JP7306618B2 - がんの転移形成能に関与する因子および前記因子を用いたがん患者の予後予測方法 - Google Patents
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Description
採取された試料において、タンパク質のアミノ酸置換を検出する工程を含む、がん患者における予後の予測方法であって、
前記アミノ酸置換が、以下の(1)から(4)のうち少なくともいずれか1つの置換である、前記予測方法である。
(1)配列番号1の256番目のグルタミンがロイシンに置換
(2)配列番号2の2684番目のグルタミンがロイシンに置換
(3)配列番号2の2686番目のフェニルアラニンがバリンに置換
(4)配列番号3の1066番目のアラニンがスレオニンに置換
前記塩基置換が、以下の(I)から(IV)のうち少なくともいずれか1つの置換である、前記予測方法である。
(I)配列番号1の256番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換
(II)配列番号2の2684番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換
(III)配列番号2の2686番目のフェニルアラニンに対応するコドンがバリンに対応するコドンに置換
(IV)配列番号3の1066番目のアラニンに対応するコドンがスレオニンに対応するコドンに置換
前記塩基置換が、以下の(i)から(iv)のうち少なくともいずれか1つの置換である、前記予測方法である。
(i)配列番号4の1305番目のアデニンがチミンに置換
(ii)配列番号5の8436番目のアデニンがチミンに置換
(iii)配列番号5の8441番目のチミンがグアニンに置換
(iv)配列番号6の3353番目のグアニンがアデニンに置換
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号1の256番目のグルタミンがロイシンに置換した前記ポリペプチド
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号2の2684番目のグルタミンがロイシンに置換した前記ポリペプチド
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号2の2686番目のフェニルアラニンがバリンに置換した前記ポリペプチド
(4)配列番号3に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号3の1066番目のアラニンがスレオニンに置換した前記ポリペプチド
(i)配列番号4の1305番目のアデニンがチミンに置換
(ii)配列番号5の8436番目のアデニンがチミンに置換
(iii)配列番号5の8441番目のチミンがグアニンに置換
(iv)配列番号6の3353番目のグアニンがアデニンに置換
本発明において、がんの限定は特になく、例えば、白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫などの造血細胞悪性腫瘍、脳腫瘍、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、食道がん、胃がん、虫垂がん、大腸がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、副腎がん、消化管間質腫瘍、中皮腫、口腔底がん、歯肉がん、舌がん、頬粘膜がんなどの喉頭がん、口腔がん、頭頚部がん、唾液腺がん、副鼻腔がん、甲状腺がん、腎臓がん、肺がん、骨肉腫、骨がん、前立腺がん、精巣腫瘍、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肛門がん、メラノーマが挙げられる。また原発性腫瘍であってもよいし転移性腫瘍であってもよい。
図1および図2に示す細胞回収装置100は、
貫通孔11aを有する平板状の遮光部材11と、
貫通孔12aを有する平板状の絶縁体12と、
導入口21、排出口22および貫通部23を有する平板状のスペーサー20と、
遮光部材11の下部およびスペーサー20の上部と密着するよう設けた電極基板31・32と、
電極基板31・32同士を接続する導線40と、
電極基板31・32に信号を印加する信号発生器50と、
を備えている。
(1)配列番号1(GenBank No.NP_005350.1)に記載のアミノ酸配列を含むSMAD4(SMAD family member 4)タンパク質において、少なくとも配列番号1の256番目のグルタミンがロイシンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号7のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
