JP6970665B2 - 細胞外小胞回収方法及び細胞外小胞用容器 - Google Patents

Description

本発明は、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）に代表される細胞由来の小胞を効率的に回収するための方法及びその回収に用いる容器、器具に関する。また、エクソソームによって検査する方法に用いるための基板、流路等に関する。

細胞外小胞とは、細胞に由来する細胞外に存在する小胞で、その大きさからエクソソーム、微小小胞体（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）、アポトーシス小体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｏｄｙ）に分類される。エクソソームや微小小胞体には、タンパク質やｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの核酸が含まれ、アポトーシス小体には断片化された核や細胞小器官が含まれている。細胞外小胞の中でも、エクソソームや微小小胞体にはタンパク質や核酸が含まれていることから、放出した細胞由来の情報が含まれており、バイオマーカーとして利用できる可能性を有している。特にエクソソームは診断マーカーや治療に利用できる可能性を含んでおり近年注目されている。

エクソソームは、細胞から分泌される脂質二重膜で形成された直径３０〜１００ｎｍの小胞体である。エクソソームはほとんどの細胞から分泌されることが知られており、血液、唾液、尿、母乳などの体液中で存在が確認されている。エクソソームには分泌された細胞由来のＲＮＡやタンパク質が内包されており、体液中を循環することで離れた細胞まで情報を伝達する可能性が示唆されている（非特許文献１）。癌細胞由来のエクソソームに含まれている核酸やタンパク質によって、癌の進展が促進される可能性が示され、さらにこのことからエクソソームを用いた癌診断システムの可能性が示唆された（非特許文献２）。

上述のように、エクソソームに内包されているタンパク質や核酸は、分泌された細胞種によって異なることが明らかになっている。そのため、エクソソーム由来の核酸やタンパク質は診断マーカーとして有用である。また、エクソソームは唾液や尿中にも含まれることから、エクソソームを用いた精度の高い検査方法を確立することができれば、非侵襲的な診断方法とすることができる。さらに、エクソソームの情報伝達機能を用いることによって、健康な細胞から採取し回収したエクソソームを、傷害を受けた細胞や罹患細胞の回復に用いる試みも行われている（特許文献１）。

唾液など少量の試料からエクソソームを精製したり、治療目的で多量のエクソソームを精製するためには、回収率良く精製する方法が必要となる。従来からエクソソームを精製する方法として、遠心分離やカラムにより単離する方法が開示されている（特許文献２、３）。中でも超遠心を用いた遠心分離法は確立された回収技術であり、エクソソームの形状維持性の点で優れた技術である。

例えば、細胞の培養上清からエクソソームを回収する場合であれば、エクソソームを含む培地を低速遠心で細胞の破片等を除去した後に、２時間程度超遠心によりエクソソームをペレットとして回収することができる。こうして得たエクソソームはＰＢＳなどの緩衝液に再分散させ、さらに精製を行ったり、そのまま検査や研究などの解析に用いることができる。

特表２０１４−５０７１４０号公報 特表２００３-５３１８６４号公報 特表２００２−５３５６６５号公報 特開平７−８３９２３号公報 国際公開第２００５／００１０１９号

Valadi, H. et al., 2007, Nat. Cell Biol., Vol.9, p.654-659. Skog, J. et al., 2008,Nat. Cell Biol., Vol.10, pp.1470-1476.

しかしながら、上述の超遠心による回収方法では、使用する回収容器のプラスチック表面にエクソソームが非特異的に吸着し、安定した回収率が得られず、操作のたびに回収率が低下することが問題となっていた。特に、定量的な解析を行うにあたって、精製に用いる容器や、解析器具の表面への吸着は、解析の効率だけではなく解析結果にも影響を与える。しかしながら、今までエクソソームなどの細胞外小胞の吸着を防止する有効な方法は開発されていない。

