혈구 용량	단핵구 회수율 1	단핵구 회수율 2
실시예 1	0.8 ㎤	85%	82%
실시예 2	0.5 ㎤	87%	84%
비교예 1	2.1 ㎤	85%	60%
비교예 2	1.5 ㎤	66%	58%
비교예 3	6.5 ㎤	85%	32%
비교예 4	12.0 ㎤	95%	21%

이하의 실시예 3 내지 6, 비교예 5 내지 9는 제대혈로부터 단핵구를 분리, 농축하는 방법에 대해서 예시한다. 이 경우의 불요 세포는 적혈구이다.

〔실시예 3〕

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

상 용기와 하 용기를 포함하여 조립한 후 내 치수가 세로 43 ㎜, 가로 43 ㎜, 높이 2.9 ㎜(유효 여과 단면적 18.5 ㎠, 내용적 7 ㎤)로 액체 유출구와 액체 유입구를 최장 대각선 상에 가지는 폴리카르보네이트제 용기의 입구측으로부터, 제1층째에 유핵세포 포착재로서 평균섬유직경 1.7 ㎛의 폴리에스테르 부직포 1.37 g을, 제2층째에 회수액 정류화재로서 평균섬유직경 1.1 ㎛의 폴리에스테르 부직포 0.19 g을 포함하는 필터재를, 상 용기와 하 용기의 주변에서 끼워 넣어지도록 충전해서 용기 입구측 공간과 출구측 공간으로 분리했다. 또한, 제1층째의 충전시 두께 및 충전 밀도는 각각 2.5 ㎜ 및 0.24 g/㎤, 제2층째의 충전시 두께 및 충전 밀도는 각각 0.4 ㎜ 및 0.20 g/㎤이고, 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값은 74 ㎝였다. 또, 해당 필터재에 혈소판 통과성을 부여할 목적으로, 친수성 폴리머 코팅을 행했다. 즉, 히드록시에틸메타크릴레이트·디메틸아미노에틸메타크릴레이트 공중합체 (몰비로 97:3)의 1% 에탄올 용액을 해당 세포 분리 필터 장치의 액체 유입구로부터 통액시켜 질소 가스로 여분의 폴리머 용액을 퍼지한 후, 60℃로 8시간 이상 진공 건조기로 건조시켰다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)세포 분리 조작

세포 분리 필터 장치에, CPD 첨가 인간 제대혈 100 ㎤를 세포 함유액의 입구로부터 낙차에 의해 통액해서 단핵구를 포착했다. 여과한 혈액은 배출 병에 회수했다. 그 후, 시판되는 10% 덱스트란 생리 식염수 용액 (고바야시 제약 「덱스트란 40주」)에 인간 혈청 알부민을 3%가 되도록 첨가한 액체 19 ㎤와 공기 18 ㎤를 실린지에 충전하고, 세포 함유액의 출구로부터 수동으로 통액시켜 세포 함유액의 입구로부터 단핵구를 회수했다. 이 경우의 회수된 세포액량은 23 ㎤, 회수에 요한 시간은 2초(유속 570 ㎤/분)였다.

(4)분석

본 세포 분리 조작에서의 세포수의 계수는 다 항목 자동 혈구 분석 장치(시스멕스사 SF3000)를 이용해서 측정하여 단핵구 회수율을 이하의 계산식으로 산출했다.

단핵구 회수율(%) = 100×(회수 세포액 중의 단핵구 수/제대혈 중의 단핵구 수)

(5)결과

본 세포 분리 조작에서의 단핵구 회수율은 85%, 여과 시간은 6분이었다.