(2)配列番号2(GenBank No.NP_000042.3)に記載のアミノ酸配列を含むATM(ATM serine/threonine kinase)タンパク質のうち、少なくとも配列番号2の2684番目のグルタミンがロイシンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号8のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むATMタンパク質において、少なくとも配列番号2の2686番目のフェニルアラニンがバリンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号9のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
(4)配列番号3(GenBank No.NP_006209.2)に記載のアミノ酸配列を含むPIK3CA(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-Kinase Catalytic subunit Alpha)タンパク質において、少なくとも配列番号3の1066番目のアラニンがスレオニンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号10のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
(5)配列番号2(GenBank No.NP_000042.3)に記載のアミノ酸配列を含むATM(ATM serine/threonine kinase)タンパク質のうち、少なくとも配列番号2の2684番目のグルタミンがロイシンに置換し、かつ少なくとも配列番号2の2686番目のフェニルアラニンがバリンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号15のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
(I)配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むSMAD4タンパク質をコードするヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号1の256番目のグルタミンに対応するコドン(CAAまたはCAG)がロイシンに対応するコドン(TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTGのいずれか)に置換したポリヌクレオチド
(II)配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むATMタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号2の2684番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換したポリヌクレオチド
(III)配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むATMタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号2の2686番目のフェニルアラニンに対応するコドン(TTTまたはTTC)がバリンに対応するコドン(GTT、GTC、GTA、GTGのいずれか)に置換したポリヌクレオチド
(IV)配列番号3に記載のアミノ酸配列を含むPIK3CAタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号3の1066番目のアラニンに対応するコドン(GCT、GCC、GCA、GCGのいずれか)がスレオニンに対応するコドン(ACT、ACC、ACA、ACGのいずれか)に置換したポリヌクレオチド
(V)配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むATMタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号2の2684番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換し、かつ少なくとも配列番号2の2686番目のフェニルアラニンに対応するコドン(TTTまたはTTC)がバリンに対応するコドン(GTT、GTC、GTA、GTGのいずれか)に置換したポリヌクレオチド
(i)配列番号4(GenBank No.NM_005359.5)に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも1305番目のアデニンがチミンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号11で表される。
前記(II)のポリヌクレオチドの一態様として、
