JP6686357B2

JP6686357B2 - 細胞の回収方法

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Publication number: JP6686357B2
Application number: JP2015199630A
Authority: JP
Inventors: 泰之秋山; 聡文最上
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2015-03-20
Filing date: 2015-10-07
Publication date: 2020-04-22
Anticipated expiration: 2035-10-07
Also published as: JP2016174596A

Description

本発明は、細胞を含む溶液から前記細胞を効率的に回収する方法に関する。特に本発明は、前記溶液中に含まれる細胞量が非常に少ない場合であっても、前記細胞を効率的に回収可能な方法に関する。

近年、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁もしくは分散して得られる組織標本試料や細胞培養液などから細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、がん患者より採取した血液から腫瘍細胞（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｕｍｏｒＣｅｌｌ、以下ＣＴＣ）を採取し、当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子分析を行ない、前記分析により得られた知見に基づき治療方針を判断する研究が進められている。

血液などの検体中に含まれる細胞を回収する方法として、細胞を保持可能な保持部を設けた細胞保持手段に細胞を含む溶液を導入した後、誘電泳動力を用いて前記保持部に前記細胞を保持させることで細胞を回収する方法がある。特許文献１には、上部電極と、多数の貫通孔が形成された絶縁体層を設けた下部電極との間の空間に、微粒子を含む懸濁液を導入し、両電極間に交流電圧を印加することで、誘電泳動力により微粒子を貫通孔内に導入し固定する方法が開示されている。しかしながら、ＣＴＣのように血液中に含まれる量が非常に少ない希少細胞に対しては、特許文献１に開示の方法を用いても、効率的に細胞を回収するのは困難であった。

特開２００７−２９６５１０号公報

本発明の課題は、細胞を含む溶液から前記細胞を回収する方法であって、前記溶液中に含まれる細胞量が非常に少ない場合であっても、効率的に細胞を回収可能な方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

すなわち本発明の第一の態様は、
細胞を含む溶液を、前記細胞を保持可能な保持部を設けた細胞保持手段に導入する工程と、
前記保持部に前記細胞を保持させる工程とを含む、細胞の回収方法であって、
細胞を含む溶液が、血液由来タンパク質、乳由来タンパク質または親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含む溶液である、前記回収方法である。

さらに本発明の第二の態様は、
細胞を含む溶液を、前記細胞を保持可能な保持部を設けた細胞保持手段に導入する工程と、
前記保持部に前記細胞を保持させる工程と、
接着物質を含む溶液を前記細胞保持手段に導入することで、前記保持された細胞を前記保持部に接着させる工程とを含む、細胞の固定化方法であって、
細胞を含む溶液が、血液由来タンパク質、乳由来タンパク質または親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含む溶液である、前記固定化方法である。

さらに本発明の第三の態様は、
細胞を含む溶液を、前記細胞を保持可能な保持部を設けた細胞保持手段に導入する工程と、
前記保持部に前記細胞を保持させる工程と、
接着物質を含む溶液を前記細胞保持手段に導入することで、前記保持された細胞を前記保持部に接着させる工程と、
細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬を前記細胞保持手段に導入することで、前記保持部に接着した細胞を標本化する工程とを含む、細胞の標本化方法であって、
細胞を含む溶液が、血液由来タンパク質、乳由来タンパク質または親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含む溶液である、前記標本化方法である。

また本発明の第四の態様は、細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬がエタノールとホルムアルデヒドとを少なくとも含む試薬である、前記第三の態様に記載の方法である。

また本発明の第五の態様は、接着物質を含む溶液がポリ−Ｌ−リジンを少なくとも含む溶液である、前記第二から第四の態様のいずれかに記載の方法である。

また本発明の第六の態様は、細胞を含む溶液が、糖をさらに含む溶液である、前記第一から第五の態様のいずれかに記載の方法である。

また本発明の第七の態様は、保持部に細胞を保持させる工程を、誘電泳動力を用いて行なう、前記第一から第六の態様のいずれかに記載の方法である。

また本発明の第八の態様は、細胞を含む溶液が親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含む溶液であり、前記親水性高分子を結合したタンパク質が、当該タンパク質に対し親水性高分子を１．５以上のモル比で反応させて得られたタンパク質である、前記第一から第七の態様のいずれかに記載の方法である。