〔실시예 4〕

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

상 용기와 하 용기를 포함하여 조립한 후 내 치수가 세로 30 ㎜, 가로 30 ㎜, 높이 12.4 ㎜(유효 여과 단면적 9 ㎠, 내용적 11 ㎤)로 액체 유출구와 액체 유입구를 최장 대각선 상에 가지는 폴리카르보네이트제 용기의 입구측으로부터, 제1층째에 유핵세포 포착재로서 평균섬유직경 2.3 ㎛의 폴리에스테르 부직포 1.32 g을, 제2층째에 회수액 정류화재로서 평균섬유직경 1.1 ㎛의 폴리에스테르 부직포 0.19 g을 포함하는 필터재를, 상 용기와 하 용기의 주변에서 끼워 넣어지도록 충전해서 용기 입구측 공간과 출구측 공간으로 분리했다. 또한, 제1층째의 충전시 두께 및 충전 밀도는 각각 5.4 ㎜ 및 0.20 g/㎤, 제2층째의 충전시 두께 및 충전 밀도는 각각 7 ㎜ 및 0.20 g/㎤이고, 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값은 16.7 ㎝였다. 또, 실시예 1과 같이 부직포에 친수성 폴리머 코팅을 행했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)세포 분리 조작

실시예 3과 같은 세포 분리를 행했다. 회수된 세포액량은 21 ㎤이고, 회수에 요한 시간은 3초(유속 380 ㎤/분)였다.

(4)결과

본 세포 분리 조작에서의 단핵구 회수율 75%, 여과 시간은 10분(유속 10 ㎤/분).

〔실시예 5〕

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

용기는 실시예 3과 같은 것을 이용했다. 용기의 입구측으로부터, 제1층째에 응집괴 포착재로서 평균섬유직경 12 ㎛의 폴리에스테르 부직포 0.14 g을, 제2층째에 유핵세포 포착재로서 1.7 ㎛의 폴리에스테르 부직포 1.28 g을, 제3층째에 회수액 정류화재로서 평균섬유직경 1.1 ㎛의 폴리에스테르 부직포 0.19 g을 포함하는 필터재를 충전했다. 또한, 제1층째의 충전시 두께 및 충전 밀도는 각각 0.3 ㎜ 및 0.20 g/㎤, 제2층째의 충전시 두께 및 충전 밀도는 각각 2.2 ㎜ 및 0.24 g/㎤, 제3층째의 충전시 두께 및 충전 밀도는 각각 0.4 ㎜ 및 0.20 g/㎤이고, 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값은 84.1 ㎝였다. 또, 실시예 3과 같이 부직포에 친수성 폴리머 코팅을 행했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)세포 분리 조작

실시예 3과 같은 세포 분리를 행했다. 회수된 세포액량은 23 ㎝이고, 회수에 요한 시간은 2초(유속 570 ㎤/분)였다.

(4)결과

본 세포분리 조작에서의 단핵구 회수율은 88%, 여과시간은 4분(유속 25 ㎤/분)이었다.

〔실시예 6〕

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

용기는 실시예 3과 같은 것을 이용했다. 용기의 입구측으로부터, 제1층째에 유핵 세포 포착재로서 충전시의 평균구멍직경 12 ㎛의 폴리우레탄 다공질체를, 제2층째에 회수액 정류화재로서 충전시의 평균구멍직경 6 ㎛의 폴리우레탄 다공질체를 포함하는 필터재를 충전했다. 또한, 제1층째의 충전시 두께 및 충전 시 공극율은 각각 2.2 ㎜ 및 60%, 제2층째의 충전시 두께 및 충전 시 공극율은 각각 0.7 ㎜ 및 60%였다. 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값은 74 ㎝였다. 또, 실시예 3과 같이 폴리우레탄 다공질체에 친수성 폴리머 코팅을 행했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)세포 분리 조작

실시예 3과 같은 세포 분리를 행했다. 회수된 세포액량은 23 ㎤이고, 회수에 요한 시간은 3초(유속 380 ㎤/분)였다.

(4)결과

본 세포 분리 조작에서의 단핵구 회수율은 84%, 여과 시간은 6분(유속 16.7 ㎤/분).

〔비교예 5〕

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

용기는 실시예 3과 같은 것을 이용했다. 필터재로서는 유핵세포 포착재로서 1.7 ㎛의 폴리에스테르 부직포 1.67 g을 충전했다. 또한, 필터재의 충전시 두께 및 충전 밀도는 각각 2.9 ㎜ 및 0.25 g/㎤이고, 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값은 62.1 ㎝였다. 또, 실시예 3과 같이 부직포에 친수성 폴리머 코팅을 행했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)세포 분리 조작

(4)결과

본 세포 분리 조작에서의 단핵구 회수율은 65%, 여과 시간은 7분(유속 14.3 ㎤/분)이었다.

