CN109153882A - 细胞外小泡回收方法及细胞外小泡用容器 - Google Patents

细胞外小泡回收方法及细胞外小泡用容器 Download PDF

Info

Publication number
CN109153882A
CN109153882A CN201780032132.4A CN201780032132A CN109153882A CN 109153882 A CN109153882 A CN 109153882A CN 201780032132 A CN201780032132 A CN 201780032132A CN 109153882 A CN109153882 A CN 109153882A
Authority
CN
China
Prior art keywords
allochthon
smears
extracellular
vesicless
polymer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780032132.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109153882B (zh
Inventor
芝清隆
坂元伸行
野田朋澄
山田智
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japanese Foundation for Cancer Research
NOF Corp
Sony Corp
Original Assignee
NOF Corp
Sony Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NOF Corp, Sony Corp filed Critical NOF Corp
Publication of CN109153882A publication Critical patent/CN109153882A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109153882B publication Critical patent/CN109153882B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F230/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and containing phosphorus, selenium, tellurium or a metal
    • C08F230/02—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and containing phosphorus, selenium, tellurium or a metal containing phosphorus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F120/00—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F120/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F120/10—Esters
    • C08F120/20—Esters of polyhydric alcohols or polyhydric phenols, e.g. 2-hydroxyethyl (meth)acrylate or glycerol mono-(meth)acrylate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/10—Esters
    • C08F20/26—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen
    • C08F20/28—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen containing no aromatic rings in the alcohol moiety
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C08F220/12—Esters of monohydric alcohols or phenols
    • C08F220/16—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms
    • C08F220/18—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms with acrylic or methacrylic acids
    • C08F220/1804—C4-(meth)acrylate, e.g. butyl (meth)acrylate, isobutyl (meth)acrylate or tert-butyl (meth)acrylate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D133/00—Coating compositions based on homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof; Coating compositions based on derivatives of such polymers
    • C09D133/04—Homopolymers or copolymers of esters
    • C09D133/06—Homopolymers or copolymers of esters of esters containing only carbon, hydrogen and oxygen, the oxygen atom being present only as part of the carboxyl radical
    • C09D133/062—Copolymers with monomers not covered by C09D133/06
    • C09D133/066—Copolymers with monomers not covered by C09D133/06 containing -OH groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D133/00—Coating compositions based on homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof; Coating compositions based on derivatives of such polymers
    • C09D133/04—Homopolymers or copolymers of esters
    • C09D133/14—Homopolymers or copolymers of esters of esters containing halogen, nitrogen, sulfur or oxygen atoms in addition to the carboxy oxygen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D143/00—Coating compositions based on homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and containing boron, silicon, phosphorus, selenium, tellurium, or a metal; Coating compositions based on derivatives of such polymers
    • C09D143/02—Homopolymers or copolymers of monomers containing phosphorus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D5/00—Coating compositions, e.g. paints, varnishes or lacquers, characterised by their physical nature or the effects produced; Filling pastes
    • C09D5/16—Antifouling paints; Underwater paints
    • C09D5/1656—Antifouling paints; Underwater paints characterised by the film-forming substance
    • C09D5/1662—Synthetic film-forming substance
    • C09D5/1668—Vinyl-type polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D129/00—Coating compositions based on homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by an alcohol, ether, aldehydo, ketonic, acetal, or ketal radical; Coating compositions based on hydrolysed polymers of esters of unsaturated alcohols with saturated carboxylic acids; Coating compositions based on derivatives of such polymers
    • C09D129/02—Homopolymers or copolymers of unsaturated alcohols
    • C09D129/04—Polyvinyl alcohol; Partially hydrolysed homopolymers or copolymers of esters of unsaturated alcohols with saturated carboxylic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Paints Or Removers (AREA)

Abstract

本发明开发出一种用于防止以外来体为代表的细胞外小泡向器具的吸附的涂布剂。通过使用含有重均分子量为1万以上且100万以下的亲水性聚合物、且所得的涂布被膜的接触角为0度以上且30度以下的涂布剂，可以防止细胞外小泡向器具的吸附。