また本発明の第九の態様は、親水性高分子を結合したタンパク質が、親水性高分子を結合した血液由来タンパク質または親水性高分子を結合した乳由来タンパク質である、前記第一から第八の態様のいずれかに記載の方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の方法で分離回収する、細胞を含む溶液は、細胞を含む液状の組成物を意味する。具体的には、血液、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水などの生体試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた液や、前記生体試料や前記組織懸濁液より分離して得られる、前記生体試料または前記組織由来の細胞を含む画分や、あらかじめ単離した細胞の培養液、などがあげられる。このうち前記生体試料や前記組織懸濁液より分離して得られる、前記生体試料または前記組織由来の細胞を含む画分の一例として、生体試料や組織懸濁液を密度勾配形成用媒体上に重層後、密度勾配遠心分離を行ない、得られる画分があげられる。

本発明は、細胞を含む溶液を、前記細胞を保持可能な保持部を設けた細胞保持手段に導入した後、前記保持部に前記細胞を保持させることで細胞を回収する際、前記溶液に血液由来タンパク質、乳由来タンパク質または親水性高分子を結合したタンパク質がさらに含まれていることを特徴としている。血液由来タンパク質は水溶性タンパク質であればよく、一例として血清由来タンパク質や血漿由来タンパク質があげられ、さらに具体的な例として当業者が通常用いる血清由来タンパク質である、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）があげられる。乳由来タンパク質も水溶性タンパク質であればよく、具体的な例としては、当業者が通常用いる乳由来タンパク質であるカゼインがあげられる。また親水性高分子は電荷を持たない親水性高分子であればよく、一例としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレート、ポリアクリルアミド、ホスホリルコリン基を側鎖に有するポリマー、多糖類、ポリペプチドがあげられる。親水性高分子を結合したタンパク質は、親水性高分子とタンパク質とが一定の割合で結合したタンパク質であり、例えば、タンパク質と結合可能な官能基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基）を付与した親水性高分子とタンパク質とを一定のモル比で反応させることで得られる。親水性高分子を結合したタンパク質の一例として、親水性高分子を結合した血液由来タンパク質や親水性高分子を結合した乳由来タンパク質があげられる。なお親水性高分子とタンパク質との反応比は、タンパク質に対し親水性高分子を０．０１以上のモル比で反応させればよく、１．５以上のモル比で反応させればより好ましく、２以上のモル比で反応させると最も好ましい（タンパク質に対し親水性高分子を２以上のモル比で反応させると、血液由来タンパク質の場合は前記タンパク質に対し親水性高分子が実測モル比１以上で結合し、乳由来タンパク質の場合は前記タンパク質に対し親水性高分子が実測モル比０．２以上で結合する）。また前記溶液に、マンニトール、グルコース、スクロースなどの糖をさらに含むと細胞へのダメージが少なくなるため好ましく、前記糖を含む溶液に塩化カルシウムや塩化マグネシウムなどの電解質や、ＢＳＡ等のタンパク質をさらに含んでもよい。添加する糖の濃度は等張液となる濃度とすればよく、糖としてマンニトールを用いる場合は終濃度で２５０ｍＭから３５０ｍＭの間とすればよい。

本発明の回収方法で用いる、細胞保持手段に設けた保持部の例として、細胞を収納可能な孔や、前記細胞を固定可能な材料（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）で覆われた面があげられる。なお保持部の大きさを前記細胞を一つだけ保持可能な大きさとすると、特定細胞の採取および解析（形態学的分析、組織型分析、遺伝子分析など）が容易に行なえる点で好ましい。