〔비교예 6〕

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

상 용기와 하 용기를 포함하여 조립한 후 내 치수가 세로 22 ㎜, 가로 22 ㎜, 높이 12.4 ㎜(유효 여과 단면적 5.3 ㎠, 내용적 7 ㎤)로 액체 유출구와 액체 유입구를 최장 대각선 상에 가지는 폴리카르보네이트제 용기의 입구측으로부터, 제1층째에 유핵세포 포착재로서 평균섬유직경 1.7 ㎛의 폴리에스테르 부직포 1.50 g을, 제2층째에 회수액 정류화재로서 1.1 ㎛의 폴리에스테르 부직포 0.30 g을 포함하는 필터재를 충전했다. 또한, 제1층째의 충전시 두께 및 충전 밀도는 각각 10 ㎜ 및 0.24 g/㎤, 제2층째의 충전시 두께 및 충전 밀도는 각각 2.4 ㎜ 및 0.20 g/㎤이고, 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값은 5.3 ㎝였다. 또, 실시예 3과 같이 부직포에 친수성 폴리머 코팅을 행했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)세포 분리 조작

실시예 3과 같은 세포 분리를 행했지만, 여과 개시 후 급격하게 유속이 저하하여 30분이 지난 상황에서 1시간 이상 경과해도 여과가 완료되지 않았다.

〔비교예 7〕

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

상 용기와 하 용기를 포함하여 조립한 후 내 치수가 세로 74.2 ㎜, 가로 74.2 ㎜, 높이 3 ㎜(유효 여과 단면적 55 ㎠, 내용적 16 ㎤)로 액체 유출구와 액체 유입구를 최장 대각선 상에 가지는 폴리카르보네이트제 용기의 입구측으로부터, 제1층째에 유핵세포 포착재로서 평균섬유직경 1.7 ㎛의 폴리에스테르 부직포 3.61 g을, 제2층째에 회수액 정류화재로서 1.1 ㎛의 폴리에스테르 부직포 0.58 g을 포함하는 필터재를 충전했다. 또한, 제1층째의 충전시 두께 및 충전 밀도는 각각 2.5 ㎜ 및 0.24 g/㎤, 제2층째의 충전시 두께 및 충전 밀도는 각각 0.5 ㎜ 및 0.20 g/㎤이고, 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값은 220 ㎝였다. 또, 실시예 3과 같이 부직포에 친수성 폴리머 코팅을 행했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)세포 분리 조작

(4)결과

본 세포 분리 조작에서의 단핵구 회수율은 55%, 여과 시간은 4분(유속 33.3 ㎤/분)이었다.

〔비교예 8〕

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

연질 염화 비닐제의 액체 유입구를 가지는 시트 1매와 액체 유출구를 가지는 시트 1매로, 액체 유입구측으로부터 제1층째에 유핵세포 포착재로서 평균섬유직경 1.7 ㎛의 폴리에스테르 부직포 1.37 g을, 제2층째에 회수액 정류화재로서 평균섬유직경 1.1 ㎛의 폴리에스테르 부직포 0.19 g을 포함하는 필터재를 끼우고, 유효 여과 단면적이 18.5㎠가 되도록 주변을 고주파 용착해서 자루 모양의 필터 장치를 작성했다. 제1층째의 부직포가 2.2 ㎜가 되도록 이 필터 장치를 2매의 아크릴판 사이에 끼워 두께를 조절했다. 부직포의 두께의 조절은, 마찬가지로 작성한 필터 장치를 이용해서 별도 교정하고, 2매의 아크릴판의 간격에 의해 조절했다. 이 경우의 내용적은 7 ㎤였다. 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값은 74 ㎝였다. 또, 여기서 사용한 부직포는 필터 장치 작성 전에 실시예 1과 같은 친수성 폴리머의 에탄올에 침지하고, 60℃로 8시간 이상 진공 건조기로 건조시킨 후 사용했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)세포 분리 조작