Description

细胞外小泡回收方法及细胞外小泡用容器
技术领域
本发明涉及用于有效地回收以外来体(exosome)为代表的来自于细胞的小泡的方法及该回收中所用的容器、器具。另外，涉及用于在利用外来体检查的方法中使用的基板、流路等。
背景技术
所谓细胞外小泡，是来自于细胞的存在于细胞外的小泡，根据其大小分类为外来体、微泡(微小小胞体，Microvesicle)、凋亡小体(apoptotic body)。在外来体、微泡中，包含蛋白质或mRNA、miRNA等核酸，在凋亡小体中包含被片段化了的核、细胞小器官。在细胞外小泡中，由于在外来体、微泡中包含蛋白质、核酸，因此包含来自于释放它们的细胞的信息，有可能可以作为生物标记利用。特别是外来体有可能可以在诊断标记、治疗中利用，近年来受到关注。
外来体是从细胞中分泌的由脂质双层膜形成的直径30～100nm的小泡体。已知从大多数的细胞中分泌外来体，在血液、唾液、尿、母乳等体液中确认了其的存在。在外来体中内包有来自于分泌它们的细胞的RNA、蛋白质，表明有可能通过在体液中循环而将信息传递至远离的细胞(非专利文献1)。利用来自于癌细胞的外来体中所含的核酸、蛋白质，可显示出癌的发展得到促进的可能性，此外该情况还表明使用了外来体的癌诊断系统的可能性(非专利文献2)。
如上所述，已明确内包于外来体中的蛋白质、核酸根据分泌它们的细胞种类而不同。因此，来自于外来体的核酸、蛋白质作为诊断标记而言有用。另外，由于外来体还包含于唾液、尿中，因此如果可以确立使用了外来体的精度高的检查方法，就可以作为非侵入性诊断方法。此外，还进行过通过使用外来体的信息传递功能而将从健康的细胞采集回收的外来体用于受到伤害的细胞、患病细胞的恢复的尝试(专利文献1)。
为了从唾液等少量的试样中纯化外来体、或出于治疗目的而纯化大量的外来体，需要回收率良好地纯化的方法。以往作为纯化外来体的方法，公开过利用离心分离、色谱柱进行分离的方法(专利文献2、3)。其中使用了超速离心的离心分离法是经过确立的回收技术，是在外来体的形状维持性这一点上优异的技术。
例如，如果是从细胞的培养上清液中回收外来体的情况，则可以在将包含外来体的培养基利用低速离心除去细胞的碎片等后，利用2小时左右的超速离心将外来体以颗粒的形式回收。使如此得到的外来体再分散于PBS等缓冲液中，然后进行纯化、或者直接用于检查、研究等分析中。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2014－507140号公报
专利文献2：日本特表2003-531864号公报
专利文献3：日本特表2002－535665号公报
专利文献4：日本特开平7－83923号公报
专利文献5：国际公开第2005/001019号
非专利文献
非专利文献1：Valadi，H.等，2007，Nat.Cell Biol.，Vol.9，p.654-659.
非专利文献2：Skog，J.等，2008，Nat.Cell Biol.，Vol.10，pp.1470-1476.
发明内容
发明所要解决的问题
然而，在上述的借助超速离心的回收方法中，外来体非特异性地吸附于所使用的回收容器的塑料表面，无法得到稳定的回收率，每一次操作时回收率都会降低成为问题。特别是，在进行定量分析时，向纯化中所用的容器、分析器具的表面的吸附不仅对分析的效率产生影响，对分析结果也产生影响。然而，迄今为止还没有开发出防止外来体等细胞外小泡的吸附的有效的方法。
以往，公开过利用亲水性聚合物防止作为来源于生物体的物质的蛋白质、细胞向容器非特异性吸附的方法(专利文献4、5)。专利文献4中公开过，通过用包含2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱聚合物、或含有2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的成分的共聚物的PBS溶液涂布聚苯乙烯制的容器，可以防止蛋白质的吸附。专利文献5中公开过，通过使用含有磷酰胆碱类似基团的化合物包覆培养容器，可以防止ES细胞向培养容器上的粘附，能够有效地形成胚状体。
然而，专利文献4是专门化于蛋白质的方法，虽然在外来体等的表面表露出蛋白质，但是很难完全防止由脂质双层膜形成的细胞外小泡的吸附。另外，专利文献5的方法是防止由脂质双层膜形成的细胞的吸附的方法，但是由于细胞与细胞外小泡、特别是外来体的大小完全不同，因此向容器的吸附的程度大不相同，无法完全防止外来体向容器的吸附。
本发明的课题在于，提供一种涂布剂，其用于在纯化以外来体为代表的来自于细胞的小泡时，防止来自于细胞的小泡向离心管等纯化中使用的容器、吸移管头等器具的吸附，实现回收率的提高。另外，本发明的课题在于，提供一种涂布剂，其不仅可以在纯化的过程中使用，而且通过涂布于外来体分析中所用的基板、流路等，可以提高外来体分析的精度。此外，本发明的课题在于，提供利用这些涂布剂涂布了的容器或吸移管头、基板等分析器具。
用于解决问题的方法
本发明涉及以下的涂布剂、器具、纯化方法、分析方法。
(1)一种用于防止细胞外小泡吸附的涂布剂，其含有重均分子量为1万以上且100万以下的亲水性聚合物，且所得的涂布被膜的接触角为0度以上且30度以下。
(2)根据(1)记载的涂布剂，其中，所述亲水性聚合物包含选自2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、乙烯醇、乙烯基吡咯烷酮、甲氧基烷撑二醇单甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸2－羟基乙酯中的一种以上的亲水性单体。
(3)根据(2)记载的涂布剂，其中，构成所述亲水性聚合物的所述亲水性单体为2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，所述亲水性聚合物是含有30摩尔％以上且50摩尔％以下的基于2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的构成单元、且剩余包含含有疏水性基团的单体的共聚物。
