JP4663979B2 - 粒子の接着性を防止するための方法 - Google Patents
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Description
−=粘着なし
(9)=非常に低い粘着性
9=顕著な粘着性
99=強い粘着性
999=非常に強い粘着性
OK=定量化はないが、比較対照との相違は識別できない。
溶液のpH値に対するポリビニルアルコールの影響
PBS中のポリビニルアルコールの1%の溶液のpH値を測定し、そして7.31である(生理学的なpH範囲はpH7.2〜7.4である)。
他の添加物との比較での細胞接着性に対するポリビニルアルコールの影響
溶液:
Jurkat細胞(英国、ソールズベリー(Salisbury)の動物細胞培養のヨーロッパ保存機関(European Collection of Animal Cell Cultures)のクローンE6.1)とU937−細胞(英国、ソールズベリーの動物細胞培養のヨーロッパ保存機関の単球細胞系)をRPMI 1640培地(カールスルーエ(Karlsruhe)のGIBCOライフテクノロジーズ社(GIBCO Life Technologies)でペニシリンおよびストレプトマイシン(ベルリン(Berlin)のセロムド/バイオクロム社(Seromed/Biochrom)と10%の胎児の子牛の血清(ベルリンのセロムド/バイオクロム社)の各100IU/mlの添加下に培養した。この細胞懸濁液3mlごとに遠心分離し、そしてカルシウムおよびマグネシウム不含のリン酸緩衝生理食塩水(PBS、ベルリンのセロムド/バイオクロム社)300μl中に取った。24ウェル型プレートのウェル(24ウェル型のポリスチレン培養皿、コーニング・コ−スター社(Corning Co−star)を後記の物質の表1に記載の濃度の添加下にPBS各500μlで満たした。メチルセルロース(2%溶液の15センチポアズおよび4000センチポアズの粘度、シュタインハイム(Steinheim)のシグマ・アルドリッヒ社(SIGMA Aldrich GmbH)、フィコール(Ficoll)70およびフィコール400(スウェーデン、ウプサラ(Uppsala)のファルマシア社(Pharmacia)、デキストランT10(スウェーデン、ウプサラのファルマシア社)、ポリビニルピロリドン15および25(セルバ社(Serva)、ポリエチレングリコール5000(フルカ社(Fluka)ならびにポリビニルアルコール30000〜70000(シュタインハイムのシグマ・アルドリッヒ社)を試験した。上記の細胞懸濁液50μlを添加した。比較対照として細胞培地500μl(この培地ではこれらの懸濁細胞は粘着しない)中の試料を使用した。
上記試料を37℃で30分間インキュベーションした。接着していない細胞を含む上澄みを取り、そして緩衝液によって置き換えた。粘着性を定性的に評価した(表1参照)。上澄みならウェル中の細胞を、細胞の活力度を検査するためにトリパンブルー溶液(0.2%、シュタインハイムのシグマ・アルドリッヒ社社)で染色した。ポリビニルアルコールのみが両方の細胞系において細胞粘着性に対する著しく顕著な抑制効果を有する。この効果は0.1%(w/v)の濃度ですでに現れる。
接着防止効果が与えられている多くの物質をポリビニルアルコールと比較して試験した。例えば、非特異的な結合を阻止するためにフローサイトメトリーで知られておりかつ免疫活性の検出(例えばウェスタンブロット法)で使用される牛の血清アルブミン(BSA)。さらに、血液試料の密度勾配遠心分離でかあるいは細胞培養技術で使用される種々の親水性重合体を検査した。カルシウムおよびマグネシウム不含の緩衝液中のカドヘリンおよびインテグリン、特異的な細胞−細胞−および細胞−支持体−接着性分子、の影響さえ検査した。これらの分子は相互作用のためにカルシウムを必要とする。ポリビニルアルコールが試料担体への懸濁された細胞の接着性を防止する効果において成果を上げて他の物質を顕著に凌駕することが明らかにされた。
生きている哺乳動物の細胞に関してのポリビニルアルコールの毒性の検査
実施:
マイクロリットル注射器からの細胞の回収への0.5%(w/v)のPVAの使用を検査した。Jurkat細胞を1mlあたり5.69×105個の細胞の濃度で、0.5%PVA(w/v)を含むPBS中に懸濁した。この懸濁液5μlを5μlの注射器(ダイナテック社(Dynatech))中に吸収した。1μlごとに直ちにかつ1分ないしは5分後にテラサキプレート(Terasaki−Platte)(ウィースバーデン(Wiesbaden)のナンク社(NUNC))のウェルの中に移した。細胞を該プレート中でライブ/デッド・ステイン・キット(Live/Dead Stain Kit)(オランダ、ライデン(Leiden)のモレキュラー・プローブ社(Molecular Probes))で染色しかつ計数し;その際、同時にそれらの活力度を検査した。回収率を測定した。
細胞の90%より多くを−5分後でも−注射器から回収することができた。従って該細胞は付着していなかった。死んだ細胞のパーセンテージは初め、即ち0分で0.8%であり、そして5分後に2.4%に増加しただけだった。
ポリビニルアルコールを含む細胞緩衝液を使用した微量分析システムでの細胞の検査
材料:
微細流路における懸濁された細胞を使用した作業へのポリビニルアルコールの使用をサイトコン(登録商標)300装置システムを用いて検査した。サイトコン(登録商標)チップはガラスから成り、かつ高さ40μm、幅200〜600μmおよび長さ約1〜2cmの流路を有し、その際、チップの特別な実施形態は流路中に電極を有していてもよい。サイトコン(登録商標)ソーターチップは、例えば、懸濁された粒子(特に細胞)のソーティングのために微細流路中の誘電分岐器としての電極を有し、サイトコン(登録商標)ポレーターチップの場合には電極は、細胞融合および/または細胞穿孔法を実施することができるように配置されており、そして、閉じられた微細流路内の2つの電極平面、流路交差点での誘電フィールドケージならびに誘電分岐器として形成された電極を含むサイトコン(登録商標)ローダーチップの場合には、ストップフロー分析の実施ならびに分析された粒子の後続のソーティングに適当である。
細胞を緩衝液中に懸濁し、そしてサイトコン(登録商標)チップに注入した。懸濁液を流路システム内である一定の流速(「試料」)で送り、そしてチップ出口においてシース流れで加速した。洗い落とされた細胞を数え、そして回収率を初期濃度と注入された試料量から計算した。
使用する細胞量がたった数百の細胞であり、かつ微細流路での流速が非常に遅かったにもかかわらず(微細流路中の細胞の滞留時間約2分間)、細胞の回収率は非常に高く(表2)、そして約100%の値を達成可能であった。
血球の分画(赤血球からのリンパ球の分離)
実施:
ヒトの全血とJurkat−Tリンパ腫細胞とPVA含有の緩衝液の混合がつくった。この緩衝液はPBS20%(v/v)、0.3モルのイノシトール溶液80%(v/v)とPVA(30000〜70000、シグマ社(Sigma))0.5%(w/v)を含んでいた。よく見えるように実験の間、Jurkat細胞を10μモルのカルセイン−AM(登録商標)(Calcein−AM)(モレキュラー・プローブ社)で標識化した。
上記細胞試料をJurkat細胞2.5×106個/mlおよび赤血球1.8×107個/mlの濃度で混合した。該試料0.3μlをサイトコン(登録商標)チップ(微量分析システム)に注入した。
画分1でのJurkat細胞に対する濃縮係数は一実験例の場合で17.5である。この画分でのJurkat細胞の収率は、この場合93%であった(表3)。
Claims (14)
- 微量分析システム又は合成微粒子の表面への、溶液中の細胞および細胞成分を含む粒子の接着性を防止するための方法において、前記粒子が、少なくとも1つのポリビニルアルコールを含有する溶液中に提供されることを特徴とする、粒子の接着性を防止するための方法。
- 前記溶液中のポリビニルアルコールの濃度が0.01%(w/v)〜5%(w/v)であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記ポリビニルアルコールが水溶性であることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞および/または原核細胞であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞成分がリポソーム、脂質膜、脂質、タンパク質、DNA、核酸、伝達物質、糖、グリカンおよび/または糖タンパク質であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面が細胞、細胞膜、細胞成分、被覆されていないかもしくは生体分子で被覆された、ケイ素、シリコーン、有機重合体および/またはガラスから成る表面であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生体分子が脂質膜、脂質、タンパク質(殊に免疫抗体)、DNA、核酸、伝達物質、ビオチン、糖、グリカンおよび/または糖タンパク質であることを特徴とする、請求項6記載の方法。
- 前記有機重合体がPMMA、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、テフロン(登録商標)、ポリアクリル、ナイロン(登録商標)および/またはペルロン(登録商標)であることを特徴とする、請求項6または7記載の方法。
- 前記表面が微量分析システムの流路表面を含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面が合成微粒子の表面を含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- −緩衝食塩水、
−イノシトール、
−ポリビニルアルコール
を含有する溶液の使用において、前記ポリビニルアルコールの含量が0.1%(w/v)〜1.1%(w/v)であり、
微量分析システムまたは合成微粒子の表面への、粒子の接着を防止するための使用。 - 前記緩衝食塩水がPBSであることを特徴とする、請求項11記載の溶液の使用。
- 前記緩衝食塩水および/またはイノシトールの含量が可変的であることを特徴とする、請求項11または12記載の使用。
- 前記ポリビニルアルコールの含量が0.3%(w/v)〜0.6%(w/v)であることを特徴とする、請求項11〜13のいずれか1項に記載の使用。
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