従来、生体由来物質であるタンパク質や細胞を親水性ポリマーによって、容器へ非特異的に吸着するのを防止する方法は開示されている（特許文献４、５）。特許文献４には２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体や、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン含有成分の共重合体を含むＰＢＳ溶液でポリスチレン製の容器をコートすることにより、タンパク質の吸着を防止できることが開示されている。特許文献５には、ホスホリルコリン類似基を含有する化合物を用いて培養容器を被覆することによって、ＥＳ細胞の培養容器への接着を防止し、効率良く胚様体を形成できることが開示されている。

しかしながら、特許文献４はタンパク質に特化した方法であり、エクソソーム等の表面にはタンパク質が表出しているとはいえ、脂質二重膜で形成されている細胞外小胞の吸着を完全に防止することが困難であった。また、特許文献５の方法は、脂質二重膜で形成されている細胞の吸着を防止するものであるが、細胞と細胞外小胞、特にエクソソームとではその大きさが全く異なることから容器への吸着の程度が大きく異なり、エクソソームの容器への吸着を完全に防止することはできなかった。

本発明は、エクソソームに代表される細胞由来の小胞を精製する際に、遠心管など精製に使用する容器やピペットチップなどの器具への細胞由来の小胞の吸着を防止し、回収率の向上を図るためのコーティング剤を提供することを課題とする。また、精製の過程に使用できるだけではなく、エクソソーム解析に用いる基板、流路などにコートすることによって、エクソソーム解析の精度を向上させることができるコーティング剤を提供することを課題とする。さらに、これらコーティング剤によってコートされた容器やチップ、基板などの分析器具を提供することを課題とする。

本発明は以下のコーティング剤、器具、精製方法、解析方法に関する。
（１）重量平均分子量が１万以上１００万以下である親水性ポリマーを含有し、得られるコーティング被膜の接触角が０度以上３０度以下である細胞外小胞吸着防止用コーティング剤。
（２）前記親水性ポリマーが２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、メトキシアルキレングリコールモノメタクリレート又はメタクリル酸２−ヒドロキシエチルからなる１種以上の親水性単量体を含む（１）記載のコーティング剤。
（３）前記親水性ポリマーを構成する前記親水性単量体が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンであって、２−メタクリルロイルオキシエチルホスホリルコリンに基づく構成単位を３０モル％以上５０モル％以下含有し、残余が疎水性基含有単量体からなる共重合体である（２）記載のコーティング剤。
（４）（１）〜（３）いずれか１つ記載のコーティング剤でコートされている器具。
（５）（４）記載の器具を用いることを特徴とする細胞外小胞の精製及び／又は解析方法。

コーティング剤の有無によるエクソソーム回収量を示す図。 コーティング剤の種類によるエクソソーム回収量を示す図。 コーティング剤によるエクソソーム回収量を粒子数によって検討した結果を示す図。 図４Ａは、コーティング剤によるエクソソーム回収量を粒子数によって、図４Ｂはウェスタンブロッティングによって検討した結果を示す図。 図５Ａは、コーティング剤の膜厚によるエクソソーム回収量を粒子数によって、図５Ｂはウェスタンブロッティングによって検討した結果を示す図。図５Ｃは回収サンプル、吸着サンプルを電気泳動し、銀染色により解析した図。

本発明で細胞外小胞とは、細胞に由来する小胞をいい、具体的には、エクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体を指す。以下の実施例ではエクソソームを中心に記載するが、エクソソーム以外の細胞外小胞にも応用できることは言うまでもない。

また、本発明のコーティング剤は、遠心管、チューブ、ピペットチップなど、エクソソーム等の細胞外小胞を精製する際に使用する器具にコートすることによって、その吸着を防止し、回収率を向上することができる。また、ビーズ、マイクロタイタープレート、スライドグラス、マイクロタス、ラボ・オン・チップ等、当該分野で用いられている分析器具、分析機器にコートすることにより非特異吸着を防止し、分析精度を向上させることができる。

本発明のコーティング剤は、どのような材質の器具であってもコートすることができる。例えば、遠心管として多用されているポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアロマーや、分析器具の基材として使用される塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、シリコン、親水性ポリジメチルシロキサン、疎水性ポリジメチルシロキサン、ガラス、ステンレスやアルミなどの金属も本発明のコーティング剤によってコートすることにより、エクソソーム等の細胞外小胞の吸着を防止することができる。