(4)一种器具，其被涂布以(1)～(3)中任一项记载的涂布剂。
(5)一种细胞外小泡的纯化和/或分析方法，其特征在于，使用(4)记载的器具。
附图说明
图1是表示基于涂布剂的有无的外来体回收量的图。
图2是表示基于涂布剂的种类的外来体回收量的图。
图3是表示利用粒子数研究基于涂布剂的外来体回收量的结果的图。
图4A是表示利用粒子数研究基于涂布剂的外来体回收量的结果的图，图4B是表示利用蛋白印迹法研究基于涂布剂的外来体回收量的结果的图。
图5A是表示利用粒子数研究基于涂布剂的膜厚的外来体回收量的结果的图，图5B是表示利用蛋白印迹法研究基于涂布剂的膜厚的外来体回收量的结果的图。图5C是对回收样品、吸附样品进行电泳、并利用银染色进行了分析的图。
具体实施方式
本发明中所谓细胞外小泡，是指来自于细胞的小泡，具体而言，是指外来体、微泡、凋亡小体。以下的实施例中以外来体为中心进行记载，然而当然也可以应用于外来体以外的细胞外小泡。
另外，通过将本发明的涂布剂涂布于离心管、试管、吸移管头等在纯化外来体等细胞外小泡时使用的器具，可以防止其吸附，提高回收率。另外，通过涂布于微珠、微量滴定板、载玻片、微型全分析系统、芯片上实验室等该领域中所用的分析器具、分析设备，可以防止非特异吸附，提高分析精度。
无论是何种材质的器具，都可以涂布本发明的涂布剂。例如常用作离心管的聚碳酸酯、聚丙烯、异质同晶聚合物(ポリアロマー)、或用作分析器具的基材的氯乙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、硅、亲水性聚二甲基硅氧烷、疏水性聚二甲基硅氧烷、玻璃、不锈钢或铝等金属也可以通过利用本发明的涂布剂涂布，来防止外来体等细胞外小泡的吸附。
利用本发明的涂布剂得到的涂布被膜的接触角为0度以上且30度以下，然而优选为0度以上且25度以下。另外，本发明的亲水性聚合物的分子量的重均分子量为10000以上且1000000以下，然而从涂布被膜的耐久性的方面考虑优选为100000以上，另外为了抑制由涂布时的高粘度造成的涂布斑纹，更优选为700000以下。
另外，作为亲水性聚合物的亲水性单体，只要是可以合成亲水性的聚合物、或共聚物的单体即可，然而其中优选为2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、乙烯醇、乙烯基吡咯烷酮、甲氧基烷撑二醇单甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸2－羟基乙酯。这些亲水性单体可以以聚合物的形式使用，也可以与其他的单体一起以共聚物的形式使用。
其中，可以优选使用2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)与疏水性单体的共聚物。作为疏水性单体，可以使用甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸正丁酯(BMA)、甲基丙烯酸2－乙基己酯(EhMA)、甲基丙烯酸十二烷基酯(DMA)、甲基丙烯酸硬脂基酯(SMA)等，然而从获取容易度和制膜性的方面考虑，特别优选与甲基丙烯酸正丁酯的共聚物。另外，在制作MPC与疏水性单体的共聚物的情况下，MPC与疏水性单体的组成比可以为20/80～50/50。
本发明的涂布剂可以以溶液的形式使用，该溶液以0.05％以上且5.0％以下的浓度含有上述的聚合物、或共聚物。如果小于0.05重量％，则无法发挥所期望的效果，另外如果高于5重量％，则有可能产生由涂布剂的涂布斑纹造成的效果降低、涂布剂的物理性剥离。作为溶剂，可以使用乙醇、甲醇等醇类、或磷酸缓冲液、Tris缓冲液、PBS、TBS等该领域中通常所用的缓冲液。
另外，将涂布剂在器具上制膜时的膜厚优选为50nm以上且2000nm以下，更优选为90nm以上且900nm以下。
在器具上制膜时，无法完全均匀地制膜。由于以薄的膜厚制膜非常困难，因此在平均膜厚小于50nm的情况下，膜厚的波动大，产生防止外来体吸附的效果弱的部位。另外，在膜厚大于2000nm的情况下，制膜中所用的涂布液(聚合物溶液)的粘度高，所使用的聚合物量也变多，因此从制膜时的作业性(干燥、操作性的方面)和经济性的方面考虑是困难的。如果是50nm以上且2000nm以下的膜厚，则有防止外来体吸附的效果。此外，在90nm以上且900nm以下的膜厚的情况下，能够以稳定的膜厚进行制膜，因此可以防止外来体的吸附，获得稳定的测定结果。
以下，在给出实施例的同时，对本发明进行详细说明。
1.聚合物
以下的实施例中，使用了下述表1中所示的聚合物。
[聚合物1]
将MPC 23.5g及BMA 26.5g溶解于乙醇50g中后加入四口烧瓶，吹入30分钟氮气后，在45℃加入过氧化新癸酸叔丁酯0.1g并使之聚合反应24小时。一边搅拌一边将聚合液滴加到3L的二乙基醚中，过滤析出的沉淀，在45℃真空干燥48小时而得到粉末36.8g。利用以聚乙二醇作为标准使用的凝胶渗透色谱(Tosoh公司制)测定出分子量。重均分子量为580000。利用1H－NMR进行了组成分析，其结果是，MPC/BMA＝30/70(摩尔比)。
将上述的聚合物0.5g溶解于乙醇100g中而制备出0.5重量％的溶液。将其涂布于PET膜上后风干，对所得的材料进行了水洗。将其作为接触角测定用样品。利用使用了DropMaster(协和界面科学公司制)的气泡法进行接触角测定，求出接触角值作为水的接触角。具体而言，作为“180°－气泡角”算出。所得的涂布被膜的接触角值为25度。
[聚合物2]
将MPC 4.7g及BMA 5.3g溶解于乙醇90g中后加入四口烧瓶，吹入30分钟氮气后，在60℃加入过氧化新癸酸叔丁酯0.25g并使之聚合反应24小时。一边搅拌一边将聚合液滴加到3L的二乙基醚中，过滤析出的沉淀，在45℃真空干燥48小时而得到粉末36.8g。重均分子量为120000。在利用1H－NMR进行的组成分析中，MPC/BMA＝30/70(摩尔比)。所得的涂布被膜的接触角值为20度。
[聚合物3]
