JP2016106622A - 細胞の分離回収方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 細胞を含む溶液から前記細胞を分離回収する方法であって、前記溶液中に含まれる細胞量が非常に少ない場合であっても、効率的に細胞を分離回収できる方法を提供すること。【解決手段】 細胞を含む溶液を遠心分離することで前記細胞を分離回収する方法であって、細胞を含む溶液に親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含ませることで、前記課題を解決する。【選択図】 なし

Description

本発明は、細胞を含む溶液から前記細胞を効率的に分離回収する方法に関する。特に本発明は、前記溶液中に含まれる細胞量が非常に少ない場合であっても、前記細胞を効率的に分離回収できる方法に関する。

近年、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁もしくは分散して得られる組織標本試料や細胞培養液などから細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、がん患者より採取した血液から腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ、以下ＣＴＣ）を採取し、当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子分析を行ない、前記分析により得られた知見に基づき治療方針を判断する研究が進められている。

血液などの検体中に含まれる細胞を分離回収する方法として、従来から遠心分離による方法が用いられており、前記細胞をより多く回収するための効率のよい分離回収方法が求められている。特許文献１は、密度勾配遠心分離を用いた方法で血液中に含まれる細胞を分離回収する方法であって、血液由来タンパク質および／または乳由来タンパク質を含有する溶液を前記血液に添加することで、効率的な細胞の分離回収を実現している。しかしながら、ＣＴＣのように血液中への含量が非常に少ない細胞に対しては、引用文献１に開示の方法を用いても、効率的に細胞を分離回収するのは困難であった。

特開２０１１−０２４５７５号公報

本発明の課題は、細胞を含む溶液から前記細胞を分離回収する方法であって、前記溶液中に含まれる細胞量が非常に少ない場合であっても、効率的に細胞を分離回収できる方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

すなわち本発明の第一の態様は、
細胞を含む溶液を遠心分離することで、前記細胞を分離回収する方法であって、
細胞を含む溶液が、親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含む溶液である、前記方法である。

また本発明の第二の態様は、細胞を含む溶液が、糖をさらに含んだ溶液である、前記第一の態様に記載の方法である。

また本発明の第三の態様は、
細胞を含む溶液を密度勾配形成用媒体上に重層する工程と、
密度勾配遠心分離を行ない、前記細胞を含む上清を回収する工程と、
前記上清を遠心分離して得られた前記細胞を含むペレットを、親水性高分子を結合したタンパク質および糖を含んだ溶液に懸濁させる工程と、
前記ペレット懸濁液を遠心分離することで、前記細胞を含むペレットを回収する工程とを含む、細胞を分離回収する方法である。

また本発明の第四の態様は、親水性高分子を結合したタンパク質が、タンパク質に対し親水性高分子を０．５以上のモル比で反応させて得られたタンパク質である、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の方法。

また本発明の第五の態様は、タンパク質が血液由来タンパク質または乳由来タンパク質である、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の方法で分離回収する、細胞を含む溶液は、細胞を含む液状の組成物を意味する。具体的には、血液、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水などの生体試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた液や、前記生体試料や前記組織懸濁液より分離して得られる、前記生体試料または前記組織由来の細胞を含む画分や、あらかじめ単離した細胞の培養液、などがあげられる。このうち前記生体試料や前記組織懸濁液より分離して得られる、前記生体試料または前記組織由来の細胞を含む画分の一例として、生体試料や組織懸濁液を密度勾配形成用媒体上に重層後、密度勾配遠心分離を行ない、得られる画分があげられる。