本発明の回収方法において、細胞保持手段に設けた保持部へ細胞を保持させる方法に特に限定はなく、単に保持部に細胞を含む液体を導入するだけでもよいし、細胞を含む液体を導入した後、遠心力を利用して保持部へ強制的に細胞を導入させてもよい。また保持部を設けたスライドに細胞を含む液体を塗布することで前記細胞を前記保持部に保持させてもよい。中でも細胞を含む液体を導入した後、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入させると、細胞を保持部へ効率的に保持させることができる点で好ましい。誘電泳動力を用いた保持部への細胞の保持は、具体的には、交流電圧を印加することで誘電泳動を発生させ、保持部内へ細胞を導入すればよい。印加する交流電圧は、保持部内の細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧であると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚの間とし、電界強度を１×１０^５から５×１０^５Ｖ／ｍの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。

本発明の回収方法と、接着物質を含む溶液を細胞保持手段に導入する工程とを組み合わせることで、細胞保持手段に設けた保持部に保持された細胞を前記保持部に接着（固定）させることができる。接着物質は、細胞を構成する成分と特異的に結合可能な物質であれば、特に制限はなく、例えば、細胞表面特有の物質を認識する分子であるリガンド、レクチン、抗体などや、細胞の脂質二重膜に結合可能な脂質オレイル基を有するＢｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅＡｎｃｈｏｒｆｏｒＭｅｍｂｒａｎｅ（ＢＡＭ）があげられる。中でも細胞表面と静電的に結合するポリ−Ｌ−リジンは、比較的短時間で細胞を構成する成分との結合が可能なため、好ましい。なお溶液へ添加するポリ−Ｌ−リジンの濃度を０．０１（ｗ／ｖ）％以下とすると好ましい。接着物質を含む試薬による前記接着物質の保持部への修飾は、保持部へ細胞を導入する工程の前に行なってもよいし、保持部へ細胞を導入する工程の後に行なってもよい。保持部へ細胞を導入する工程の後に行なう場合は、細胞へのダメージを少なくするために、修飾処理を短時間で完了させた方がよい。具体的には接着物質がポリ−Ｌ−リジンの場合、処理時間は５分以内が好ましく、３分以内がより好ましい。

本発明の回収方法と、接着物質を含む溶液を細胞保持手段に導入する工程と、細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬を細胞保持手段に導入する工程とを組み合わせることで、細胞保持手段に設けた保持部に保持された細胞を標本化することができる。細胞膜透過試薬は細胞膜内部のタンパク質や核酸などを標識可能な状態となる試薬であればよく、一例として、エタノール、メタノールなどのアルコール類や、サポニン、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）、ジギトニンなどの界面活性剤があげられる。細胞固定試薬は細胞の持つタンパク質や形態、状態を固定保存可能な試薬であればよく、一例として、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどのアルデヒド類や、金属塩、有機溶媒系固定液があげられる。中でも、細胞膜透過試薬としてはエタノールが、細胞固定試薬としてはホルムアルデヒドが、それぞれ好ましい。細胞膜透過試薬としてエタノールを用いる場合、３０％（ｖ／ｖ）以上のエタノールを含む試薬を用いればよいが、４０％（ｖ／ｖ）以上のエタノールを含む試薬を用いると、接着した細胞が十分な透過性を有するため好ましい。また４０から５０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む試薬を用いると、接着した細胞が十分な透過性を有し、かつその後の細胞回収工程を容易に行なえる点でさらに好ましい（特願２０１４−２３８８７１号）。また細胞固定試薬としてホルムアルデヒドを用いる場合、０．１から５％（ｖ／ｖ）含むと好ましく、０．１から１％（ｖ／ｖ）含むと細胞膜内外タンパク質の架橋反応による抗原のマスキングが防止できる点でより好ましい（特願２０１４−２３８８７１号）。