本発明のコーティング剤によって得られるコーティング被膜の接触角は０度以上３０以下であるが、０度以上２５度以下であることが好ましい。また、本発明の親水性ポリマーの分子量は重量平均分子量が１０，０００以上１，０００，０００以下であるが、コーティング膜の耐久性の点から１００，０００以上が好ましく、またコーティング時の高粘度による塗り斑を抑制するために７００，０００以下であることがより好ましい。

また、親水性ポリマーの親水性単量体としては、親水性の重合体、あるいは共重合体を合成できるものであれば構わないが、中でも２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、メトキシアルキレングリコールモノメタクリレート又はメタクリル酸２−ヒドロキシエチルであることが好ましい。これら親水性単量体は、重合体として使用しても、他の単量体とともに共重合体として使用してもよい。

なかでも、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）と疎水性単量体との共重合体は好ましく用いることができる。疎水性単量体としては、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）、メタクリル酸２−エチルヘキシル（ＥｈＭＡ）、メタクリル酸ドデシル（ＤＭＡ）、メタクリル酸ステアリル（ＳＭＡ）などを用いることができるが、特にメタクリル酸−ｎ−ブチルとの共重合体が入手しやすさと製膜性の点から好ましい。また、ＭＰＣと疎水性単量体との共重合体を作製する場合には、ＭＰＣと疎水性単量体の組成比は２０／８０〜５０／５０が良い。

本発明のコーティング剤は上述の重合体、あるいは共重合体を０．０５％以上５．０％以下の濃度で含有した溶液として用いることができる。０．０５重量％未満であると所望の効果を発揮できず、また５重量％より高いとコーティング剤の塗工斑による効果の低下やコーティング剤の物理的な剥離を生ずる恐れがある。溶媒としては、エタノール、メタノールなどのアルコール類、あるいはリン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＢＳ、ＴＢＳなど当該分野で通常用いられている緩衝液を用いることができる。

また、コーティング剤を器具に製膜する場合の膜厚は５０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下であることが好ましく、より好ましくは、９０ｎｍ以上９００ｎｍ以下であることが好ましい。

器具に製膜する場合、完全に均一に製膜することはできない。薄い膜厚で製膜することは非常に困難であることから、平均膜厚が５０ｎｍ未満の場合には、膜厚のばらつきが大きく、エクソソームの吸着防止効果が弱い箇所が生じる。また、膜厚が２０００ｎｍより大きい場合には、製膜に用いるコーティング液（ポリマー溶液）の粘度が高く、使用するポリマー量も多くなるため、製膜時の作業性（乾燥や操作性の点）と経済性の点から難しい。５０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の膜厚であれば、エクソソームの吸着を防止する効果がある。さらに、９０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の膜厚の場合には、安定した膜厚で製膜を行うことができるため、エクソソームの吸着を防止し、安定した測定結果を得ることができる。
以下、実施例を示しながら、本発明を詳細に説明する。

１．重合体
以下の実施例では、下記表１に示す重合体を用いた。
［重合体１］
ＭＰＣ２３．５ｇ及びＢＭＡ２６．５ｇをエタノール５０ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、４５℃でｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート０．１ｇを加えて２４時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に攪拌しながら滴下し、析出した沈殿をろ過し、４８時間４５℃で真空乾燥して粉末３６．８ｇを得た。分子量は標準をポリエチレングリコールに用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィー（東ソー社製）により測定した。重量平均分子量は、５８０，０００であった。^１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析した結果、ＭＰＣ／ＢＭＡ＝３０／７０（モル比）であった。

上記のポリマー０．５ｇをエタノール１００ｇに溶解して０．５重量％の溶液を調製した。これをＰＥＴフィルム上に塗布した後風乾したものを水洗した。これを接触角測定用サンプルとした。接触角測定はドロップマスター（協和界面科学社製）を用いた気泡法により行い、接触角値を水の接触角として求めた。具体的には、「１８０°−気泡角」として算出した。得られたコーティング被膜の接触角値は２５度であった。