여과는 실시예 3과 같이 행했다. 한편, 회수시에는 필터 장치를 사이에 두고 있던 2매의 아크릴판 간격을 넓혀, 상기 교정에 의해 유핵세포 포착재의 두께를 3.5 ㎜가 되도록 조정한 후(내용적 11 ㎖, 유핵세포 포착재의 충전 밀도 017 g/㎤), 10% 덱스트란 생리 식염수 용액에 인간 혈청 알부민을 3%가 되도록 첨가한 액체 23 ㎤와 공기 18 ㎤를 실린지에 충전하고, 세포 함유액의 출구로부터 수동으로 통액시켜 세포 함유액의 입구로부터 단핵구를 회수했다. 이 경우의 필터재의 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값은 51.4 ㎝였다. 회수된 세포액량은 22 ㎤이고, 회수에 요한 시간은 5초(유속 276 ㎤/분)였다.

(4)결과

본 세포 분리 조작에서의 단핵구 회수율은 45%, 여과시간은 6분(유속 16.7 ㎤/분)이었다.

〔비교예 9〕

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

비교예 8과 같은 필터 장치를 이용했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)세포 분리 조작

10% 덱스트란 생리 식염수 용액에 인간 혈청 알부민을 3%가 되도록 첨가한 액체 95 ㎤와 공기 18 ㎤를 회수액으로 한 이외에는 비교예 8과 같은 조작을 행했다. 회수된 세포액량은 18 ㎤이고, 회수에 요한 시간은 1분(유속 100 ㎤/분)였다.

(4)결과

본 세포 분리 조작에서의 단핵구 회수율은 85%, 여과 시간은 6분(유속 16.7 ㎤/분)이었다.

실시예 및 비교예의 결과를 표 2에 종합했다.

	유효 여과 단면적 /유핵세포 포착재 (여과시)	유효 여과 단면적 /유핵세포 포착재 (회수시)	회수액 정류화재의 유무	회수 세포액량	단핵구 회수율	여과 시간
실시예 3	74 ㎝	74 ㎝	있음	23 ㎖	85%	6분
실시예 4	16.7 ㎝	16.7 ㎝	있음	21 ㎖	75%	10분
실시예 5	84.1 ㎝	84.1 ㎝	있음	23 ㎖	88%	4분
실시예 6	74 ㎝	74 ㎝	있음	23 ㎖	70%	6분
비교예 5	62.1 ㎝	62.1 ㎝	없음	23 ㎖	65%	7분
비교예 6	5.3 ㎝	5.3 ㎝	있음	-	회수 불능	여과 불능
비교예 7	220 ㎝	220 ㎝	있음	21 ㎖	55%	4분
비교예 8	74 ㎝	51.4 ㎝	있음	22 ㎖	45%	6분
비교예 9	74 ㎝	51.4 ㎝	있음	100 ㎖	85%	6분

이하의 실시예 7 및 비교예 10 내지 11은 제대혈로부터 단핵구를 필터 장치로 분리한 후, 원심 농축하여 동결 보존하는 방법에 대해서 예시한다. 이 경우의 불요 세포는 적혈구이다.

〔실시예 7〕

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

실시예 1과 같은 것을 사용했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)저류 백

도 2 타입의 저류 백을 사용했다. 저류부의 내용적은 40 ㎤이고, 동결 보존부의 내용적은 5 ㎤, 재질은 에틸렌아세트산 비닐 공중합체(EVA)의 것을 사용했다.