(ii)配列番号5(GenBank No.NM_000051.3)に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも8436番目のアデニンがチミンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号12で表される。
前記(III)のポリヌクレオチドの一態様として、
(iii)配列番号5に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも8441番目のチミンがグアニンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号13で表される。
前記(IV)のポリヌクレオチドの一態様として、
(iv)配列番号6(GenBank No.NM_006218.2)に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも3353番目のグアニンがアデニンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号14で表される。
(V)配列番号5(GenBank No.NM_000051.3)に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも8436番目のアデニンがチミンに置換し、かつ少なくとも8441番目のチミンがグアニンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号16で表される。
[1]がん患者(がんの疑いのある患者も含む)から血液を採取する。なお、血液を採取する際、クエン酸、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの抗凝固剤を添加してもよい。また必要に応じ、採取した血液を生理食塩水などで希釈してもよい。
[2]採取した血液(または希釈した血液)を密度勾配遠心法に供し、当該血液中に含まれる夾雑細胞(赤血球、白血球など)を除去する。密度勾配遠心法は、物質をその比重に基づき分離する方法であり、密度勾配を形成した媒体(密度勾配溶液)上に採取した血液(または希釈した血液)を重層した後、遠心分離を行なうことにより、夾雑細胞やごみを除去し、がん細胞(CTC)を含む画分(上層)を回収することができる。なお、前記遠心分離を行なう前に、採取した血液(または希釈した血液)に、夾雑細胞(赤血球、白血球など)と結合可能な結合剤(例えば、RosetteSep(StemCell Technologies社製))を添加することもできる。前記結合剤は、赤血球、白血球および/またはこれら細胞の表面抗原と結合することで細胞凝集体を形成し、これら細胞の密度を大きくすることができるため、密度勾配遠心法によるCTCの分離を容易にする。密度勾配遠心法により夾雑細胞やごみが除去されたCTCを含む画分は、速やかに後続の操作を行なうことが好ましいが、後続の操作を速やかに行なえない場合は、凍結保存による保存処理を行なってもよい。凍結保存する際は、CELLBANKER2(日本全薬工業社製)などの細胞保存溶液にCTCを含む画分を懸濁させた後、-80℃で凍結保存すればよい。
[3][2]で得られたCTCを含む画分に塩化アンモニウムを含む溶液を添加して撹拌することで、当該画分に混入した赤血球を溶血させる。本操作により、分離回収したCTCの観察が良好になる。
[4][3]で得られた溶血処理後のCTCを含む溶液を遠心分離することで血液成分を除去することでCTCをペレット状にした後、適切な溶液を用いてCTCを懸濁させる。
[5][4]で調製したCTCを含む懸濁液を再度遠心分離し、CTCを含むペレットを回収する。なお、必要に応じ、前記回収したペレットを溶液に再度懸濁させ、遠心分離する工程を追加してもよい。
[6][5]で得られたCTCを、図1に示す細胞回収装置100に設けた細胞保持手段10上に展開後、誘電泳動力80により細胞70を保持部60へ保持させる(図3(1))。
[7]接着物質90を細胞回収装置100に導入し、CTCを保持部60に接着する(図3(2))。接着物質90としては、例えばポリ-L-リジンを用いることができ、その濃度は0.01(w/v)%以下とするとよい。
[8]保存処理剤および細胞膜透過処理剤を細胞回収装置100に導入し、CTCの保存および膜透過処理を施す。保存処理剤としては、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒドドナー化合物(加水分解を受けることでホルムアルデヒドを放出可能な化合物)、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類、メタノール、エタノールなどのアルコール類、および重金属を含む溶液が例示できる。細胞膜透過処理剤としては、メタノール、エタノールなどのアルコール類や、サポニンなどの界面活性剤が例示できる。
[9]抗体による非特異的な反応を防ぐため、保存および膜透過処理後の標的細胞を保持した保持部に対してタンパク質によるブロッキング処理を施す。