［重合体２］
ＭＰＣ４．７ｇ及びＢＭＡ５．３ｇをエタノール９０ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃でｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート０．２５ｇを加えて２４時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に攪拌しながら滴下し、析出した沈殿をろ過し、４８時間４５℃で真空乾燥して粉末３６．８ｇを得た。重量平均分子量は、１２０，０００であった。^１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析では、ＭＰＣ／ＢＭＡ＝３０／７０（モル比）であった。得られたコーティング被膜の接触角値は２０度であった。

［重合体３］
重合体３は、分子量３００，０００のポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用した。得られたコーティング被膜の接触角値は３０度であった。

［重合体４］（比較例）
重合体４は、ＭＰＣ８．４ｇおよびＢＭＡ３６．６ｇをエタノール５４．６ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃でｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート０．３７ｇを加え２４時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に攪拌しながら滴下し、析出した沈殿をろ過し、４８時間４５℃で真空乾燥して粉末２６．３ｇを得た。重量平均分子量は３４０，０００であった。^１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析した結果、ＭＰＣ／ＢＭＡ＝１０／９０（モル比）であった。得られたコーティング被膜の接触角値は４２度であった。

上記の親水性ポリマーを含有したコーティング剤を用いて、精製に用いる容器のコーティングを行い、エクソソームの吸着量の解析を行った。なお、コーティングは、表１に示す重合体１〜３、比較例である重合体４の親水性ポリマーを夫々０．５ｗｔ％含むエタノール溶液で容器表面を濡らし、余剰液を排出した後に乾燥させて用いた。

２．親水性ポリマーの有無によるエクソソームの吸着比較
［エクソソームを含む培養上清の調製］
エクソソームはヒト肝がん由来の細胞株ＨｕＨ−７細胞、又は大腸がん由来の細胞株ＨＴ−２９細胞の培養上清から得た。ＨｕＨ−７細胞からエクソソームを得る場合は以下のようにして行った。１×１０^６個のＨｕＨ-７細胞は、１０％ウシ胎仔血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、１／１００量のペニシリンストレプトマイシン（ペニシリンストレプトマイシン溶液×１００、和光純薬工業製）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地、２５ｍｌに懸濁して、１５０ｍｍシャーレ（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈｅｓ １５０ｍｍ、イワキ株式会社製）に播種し、５％ＣＯ_２、３７℃、７２時間培養した。その後培地を吸引除去し、ウシ胎仔血清を含まないＲＰＭＩ １６４０培地を２５ｍｌ加え、５％ＣＯ_２、３７℃、６６時間培養した。６６時間後に、培養上清を回収し、８，９００ｘｇ１０分で低速遠心を行い、上清を０．２２μｍフィルター（ｍｉｌｌｉｅｘ−ＧＳ・ＳＬＧＶ０３３ＲＳ、メルク社製）に通した。

ＨＴ−２９細胞からエクソソームを得る場合には、以下のようにして行った。２ｘ１０^８個のＨＴ−２９細胞を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリンストレプトマイシンを添加したＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地、５００ｍｌに播種し、Ｂｅｌｌｏｃｅｌｌ（ＣＥＳＣＯ社製）培養器を用い、５％ＣＯ_２、３７℃、９６時間培養した。次に、培地をデカントで除去し、ウシ胎仔血清を含まないＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地を５００ｍｌ加え、５％ＣＯ_２、３７℃、７２時間さらに培養した。７２時間後に、培養上清を回収し、上記と同様にして低速遠心し、上清をフィルターに通しエクソソームの含まれた培養上清を得た。

［実施例１］エクソソーム吸着実験１
上記で調製したＨｕＨ−７細胞の培養上清４８０ｍｌを３０，７００ｒｐｍで７０分遠心し、エクソソームの濃縮を行った。沈殿は１２ｍｌの培養上清に再懸濁し、さらに培養上清６０ｍｌを加え、エクソソームが濃縮された試料を得た。