(4)세포 농축 조작

사전에 클램프(21, 22, 23)를 닫아 두었다. 200 ㎤의 세포 함유액 백에 저류된 CPD 첨가 인간 제대혈 100 ㎤와 혈액도관(11)을 접속했다. 클램프(21과 23)를 열어 낙차에 의해 여과를 개시했다. 여과된 혈액은 배출 백(70)에 저류했다. 세포 함유액 백 내의 모든 혈액이 세포 분리 필터 장치(40)에 도입된 것을 확인 후, 클램프(21, 23)를 닫았다. 다음에 10% 덱스트란 생리 식염수 용액 (고바야시 제약 「덱스트란 40주」)에 인간 혈청 알부민을 최종 농도 3%가 되도록 첨가한 액체 19 ㎤와 공기 18 ㎤를 실린지에 충전했다. 다음에 클램프(22)를 열어 회수액 주입구(60)로부터 수동으로 통액시켜 동결 보존부(120)를 가지는 저류 백에 단핵구를 회수했다. 이 경우의 회수된 세포액량은 23 ㎤였다. 열 봉합기를 이용해서 세포 분리 시스템으로부터 저류 백을 떼어낸 후, 동결 보존부(120)를 원심 컵의 저면측으로 해서 1000 G×15분의 원심 조건으로 원심 분리했다. 협착부(용단 분리부)(110)까지의 상청을 제거하고, 동결 보존부(120)의 공기를 밀어내면서 열 봉합기를 이용해서 용단 분리부(110)로 용단하여 저류부(100)로부터 떼어냈다. 다음에 동결 보존부(120)를 손가락으로 누르면서 침전물을 풀었다. 동결 보존부(120)의 표면을 냉제로 차게 하면서 동해 보호제 도입부(130)로부터 50% 디메틸술폭시드를 실린지 펌프를 이용해서 0.3 ㎤/분의 유속으로 1 ㎤ 가했다. 최종 용적은 5 ㎤였다. 그 후, -80℃ 중에서 2시간 정치하고, 액체 질소 기상으로 동결 보존했다.

(5)분석

동결 보존 전에 유핵세포의 취출구(140)로부터 샘플링하여 원래의 제대혈과 합쳐 다 항목 자동 혈구 분석 장치(시스멕스사 SF3000)를 이용해서 단핵구 수를 측정하여 회수율을 계산했다.

(6)결과

본 세포 농축 조작에서의 단핵구 회수율은 85%이고, 동결 해동 후, 동결 보존부(120)의 파손은 볼 수 없었다.

〔비교예 10〕

필터법으로 분리된 단핵구를 원뿔형 튜브로 바꿔 옮겨 원심 농축하고 다시 단핵구 농축액을 저류 백으로 바꿔 옮겨 동결 보존했다.

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

실시예 7과 같은 것을 사용했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템으로, 저류 백 대신에 본 발명에서 말하는 협착부(110)나 동결 보존부(120)를 갖지 않는 통상의 혈액 백을 이용했다.

(3)저류 백

실시예 7과 같은 것을 사용했다.

(4)세포 분리 조작

실시예 7과 같이 도 1의 세포 분리 시스템으로 제대혈을 처리하고, 본 발명에서 말하는 협착부(110)나 동결 보존부(120)를 갖지 않는 통상의 혈액 백에 유핵세포를 회수했다. 회수된 유핵세포액 23 ㎤를 14 ㎤ 원뿔형 튜브 2개로 바꿔 옮겨 1000 G×15분의 원심 조건으로 원심 분리했다. 용적이 4 ㎤가 되도록 상청을 제거하고 침전물을 재 부유시킨 후에, 50% 디메틸술폭시드 1 ㎤를 냉제로 차게 하면서 0.3 ㎤/분의 유속으로 가했다. 그 후, 이 세포 농축물을 도 2 타입의 저류 백으로 바꿔 옮기고, 실시예 7과 같은 방법으로 동결 보존했다.

(5)결과

본 세포 농축 조작에서의 단핵구 회수율은 50%였다. 동결 해동 후, 동결 보존부(120)의 파손은 볼 수 없었다.

〔비교예 11〕

실시예 7에 있어서 동결 보존부(120) 내의 공기를 빼내는 조작을 행하지 않고 동결 보존했다.

(1)세포 분리 필터 장치의 제작

실시예 7과 같은 것을 사용했다.

(2)세포 분리 시스템

도 1의 세포 분리 시스템을 사용했다.

(3)저류 백

실시예 7과 같은 것을 사용했다.