本発明の方法で回収した細胞の測定は、保持部に保持された細胞を、例えば顕微鏡や光学検出器などで観察することで測定すればよい。

本発明の細胞回収方法で用いる細胞保持手段を備えた細胞回収装置の一例を図１に示す。図１に示す細胞回収装置１００は、
貫通孔１１ａを有した平板状の遮光部材１１と、貫通孔１２ａを有した平板状の絶縁体１２と、導入口１３ａ、排出口１３ｂおよび貫通部１３ｃを有した平板状のスペーサ１３とからなる細胞導入保持手段１０と、
細胞導入保持手段１０を上下方向に密着して挟むよう設けた電極基板２１・２２と、
電極基板２１・２２同士を接続する導線３０と、
電極基板２１・２２に信号を印加する信号発生器４０と、
を備えている。遮光部材１１が有する貫通孔１１ａと絶縁体１２が有する貫通孔１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１および絶縁体１２を設けている。貫通孔１１ａ、貫通孔１２ａおよび遮光部材１１の下部に密着して設けた電極基板２１により保持部５０が構成され、導入口１３ａから細胞を含む液体を導入すると、貫通部１３ｃを通じて保持部５０へ細胞が導入される。電極基板２２はスペーサ１３上部に密着して設けており、導入口１３ａから導入した、細胞を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお保持部５０に保持した細胞の回収を容易にするため、電極基板２２はスペーサ１３から取り外し可能な構造となっている。
なお貫通孔１１ａ・１２ａは直径３０μｍ、深さ４０μｍであり、孔間隔５０μｍでアレイ状に配置されている。また遮光部材１１はクロム膜で構成されており、スペーサ１３の厚さは１ｍｍである。

以下、本発明の標本化方法の一例として、血液中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）を標本化する方法について説明するが、本発明は本説明の内容に限定されるものではない。
（１）がんの疑いのある患者から血液から採取し、密度勾配遠心法を用いて、ＣＴＣを含むペレットを取得後、血液由来タンパク質、乳由来タンパク質または親水性高分子を結合したタンパク質（例えば、ポリエチレングリコールを結合したＢＳＡやポリエチレングリコールを結合したカゼイン）を含む溶液を添加し、ＣＴＣを懸濁させる。血液由来タンパク質、乳由来タンパク質または親水性高分子を結合したタンパク質の濃度は、懸濁液でのタンパク質の終濃度として、０．０１から２５％（ｗ／ｖ）の間であればよく、０．０２から５％（ｗ／ｖ）の間であればより好ましく、０．０５から２％（ｗ／ｖ）の間であればさらに好ましい。
（２）（１）で調製したＣＴＣを含む懸濁液を、図１に示した細胞回収装置１００に備えた導入口１３ａから、信号発生器４０から交流電圧を電極基板２１・２２へ印加した状態で導入することで、誘電泳動力により保持部５０へＣＴＣが保持させる。誘電泳動時、ＣＴＣを含む懸濁液の電気伝導度が高いと、交流電場印加の際に発熱し、溶媒内のＣＴＣを含む粒子のブラウン運動が活発になるため、誘電泳動力によるＣＴＣ保持能が低下する。またＣＴＣを含む懸濁液の電気泳動度が低いと、細胞表面の負電荷による細胞自体の分散安定性が高まるため、細胞の微細孔近傍への沈降が妨げられ、保持部５０へのＣＴＣ保持能力が低下する。一方、ＣＴＣを含む懸濁液に血液由来タンパク質、乳由来タンパク質または親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含ませると、細胞自体の分散安定性が低下し、細胞が貫通孔１１ａ・１２ａ近傍に速やかに沈降するので、保持部５０へのＣＴＣの保持能が向上する。
（３）保持部５０に保持されたＣＴＣに対し、接着物質を含む溶液を導入口１３ａから導入することで、前記ＣＴＣを保持部５０に接着させる。接着物質としてポリ−Ｌ−リジンを用いた場合、血液由来タンパク質、乳由来タンパク質、またはタンパク質に対し親水性高分子を１以下のモル比で反応させて得られた親水性高分子を結合したタンパク質が共存すると、ポリ−Ｌ−リジンとタンパク質とが結合し可溶性が低下して白色の析出物が形成するため、ＣＴＣの観察・測定が困難となる（後述の実施例２参照）。そこでタンパク質に対し親水性高分子を１．５以上のモル比で反応させて得られた、親水性高分子を結合したタンパク質を含む溶液でＣＴＣを懸濁させるとよい。
（４）保持部５０に接着したＣＴＣに対し、細胞固定試薬を含有する細胞膜透過試薬を導入口１３ａから導入することで、前記ＣＴＣを標本化させる。