以下の超遠心工程は、すべて重合体１の親水性ポリマーを含有するコーティング剤をコートした超遠心用チューブ（ＵＣチューブ、Ｕｌｔｒａ-Ｃｌｅａｒ Ｔｕｂｅｓ、ベックマン・コールター社製）、あるいはコートしていない遠心管にエクソソームが含まれる試料を等量分注し精製を行い、コーティング剤の有無によるエクソソーム回収率を比較した。なお、以下の実験で用いたコーティング剤の膜厚は特に断らない限りおよそ９０ｎｍのものを用いた。

濃縮されたエクソソームを含む試料は、３０，７００ｒｐｍで１２０分遠心を行った。得られた沈殿は、３ｍｌの４５％ ＯｐｔｉＰｒｅｐ（コスモ・バイオ株式会社製）にピペッティングで懸濁し、８−４０％のグラジエントを用いて２４，２００ｒｐｍで２０分遠心した後１０分画に分けて採取した。採取した各分画は３０，７００ｒｐｍ１２０分遠心し、沈殿を２５０μｌＰＢＳに懸濁して回収した。

各分画で回収されたエクソソーム、及び遠心管に吸着したエクソソーム量をウェスタンブロッティングにより解析した。定法にしたがって、ウェスタンブロッティングを行い、エクソソームのマーカーとして知られているＣＤ９及びＣＤ６３を検出した。抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体（両者ともコスモ・バイオ株式会社製）を夫々一次抗体として、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製）を反応させ、化学発光検出を行った。

図１は１０分画に分画した各分画で回収されたエクソソーム量（回収量）、遠心管に吸着して回収できなかったエクソソーム量（吸着量）を重合体１の親水性ポリマーを含有したコーティング剤、あるいは未処理の遠心管を用いた場合で比較したものである。図１に示すように、コーティング剤を用いずにエクソソームの精製を行った場合には、回収されたエクソソームはごくわずかであり、多くのエクソソームが遠心管に吸着していた。これに対し、重合体１の親水性ポリマーをコートした遠心管を用いて精製を行った場合には、遠心管に吸着したエクソソームはごくわずかであり、ほとんどのエクソソームは再懸濁させて回収することができた。

［実施例２］エクソソーム吸着実験２
重合体１〜３の親水性ポリマーをコートした遠心管、あるいは未処理の遠心管に、上記と同様に低速遠心後、０．２２μｍのフィルター濾過を行ったＨｕＨ-７細胞の培養上清１２ｍｌにＰＢＳ２３ｍｌを加えた試料を入れ、３７，０００ｒｐｍ７０分超遠心を行った。沈殿を２５０μｌのＰＢＳに懸濁して回収した。沈殿回収後の遠心管は１５０μｌ、１×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて溶出した（１回目遠心管吸着試料）。回収したエクソソームは３０ｍｌのＰＢＳを加え、夫々重合体１〜３の親水性ポリマーをコートした新しい遠心管、あるいは新しい未処理の遠心管を用い、再度３７，０００ｒｐｍ１２０分遠心を行った。エクソソームは１５０μｌになるようにＰＢＳで懸濁して回収した。また、エクソソーム回収後の遠心管は１５０μｌの１×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて溶出した（２回目遠心管吸着試料）。

回収したエクソソーム、１回目、２回目の超遠心で遠心管に吸着したエクソソームは実施例１と同様にしてウェスタンブロッティングにより解析を行った。結果を図２に示す。

図２は同じ実験を３回行い、各実験のウェスタンブロッティングの結果を示している。図中、上清は培養上清を、−は未処理の遠心管を、１〜３は重合体１〜３の親水性ポリマーを含有するコーティング剤によってコートした遠心管を用いていることを示す。

ＣＤ６３、ＣＤ９どちらのマーカーによって検出した場合も、コーティング剤を使用した場合にはエクソソームが効率よく回収されている。一方、未処理（-）の遠心管を用いた場合には、遠心管に非特異的に吸着したエクソソーム量が多く、回収率が非常に悪くなっている。