(4)세포 분리 조작

동결 보존부(120)에 2 ㎤의 공기를 봉입하여 동결 보존한 이외에는 실시예 7과 같이 처리했다.

(5)결과

본 세포 농축 조작에서의 단핵구 회수율은 85%였지만, 동결 해동 후, 동결 보존부(120)의 파손을 볼 수 있었다.

본 발명에 의한 세포 농축물의 조제 방법은, 세포의 동결 보존의 사전 처리 수단으로서 이용되고, 간편하게 골수, 제대혈, 말초혈 등의 세포 함유액으로부터 단핵구 등의 유핵세포를 적혈구 등의 불요 세포로부터 효율적으로 분리할 수 있고, 유핵세포의 동결 보존 용액의 용적을 대폭적으로 작게 할 수 있으므로 유핵세포의 동결 보존에 유용한 방법으로서, 보존 비용을 낮게 억제하는데 유효한 수단으로서 이용할 수 있다. 또, 본 발명의 세포의 동결 보존 방법은 골수, 제대혈, 말초혈 등의 세포 함유액으로부터 단핵구 등의 유핵세포를 적혈구 등의 불요 세포로부터 분리하여 동결 보존하기 위해서 사용할 수 있고, 유핵세포의 손실, 세균 오염의 위험, 동결 용기 파손의 위험을 저감 하는데 유효한 수단으로서 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 의한 세포 농축물의 조제 방법을 행하기 위한 시스템의 일례를 나타내는 모식도이다.

도 2는 본 발명의 저류 백 형상의 일례를 나타내는 모식도이다.

도 3은 본 발명의 저류 백 형상의 다른 예를 나타내는 모식도이다.

도 4는 본 발명의 저류 백 형상의 또 다른 예를 나타내는 모식도이다.

Claims

유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을, 유핵세포를 실질적으로 포착하고 불요 세포는 실질적으로 통과시키는 필터재를 포함하는 필터 장치에 도입해서 유핵세포를 해당 필터재에 포착하고 불요 세포를 배출시킨 후, 해당 필터 장치에 회수액을 도입해서 해당 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수하는 세포 농축물의 조제 방법에 있어서, 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을 유핵세포가 풍부한 층과 불요 세포가 풍부한 층으로 층 분리한 후, 상기 필터 장치에 먼저 해당 불요 세포가 풍부한 층을 도입하고, 계속해서 해당 유핵세포가 풍부한 층을 도입해서 유핵세포를 해당 필터재에 포착시키면서 해당 필터 장치 내에 잔존하는 불요 세포를 배출시킨 후, 해당 필터 장치에 회수액을 도입해서 해당 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 세포 농축물의 조제 방법.
제1항에 있어서, 불요 세포를 중력 또는 원심력에 의해 침강시킴으로써, 적어도 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을 유핵세포가 풍부한 층과 불요 세포가 풍부한 층으로 층 분리하는 세포 농축물의 조제 방법.
제1항에 있어서, 불요 세포를 응집시킨 후에 불요 세포를 중력 또는 원심력에 의해 침강시킴으로써, 적어도 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을 유핵세포가 풍부한 층과 불요 세포가 풍부한 층으로 층 분리하는 세포 농축물의 조제 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불요 세포가 적혈구인 세포 농축물의 조제 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유핵세포가 조혈 줄기세포인 세포 농축물의 조제 방법.
제3항에 있어서, 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액에 히드록시에틸스타치를 첨가함으로써 불요 세포를 응집시키는 세포 농축물의 조제 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유핵세포가 풍부한 층이 유핵세포 농후층과 유핵세포 희박층을 포함하고, 필터 장치에 유핵세포 희박층, 유핵세포 농후층의 순서로 도입하는 세포 농축물의 조제 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유핵세포가 풍부한 층이 유핵세포 농후층과 유핵세포 희박층을 포함하고, 필터 장치에 유핵세포 농후층, 유핵세포 희박층의 순서로 도입하는 세포 농축물의 조제 방법.
제8항에 있어서, 상기 유핵세포 희박층의 일부 또는 전부를 회수액의 적어도 일부로서 이용하는 세포 농축물의 조제 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터 장치에 회수액을 도입해서 해당 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수한 후에, 다시 회수한 유핵세포 함유액을 원심 분리하여 상청을 제거함으로써 유핵세포를 농축하는 세포 농축물의 조제 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터재가, 적어도 세포 함유액의 입구와 출구를 가지는 용기 내에 다공질체를 포함하는 유핵세포 포착재 및 회수액 정류화재가 세포 함유액의 입구측으로부터 출구측을 향해 이 순서로 충전되고, 해당 필터재의 유효 여과 면적을 충전시의 유핵세포 포착재의 두께로 나눈 값이 15 내지 120 ㎝인 것을 특징으로 하는 세포 농축물의 조제 방법.
유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을, 유핵세포를 실질적으로 포착하고 불요 세포는 실질적으로 통과시키는 필터재를 포함하는 필터 장치에 도입해서 유핵세포를 해당 필터재에 포착하고 불요 세포를 배출시킨 후, 해당 필터 장치에 회수액을 도입해서 해당 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수하는 세포 농축물의 조제 방법에 있어서, 다공질체를 포함하는 유핵세포 포착재 및 회수액 정류화재가 적층되는 필터재로서, 또한 해당 필터재의 유효 여과 면적을 충전시의 유핵 세포 포착재의 두께로 나눈 값이 15 내지 120 ㎝인 필터재가, 유핵세포 포착재가 세포 함유액의 입구측에 되도록 세포 함유액의 입구와 출구를 가지는 용기에 충전되는 필터 장치를 이용해서, 세포 함유액의 입구로부터 세포 함유액을 필터 장치에 도입해서 유핵세포를 필터재에 포착시키고, 불요 세포를 해당 필터 장치로부터 배출시킨 후, 세포 함유액의 출구측으로부터 회수액을 도입해서 해당 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 세포 함유액의 입구측으로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 세포 농축물의 조제 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 유핵세포 포착재의 세포 함유액 입구측에 다시 응집괴 포착재가 충전되어 있는 세포 농축물의 조제 방법.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 필터재가 부직포인 세포 농축물의 조제 방법.
제14항에 있어서, 부직포를 포함하는 유핵세포 포착재 및 회수액 정류화재가 각각,