本発明は、細胞を含む溶液を前記細胞を保持可能な保持部を設けた細胞保持手段に導入する工程と、前記保持部に前記細胞を保持させる工程とを含む細胞の回収方法において、細胞を含む溶液に血液由来タンパク質、乳由来タンパク質または親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含ませることを特徴としている。本発明の方法は細胞を含む溶液から前記細胞を高効率に回収することができ、特に前記溶液中に含まれる細胞量が非常に少ない場合に有用な方法である。

例えば本発明を、血液中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）の回収に適用することで、採血量を少なくすることができ、患者への負担を低減させることができる。またがんの診断をＣＴＣの存在により行なう場合、ＣＴＣの有無の判断結果に対する信頼性が向上するため、精度高く診断することができる。

本発明の細胞回収方法を利用可能な装置の一例を示した図。（Ａ）は分解図を、（Ｂ）は正面図を、それぞれ表わす。

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。

実施例１
（１）一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ−ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（３００ｍｇ、４．５μｍｏｌ）とを、炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、１５ｍＬ）に溶解させ、当該溶液を室温で３時間撹拌することでポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ（ＰＥＧ−ＢＳＡ）を調製した。なお調製する際、ｍＰＥＧ−ＮＨＳとＢＳＡとのモル比（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡ）を１、２または５となるようにした。調製後、分画分子量１００００の透析膜を用いて、純水への溶液置換を３日間行なった。
（２）ヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）を、５％ＣＯ_２環境下、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離し、蛍光染色色素（ＣＦＳＥ、同仁化学研究所社製）で標識した。蛍光標識されたＳＫＢＲ３細胞を目的とする細胞とし、蛍光標識されたＳＫＢＲ３細胞５０から２００個を０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび３００ｍＭマンニトールを含む溶液８００μＬ、または（１）で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液８００μＬに添加し、懸濁させた。
（３）（２）で得られたＳＫＢＲ３細胞を含む懸濁液を図１に示す細胞回収装置１００に導入し、信号発生器４０で電圧２０Ｖｐｐ、周波数１ＭＨｚの交流電圧を電極基板２１・２２に３分間印加することで細胞回収装置１００が有する保持部５０にＳＫＢＲ３細胞を保持させた。
（４）細胞診断チップに保持されたＳＫＢＲ３細胞数を計測し、（２）で添加したＳＫＢＲ３細胞数で除することで回収率を算出した。

実施例２
（１）一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ−ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）と、カゼイン（３００ｍｇ、１０．７μｍｏｌ）（カゼインの分子量２８０００と仮定し算出）とを、純水（３０ｍＬ）に溶解させ、当該溶液を室温で２４時間撹拌することでポリエチレングリコールを結合したカゼイン（ＰＥＧ−カゼイン）を調製した。なお調製する際、ｍＰＥＧ−ＮＨＳとカゼインとのモル比（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼイン）を０．５、１、２または５となるようにした。
（２）実施例１（２）のＳＫＢＲ３細胞に懸濁させる溶液として、０．１％（ｗ／ｖ）カゼインおよび３００ｍＭマンニトールを含む溶液８００μＬ、また
（１）で調製したＰＥＧ−カゼイン（カゼインとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液を用いた他は、実施例１と同様な方法で回収率を算出した。