本発明は細胞を含む溶液から前記細胞を遠心分離を用いて分離回収する際、前記溶液に親水性高分子を結合したタンパク質がさらに含まれていることを特徴としている。親水性高分子は電荷を持たない親水性高分子であればよく、一例としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレート、ポリアクリルアミド、ホスホリルコリン基を側鎖に有するポリマー、多糖類、ポリペプチドがあげられる。タンパク質は水溶性を有していればよく、一例として血清由来タンパク質や血漿由来タンパク質などの血液由来タンパク質やカゼインなどの乳由来タンパク質があげられ、さらに具体的な例として当業者が通常用いる血清由来タンパク質であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）や、当業者が通常用いる乳由来タンパク質であるカゼインがあげられる。親水性高分子を結合したタンパク質は、親水性高分子とタンパク質とが一定の割合で結合したタンパク質であり、例えば、タンパク質と結合可能な官能基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基）を付与した親水性高分子とタンパク質とを一定のモル比で反応させることで得られる。なお親水性高分子とタンパク質との反応比は、タンパク質に対し親水性高分子を０．０１以上のモル比で反応させればよく、０．５以上のモル比で反応させればより好ましく、２以上のモル比で反応させると最も好ましい（タンパク質に対し親水性高分子を２以上のモル比で反応させると、血液由来タンパク質の場合は前記タンパク質に対し親水性高分子が実測モル比１以上で結合し、乳由来タンパク質の場合は前記タンパク質に対し親水性高分子が実測モル比０．２以上で結合する）。また前記溶液に、マンニトール、グルコース、スクロースなどの糖をさらに含むと細胞へのダメージが少なくなるため好ましく、前記糖を含む溶液に塩化カルシウムや塩化マグネシウムなどの電解質や、ＢＳＡやカゼイン等のタンパク質をさらに含んでもよい。添加する糖の濃度は等張液となる濃度とすればよく、糖としてマンニトールを用いる場合は終濃度で２５０ｍＭから３５０ｍＭの間とすればよい。

本発明の方法で分離回収した細胞の測定は、例えば、スライドに塗布したり、顕微鏡や光学検出器などで観察したり、フローサイトメトリーを用いたりして行なえばよい。なお本発明の方法で分離回収した細胞の測定を、顕微鏡や光学検出器などで観察して行なう場合、前記細胞を含む懸濁液を、前記細胞を保持可能な保持部を有した細胞保持手段に導入し、前記保持部に前記細胞を保持した後、顕微鏡や光学検出器などで観察するとよい。保持部の例として、前記細胞を収納可能な孔や、前記細胞を固定可能な材料（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）で覆われた面があげられる。なお保持部の大きさを前記細胞を一つだけ保持可能な大きさとすると、特定細胞の採取および解析（形態学的分析、組織型分析、遺伝子分析など）が容易に行なえる点で好ましい。また細胞を保持部に保持させる際、誘電泳動力を用いると、保持部に細胞を効率的に保持させることができる点で好ましい。誘電泳動力を用いる場合、具体的には、交流電圧を印加することで誘電泳動を発生させ、保持部内へ細胞を導入すればよい。印加する交流電圧は、保持部内の細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧であると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚの間とし、電界強度を１×１０^５から５×１０^５Ｖ／ｍの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。