聚合物3使用了分子量300000的聚(甲基丙烯酸2－羟基乙酯)(Sigma－Aldrich公司制)。所得的涂布被膜的接触角值为30度。
[聚合物4](比较例)
聚合物4如下得到，即，将MPC 8.4g及BMA 36.6g溶解于乙醇54.6g中后加入四口烧瓶，吹入30分钟氮气后，在60℃加入过氧化新癸酸叔丁酯0.37g并使之聚合反应24小时。一边搅拌一边将聚合液滴加到3L的二乙基醚中，过滤析出的沉淀，在45℃真空干燥48小时而得到粉末26.3g。重均分子量为340000。利用1H－NMR进行了组成分析，其结果是，MPC/BMA＝10/90(摩尔比)。所得的涂布被膜的接触角值为42度。
[表1]
组成 组成比(摩尔％) 重均分子量 接触角
聚合物1 MPC/BMA 30/70 580000 25
聚合物2 MPC/BMA 30/70 120000 20
聚合物3 HEMA 100 300000 30
聚合物4 MPC/BMA 10/90 340000 42
使用含有上述亲水性聚合物的涂布剂，进行纯化中所用的容器的涂布，进行了外来体的吸附量的分析。需要说明的是，涂布如下所示地使用涂布剂，即，用分别包含0.5wt％的表1中所示的聚合物1～3、作为比较例的聚合物4的亲水性聚合物的乙醇溶液浸湿容器表面，排出剩余液后使之干燥。
2.基于亲水性聚合物的有无的外来体的吸附比较
[包含外来体的培养上清液的制备]
外来体由来自于人肝癌的细胞株HuH－7细胞、或来自于大肠癌的细胞株HT－29细胞的培养上清液得到。在由HuH－7细胞得到外来体的情况下，如下所示地进行。将1×106个HuH-7细胞悬浮于添加有10％胎牛血清(Thermo Fisher Scientific公司制)、1/100量的青霉素链霉素(青霉素链霉素溶液×100、和光纯药工业制)的RPMI 1640培养基25ml中，接种于150mm培养皿(细胞培养皿150mm、IWAKI株式会社制)，在5％CO2中在37℃培养72小时。其后抽吸除去培养基，加入不含有胎牛血清的RPMI 1640培养基25ml，在5％CO2中在37℃培养66小时。66小时后，回收培养上清液，以8900xg低速离心10分钟，使上清液通过0.22μm过滤器(milliex－GS·SLGV033RS、Merck公司制)。
在由HT－29细胞得到外来体的情况下，如下所示地进行。将2×108个HT－29细胞接种于添加有10％胎牛血清、青霉素链霉素的McCoy’s 5A培养基500ml中，使用Bellocell(CESCO公司制)培养器，在5％CO2中在37℃培养96小时。然后，利用倾析除去培养基，加入不含有胎牛血清的McCoy’s 5A培养基500ml，在5％CO2中在37℃再培养72小时。72小时后，回收培养上清液，与上述相同地进行低速离心，使上清液通过过滤器，得到含有外来体的培养上清液。
[实施例1]外来体吸附实验1
将利用上述操作制备的HuH－7细胞的培养上清液480ml以30700rpm进行70分钟离心，进行了外来体的浓缩。将沉淀再悬浮于12ml的培养上清液中，再加入培养上清液60ml，得到外来体被浓缩了的试样。
以下的超速离心工序中，向全部涂布了含有作为聚合物1的亲水性聚合物的涂布剂的超速离心用试管(UC试管、Ultra-Clear Tubes、Beckman Coulter公司制)、或者向未进行涂布的离心管中等量分注含有外来体的试样并进行纯化，并比较了基于涂布剂的有无的外来体回收率。需要说明的是，以下的实验中所用的涂布剂的膜厚只要没有特别指出，则使用了大约90nm的膜厚。
对含有被浓缩了的外来体的试样以30700rpm进行120分钟离心。将所得的沉淀利用移液悬浮于3ml的45％OptiPrep(Cosmo Bio株式会社制)中，使用8－40％的梯度以24200rpm进行20分钟离心后分为10个级分地进行采集。对所采集的各级分以30700rpm进行120分钟离心，将沉淀悬浮于250μl PBS中回收。
对各级分中回收到的外来体、以及吸附于离心管的外来体量利用蛋白印迹法进行了分析。依照常法，进行蛋白印迹法，检测出作为外来体的标记为人所知的CD9及CD63。将抗CD9抗体、抗CD63抗体(两者均为Cosmo Bio株式会社制)分别作为一抗，作为二抗使HRP标记抗小鼠IgG抗体(Bio-Rad Laboratories公司制)反应，进行了化学发光监测。
图1是在使用了含有作为聚合物1的亲水性聚合物的涂布剂的离心管、或者使用了未处理的离心管的情况下比较分级为10个级分的各级分中回收的外来体量(回收量)、吸附于离心管而无法回收的外来体量(吸附量)的图。如图1所示，在不使用涂布剂地进行外来体的纯化的情况下，回收的外来体极为微少，大多数的外来体吸附于离心管。与之相反，在使用涂布有作为聚合物1的亲水性聚合物的离心管进行纯化的情况下，吸附于离心管的外来体极为微少，可以使大多数的外来体再次悬浮而回收。
[实施例2]外来体吸附实验2
向涂布有作为聚合物1～3的亲水性聚合物的离心管、或者向未处理的离心管中，加入在与上述相同地在低速离心后进行了0.22μm的过滤器过滤的HuH-7细胞的培养上清液12ml中加入PBS 23ml而得的试样，以37000rpm进行70分钟超速离心。将沉淀悬浮于250μl的PBS中回收。对回收沉淀后的离心管加入150μl、1×SDS sample buffer进行洗脱(第一次离心管吸附试样)。对回收到的外来体加入30ml的PBS，使用分别涂布有作为聚合物1～3的亲水性聚合物的新的离心管、或者新的未处理的离心管，再次以37000rpm进行120分钟离心。以达到150μl的方式用PBS进行悬浮、回收外来体。另外，对回收外来体后的离心管加入150μl的1×SDS sample buffer进行洗脱(第二次离心管吸附试样)。
对回收的外来体、在第一次、第二次的超速离心中吸附于离心管的外来体与实施例1相同地利用蛋白印迹法进行了分析。将结果表示于图2中。
图2表示进行3次相同的实验后各实验的蛋白印迹法的结果。图中，上清液表示培养上清液，－表示未处理的离心管，1～3表示使用了利用含有作为聚合物1～3的亲水性聚合物的涂布剂涂布了的离心管。
