JPWO2017204187A1 - 細胞外小胞回収方法及び細胞外小胞用容器 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)重量平均分子量が1万以上100万以下である親水性ポリマーを含有し、得られるコーティング被膜の接触角が0度以上30度以下である細胞外小胞吸着防止用コーティング剤。
(2)前記親水性ポリマーが2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、メトキシアルキレングリコールモノメタクリレート又はメタクリル酸2−ヒドロキシエチルからなる1種以上の親水性単量体を含む(1)記載のコーティング剤。
(3)前記親水性ポリマーを構成する前記親水性単量体が、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンであって、2−メタクリルロイルオキシエチルホスホリルコリンに基づく構成単位を30モル%以上50モル%以下含有し、残余が疎水性基含有単量体からなる共重合体である(2)記載のコーティング剤。
(4)(1)〜(3)いずれか1つ記載のコーティング剤でコートされている器具。
(5)(4)記載の器具を用いることを特徴とする細胞外小胞の精製及び/又は解析方法。
以下、実施例を示しながら、本発明を詳細に説明する。
以下の実施例では、下記表1に示す重合体を用いた。
[重合体1]
MPC23.5g及びBMA26.5gをエタノール50gに溶解して4つ口フラスコに入れ、30分間窒素を吹き込んだ後、45℃でt−ブチルペルオキシネオデカノエート0.1gを加えて24時間重合反応させた。重合液を3Lのジエチルエーテル中に攪拌しながら滴下し、析出した沈殿をろ過し、48時間45℃で真空乾燥して粉末36.8gを得た。分子量は標準をポリエチレングリコールに用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィー(東ソー社製)により測定した。重量平均分子量は、580,000であった。1H−NMRにて組成分析した結果、MPC/BMA=30/70(モル比)であった。
MPC4.7g及びBMA5.3gをエタノール90gに溶解して4つ口フラスコに入れ、30分間窒素を吹き込んだ後、60℃でt−ブチルペルオキシネオデカノエート0.25gを加えて24時間重合反応させた。重合液を3Lのジエチルエーテル中に攪拌しながら滴下し、析出した沈殿をろ過し、48時間45℃で真空乾燥して粉末36.8gを得た。重量平均分子量は、120,000であった。1H−NMRにて組成分析では、MPC/BMA=30/70(モル比)であった。得られたコーティング被膜の接触角値は20度であった。
重合体3は、分子量300,000のポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)(Sigma−Aldrich社製)を使用した。得られたコーティング被膜の接触角値は30度であった。
重合体4は、MPC8.4gおよびBMA36.6gをエタノール54.6gに溶解して4つ口フラスコに入れ、30分間窒素を吹き込んだ後、60℃でt−ブチルペルオキシネオデカノエート0.37gを加え24時間重合反応させた。重合液を3Lのジエチルエーテル中に攪拌しながら滴下し、析出した沈殿をろ過し、48時間45℃で真空乾燥して粉末26.3gを得た。重量平均分子量は340,000であった。1H−NMRにて組成分析した結果、MPC/BMA=10/90(モル比)であった。得られたコーティング被膜の接触角値は42度であった。
[エクソソームを含む培養上清の調製]
エクソソームはヒト肝がん由来の細胞株HuH−7細胞、又は大腸がん由来の細胞株HT−29細胞の培養上清から得た。HuH−7細胞からエクソソームを得る場合は以下のようにして行った。1×106個のHuH-7細胞は、10%ウシ胎仔血清(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)、1/100量のペニシリンストレプトマイシン(ペニシリンストレプトマイシン溶液×100、和光純薬工業製)を添加したRPMI 1640培地、25mlに懸濁して、150mmシャーレ(cell culture dishes 150mm、イワキ株式会社製)に播種し、5%CO2、37℃、72時間培養した。その後培地を吸引除去し、ウシ胎仔血清を含まないRPMI 1640培地を25ml加え、5%CO2、37℃、66時間培養した。66時間後に、培養上清を回収し、8,900xg10分で低速遠心を行い、上清を0.22μmフィルター(milliex−GS・SLGV033RS、メルク社製)に通した。