[10]ブロッキング処理した後、白血球が発現するタンパク質(白血球マーカー)、上皮系細胞が発現するタンパク質(上皮系マーカー)、もしくはがん細胞が発現するタンパク質(がん細胞由来マーカー)に対する蛍光標識抗体、または細胞核を蛍光染色させる試薬を用いて細胞を標識し(図3(3))、洗浄後、蛍光顕微鏡200などで細胞の蛍光像および明視野像を観察する(図3(4))。白血球が発現するタンパク質に対する抗体としては、抗CD45抗体を用いることができる。また、上皮系細胞が発現するタンパク質に対する抗体としては、抗CK抗体や抗EpCAM抗体などを用いることができる。細胞核を蛍光染色させる試薬としては、4’,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)やHoechst 33342(商品名)などを用いることができる。
[11]観察した蛍光像および明視野像を基に標的細胞(CTC)71を検出する(図3(4))。CTCの検出は例えば、細胞核が染色されており、抗CD45抗体では標識されず、かつ上皮系細胞が発現するタンパク質に対する抗体(抗CK抗体や抗EpCAM抗体など)またはがん細胞が発現するタンパク質に対する抗体で標識された細胞をCTCとして検出すればよい。また細胞核が染色されており、抗CD45抗体では標識されず、かつ赤血球や白血球と比較して明視野像での細胞の形状が大きい細胞をCTCとして検出してもよい。
[12]蛍光顕微鏡200で検出したCTC71を回収するために、電極基板32をスペーサー20から取り外した後、回収装置300で吸引することでCTC71を回収する(図3(5))。電極基板32を取り外す際は、スペーサー20を剥がさないよう取り外す必要がある。もしスペーサー20が絶縁体12から剥がれると、装置内に保持されている溶液が系外に流れてしまい、CTC71が破壊されるからである。回収装置300によるCTC71の吸引は、前記(11)で検出したCTC71が保持されている保持部60に回収装置300を移動させ、回収装置300により液を吸引することでCTC71を回収する。なお、回収装置300によるCTC71の吸引位置を、CTC71を標本化した保持部60の中心から水平方向に一定距離ずらした位置とすると、CTC71の吸引を容易に行なえるため好ましい。具体的にはCTC71の吸引位置を、保持部60の中心から水平方向に保持部60の直径の0.1倍から2倍の長さ分(ただし隣接する保持部60間の距離の2分の1以下)ずらし、かつ保持部60の高さから垂直方向に保持部60の高さの0.01倍から2倍の高さ分高い位置とすると好ましい。また、回収装置300によるCTC71の吸引操作の前に、CTC71と保持部60との接着性を弱める酵素を含む溶液を添加する操作を行なってもよい。
[13]回収装置300による吸引で回収したCTC71を回収チュ-ブ400へ吐出する(図3(6))。回収チュ-ブ400へCTC71が吐出されたかどうかを光学検出器200で検出してもよい。
[14]回収チュ-ブ400に回収されたCTC71中の核酸を抽出し、PCR法により抽出した核酸に含まれる特定ポリヌクレオチドを増幅した後、サンガー法により特定ポリヌクレオチドの塩基配列を決定することで、特定ポリヌクレオチドの塩基置換を検出する。PCR増幅産物の配列解析には、次世代シーケンサーと呼称されるハイスループットな解析が可能な装置を使用してもよい。次世代シーケンサーとしては、例えば、Genome Sequencer FLXシステム(ロシュ・ダイアグノスティックス社)、HiSeq/Genome Analyzer IIx(GAIIx)/ MiSeq(イルミナ社)及びIon PGMシーケンサー(Ion PGM)(Thermo Fisher社)があげられる。
(i)配列番号4の1305番目のアデニンがチミンに置換
(ii)配列番号5の8436番目のアデニンがチミンに置換
(iii)配列番号5の8441番目のチミンがグアニンに置換
(iv)配列番号6の3353番目のグアニンがアデニンに置換
なお本発明の特定タンパク質および特定ポリヌクレオチドは、細胞障害性T細胞が有するT細胞受容体の同定にも利用可能であり、これにより、抗腫瘍効果が向上した遺伝子導入T細胞を作製できる。
(1)インフォームドコンセントを得たステージIVの各がん患者から、血液を採取した。
(2)(1)で採取した血液に、生理食塩水、白血球・血小板結合剤(RosetteSep、StemCell Technologies社製)を添加することで、希釈血液試料を調製した。
(3)調製した希釈血液試料を、密度1.084g/mLの密度勾配溶液に重層し、2000×gで10分間、室温にて遠心後、上清を回収した。
(4)(3)で回収した上清に、0.9%(w/v)塩化アンモニウムと0.1%(w/v)炭酸水素カリウムと含む溶血液で30mLまでメスアップし、300×gで10分間、室温にて遠心分離した。当該操作により上清に混入した赤血球が破壊され、分離回収した細胞の観察が良好になる。