无论在利用CD63、CD9哪种标记检测的情况下，都是在使用涂布剂的情况下有效地回收了外来体。另一方面，在使用了未处理(－)的离心管的情况下，非特异性吸附于离心管的外来体量多，回收率变得非常差。
[实施例3]外来体吸附实验3
利用Nanosight LM10(Malvern公司制)测定出实施例2中回收到的外来体的粒子数。校准是利用将Silica Microspheres：100nm(Polysiciences、Inc.#24041)用通过了GEPuradisc 13(NYL 0.1μm)的MiliQ水稀释了的物质来进行。然后，将外来体用通过了GEPuradisc 13的PBS稀释为大约108左右，用注射器将样品溶液注入测定池并等待10秒，然后进行30秒的数据测定。推压注射器，使腔室内的样品溶液移动，由此在用新的样品替换池内的同时进行5次测定。图3表示出平均值、以及标准偏差。Detection threshold使用4，Camera level使用14。
可明确，在使用含有作为聚合物1～3任意一种的亲水性聚合物的涂布剂的情况下，与使用未处理的离心管进行纯化的情况相比，外来体的回收率都大幅度提高。
[实施例4]
依照下述的要领进行一次、或两次离心，研究了外来体的回收量、吸附于试管的量。从HT－29细胞的培养上清液中如下所示地纯化外来体。将如上所述地制备的HT－29细胞的培养上清液500ml以160000xg进行70分钟离心，使外来体沉淀，接下来将沉淀用180ml的PBS再次悬浮，再以160000xg进行70分钟离心而清洗。将所得的沉淀再悬浮于1.3ml的PBS中，作为外来体粗级分。
将外来体粗级分1.3ml与1.7ml的46％碘克沙醇(OptiPrep、Cosmo Bio公司制)混合，放入离心试管的底部，在其上层叠8％到40％的碘克沙醇连续密度梯度。将离心试管用Beckman L－90K离心机和SW32Ti转子以100000xg进行17小时的平衡密度梯度离心。离心后，从试样的上液面每次4.26ml地回收3个级分，其后，每次3.26ml地回收6个级分，共计分为9个级分。将各个级分悬浮于27ml的PBS中，以160000xg进行120分钟的离心后，将沉淀悬浮于500μl的PBS中，得到纯化外来体。该9个级分当中，在该实验中，将级分2(密度1.36g/cm3)作为纯化外来体试样使用。
将由HT－29细胞的培养上清液得到的密度1.36g/cm3外来体溶液向微量试管(Eppendorf公司制)中各加入30μl。试管准备了预先涂布有作为聚合物1、或聚合物4的亲水性聚合物的试管。吸附实验如下进行，即，在室温下静置10分钟，以13200rpm在4℃进行30分钟离心后，用旋涡混合器搅拌10秒，回收外来体。在进行两次离心的情况下，将相同的工序进行两次，回收外来体。对回收的外来体使用Nanosight LM10利用蛋白印迹法分析了粒子数。进行三次实验，粒子数表示平均值，基于蛋白印迹法的结果表示三次的各实验结果(图4)。
图4A表示回收的外来体的粒子数的分析结果。实验以相对于输入的比例表示三次的平均值，括号内的数字表示离心的次数。在使用了聚合物1的情况下，进行一次离心时可以回收输入的50％以上，进行两次离心时也可以回收30％以上的粒子。与之不同，在使用了聚合物4的比较例的情况下，进行一次离心时回收30％，进行两次时只有15％左右的回收率。
图4B中表示基于蛋白印迹法的分析结果。各组合是在第一次、第二次、第三次的各实验中分析回收的样品、吸附于试管的样品、并从上方起依次表示第一次到第三次的分析结果。使用抗EpCAM抗体(R&D Systems公司制)、抗CD9抗体进行了检测。在使用了聚合物4的情况下，进行两次离心而回收到的样品中，无论使用抗EpCAM抗体、抗CD9抗体的哪种抗体时，都基本上检测不到，然而在使用了聚合物1的情况下，无论在哪种情况下都能够检出。
[实施例5]
进行了基于涂布剂的膜厚的吸附量的比较。以达到0.5、1.0、2.0、4.0wt％的方式将聚合物1溶解于乙醇中，在微量试管(Trefu公司制)上，以90nm～1400nm改变膜厚而进行涂布，用于分析。需要说明的是，膜厚的测定是使用反射分光膜厚计(FE－3000、大塚电子株式会社制)测定的。与实施例4相同地使用由HT－29细胞的培养上清液得到的外来体，进行一次或两次离心，比较了外来体的回收量。
图5A表示回收的外来体的粒子数的分析结果。左侧显示的90、140、370、1400表示涂布微量试管的膜厚(nm)。实验以相对于输入的比例表示三次的平均值，括号内的数字表示离心的次数。－表示使用了未处理的试管的结果。无论是哪种膜厚，在使用了进行过涂布的试管的情况下，都能够回收输入的50％以上的粒子。与之不同，在未处理的试管的情况下，在进行一次离心时也只能回收平均约45％，在进行两次离心时只能回收平均20％以下的粒子。
根据粒子数的分析，没有观察到由涂布剂的厚度造成的回收量的差别，如果考虑制膜时的波动、作业性，则优选为50nm以上且2000nm以下的膜厚。可以认为，如果是该范围的膜厚，则可以防止外来体的吸附，并且可以获得稳定的测定结果。
图5B中，表示基于蛋白印迹法的分析结果。与实施例4相同，表示利用抗EpCAM抗体、以及抗CD9抗体进行检测的结果。无论是哪种膜厚，与没有涂布的试管相比，都可以得到外来体的吸附得到明显抑制的结果。
图5C中表示对回收样品、吸附于试管的样品进行SDS电泳、并利用银染色进行了分析的结果。在使用未处理的试管的情况下，回收量明显地降低。与之不同，可明确，无论是哪种膜厚，在进行了涂布的情况下，吸附样品减少，回收样品增加。
如上述实施例中所示，通过使用含有聚合物1～3的涂布剂，外来体向容器的吸附减少，回收率明显提高。利用这些涂布剂，不仅可以提高外来体回收率，而且可以精度优良地进行定量分析。
产业上的可利用性
通过使用本发明的涂布剂，可以防止以外来体为首的细胞外小泡向容器、分析中所用的基板等的吸附。其结果是，可以显著地改善细胞外小泡的回收率，此外可以提高分析的精度。