比較例１
実施例１（２）のＳＫＢＲ３細胞に懸濁させる溶液として、３００ｍＭマンニトールを含む溶液を用いた他は、実施例１と同様な方法で回収率を算出した。

実施例１および２ならびに比較例１での回収率の結果をまとめて表１に示す。なお表１において、ＰＥＧ（１）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比１の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＰＥＧはＢＳＡに対して実測モル比０．４５で結合している）であり、ＰＥＧ（２）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比２の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＰＥＧはＢＳＡに対して実測モル比１．１４で結合している）であり、ＰＥＧ（５）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比５の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＰＥＧはＢＳＡに対して実測モル比３．０１で結合している）であり、ＰＥＧ（１）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比１の条件で調製したＰＥＧ−カゼイン（ＰＥＧはカゼインに対して実測モル比０．１２で結合している）であり、ＰＥＧ（２）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比２の条件で調製したＰＥＧ−カゼイン（ＰＥＧはカゼインに対して実測モル比０．２３で結合している）であり、ＰＥＧ（５）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比５の条件で調製したＰＥＧ−カゼイン（ＰＥＧはカゼインに対して実測モル比０．３８で結合している）である。誘電泳動力を用いたがん細胞の分離回収工程において、血液由来タンパク質であるＢＳＡ、乳由来タンパク質であるカゼイン、親水性高分子を結合した血液由来タンパク質であるＰＥＧ−ＢＳＡ、または親水性高分子を結合した乳由来タンパク質であるＰＥＧ−カゼインを含む溶液を用いることで、ＰＥＧおよびタンパク質を含まない溶液（８８．８％）と比較し、回収率が向上していることがわかる（９６．１％から１００％）。特にＢＳＡまたはカゼインに対しＰＥＧを２以上のモル比で反応させて得られたＰＥＧ−ＢＳＡまたはＰＥＧ−カゼインでは回収率１００％であった。

実施例３
（１）実施例１（２）から（３）と同様な方法で、誘電泳動により保持部５０にＳＫＢＲ３細胞を保持した。その後、引き続き信号発生器４０で電圧２０Ｖｐｐ、周波数１ＭＨｚの交流電圧を電極基板２１・２２に印加しながら、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭマンニトール溶液を導入することで、ＳＫＢＲ３細胞を保持部５０に接着させた。
（２）（１）でポリ−Ｌ−リジンにより微細孔内にＳＫＢＲ３細胞を接着させた後、細胞導入保持手段１０内部を目視および顕微鏡で観察した。

実施例４
実施例１（２）のＳＫＢＲ３細胞に懸濁させる溶液として、０．１％（ｗ／ｖ）カゼインおよび３００ｍＭマンニトールを含む溶液８００μＬ、または実施例２（１）で調製したＰＥＧ−カゼイン（カゼインとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液を用いた他は、実施例３と同様な方法で観察した。

比較例２
実施例１（２）のＳＫＢＲ３細胞に懸濁させる溶液として、３００ｍＭマンニトールを含む溶液を用いた他は、実施例３と同様な方法で観察した。

実施例３および４ならびに比較例２における目視での観察結果をまとめて表２に示す。なお表２において、ＰＥＧ（１）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比１の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡであり、ＰＥＧ（２）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比２の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡであり、ＰＥＧ（５）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比５の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡであり、ＰＥＧ（１）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比１の条件で調製したＰＥＧ−カゼインであり、ＰＥＧ（２）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比２の条件で調製したＰＥＧ−カゼインであり、ＰＥＧ（５）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比５の条件で調製したＰＥＧ−カゼインである。がん細胞を保持部５０に接着させる工程において、ＰＥＧを含まないＢＳＡまたはカゼイン溶液や、ＰＥＧ（１）−ＢＳＡまたはＰＥＧ（１）−カゼインを含む溶液を用いると白色の析出物が生成されていることが観察された。白色の析出物は保持部５０に保持された細胞の観察・測定を困難にするため好ましくない。一方、タンパク質を含まない溶液や、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡまたはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインのモル比２以上のモル比で反応させて得られたＰＥＧ−ＢＳＡを含む溶液を用いた場合は、白色析出物は確認されず、顕微鏡下においても良好な細胞観察が可能であった。

実施例５
（１）実施例１（２）のＳＫＢＲ３細胞に懸濁させる溶液として、
ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比２の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液、または
ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比２の条件で調製したＰＥＧ−カゼイン（カゼインとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液、
を用いた他は、実施例３（１）と同様な方法で、ポリ−Ｌ−リジンにより微細孔内にＳＫＢＲ３細胞を接着させた。
（２）５０％（ｖ／ｖ）エタノールおよび１％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む溶液を図１に示す細胞回収装置１００へ導入することで、保持部に保持されたＳＫＢＲ３細胞を標本化した。
（３）保持部５０に保持されたＳＫＢＲ３細胞数（計測値）を、誘電泳動後の時点で保持部５０に捕捉されたＳＫＢＲ３細胞数（計測値）で除することで保持率を算出した。