(5)上清を除去後、分離回収した細胞を含むペレットを、300mMマンニトールを含む溶液30mLで再懸濁し、300×gで5分間、室温にて遠心分離後、上清を除去した。再度300mMマンニトールを含む溶液30mLで再懸濁した後、300×gで5分間、室温にて遠心分離し、上清を除去した。当該操作は、血液成分を除去し、標的細胞を濃縮するための操作である。
(6)(5)で上清を除去した細胞を含む懸濁液を図1および2に示す細胞回収装置1000に展開し、交流電圧を3分間印加することで前記装置が有する保持部60に細胞を保持させた。本実施例で用いた細胞回収装置100は、直径30μmで深さ40μmの微細孔からなる微細孔を複数有した絶縁体12と前記絶縁体と下部電極基板の間に設置した遮光性のクロム膜(遮光部材11)とからなる保持部60を、厚さ1mmのスペーサー20と下部電極基板31とで挟んだ構造であり、スペーサー20を上部電極基板31と下部電極基板32とで挟んだ構造である。
(7)(6)の条件で交流電圧を印加しながら、0.01(w/v)%のポリ-L-リジンを含む300mMマンニトール水溶液を導入し、3分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、前記水溶液を吸引除去した。
(8)50%(v/v)エタノールと1%(w/v)ホルムアルデヒドを含む水溶液(以下、細胞膜透過試薬)を導入し、10分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部60に導入した細胞を標本化した。
(9)細胞膜透過試薬を吸引除去し、PBS(Phosphate buffered saline)を導入することで、残留した細胞膜透過試薬を洗浄した。
(10)細胞膜内外のタンパク質と特異的に結合可能な蛍光標識された抗体と、細胞核を標識する蛍光試薬(DAPI:4’,6-DiAmidino-2-PhenylIndole(同仁化学研究所社))を含む水溶液(以下、標識試薬)を導入し、30分間静置した。なお前記標識された抗体として、白血球表面に発現しているCD45に対する抗体(Beckman-Coulter社)と、上皮系細胞の細胞質内で発現しているCK(サイトケラチン)に対する抗体(Miltenyi Biotec社)を用いている。
(11)標識試薬を吸引除去し、PBSを導入することで、残留した標識試薬を除去した。
(12)(11)で標識した細胞を含む細胞回収装置100を蛍光顕微鏡のステージ上に載置した後、複数の保持部60に捕捉した全ての細胞を観察するために保持部60全体の撮像を行なった。これにはコンピューター制御式電動ステージ、電子増倍型冷却CCDカメラ(EMCCD、FLOVEL社製ADT-100)を装備した蛍光顕微鏡(Olympus社製IX71)を用いた。画像取得及び解析ソフトウェアにはLabVIEW(National Instruments社)を用いた。
(13)(12)で撮像した細胞の中から、
細胞核を有していることを示すDAPIで染色されている細胞(DAPI陽性)であり、
白血球で発現しているCD45に対する抗体で染色されていない細胞(CD45陰性)であり、
上皮系の性質を有していることを示すCKに対する抗体で染色されていない細胞(CK陰性)であり、かつ赤血球や白血球と比較して明視野像での細胞の形状が大きい細胞を標的細胞(がん細胞)として計数した。
(14)細胞回収装置100の上部電極基板32を取り外した後、蛍光顕微鏡のステージ上へ載置し、保持部60内に保持された、(13)で計数済の標的細胞を円筒状の細管により吸引し、PCRチューブ内へ標的細胞を吐出した。
(15)標的細胞の遺伝子ホットスポット解析を、当該標的細胞における変異を同定するために実行した。具体的には前記標的細胞から抽出したゲノムDNAを1細胞全ゲノム増幅キット(Silicon Biosystems社製Ampli1)により増幅し、得られたPCR産物をゲル精製し、IonPGMシーケンサーおよびIon AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2キット(いずれもThermo Fisher社)によって50種のがん関連遺伝子における変異を解析した。
実施例1(1)において採血したがん患者からがん原発組織を採取した。
がん原発組織および転移組織の切除検体、あるいはホルマリン固定パラフィン包埋組織検体より、QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen社製品)を用いて抽出したゲノムDNAを、上述のIonPGM(サーモフィッシャー)Ion AmpliSeqTM Cancer Hotspot Panel v2によって50種のがん関連遺伝子変異を解析した。
実施例1(1)において採血したがん患者から白血球を採取した。
患者末梢血よりDNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen社製品)を用いて抽出したゲノムDNAを、上述のIonPGM(サーモフィッシャー)Ion AmpliSeqTM Cancer Hotspot Panel v2によって50種のがん関連遺伝子変異を解析した。