以下、本発明の分離回収方法の一例として、血液中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分離回収する方法について説明するが、本発明は本説明の内容に限定されるものではない。
（１）がんの疑いのある患者から血液を採取する。なお血液を採取する際、クエン酸、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの抗凝固剤を添加してもよい。また必要に応じ、採取した血液を生理食塩水などで希釈してもよい。
（２）採取した血液（または希釈した血液）を密度勾配遠心法を用いて、ＣＴＣを分離する。密度勾配遠心法は細胞をその比重に基づき分離する方法であり、密度勾配を形成した媒体（密度勾配形成用媒体）上に採取した血液（または希釈した血液）を重層した後、遠心分離を行ない、目的とするＣＴＣを含む層（上層）を回収することで、不要な細胞を除去したＣＴＣを含む画分を得る。なお密度勾配遠心を行なう前に、血液または希釈血液に、不要な細胞である赤血球、白血球、血小板と結合可能な結合剤（例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））を添加するとよい。前記結合剤は、赤血球、白血球や血小板、および／またはこれら細胞の表面抗原と結合することで細胞凝集体を形成し、これら細胞の密度を大きくすることができるため、密度勾配遠心法によるＣＴＣの分離を容易にする。
（３）（２）で得られたＣＴＣを含む画分を遠心分離することで血液成分を除去し、当該ＣＴＣをペレット状にした後、親水性高分子を結合したタンパク質（例えば、ポリエチレングリコールを結合したＢＳＡやポリエチレングリコールを結合したカゼイン）を含む溶液を添加し、ＣＴＣを懸濁させる。親水性高分子を結合したタンパク質の濃度は、懸濁液でのタンパク質の終濃度として、０．０１から２５％（ｗ／ｖ）の間であればよく、０．０２から５％（ｗ／ｖ）の間であればより好ましく、０．０５から２％（ｗ／ｖ）の間であればさらに好ましい。
（４）（３）で調製したＣＴＣを含む懸濁液を再度遠心分離し、ＣＴＣを含むペレットを回収する。なお必要に応じ、前記回収したペレットを親水性高分子を結合したタンパク質を含む溶液に再度懸濁させ、遠心分離する工程を追加してもよい。

本発明は、細胞を含む溶液を遠心分離することで前記細胞を分離回収する方法において、細胞を含む溶液が親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含むことを特徴としている。本発明の方法は細胞を含む溶液から前記細胞を高効率に分離回収することができ、特に前記溶液中に含まれる細胞量が非常に少ない場合に有用な方法である。

例えば本発明を、血液中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）の分離回収に適用することで、採血量を少なくすることができ、患者への負担を低減させることができる。またがんの診断をＣＴＣの存在により行なう場合、ＣＴＣの有無の判断結果に対する信頼性が向上するため、精度高く診断することができる。

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。

実施例１
（１）一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ−ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（３００ｍｇ、４．５μｍｏｌ）とを、炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、１５ｍＬ）に溶解させ、当該溶液を室温で３時間撹拌することでポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ（ＰＥＧ−ＢＳＡ）を調製した。なお調製する際、ｍＰＥＧ−ＮＨＳとＢＳＡとのモル比（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡ）を０．５、１、２または５となるようにした。調製後、分画分子量１００００の透析膜を用いて、純水への溶液置換を３日間行なった。
（２）ヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）を、５％ＣＯ_２環境下、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離し、蛍光染色色素（ＣＦＳＥ、同仁化学研究所社製）で標識した。蛍光標識されたＳＫＢＲ３細胞を目的とする細胞とし、蛍光標識されたＳＫＢＲ３細胞約５０個を（１）で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬに添加し、懸濁させた。
（３）（２）で得られたＳＫＢＲ３細胞懸濁液を３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離し、上清を除去した。
（４）（３）で上清を除去したＳＫＢＲ３細胞を含む懸濁液を細胞診断チップに導入し、交流電圧を３分間印加することで前記チップが有する保持部にＳＫＢＲ３細胞を保持させた。本実施例で用いた細胞診断チップは、直径３０μｍで深さ３０μｍの微細孔からなる微細孔を複数有した絶縁体と前記絶縁体と下部電極基板の間に設置した遮光性のクロム膜とからなる保持部を、厚さ１ｍｍのスペーサーと下部電極基板とで挟んだ構造であり、前記スペーサーを上部電極基板と下部電極基板とで挟んだ構造である。
（５）細胞診断チップに保持されたＳＫＢＲ３細胞数を計測し、（２）で添加したＳＫＢＲ３細胞数で除することで回収率を算出した。

実施例２
（１）一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ−ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）と、カゼイン（３００ｍｇ、１０．７μｍｏｌ）（カゼインの分子量２８０００と仮定し算出）とを、純水（３０ｍＬ）に溶解させ、当該溶液を室温で２４時間撹拌することでポリエチレングリコールを結合したカゼイン（ＰＥＧ−カゼイン）を調製した。なお調製する際、ｍＰＥＧ−ＮＨＳとカゼインとのモル比（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼイン）を０．５、１、２または５となるようにした。
（２）実施例１（２）のＳＫＢＲ３細胞に懸濁させる溶液として、（１）で調製したＰＥＧ−カゼイン（カゼインとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液を用いた他は、実施例１と同様な方法で回収率を算出した。