［実施例３］エクソソーム吸着実験３
実施例２において回収されたエクソソームの粒子数をナノサイトＬＭ１０（マルバーン社製）によって測定した。キャリブレーションは、Ｓｉｌｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ：１００ｎｍ（Ｐｏｌｙｓｉｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．＃２４０４１）をＧＥプラディスク１３（ＮＹＬ ０．１μｍ）を通したミリＱ水で希釈したもので行った。次に、エクソソームをＧＥプラディスク１３を通したＰＢＳでおよそ１０^８程度に希釈し、シリンジでサンプル溶液を測定セルに注入し１０秒待ち、次に３０秒のデータ測定を行った。シリンジを押して、チャンバー内のサンプル溶液を移動させることにより、新しいサンプルでセル内を入れ代えながら５回測定を行った。図３は平均値、及び標準偏差を示している。Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄは４、Ｃａｍｅｒａ ｌｅｖｅｌは１４を用いた。

重合体１〜３、いずれの親水性ポリマーを含有したコーティング剤を用いた場合も、未処理の遠心管を用いて精製を行った場合に比べてエクソソームの回収率が非常に向上していることは明らかである。

[実施例４]
遠心を下記の要領で１回、又は２回行い、エクソソームの回収量、チューブに吸着する量を検討した。エクソソームはＨＴ−２９細胞の培養上清から以下のようにして精製した。上記のようにして調製したＨＴ−２９細胞の培養上清５００ｍｌを１６０，０００ｘｇで７０分遠心し、エクソソームを沈殿させ、続いて沈殿を１８０ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、さらに１６０，０００ｘｇで７０分遠心して洗浄した。得られた沈殿を１．３ｍｌのＰＢＳに再懸濁して、エクソソーム粗分画とする。

エクソソーム粗分画１．３ｍｌを１．７ｍｌの４６％ Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ（ＯｐｔｉＰｒｅｐ、コスモバイオ社製）と混合し、遠心チューブの底に入れ、その上に８％から４０％のＩｏｄｉｘａｎｏｌ連続密度勾配を重層する。遠心チューブをベックマンＬ−９０Ｋ遠心機とＳＷ３２Ｔｉローターで、１００、０００ｘｇ、１７時間、平衡密度勾配遠心を行った。遠心後、試料の上液面から４．２６ｍｌずつ３分画を回収し、その後３．２６ｍｌずつ６分画を回収し、合計９分画に分けた。それぞれの分画を２７ｍｌのＰＢＳに懸濁し、１６０，０００ｘｇ、１２０分の遠心を行った後、沈殿を５００μｌのＰＢＳに懸濁して精製エクソソームとした。この９分画のうち、この実験では、分画２（密度１．３６ｇ／ｃｍ^３）を精製エクソソーム試料として用いた。

ＨＴ−２９細胞の培養上清より得た密度１．３６ｇ／ｃｍ^３エクソソーム溶液をマイクロチューブ（エッペンドルフ社製）に各３０μｌずつ入れた。チューブは、予め重合体１、又は重合体４の親水性ポリマーをコートしたものを用意した。吸着実験は室温で１０分静置し、１３，２００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心した後、ボルテックスミキサーで１０秒撹拌し、エクソソームを回収した。遠心を２回行う場合は、同じ工程を２回行い、エクソソームを回収した。回収したエクソソームは、ナノサイトＬＭ１０を用いて粒子数を、ウェスタンブロッティングによって解析を行った。実験は３回行い、粒子数は平均を、ウェスタンブロッティングによる結果は３回の各実験結果を示す（図４）。

図４Ａは、回収したエクソソームの粒子数の解析結果を示す。実験は３回の平均値をインプットに対する割合で示し、かっこ内の数字は遠心した回数を示す。重合体１を用いた場合には、遠心を１回行った場合にはインプットの５０％以上、２回遠心を行った場合であっても３０％以上の粒子を回収することができる。これに対し、重合体４の比較例を用いた場合には、遠心を１回行った場合には３０％、２回行った場合には１５％程度の回収率しかなかった。