本発明の因子に対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、マウス、ラットなど、その由来となる動物種に制限されない。しかし抗体産生細胞を作製する際の細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。
(1)インフォームドコンセントを得た癌患者から、治療経過に合わせて血液を数回採取した。
(2)(1)で採取した血液を溶血法、比重分離法、磁気ビーズ分離法等の1つ、もしくいずれかの組合せを用いることにより、血液内のCTCを濃縮した。
(3)濃縮後の細胞群を、生理食塩水、(Phosphate-Buffered Saline)、マンニトール等の細胞を等張に調整された糖溶媒に懸濁した。
(4)前記懸濁液をガラススライド、もしくは細胞と同サイズのマイクロウェルが多数配置されたようなマイクロウェルチップに展開した標本を作製した。
(5)ホルムアルデヒドやエタノール等に例示される細胞固定液、膜透過液を導入し、約10分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部に導入した細胞を標本化した。
(6)細胞固定、膜透過液を吸引除去し、PBS(Phosphate buffered saline)を導入することで、残留した細胞固定、膜透過液を洗浄した。
(7)がんの転移形成に関与する因子に結合する蛍光標識された抗体と、細胞核を標識する蛍光試薬(DAPI:4’,6-diamidino-2-phenylindole)を含む水溶液を導入し、30分間静置した。なお、混入した白血球の標識には、白血球表面に発現しているCD45に対する抗体を用いた。
(8)標識液を吸引除去し、PBSを導入することで、残留した標識液を除去した。
(9)標識後の標本(ガラススライド、マイクロウェルチップ)を蛍光顕微鏡のステージ上に載置した後、複数の保持孔に捕捉した全ての細胞を観察するために保持部全体の撮像を行なった。これにはコンピューター制御式電動ステージ、電子増倍型冷却CCDカメラ(EMCCD;FLOVEL,ADT-100)を装備した蛍光顕微鏡(IX71; Olympus)を用いた。画像取得及び解析ソフトウェアにはLabVIEW(National Instruments)を用いた。
(10)(9)で撮像した細胞の中から、
細胞核を有していることを示すDAPIで染色されている細胞(DAPI陽性)であり、
白血球で発現しているCD45に対する抗体で染色されていない細胞(CD45陰性)であり、がん転移形成に関与する因子の対する抗体で染色された標的細胞(DAPI陽性/CD45陰性/がん転移因子陽性細胞)を計数した。
予後予測の閾値は、健常者からの偽陽性数(ベースライン)、CTC数と無増悪生存期間および全生存期間の評価にて決定する。
(1)実施例1で取得した遺伝子変異のうち、SMAD4遺伝子およびPIK3CA遺伝子を選択し、それぞれ野生型(SMAD4遺伝子:配列番号4、PIK3CA遺伝子:配列番号6)と変異型(SMAD4遺伝子:配列番号11、PIK3CA遺伝子:配列番号14)のcDNAをそれぞれ合成した。合成したcDNAはシーケンスにより配列を確認した。なおこれらの操作はユニーテック社に委託した。
(2)レトロウイルスベクターの骨格としてpMXs-Neoベクターを用い、(1)で合成したcDNAをそれぞれ挿入したベクターを作製した。また、pMX-Neoを基に、Neo(ネオマイシン)遺伝子を緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子に置換した空ベクターを作製した。作製したベクターは、0.8%(w/v)アガロースゲル電気泳動により前記配列が挿入されていることを確認した。また、シーケンスにより挿入した配列を確認した。なおこれらの操作はユニーテック社に委託した。
(3)Retrovirus Packaging Kit Ampho(タカラバイオ社)を用い、(2)で作製したベクターをそれぞれパッケージング細胞である293T細胞に形質導入し、48時間培養後に採取した培養液上清をフィルターろ過することにより、各種レトロウイルス液を得た。
(4)ヒト大腸がん細胞株WiDRに対しレトロウイルス感染を行ない、前記遺伝子をそれぞれ形質導入した。レトロウイルス感染は、WiDR細胞を6ウェルプレートに播種し、24時間後に(3)で取得したレトロウイルス液をそれぞれ2倍希釈となるようウェルに加え、そのまま48時間培養することにより行なった。前記方法により、5種の遺伝子導入WiDR細胞(野生型PIK3CA遺伝子導入WiDR細胞、変異型PIK3CA遺伝子導入WiDR細胞、野生型SMAD4遺伝子導入WiDR細胞、変異型SMAD4遺伝子導入WiDR細胞およびEGFP遺伝子(空ベクター)導入WiDR細胞)を取得した。
実施例4で取得した5種の遺伝子導入WiDR細胞と、ネガティブコントロールとして遺伝子導入未実施のWiDR細胞をそれぞれ接着細胞培養用24ウェルプレートに播種し、96時間培養後、正立顕微鏡(Olympus社製IX71)を用いて細胞形態を観察した。