比較例１
実施例１（２）のＳＫＢＲ３細胞に懸濁させる溶液として、
３００ｍＭマンニトールを含む溶液、
３００ｍＭマンニトールおよび１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む溶液、
３００ｍＭマンニトールおよび０．１％（ｗ／ｖ）カゼインを含む溶液、
３００ｍＭマンニトールおよび、一方の末端がメトキシ基、もう一方の末端がカルボキシ基である分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ｍＰＥＧ−ＮＨＳの加水分解物）０．３ｍＭを含む溶液、または
３００ｍＭマンニトールおよび、両末端がヒドロキシ基である分子量６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＯＨ）０．３ｍＭを含む溶液、
を用いた他は、実施例１と同様な方法で回収率を算出した。

実施例１および２ならびに比較例１での回収率の結果をまとめて表１に示す。なお表１において、ＰＥＧ（０．５）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比０．５の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＰＥＧはＢＳＡに対して実測モル比０．３３で結合している）であり、ＰＥＧ（１）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比１の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＰＥＧはＢＳＡに対して実測モル比０．４５で結合している）であり、ＰＥＧ（２）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比２の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＰＥＧはＢＳＡに対して実測モル比１．１４で結合している）であり、ＰＥＧ（５）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比５の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＰＥＧはＢＳＡに対して実測モル比３．０１で結合している）であり、ＰＥＧ（０．５）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比０．５の条件で調製したＰＥＧ−カゼイン（ＰＥＧはカゼインに対して実測モル比０．０８で結合している）であり、ＰＥＧ（１）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比１の条件で調製したＰＥＧ−カゼイン（ＰＥＧはカゼインに対して実測モル比０．１２で結合している）であり、ＰＥＧ（２）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比２の条件で調製したＰＥＧ−カゼイン（ＰＥＧはカゼインに対して実測モル比０．２３で結合している）であり、ＰＥＧ（５）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比５の条件で調製したＰＥＧ−カゼイン（ＰＥＧはカゼインに対して実測モル比０．３８で結合している）である。遠心分離を用いたがん細胞の分離回収工程において、親水性高分子を結合した血液由来タンパク質であるＰＥＧ−ＢＳＡまたは親水性高分子を結合した乳由来タンパク質であるＰＥＧ−カゼインを含む溶液を用いることで、ＰＥＧおよびタンパク質を含まない溶液（３．８％）や、ＢＳＡまたはカゼインを含む溶液（９０．６％、８８．１％）や、ＰＥＧを含む溶液（８９．０％、１２．９％）と比較し、回収率が向上していることがわかる（９１．３％から９９．２％）。またＰＥＧ−ＢＳＡまたはＰＥＧ−カゼインを含む溶液同士で比較したところ、がん細胞回収率は、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡまたはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインの上昇に伴い向上しており、ＰＥＧ（２）−ＢＳＡ、ＰＥＧ（５）−ＢＳＡ、ＰＥＧ（２）−カゼインおよびＰＥＧ（５）−カゼインを含んだ溶液では回収率が９７％以上と高い回収率となった。

実施例３
（１）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に３ｍＬ採血後、前記採血管に３ｍＬの生理食塩水、７５μＬの白血球・赤血球結合剤（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および蛍光標識した約５０個のＳＫＢＲ３細胞を添加することで、希釈血液試料を調製した。
（２）調製した希釈血液試料を、密度１．０９１ｇ／ｍＬの密度勾配溶液に重層し、２０００×ｇで５分間、室温にて遠心後、上清を回収した。
（３）（２）で回収した上清に、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムと含む溶血液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間、室温にて遠心分離した。当該操作により上清に混入した赤血球が破壊され、分離回収したＳＫＢＲ３細胞の観察が良好になる。
（４）上清を除去後、ＳＫＢＲ３細胞を含むペレットを、実施例１（１）に記載の方法で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。
（５）再懸濁液を３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離後、上清を除去し、再度、ＳＫＢＲ３細胞を含むペレットをＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。当該操作は、血液成分を除去し、目的とするＳＫＢＲ３細胞を濃縮するための操作である。
（６）実施例１（３）から（５）と同様な方法で、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。