上記で調製したHuH−7細胞の培養上清480mlを30,700rpmで70分遠心し、エクソソームの濃縮を行った。沈殿は12mlの培養上清に再懸濁し、さらに培養上清60mlを加え、エクソソームが濃縮された試料を得た。
重合体1〜3の親水性ポリマーをコートした遠心管、あるいは未処理の遠心管に、上記と同様に低速遠心後、0.22μmのフィルター濾過を行ったHuH-7細胞の培養上清12mlにPBS23mlを加えた試料を入れ、37,000rpm70分超遠心を行った。沈殿を250μlのPBSに懸濁して回収した。沈殿回収後の遠心管は150μl、1×SDS sample bufferを加えて溶出した(1回目遠心管吸着試料)。回収したエクソソームは30mlのPBSを加え、夫々重合体1〜3の親水性ポリマーをコートした新しい遠心管、あるいは新しい未処理の遠心管を用い、再度37,000rpm120分遠心を行った。エクソソームは150μlになるようにPBSで懸濁して回収した。また、エクソソーム回収後の遠心管は150μlの1×SDS sample bufferを加えて溶出した(2回目遠心管吸着試料)。
実施例2において回収されたエクソソームの粒子数をナノサイトLM10(マルバーン社製)によって測定した。キャリブレーションは、Silica Microspheres:100nm(Polysiciences、Inc.#24041)をGEプラディスク13(NYL 0.1μm)を通したミリQ水で希釈したもので行った。次に、エクソソームをGEプラディスク13を通したPBSでおよそ108程度に希釈し、シリンジでサンプル溶液を測定セルに注入し10秒待ち、次に30秒のデータ測定を行った。シリンジを押して、チャンバー内のサンプル溶液を移動させることにより、新しいサンプルでセル内を入れ代えながら5回測定を行った。図3は平均値、及び標準偏差を示している。Detection thresholdは4、Camera levelは14を用いた。
遠心を下記の要領で1回、又は2回行い、エクソソームの回収量、チューブに吸着する量を検討した。エクソソームはHT−29細胞の培養上清から以下のようにして精製した。上記のようにして調製したHT−29細胞の培養上清500mlを160,000xgで70分遠心し、エクソソームを沈殿させ、続いて沈殿を180mlのPBSで再懸濁し、さらに160,000xgで70分遠心して洗浄した。得られた沈殿を1.3mlのPBSに再懸濁して、エクソソーム粗分画とする。
コーティング剤の膜厚による吸着量の比較を行った。重合体1を0.5、1.0、2.0、4.0wt%となるようにエタノールに溶解し、マイクロチューブ(トレフ社製)に、90nm〜1400nmまで膜厚を変えてコートし解析に用いた。なお、膜厚の測定は、反射分光膜厚計(FE−3000、大塚電子株式会社製)を用いて測定した。実施例4と同様に、HT−29細胞の培養上清から得られたエクソソームを用い、遠心を1回、あるいは2回行い、エクソソームの回収量を比較した。
Claims (5)
- 重量平均分子量が1万以上100万以下である親水性ポリマーを含有し、
得られるコーティング被膜の接触角が0度以上30度以下である細胞外小胞吸着防止用コーティング剤。 - 前記親水性ポリマーが
2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、メトキシアルキレングリコールモノメタクリレート又はメタクリル酸2−ヒドロキシエチルからなる1種以上の親水性単量体を含む請求項1記載のコーティング剤。 - 前記親水性ポリマーを構成する前記親水性単量体が、
2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンであって、
2−メタクリルロイルオキシエチルホスホリルコリンに基づく構成単位を30モル%以上50モル%以下含有し、
残余が疎水性基含有単量体からなる共重合体である請求項2記載のコーティング剤。 - 請求項1〜3いずれか1項記載のコーティング剤でコートされている器具。
- 請求項4記載の器具を用いることを特徴とする細胞外小胞の精製及び/又は解析方法。
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