10:細胞保持手段
11:遮光部材
12:絶縁体
11a・12a:貫通孔
20:スペーサー
21:導入口
22:排出口
23:貫通部
31・32:電極基板
40:導線
50:信号発生器
60:保持部
70:細胞
71:標的細胞(CTC)
80:誘電泳動力
90:接着物質
200:蛍光顕微鏡
300:回収装置
400:回収チューブ
Claims (10)
- 血液試料において、血中循環がん細胞由来のタンパク質のアミノ酸置換を検出する工程を含む、がん患者における予後を予測するための方法であって、
前記アミノ酸置換が、以下の(1)から(4)のうち少なくともいずれか1つの置換である、前記方法。
(1)配列番号1の256番目のグルタミンがロイシンに置換
(2)配列番号2の2684番目のグルタミンがロイシンに置換
(3)配列番号2の2686番目のフェニルアラニンがバリンに置換
(4)配列番号3の1066番目のアラニンがスレオニンに置換 - 前記血液試料からがん細胞を回収する工程をさらに含み、前記検出工程が、がん細胞が発現するタンパク質のアミノ酸置換を検出する、請求項1に記載の方法。
- 血液試料からがん細胞を回収する工程を、血液試料中に含まれるがん細胞を保持可能な保持部を複数設けた細胞保持手段と誘電泳動力を発生させる手段とを備えた細胞回収装置を用いて行なう、請求項2に記載の方法。
- 血液試料において、血中循環がん細胞由来のポリヌクレオチドの塩基置換を検出する工程を含む、がん患者における予後を予測するための方法であって、
前記塩基置換が、以下の(I)から(IV)のうち少なくともいずれか1つの置換である、前記方法。
(I)配列番号1の256番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換
(II)配列番号2の2684番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換
(III)配列番号2の2686番目のフェニルアラニンに対応するコドンがバリンに対応するコドンに置換
(IV)配列番号3の1066番目のアラニンに対応するコドンがスレオニンに対応するコドンに置換 - 血液試料において、血中循環がん細胞由来のポリヌクレオチドの塩基置換を検出する工程を含む、がん患者における予後を予測するための方法であって、
前記塩基置換が、以下の(i)から(iv)のうち少なくともいずれか1つの置換である、前記方法。
(i)配列番号4の1305番目のアデニンがチミンに置換
(ii)配列番号5の8436番目のアデニンがチミンに置換
(iii)配列番号5の8441番目のチミンがグアニンに置換
(iv)配列番号6の3353番目のグアニンがアデニンに置換 - 前記血液試料からがん細胞を回収する工程をさらに含み、前記検出工程が、がん細胞においてポリヌクレオチドの塩基置換を検出する、請求項4又は5に記載の方法。
- 血液試料からがん細胞を回収する工程を、血液試料中に含まれるがん細胞を保持可能な保持部を複数設けた細胞保持手段と誘電泳動力を発生させる手段とを備えた細胞回収装置を用いて行なう、請求項6に記載の方法。
- 請求項1~3のいずれか1項に記載の方法に用いるための抗体、またはそのフラグメントであって、以下の(1)から(4)のいずれかのポリペプチドからなる、がんの転移形成能に関与するタンパク質を特異的に認識する抗体、またはそのフラグメント。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号1の256番目のグルタミンがロイシンに置換した前記ポリペプチド
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号2の2684番目のグルタミンがロイシンに置換した前記ポリペプチド
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号2の2686番目のフェニルアラニンがバリンに置換した前記ポリペプチド
(4)配列番号3に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号3の1066番目のアラニンがスレオニンに置換した前記ポリペプチド - 前記置換を有さないタンパク質を認識しない、請求項8に記載の抗体、またはそのフラグメント。
- 請求項4~7のいずれか1項に記載の方法に用いるためのプローブであって、配列番号4~6のいずれか1つの塩基配列において、以下の(i)から(iv)のうち少なくともいずれか1つの置換を有する、塩基配列の遺伝子の存在を測定するためのプローブ。
(i)配列番号4の1305番目のアデニンがチミンに置換
(ii)配列番号5の8436番目のアデニンがチミンに置換
(iii)配列番号5の8441番目のチミンがグアニンに置換
(iv)配列番号6の3353番目のグアニンがアデニンに置換
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