実施例４
実施例３（４）および（５）のＳＫＢＲ３細胞に懸濁させる溶液として、実施例２（１）に記載の方法で調製したＰＥＧ−カゼイン（カゼインとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液を用いた他は、実施例３と同様な方法で、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。

比較例２
実施例３（４）および（５）のＳＫＢＲ３細胞に懸濁させる溶液として、
３００ｍＭマンニトールを含む溶液、
３００ｍＭマンニトールおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む溶液、または
３００ｍＭマンニトールおよび０．１％（ｗ／ｖ）カゼインを含む溶液、
を用いた他は、実施例３と同様な方法で、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。

実施例３および４ならびに比較例２での回収率の結果をまとめて表２に示す。なお表２において、ＰＥＧ（１）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比１の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＰＥＧはＢＳＡに対して実測モル比０．４５で結合している）であり、ＰＥＧ（２）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比２の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＰＥＧはＢＳＡに対して実測モル比１．１４で結合している）であり、ＰＥＧ（５）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比５の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＰＥＧはＢＳＡに対して実測モル比３．０１で結合している）であり、ＰＥＧ（１）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比１の条件で調製したＰＥＧ−カゼイン（ＰＥＧはカゼインに対して実測モル比０．１２で結合している）であり、ＰＥＧ（２）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比２の条件で調製したＰＥＧ−カゼイン（ＰＥＧはカゼインに対して実測モル比０．２３で結合している）であり、ＰＥＧ（５）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比５の条件で調製したＰＥＧ−カゼイン（ＰＥＧはカゼインに対して実測モル比０．３８で結合している）である。遠心分離を用いたがん細胞の分離回収工程において、親水性高分子を結合した血液由来タンパク質であるＰＥＧ−ＢＳＡまたは親水性高分子を結合した乳由来タンパク質であるＰＥＧ−カゼインを含む溶液を用いることで、ＰＥＧおよびタンパク質を含まない溶液（８１．５％）や、ＢＳＡまたはカゼインを含む溶液（８７．０％、８６．６％）と比較し、回収率が向上していることがわかる（９０．４％から９６．４％）。またＰＥＧ−ＢＳＡを含む溶液同士で比較したところ、がん細胞回収率は、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡの上昇に伴い向上しており、ＰＥＧ（２）−ＢＳＡおよびＰＥＧ（５）−ＢＳＡを含んだ溶液では回収率が９５．０％前後と高い回収率となった。

Claims (5)

1. 細胞を含む溶液を遠心分離することで、前記細胞を分離回収する方法であって、
   細胞を含む溶液が、親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含む溶液である、前記方法。
2. 細胞を含む溶液が、糖をさらに含んだ溶液である、請求項１に記載の方法。
3. 細胞を含む溶液を密度勾配形成用媒体上に重層する工程と、
   密度勾配遠心分離を行ない、前記細胞を含む上清を回収する工程と、
   前記上清を遠心分離して得られた前記細胞を含むペレットを、親水性高分子を結合したタンパク質および糖を含んだ溶液に懸濁させる工程と、
   前記ペレット懸濁液を遠心分離することで、前記細胞を含むペレットを回収する工程とを含む、細胞を分離回収する方法。
4. 親水性高分子を結合したタンパク質が、タンパク質に対し親水性高分子を０．５以上のモル比で反応させて得られたタンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. タンパク質が血液由来タンパク質または乳由来タンパク質である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。