Claims (5)

1.一种用于防止细胞外小泡吸附的涂布剂，
其含有重均分子量为1万以上且100万以下的亲水性聚合物，
所得的涂布被膜的接触角为0度以上且30度以下。
2.根据权利要求1所述的涂布剂，其中，
所述亲水性聚合物包含选自2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、乙烯醇、乙烯基吡咯烷酮、甲氧基烷撑二醇单甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸2－羟基乙酯中的一种以上的亲水性单体。
3.根据权利要求2所述的涂布剂，其中，
构成所述亲水性聚合物的所述亲水性单体为2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，
所述亲水性聚合物是含有30摩尔％以上且50摩尔％以下的基于2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的构成单元、且剩余包含含有疏水性基团的单体的共聚物。
4.一种器具，其被涂布以权利要求1～3中任一项所述的涂布剂。
5.一种细胞外小泡的纯化和/或分析方法，其特征在于，
使用权利要求4所述的器具。
CN201780032132.4A 2016-05-24 2017-05-23 细胞外小泡回收方法及细胞外小泡用容器 Active CN109153882B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016103091 2016-05-24
JP2016-103091 2016-05-24
PCT/JP2017/019121 WO2017204187A1 (ja) 2016-05-24 2017-05-23 細胞外小胞回収方法及び細胞外小胞用容器