図４Ｂに、ウェスタンブロッティングによる解析結果を示す。各パネルは、１回目、２回目、３回目の各実験において、回収したサンプル、チューブに吸着したサンプルを解析し、上から順に１回目から３回目までの解析結果を示したものである。抗ＥｐＣＡＭ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、抗ＣＤ９抗体を用いて検出を行った。重合体４を用いた場合には、遠心を２回行って回収したサンプルでは、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗ＣＤ９抗体いずれの抗体を用いた場合であってもほとんど検出されなかったのに対し、重合体１を用いた場合には、いずれの場合も検出可能であった。

［実施例５］
コーティング剤の膜厚による吸着量の比較を行った。重合体１を０．５、１．０、２．０、４．０ｗｔ％となるようにエタノールに溶解し、マイクロチューブ（トレフ社製）に、９０ｎｍ〜１４００ｎｍまで膜厚を変えてコートし解析に用いた。なお、膜厚の測定は、反射分光膜厚計（ＦＥ−３０００、大塚電子株式会社製）を用いて測定した。実施例４と同様に、ＨＴ−２９細胞の培養上清から得られたエクソソームを用い、遠心を１回、あるいは２回行い、エクソソームの回収量を比較した。

図５Ａは、回収したエクソソームの粒子数の解析結果を示す。左側に示す９０、１４０、３７０、１４００は、マイクロチューブをコートした膜厚（ｎｍ）を示す。実験は３回の平均値をインプットに対する割合で示し、かっこ内の数字は遠心した回数を示す。−は未処理のチューブを用いた結果を示す。いずれの膜厚であっても、コーティングを行ったチューブを使用した場合には、インプットの５０％以上の粒子を回収可能であった。これに対し、未処理のチューブの場合には、遠心を１回行った場合でも平均約４５％、２回遠心を行った場合では平均２０％以下の粒子しか回収することができなかった。

粒子数の解析によって、コート剤の厚さによる回収量の違いは見られなかったが、製膜時のばらつき、作業性を考慮すると５０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の膜厚であることが好ましい。この範囲の膜厚であれば、エクソソームの吸着を防止し、かつ安定した測定結果が得られると考えられる。

図５Ｂに、ウェスタンブロッティングによる解析結果を示す。実施例４と同様に、抗ＥｐＣＡＭ抗体、及び抗ＣＤ９抗体により検出を行った結果を示している。いずれの膜厚でも、コートしていないチューブと比較して、明らかにエクソソームの吸着が抑えられるという結果が得られた。

図５Ｃに、回収サンプル、チューブに吸着したサンプルをＳＤＳ電気泳動し、銀染色により解析した結果を示す。未処理のチューブを用いた場合には、明らかに回収量が低下している。これに対し、いずれの膜厚であってもコーティングを行った場合には、吸着サンプルが減少し、回収サンプルが増加していることは明らかである。

上記実施例に示すように、重合体１〜３を含有するコーティング剤を用いることによりエクソソームの容器への吸着が減少し、著しく回収率が向上している。これらコーティング剤により、エクソソーム回収率を向上させることができるだけではなく、定量的な解析を精度良く行うことができる。

本発明のコーティング剤を使用することによって、エクソソームをはじめとする細胞外小胞が容器や解析に用いる基板などへ吸着することを防止できる。その結果、細胞外小胞の回収率を著しく改善し、さらに解析の精度を向上させることができる。

Claims (3)

1. 重量平均分子量が１万以上１００万以下である親水性ポリマーを含有し、
   前記親水性ポリマーが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）又は
   ２−メタクリルロイルオキシエチルホスホリルコリンに基づく構成単位を３０モル％以上５０モル％以下含有する２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートとの共重合体であって、
   得られるコーティング被膜の接触角が０度以上３０度以下である細胞外小胞吸着防止用コーティング剤。
2. 請求項１記載のコーティング剤が、５０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の膜厚でコートされている細胞外小胞精製用及び／又は解析用器具。
3. 請求項２記載の器具を用いることを特徴とする細胞外小胞の精製及び／又は解析方法。
   

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