가) 평균섬유직경이 1.1 내지 3.0 ㎛, 충전 밀도가 0.1 내지 0.3 g/㎤인 부직포를 포함하는 유핵세포 포착재,

나) 평균섬유직경이 0.5 내지 1.5 ㎛, 충전 밀도가 0.1 내지 0.3 g/㎤인 부직포를 포함하는 회수액 정류화재이고, 유핵세포 포착재, 회수액 정류화재의 순서 로 평균섬유직경이 작아지는 것을 특징으로 하는 세포 농축물의 조제 방법.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 필터재가 스펀지상 구조체인 세포 농축물의 조제 방법.
제16항에 있어서, 스펀지상 구조체를 포함하는 유핵세포 포착재 및 회수액 정류화재가 각각,

가) 충전시의 평균구멍직경이 7 내지 25 ㎛, 충전시의 공극율이 55 내지 90%인 스펀지상 구조체를 포함하는 유핵세포 포착재,

나) 충전시의 평균구멍직경이 2 내지 10 ㎛, 충전시의 공극율이 55 내지 90%인 스펀지상 구조체를 포함하는 회수액 정류화재이고, 유핵세포 포착재, 회수액 정류화재의 순서로 평균구멍직경이 작아지는 것을 특징으로 하는 세포 농축물의 조제 방법.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 필터재가 부직포와 스펀지상 구조체의 조합인 세포 농축물의 조제 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항 기재의 세포 농축물의 조제 방법 후에 다시,

(b) 회수된 유핵세포를, 저류부에 설치한 유핵세포 도입구를 통해 해당 저류 부와 동결 보존부를 가지는 저류 백으로 이행시켜 저류하는 세포 저류 공정,