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109153882A true CN109153882A (zh) 2019-01-04
CN109153882B CN109153882B (zh) 2022-03-04

Family

ID=60411962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780032132.4A Active CN109153882B (zh) 2016-05-24 2017-05-23 细胞外小泡回收方法及细胞外小泡用容器

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10955410B2 (zh)
EP (1) EP3467059B1 (zh)
JP (1) JP6970665B2 (zh)
CN (1) CN109153882B (zh)
WO (1) WO2017204187A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7451385B2 (ja) * 2020-12-07 2024-03-18 大日本塗料株式会社 粒状物質をイムノクロマトグラフィー法によって検出する方法及びそのためのキット
WO2022203603A1 (en) * 2021-03-26 2022-09-29 N-Lab Technology Center Pte. Ltd. Water-soluble polymer to prevent non-specific adsorption
CN115887758B (zh) * 2022-11-15 2024-01-26 西南交通大学 负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶
CN118345022A (zh) * 2024-01-24 2024-07-16 上海市肺科医院（上海市职业病防治院） 一种唾液中外泌体的富集提取方法及在筛查结核性潜伏感染中的应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH075177A (ja) * 1993-06-15 1995-01-10 Nippon Oil & Fats Co Ltd 生化学的分析方法及び生化学的分析用反応容器
EP1152242A1 (en) * 1998-12-24 2001-11-07 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Container for immunologic assay
JP2004275862A (ja) * 2003-03-14 2004-10-07 Sumitomo Bakelite Co Ltd 糖鎖化合物吸着制御実験器具
JP2006151850A (ja) * 2004-11-26 2006-06-15 Tokuyama Corp 義歯床用コーティング材
CN101365501A (zh) * 2005-12-09 2009-02-11 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 包含聚电解质的亲水性涂料
CN101909581A (zh) * 2007-11-14 2010-12-08 加利福尼亚大学董事会 固醇修饰的两亲脂质
CN102333554A (zh) * 2009-04-24 2012-01-25 21世纪国际新技术株式会社 医疗用树脂制品及辅助呼吸插管
CN104812857A (zh) * 2012-11-29 2015-07-29 大阪有机化学工业株式会社 亲水性涂布剂

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2890316B2 (ja) * 1989-07-07 1999-05-10 科学技術振興事業団 生体適合性医療デバイス用材料
JP3443891B2 (ja) 1993-09-14 2003-09-08 日本油脂株式会社 タンパク質吸着防止剤
JP2005099040A (ja) * 1998-12-24 2005-04-14 Sumitomo Bakelite Co Ltd 免疫分析用容器
FR2788780B1 (fr) 1999-01-27 2001-03-30 Ap Cells Inc Procede de preparation de vesicules membranaires
US20040241176A1 (en) 2000-04-27 2004-12-02 Ap Cells. Inc. Method of producing membrane vesicles
JP3985578B2 (ja) * 2001-04-26 2007-10-03 日本油脂株式会社 臨床検査法
DK1657302T3 (da) 2003-06-25 2013-02-18 Nof Corp Fremgangsmåde til dannelse af embryoide legemer
JP2008058334A (ja) * 2007-11-21 2008-03-13 Towns:Kk イムノクロマトグラフィー用展開溶媒、測定法およびキット
SG183579A1 (en) 2011-02-11 2012-09-27 Agency Science Tech & Res Methods of detecting therapeutic exosomes
JPWO2015029979A1 (ja) 2013-08-30 2017-03-02 国立大学法人 東京大学 エキソソームの分析方法、エキソソーム分析チップ、及びエキソソーム分析装置
WO2015068772A1 (ja) * 2013-11-06 2015-05-14 Jsr株式会社 分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、キット及び液状組成物
WO2016033696A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Exerkine Corporation Methods of producing and using exersomes and bioengineered exersomes