比較例３
実施例１（２）のＳＫＢＲ３細胞に懸濁させる溶液として、３００ｍＭマンニトールを含む溶液を用いた他は、実施例５と同様な方法で保持率を算出した。

実施例５および比較例３での保持率の結果をまとめて表３に示す。なお表３において、ＰＥＧ（２）−ＢＳＡはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡがモル比２の条件で調製したＰＥＧ−ＢＳＡであり、ＰＥＧ（２）−カゼインはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインがモル比２の条件で調製したＰＥＧ−カゼインである。エタノールおよびホルムアルデヒドを用いた、がん細胞を標本化する工程において、親水性高分子を結合した血液由来タンパク質であるＰＥＧ−ＢＳＡ、または親水性高分子を結合した乳由来タンパク質であるＰＥＧ−カゼインを含む溶液を用いた時の保持率（９９．３％、９７．７％）は、ＰＥＧおよびタンパク質を含まない溶液を用いたとき（９８．４％）と同等の高い保持率であった。この結果は、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡまたはｍＰＥＧ−ＮＨＳ／カゼインのモル比２以上のモル比で反応させて得られたＰＥＧ−ＢＳＡまたはＰＥＧ−カゼインを含む溶液を用いても、ポリ−Ｌ−リジンによる微細孔への細胞接着を阻害することなく、かつエタノールおよびホルムアルデヒドを用いたがん細胞の標本化を行なっても、保持部５０への細胞の保持能は維持されていることが確認された。

１００：細胞回収装置
１０：細胞導入保持手段
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ、１２ａ：貫通孔
１３：スペーサ
１３ａ：導入口
１３ｂ：排出口
１３ｃ：貫通部
２１・２２：電極基板
３０：導線
４０：信号発生器
５０：保持部
６０：細胞

Claims

細胞を含む溶液を、前記細胞を保持可能な保持部を設けた細胞保持手段に導入する工程と、
前記保持部に前記細胞を保持させる工程とを含む、細胞の回収方法であって、
細胞を含む溶液が、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレート、ポリアクリルアミド及びホスホリルコリン基を側鎖に有するポリマーから選択される親水性高分子を結合したＢＳＡまたは前記親水性高分子を結合したカゼインをさらに含む溶液である、前記回収方法。
細胞を含む溶液を、前記細胞を保持可能な保持部を設けた細胞保持手段に導入する工程と、
前記保持部に前記細胞を保持させる工程と、
接着物質を含む溶液を前記細胞保持手段に導入することで、前記保持された細胞を前記保持部に接着させる工程とを含む、細胞の固定化方法であって、
細胞を含む溶液が、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレート、ポリアクリルアミド及びホスホリルコリン基を側鎖に有するポリマーから選択される親水性高分子を結合したＢＳＡまたは前記親水性高分子を結合したカゼインをさらに含む溶液である、前記固定化方法。
細胞を含む溶液を、前記細胞を保持可能な保持部を設けた細胞保持手段に導入する工程と、
前記保持部に前記細胞を保持させる工程と、
接着物質を含む溶液を前記細胞保持手段に導入することで、前記保持された細胞を前記保持部に接着させる工程と、
細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬を前記細胞保持手段に導入することで、前記保持部に接着した細胞を標本化する工程とを含む、細胞の標本化方法であって、
細胞を含む溶液が、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレート、ポリアクリルアミド及びホスホリルコリン基を側鎖に有するポリマーから選択される親水性高分子を結合したＢＳＡまたは前記親水性高分子を結合したカゼインをさらに含む溶液である、前記標本化方法。
細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬がエタノールとホルムアルデヒドとを少なくとも含む試薬である、請求項３に記載の方法。
接着物質を含む溶液がポリ−Ｌ−リジンを少なくとも含む溶液である、請求項２から４のいずれかに記載の方法。
細胞を含む溶液が、糖をさらに含む溶液である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
保持部に細胞を保持させる工程を、誘電泳動力を用いて行なう、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
前記親水性高分子を結合したＢＳＡまたは前記親水性高分子を結合したカゼインが、ＢＳＡまたはカゼインに対し前記親水性高分子を１．５以上のモル比で反応させて得られたＢＳＡまたはカゼインである、請求項１から７のいずれかに記載の方法。