(c) 저류된 유핵세포를 상기 저류 백 내에서, 동결 보존부를 회전 반경 상의 회전축으로부터 먼 위치에 배치시켜 원심 분리함으로써 유핵세포를 저류 백 내의 동결 보존부에 이동시키는 세포 농축 공정,

(d) 농축된 유핵세포를, 공기를 포함하지 않는 상태로 동결 보존부에 밀봉해서 용단 분리하는 용기 분리 공정, 및

(e) 유핵세포가 밀봉된 동결 보존부를 동결시켜 보존하는 동결 보존 공정을 차례로 행하고, 또한 상기 (b) 내지 (e)의 전 공정을 밀폐계로 행하는 세포의 동결 보존 방법.
(a) 유핵세포와 불요 세포를 포함하는 세포 함유액을, 유핵세포를 실질적으로 포착하고 불요 세포는 실질적으로 통과시키는 필터재를 포함하는 필터 장치에 도입해서 유핵세포를 해당 필터재에 포착하고 불요 세포를 배출시킨 후, 해당 필터 장치에 회수액을 도입해서 해당 필터재에 포착되어 있는 유핵세포를 회수하는 세포 농축물의 조제 공정,

(b) 회수된 유핵세포를, 저류부에 설치한 유핵세포 도입구를 통해 해당 저류부와 동결 보존부를 가지는 저류 백으로 이행시켜 저류하는 세포 저류 공정,

(c) 저류된 유핵세포를 상기 저류 백 내에서, 동결 보존부를 회전 반경 상의 회전축으로부터 먼 위치에 배치시켜 원심 분리함으로써 유핵세포를 저류 백 내의 동결 보존부에 이동시키는 세포 농축 공정,

(d) 농축된 유핵세포를, 공기를 포함하지 않는 상태로 동결 보존부에 밀봉해서 용단 분리하는 용기 분리 공정, 및

(e) 유핵세포가 밀봉된 동결 보존부를 동결시켜 보존하는 동결 보존 공정을 적어도 포함하는 공정을 차례로 행하고, 또한 상기 (b) 내지 (e)의 공정을 밀폐계로 행하는 세포의 동결 보존 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 유핵세포의 저류부가, 동결 보존부로부터 협착부를 사이에 두고 서서히 단면적을 넓히는 확대부를 가지는 형상인 세포의 동결 보존 방법.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유핵세포의 저류부는 협착부가 상기 (d)의 용기 분리 공정에 있어서 용단 분리부로서 이용되고, 동결 보존부가 상기 (e)의 동결 보존 공정에 있어서 유핵세포의 동결 보존용 용기로서 이용되는 것인 세포의 동결 보존 방법.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유핵세포의 동결 보존부가 유핵세포의 취출구를 가지는 것인 세포의 동결 보존 방법.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유핵세포의 동결 보존부 및(또는) 상기 유핵세포의 저류부가 동해 보호제 도입부를 가지는 것인 세포의 동 결 보존 방법.
제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유핵세포의 저류부가 유핵세포의 저류 백 내의 공기 배출용 필터 장치를 가지는 동결 보존 방법.
제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유핵세포의 저류부가 유핵세포의 저류 백 내의 공기 배출용 도관을 유핵세포의 도관과는 독립해서 가지는 세포의 동결 보존 방법.
제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (d)의 용기 분리 공정 전에, 상기 동해 보호제 도입부로부터 동해 보호제를 첨가하는 세포의 동결 보존 방법.
제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (d)의 용기 분리 공정 후에, 상기 동해 보호제 도입부로부터 동해 보호제를 첨가하는 세포의 동결 보존 방법.
제19항 내지 제28항 중 어느 한 항 기재의 방법을 이용하는 세포 동결물의 제조 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항 기재의 방법에 의해 얻어지는 세포 조성물.
제30항에 있어서, 상기 세포 조성물을 다시 원심 분리하여 상청을 제거함으로써 유핵세포를 농축해서 얻어지는 세포 조성물.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 불요 세포가 적혈구인 세포 조성물.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 유핵세포가 조혈 줄기세포인 세포 조성물.
제19항 내지 제28항 중 어느 한 항 기재의 방법에 의해 조제되는 세포 동결물.