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH075177A (ja) * 1993-06-15 1995-01-10 Nippon Oil & Fats Co Ltd 生化学的分析方法及び生化学的分析用反応容器
EP1152242A1 (en) * 1998-12-24 2001-11-07 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Container for immunologic assay
JP2004275862A (ja) * 2003-03-14 2004-10-07 Sumitomo Bakelite Co Ltd 糖鎖化合物吸着制御実験器具
JP2006151850A (ja) * 2004-11-26 2006-06-15 Tokuyama Corp 義歯床用コーティング材
CN101365501A (zh) * 2005-12-09 2009-02-11 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 包含聚电解质的亲水性涂料
CN101909581A (zh) * 2007-11-14 2010-12-08 加利福尼亚大学董事会 固醇修饰的两亲脂质
CN102333554A (zh) * 2009-04-24 2012-01-25 21世纪国际新技术株式会社 医疗用树脂制品及辅助呼吸插管
CN104812857A (zh) * 2012-11-29 2015-07-29 大阪有机化学工业株式会社 亲水性涂布剂

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAZUHIKO ISHIHARA, ET AL.: "《Hemocompatibility of human whole blood on polymers with a phospholipid polar group and its mechanism》", 《JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH》 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017204187A1 (ja) 2017-11-30
EP3467059B1 (en) 2022-02-23
JP6970665B2 (ja) 2021-11-24
JPWO2017204187A1 (ja) 2019-03-22
EP3467059A1 (en) 2019-04-10
US20200025750A1 (en) 2020-01-23
EP3467059A4 (en) 2020-03-11
CN109153882B (zh) 2022-03-04
US10955410B2 (en) 2021-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109153882A (zh) 细胞外小泡回收方法及细胞外小泡用容器
Tkach et al. Why the need and how to approach the functional diversity of extracellular vesicles
US11016009B2 (en) Method for isolating extracellular vesicles using aqueous two-phase system
Gusachenko et al. Nucleic acids in exosomes: disease markers and intercellular communication molecules
Toubi et al. Clinical and biological aspects of anti-P-ribosomal protein autoantibodies
EP2002262B1 (en) Devices and methods for detecting cells and other analytes
US10788487B2 (en) Solid-phase support, ligand-binding solid-phase support, method for detecting or separating target substance, and method for producing the solid-phase support
JPWO2014192731A1 (ja) 無機材料で構成される表面用の表面処理剤、表面が改質された器具および装置、該器具および装置の製造方法
JP6764852B2 (ja) 蛋白質吸着抑制方法
CN108993621A (zh) 一种用于数字酶联免疫检测的微小室阵列微流控芯片及方法
US11493412B2 (en) Method and kit for exosomes and associated biomacromolecules capture
JP5866880B2 (ja) 生理活性物質固定化用粒子、生理活性物質固定粒子及び糖親和性物質捕捉粒子
US10466235B2 (en) Solid support, ligand-bound solid support, detection or separation method for target substance, solid support production method, and ligand-bound solid support production method
CN106632877B (zh) 蛋白质固相烷基化试剂的制备及固相烷基化试剂和应用
US9632086B2 (en) Method and kit for determining-antibody sensitivity and clone cell strain
Chen et al. Blood-typing and irregular antibody screening through multi-channel microfluidic discs with surface antifouling modification
Zuvin et al. Human breast cancer cell enrichment by Dean flow driven microfluidic channels
Szittner et al. Functional blood cell analysis by label-free biosensors and single-cell technologies
Ishihara et al. Rapid and easy extracellular vesicle detection on a surface-functionalized power-free microchip toward point-of-care diagnostics
Lai et al. Unveiling the Complex World of Extracellular Vesicles: Novel Characterization Techniques and Manufacturing Considerations
JP4337643B2 (ja) 生化学用器具
US9310358B2 (en) Sugar chain array
US20210308351A1 (en) Method and Device for Enriching and Detecting Microorganisms in a Biological Sample
CN108018350A (zh) 与结核潜伏感染相关的外泌体分子标识
Wulandari et al. Design and validation of functionalized redox-responsive hydrogel beads for high-throughput screening of antibody-secreting mammalian cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant