JP2011024575A - 細胞の分離方法 - Google Patents
細胞の分離方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011024575A JP2011024575A JP2010148954A JP2010148954A JP2011024575A JP 2011024575 A JP2011024575 A JP 2011024575A JP 2010148954 A JP2010148954 A JP 2010148954A JP 2010148954 A JP2010148954 A JP 2010148954A JP 2011024575 A JP2011024575 A JP 2011024575A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- blood
- cell
- cells
- derived protein
- pbmc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 101
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 166
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 162
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 68
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 claims abstract description 50
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 89
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 89
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 78
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 42
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 24
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 19
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 19
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 14
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 14
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 6
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 6
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NTHXOOBQLCIOLC-UHFFFAOYSA-N iohexol Chemical compound OCC(O)CN(C(=O)C)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NTHXOOBQLCIOLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- -1 umbilical cord blood Substances 0.000 claims description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 3
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N Metrizamide Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(=O)N[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)OC2O)O)=C1I BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N 0.000 claims description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- YVPYQUNUQOZFHG-UHFFFAOYSA-N amidotrizoic acid Chemical compound CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(O)=O)=C1I YVPYQUNUQOZFHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 239000008119 colloidal silica Substances 0.000 claims description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 3
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 claims description 3
- 229960005223 diatrizoic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 claims description 3
- 229960001025 iohexol Drugs 0.000 claims description 3
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000554 metrizamide Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 3
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 7
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 212
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 145
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 62
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 59
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 55
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 45
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 44
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 20
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 20
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 20
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 18
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 17
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- UIQMVEYFGZJHCZ-SSTWWWIQSA-N Nalorphine Chemical compound C([C@@H](N(CC1)CC=C)[C@@H]2C=C[C@@H]3O)C4=CC=C(O)C5=C4[C@@]21[C@H]3O5 UIQMVEYFGZJHCZ-SSTWWWIQSA-N 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 6
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 5
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 229940080237 sodium caseinate Drugs 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 102100035248 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- 101001022185 Homo sapiens Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229940097706 buminate Drugs 0.000 description 2
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010045362 Serum Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000005686 Serum Globulins Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108700025316 aldesleukin Proteins 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940021013 electrolyte solution Drugs 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940087463 proleukin Drugs 0.000 description 1
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】密度勾配遠心法による細胞の分離方法において、細胞含有液と血液由来タンパク質、乳タンパク質又は血液由来タンパク質もしくは乳タンパク質のいずれかを含有する溶液とで細胞液を調製する工程、得られた細胞液を密度勾配形成用媒体の上に重層する工程、及び密度勾配遠心分離を行い、分離された細胞を回収する工程を有することを特徴とする細胞の分離方法。また、血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する溶液を用いて細胞を保存する方法も本発明に含まれる。本発明により、血液から必要とする細胞を高効率で分離できる事から、採血時に血液量は少なくてよく、自己の細胞を用いる治療において、患者の負担を軽減することが可能となる。また本発明の方法は基礎研究、医療への応用研究において極めて有用である。
【選択図】なし
Description
1)細胞含有液と血液由来タンパク質、乳タンパク質、又は血液由来タンパク質もしくは乳タンパク質のいずれかを含有する溶液とで細胞液を調製する工程、
2)工程1)で得られた細胞液を密度勾配形成用媒体の上に重層する工程、及び
3)密度勾配遠心分離を行い、分離された細胞を回収する工程、
を包含することを特徴とする。前記方法は、更に、
4)工程3)で回収した細胞を洗浄する工程、及び
5)工程4)で洗浄した細胞を保存する工程
を包含してもよい。
第1の発明の態様としては、血液由来タンパク質が血漿由来タンパク質又は血清由来タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミンである方法が提供される。また、乳タンパク質がカゼインである方法が提供される。更に、血液由来タンパク質含有する溶液が、血漿、血清又はそれらの希釈物である方法が提供される。更に、上記工程4)において、血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する溶液を用いて回収した細胞を洗浄、及び工程5)において、血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する溶液を用いて細胞を保存する方法が提供される。
第1の発明の細胞含有液としては、血液、希釈血液、骨髄液、臍帯血及び成分採血液からなる群より選択される試料が挙げられ、また、血液、希釈血液、骨髄液、臍帯血及び成分採血液からなる群より選択される試料から事前に分離された細胞を含む画分が挙げられる。更に、第1の発明の密度勾配形成用媒体としては、ショ糖、グリセロール、デキストラン、メトリザミド、イオディキサノール、ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合体、ポリビニルピロリドンの被膜をもつコロイド状シリカ粒子、スクロースポリマー、ジアトリゾ酸、イオヘキソール及びニコデンツからなる群より選択される媒体が挙げられる。
1)密度勾配形成用媒体、及び
2)血液由来タンパク質及び/又は乳タンパク質、
を含有することを特徴とする。
工程1)では、得られた画分、すなわちBuffy coat層と、血液由来タンパク質を含有する溶液、例えばヒト血清アルブミンを含む溶液とを混合することで細胞液を調製する。あるいは乳タンパク質を含有する溶液、例えばカゼインを含む溶液と混合し細胞液を調製してもよい。当該溶液は、血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含む以外は常法で用いられるもの、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液、細胞培養用培地、無血清培地等が使用できるのは当然のことである。血液由来タンパク質を含有する溶液として、血漿、血清又はそれらの希釈液も使用することができる。例えば、前記の遠心分離操作で得ることができる血漿もしくはその希釈液、血液又はその希釈液に抗凝固成分を加えずに凝固させた後に回収した上澄み液(血清)もしくはその希釈液を血液由来タンパク質を含有する溶液として使用してもよい。好ましくは、血漿、血清は非働化処理を行った後に使用される。これら血漿又は血清は、市販されている血漿(製品名:正常ヒト血漿、コージンバイオ社製)又は血清(製品名:Human serum,AB、Lonza社製)等を使用いてもよい。また、特に細胞と同じドナー由来の血漿又は血清の使用は、安全性の観点から特に好適である。
(1)PBMCの分離
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより、60mL分のへパリン加採血を実施した。得られた血液を約15mLずつコニカルチューブ(ベクトン・ディッキンソン社製又はグライナ―社製)に分注後、700×g、室温で20分間遠心し、遠心後の上清である血漿画分とPBMCを含む細胞画分とに分離した。PBMCを含む細胞画分は、ダルベッコPBS(以下、DPBSと記載する。インビトロジェン社製又はニッスイ社製)、0.96%(W/V)HSAを含む生理食塩水(以下、0.96%HSA/生理食塩水と記載する)、RPMI1640(インビトロジェン社製又は和光純薬社製)、又は生理食塩水(テルモ社製)を用いて、それぞれ20mLにフィルアップし希釈した。得られた希釈細胞液を、Ficoll−Paque PREMIUM(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)20mLの上にそれぞれ重層して、700×g、室温で20分間遠心した。遠心後、分離した層のうち、PBMC層をピペットで回収し、RPMI1640、0.96%HSA/生理食塩水又はリンパ球培養用培地GT−T551(タカラバイオ社製)をそれぞれ用いて30mLにフィルアップした後、650×g、4℃にて10分間遠心し、上清を除去した。同様に、600×g、500×gと段階的に遠心力を落としながら順次遠心操作を行い、計3回洗浄を繰り返した。得られたPBMCの生細胞数及び生存率(%)を自動血球計測装置(ヌクレオカウンター Chemometec社製)を用いて算出し、以下の式に準じて細胞回収率(%)を算出した。Ficoll重層時の希釈溶媒と洗浄時の溶媒との関係と得られた結果を表1に示す。表中、ドナー1及び2は異なるドナーの血液を用いて比較を行った結果である。
式:細胞回収率(%)=各条件で分離した際の回収PBMC細胞数/基本法※で分離した際の回収PBMC細胞数×100(※基本法とは、Ficoll重層時の希釈溶媒としてDPBSを、洗浄時の溶媒としてRPMI1640を使用する方法を示す。)
実施例1−(1)で基本法により分離して得られたPBMC又は0.96%HSA/生理食塩水を用いて分離して得られたPBMCを、1%(W/V)ウシ血清アルブミン(BSA、シグマ社製)を含むDPBS(以下1%BSA/DPBSと記載する)で洗浄した。その後、それぞれのPBMCを1%BSA/DPBSに細胞を懸濁し、FITC標識マウス抗ヒトCD8抗体/RD1標識マウス抗ヒトCD4抗体/PC5標識マウス抗ヒトCD3抗体(ベックマンコールター社製)、あるいはFITC標識マウス抗ヒトCD3抗体(ベックマンコールター社製)及びRD1標識マウス抗ヒトCD56抗体(ベックマンコールター社製)を添加した。ネガティブコントロールとしてFITC標識マウスIgG1抗体/RD1標識マウスIgG1抗体/PC5標識マウスIgG1抗体(ベックマンコールター社製)を添加した。氷上で30分間インキュベートした後、ACK Lysing Bufferを添加し、残存赤血球を溶血した。次に、0.1%(W/V)BSAを含むDPBSで細胞を洗浄し、再度DPBSに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリー(Cytomics FC500:ベックマンコールター社製)に供し、各々の細胞集団について、CD3陽性細胞、CD4陽性細胞、CD8陽性細胞、CD3陰性CD56陽性細胞の含有率を算出した。ここで含有率(%)は、全細胞数に占める陽性細胞数の占める割合を示す。結果を表2に示す。表中、ドナー1及び2は異なるドナーのPBMCを用いて比較を行った結果である。
(1)PBMCの分離
実施例1−(1)と同様の方法でインフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からPBMCを分離した。ただし、血漿分離後のPBMCを含む細胞画分は、DPBS、0.96%HSA/生理食塩水、生理食塩水又はソルデム3A(ブドウ糖、電解質液を含有する維持液、テルモ社製)を用いてそれぞれ別々に希釈を行った。中間層のPBMCの回収後の洗浄は、RPMI1640、0.96%HSA/生理食塩水、生理食塩水又はソルデム3Aをそれぞれ用いて3回行った。Ficoll重層時の希釈溶媒と洗浄時の溶媒との関係と、得られた結果を表3に示す。表中、Exp.A及びBは同一ドナーの血液を用いた実施時期の異なる実験の結果を示す。
(1)PBMCの分離回収
実施例1−(1)と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からPBMCを分離した。その結果を表4に示す。
実施例3−(1)で得られたPBMCを実施例1−(2)と同様の方法で細胞集団の解析を行った。ただし、実施例1−(2)で使用した抗体に加え、FITC標識マウス抗ヒトCD19抗体(ベクトン・ディッキンソン社製)、FITC標識マウス抗ヒトCD14抗体(ベクトン・ディッキンソン社製)、FITC標識マウス抗ヒトCD15抗体(ベクトン・ディッキンソン社製)も使用した。その結果を表5に示す。すなわち表5は、各々の細胞集団について、CD3陽性細胞、CD4陽性細胞、CD8陽性細胞、CD3陰性CD56陽性細胞、CD19陽性細胞、CD14陽性細胞及びCD15陽性細胞の含有率を算出した結果である。
実施例3−(1)で得られたPBMCを用いて、T細胞の拡大培養をおこなった。
抗CD3抗体OKT3(終濃度5μg/mL、ヤンセンファーマ社製)及びレトロネクチン(終濃度25μg/mL、登録商標、タカラバイオ社製)を含むACD−A液(テルモ社製)を培養面積86cm2にしたガス透過性培養バッグCultiLife(登録商標)215(タカラバイオ社製)に10.4mL/バッグずつ添加し、CO2濃度が5%(以下、5%CO2と記載する)中、37℃で5時間インキュベートした。更に、上記のバッグは使用前にRPMI1640で3回洗浄した後、OKT3及びレトロネクチン固定化CultiLife215として実験に供した。
(1)PBMCの分離回収
実施例1−(1)と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からPBMCを分離した。ただし、血漿分離後のPBMCを含む細胞画分は、DPBS、0.1%(V/W)HSAを含む生理食塩水又は0.3%(V/W)HSAを含む生理食塩水(以下、0.1%HSA/生理食塩水、0.3%HSA/生理食塩水とそれぞれ記載する)、0.96%HSA/生理食塩水を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のPBMCの回収後の洗浄は、それぞれRPMI1640、0.1%HSA/生理食塩水、0.3%HSA/生理食塩水、0.96%HSA/生理食塩水を用いて3回行った。その結果を表7に示す。表中、ドナー3及び4は異なるドナーの血液を用いて比較を行った結果である。
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより、成分採血を実施した。ここでいう成分採血とは、単核球採取を目的とした採血である。得られた成分採血液をDPBS又は0.96%HSA/生理食塩水で希釈後、Ficoll−paque PREMIUM上に重層して700×gで20分間遠心した。中間層のPBMCをピペットで回収後、それぞれRPMI1640又は0.96%HSA/生理食塩水を用いて3回洗浄した。その結果を表8に示す。表中、ドナー5及び6は異なるドナーの成分採血液を用いて比較を行った結果である。
(1)PBMCの分離回収
実施例1−(1)と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からPBMCを分離した。ただし、血漿分離後のPBMCを含む細胞画分は、DPBS、0.96%HSA/生理食塩水又は4.2%(W/V)HSAを含む生理食塩水(以下、4.2%HSA/生理食塩水と記載する)を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のPBMCの回収後の洗浄は、それぞれRPMI1640、0.96%HSA/生理食塩水、4.2%HSA/生理食塩水を用いて3回行った。その結果を表9に示す。
(1)PBMCの分離回収
実施例1−(1)と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からPBMCを分離した。ただし、血漿分離後のPBMCを含む細胞画分は、DPBS、又は1%(W/V)BSAを含む生理食塩水(以下、1%BSA/生理食塩水と記載する)を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のPBMCの回収後の洗浄は、それぞれRPMI1640、1%BSA/生理食塩水を用いて3回行った。その結果を表10に示す。
(1)PBMCの分離回収
実施例1−(1)と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からPBMCを分離した。ただし、血漿分離後のPBMCを含む細胞画分は、DPBS、5%(W/V)HSAを含む生理食塩水(以下5%HSA/生理食塩水と記載する)及びFicoll−Paque PREMIUMの添付資料に血液分離時の推奨バッファーとして記載されているBlanced solt solution(以下、推奨バッファーと記載する)を用いてそれぞれ別々に希釈した。推奨バッファーは、1gのD−グルコース(ナカライテスク社製)、0.0074gの塩化カルシウム2水和物(ナカライテスク社製)、0.1992gの塩化マグネシウム6水和物(ナカライテスク社製)、0.4026gの塩化カリウム(ナカライテスク社製)、17.565gのTris(ナカライテスク社製)を蒸留水(大塚製薬社製)で溶解し、5N塩酸(和光純薬社製)でpH7.6に調製後、蒸留水で1Lにメスアップしてからフィルターユニット(旭テクノグラス社製)で滅菌したバッファーAと、8.19gの塩化ナトリウム(ナカライテスク社製)を蒸留水で1Lにメスアップしてからオートクレーブ滅菌したバッファーBとを1:9の割合で混合して調製した。中間層のPBMCの回収後の洗浄は、それぞれRPMI1640、5%HSA/生理食塩水及び推奨バッファーを用いて3回行った。その結果を表11に示す。
実施例8−(1)で得られたPBMCを実施例2−(2)と同様の方法で細胞集団の解析を行った。ただし、ACK Lysing Bufferで残存赤血球の溶血処理は行わなかった。その結果を表12に示す。
(1)PBMCの分離回収
実施例1−(1)と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からPBMCを分離した。ただし、血漿分離後のPBMCを含む細胞画分は、DPBS、1%のカゼインナトリウム(和光純薬社製)を含む生理食塩水(以下、1%カゼインNa/生理食塩水と記載する)及び0.2%のカゼインナトリウムを含む生理食塩水(以下、0.2%カゼインNa/生理食塩水と記載する)を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のPBMCの回収後の洗浄は、それぞれRPMI1640、1%カゼインNa/生理食塩水及び0.2%カゼインNa/生理食塩水を用いて3回行った。その結果を表13に示す。
実施例9−(1)で得られたPBMCを実施例2−(2)と同様の方法で細胞集団の解析を行った。ただし、ACK Lysing Bufferで残存赤血球の溶血処理を行わなかった。その結果を表14に示す。
実施例9−(1)で得られたドナー8のPBMCをRPMI1640に懸濁後、CP−1(極東製薬工業社製)と25%HSA(製剤名ブミネート、バクスター社製)を17:8の割合で混合した保存液を等量加えて液体窒素中にて保存した。使用時には、これら保存PBMCを37℃水浴中にて急速融解し、10μg/mLのDNase(カルビオケム社製)を含むGT−T551(タカラバイオ社製)で洗浄後、各実験に供した。
実施例9−(3)で得られたドナー8のPBMCを用いて、T細胞の拡大培養を行った。
OKT3(終濃度0.3μg/mL)を含むDPBSを培養面積3.8cm2の12ウエルプレート(コーニング社製)に0.45mL/ウエルずつ添加し、5%CO2中37℃で5時間インキュベートした。また、上記の12ウエルプレートは使用前に培養器材から当該DPBSを吸引除去後、各ウエルをDPBSで2回、RPMI1640で1回洗浄し各実験に供した。
実施例1−(1)と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からPBMCを分離した。ただし、密度勾配形成用媒体としてFicoll−Paque PREMIUM、及びNycoPrep 1.077(AXIS−SHIELD社製)を用いた。また、血漿分離後のPBMCを含む細胞画分は、DPBS、5%HSA/生理食塩水を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のPBMCの回収後の洗浄は、分離剤ごとにそれぞれRPMI1640、5%HSA/生理食塩水を用いて3回行った。その結果を表16に示す。
(1)PBMCの分離回収
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより、成分採血を実施した。得られた成分採血液を0.96%又は5%HSA/生理食塩水で希釈後、Ficoll−paque PREMIUM上に重層して700×gで20分間遠心した。中間層のPBMCをピペットで回収後、それぞれ0.96%又は5%HSA/生理食塩水を用いて3回洗浄した。結果を表17に示す。
(1)PBMCの分離回収
実施例1−(1)と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からPBMCを分離した。ただし、血漿分離後のPBMCを含む細胞画分は、DPBS、0.96%HSA(製剤名ブミネート、バクスター社製)/生理食塩水又は0.96%HSA(製剤名アルブミナー、CSLベーリング社製)/生理食塩水を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のPBMCの回収後の洗浄は、表18記載の洗浄時溶媒を用いて3回行った。その結果を表18に示す。
(1)PBMCの分離回収
実施例1−(1)と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からPBMCを分離した。ただし、密度勾配形成用媒体としてFicoll−Paque PREMIUMとHistopaque 1.077(シグマ社製)を用いた。また、血漿分離後のPBMCを含む細胞画分は、DPBS、5%HSA/生理食塩水を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のPBMCの回収後の洗浄は、分離剤ごとにそれぞれRPMI1640、5%HSA/生理食塩水を用いて3回行った。その結果を表19に示す。
(1)PBMCの分離回収と保存
実施例1−(1)と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からPBMCを分離した。ただし、血漿分離後のPBMCを含む細胞画分は、0.96%HSA/生理食塩水を用いて25mLにフィルアップし希釈し、中間層のPBMCの回収後の洗浄は、0.96%HSA/生理食塩水を用いて3回行った。この際、遠心はすべて室温で行った。得られたPBMCを3本のコニカルチューブに分注し、500×g、室温で5分間遠心し、上清を除去した。各コニカルチューブについて、細胞濃度が1×107cells/mLとなるように2.5%HSA/生理食塩水、CPS−1(細胞科学研究所社製)、2.5%HSA/CPS−1に懸濁し、4℃暗所で保存した。各溶媒で保存当日、1日後、2日後の細胞濃度及び生存率を表20に示す。
実施例14−(1)で保存したPBMCを実施例1−(2)と同様の方法で細胞集団の解析を行った。ただし、FITC標識マウス抗ヒトCD3抗体、あるいはECD標識マウス抗ヒトCD4抗体及びPC5標識マウス抗ヒトCD8抗体を使用し、ネガティブコントロールとしてFITC標識マウスIgG1抗体/RD1標識マウスIgG1抗体/PC5標識マウスIgG1抗体及びECD標識マウスIgG1抗体を使用した。結果を表21に示す。
(1)PBMCの分離回収
実施例1−(1)と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からPBMCを分離した。ただし、血漿分離後のPBMCを含む細胞画分は、DPBS、1%カゼインNa/生理食塩水及び1%HSA/生理食塩水を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のPBMCの回収後の洗浄は、それぞれRPMI1640、1%カゼインNa/生理食塩水又は1%HSA/生理食塩水を用いて行った。このとき、各洗浄溶媒を用いて45mLにフィルアップし、遠心は全て室温で行った。結果を表22に示す。
Claims (18)
- 1)細胞含有液と血液由来タンパク質、乳タンパク質、又は血液由来タンパク質もしくは乳タンパク質のいずれかを含有する溶液とで細胞液を調製する工程、
2)工程1)で得られた細胞液を密度勾配形成用媒体の上に重層する工程、及び
3)密度勾配遠心分離を行い、分離された細胞を回収する工程、
を包含することを特徴とする細胞の分離方法。 - さらに、
4)工程3)で回収した細胞を洗浄する工程、
を包含する請求項1記載の方法。 - 工程4)において、血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する溶液を用いて、回収した細胞を洗浄することを特徴とする請求項2記載の方法。
- さらに、
5)工程4)で洗浄した細胞を保存する工程、
を包含する請求項2記載の方法。 - 工程5)において、血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する溶液を用いて細胞を未凍結下で保存することを特徴とする請求項4の方法。
- 血液由来タンパク質が、血漿由来タンパク質又は血清由来タンパク質である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 乳タンパク質がカゼインである請求項5記載の方法。
- 血漿由来タンパク質又は血清由来タンパク質が、ヒト血清アルブミン又はウシ血清アルブミンである請求項6記載の方法。
- 血液由来タンパク質を含有する溶液が、血漿、血清又はそれらの希釈物である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 細胞含有液が、血液、希釈血液、骨髄液、臍帯血及び成分採血液からなる群より選択される試料である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 細胞含有液が、血液、希釈血液、骨髄液、臍帯血及び成分採血液からなる群より選択される試料から事前に分離された細胞を含む画分である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 密度勾配形成用媒体が、ショ糖、グリセロール、デキストラン、メトリザミド、イオディキサノール、ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合体、ポリビニルピロリドンの被膜をもつコロイド状シリカ粒子、スクロースポリマー、ジアトリゾ酸、イオヘキソール及びニコデンツからなる群より選択される媒体である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 密度勾配遠心法による細胞の分離方法における、密度勾配形成用媒体の上に重層する細胞液の調製時の血液由来タンパク質、乳タンパク質、又は血液由来タンパク質もしくは乳タンパク質を含有する溶液の少なくとも1種の使用。
- 血液由来タンパク質が、血漿由来タンパク質又は血清由来タンパク質である請求項13記載の使用。
- 乳タンパク質がカゼインである請求項13記載の使用。
- 血漿由来タンパク質又は血清由来タンパク質が、ヒト血清アルブミン又はウシ血清アルブミンである請求項14記載の使用。
- 血液由来タンパク質を含有する溶液が、血漿、血清又はそれらの希釈物である請求項13に記載の使用。
- 下記1)及び2)を含有する請求項1〜5のいずれかに記載の方法に用いるためのキット;
a)密度勾配形成用媒体、
b)血液由来タンパク質及び/又は乳タンパク質。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010148954A JP5763894B2 (ja) | 2009-07-01 | 2010-06-30 | 細胞の分離方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009156568 | 2009-07-01 | ||
JP2009156568 | 2009-07-01 | ||
JP2010148954A JP5763894B2 (ja) | 2009-07-01 | 2010-06-30 | 細胞の分離方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011024575A true JP2011024575A (ja) | 2011-02-10 |
JP5763894B2 JP5763894B2 (ja) | 2015-08-12 |
Family
ID=43634077
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010148954A Active JP5763894B2 (ja) | 2009-07-01 | 2010-06-30 | 細胞の分離方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5763894B2 (ja) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016106622A (ja) * | 2014-11-26 | 2016-06-20 | 東ソー株式会社 | 細胞の分離回収方法 |
JP2016174596A (ja) * | 2015-03-20 | 2016-10-06 | 東ソー株式会社 | 細胞の回収方法 |
JP2017046685A (ja) * | 2015-09-03 | 2017-03-09 | 東ソー株式会社 | 細胞の分離回収方法 |
WO2018047884A1 (ja) * | 2016-09-09 | 2018-03-15 | 米満 吉和 | 単核球の調製方法 |
CN113502264A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-10-15 | 无锡华精生物科技有限公司 | 一种淋巴细胞分离液及其制备方法 |
CN113755435A (zh) * | 2021-10-15 | 2021-12-07 | 苏州药明康德新药开发有限公司 | 一种食蟹猴pbmc分离方法 |
CN114410580A (zh) * | 2022-02-07 | 2022-04-29 | 无锡观合医学检验所有限公司 | 一种pbmc的提取方法 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS623785A (ja) * | 1985-06-28 | 1987-01-09 | Kiyoshi Kumabe | 活性細胞及び生鮮組織の保存方法 |
JPH07500504A (ja) * | 1992-08-16 | 1995-01-19 | ヘリング,ベルンハルト・ジエイ | 純粋な形態におけるランゲルハンス島 |
JPH10508190A (ja) * | 1994-08-31 | 1998-08-18 | アクティベイテッド セル セラピー, インコーポレイテッド | 細胞分離装置および方法 |
JPH1156351A (ja) * | 1997-08-11 | 1999-03-02 | Asahi Medical Co Ltd | 細胞捕捉・回収方法 |
JP2000502892A (ja) * | 1995-12-11 | 2000-03-14 | デンドレオン コーポレイション | 細胞分離の組成物、キット、および方法 |
JP2003334067A (ja) * | 2002-05-21 | 2003-11-25 | Haemonetics Japan Co Ltd | 細胞の稀釈洗浄方法及び稀釈洗浄装置 |
JP2005139092A (ja) * | 2003-11-05 | 2005-06-02 | Japan Science & Technology Agency | 腎機能障害予防・治療用細胞製剤とその製造方法、腎機能障害の予防・治療方法 |
JP2008501011A (ja) * | 2004-06-01 | 2008-01-17 | アイエヌ モーション インベストメント,リミティド | 幹細胞を用いるinvitro技術 |
JP2009517078A (ja) * | 2005-11-29 | 2009-04-30 | ガミダ セル リミテッド | 幹細胞のホーミングおよび生着を改善する方法 |
-
2010
- 2010-06-30 JP JP2010148954A patent/JP5763894B2/ja active Active
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS623785A (ja) * | 1985-06-28 | 1987-01-09 | Kiyoshi Kumabe | 活性細胞及び生鮮組織の保存方法 |
JPH07500504A (ja) * | 1992-08-16 | 1995-01-19 | ヘリング,ベルンハルト・ジエイ | 純粋な形態におけるランゲルハンス島 |
JPH10508190A (ja) * | 1994-08-31 | 1998-08-18 | アクティベイテッド セル セラピー, インコーポレイテッド | 細胞分離装置および方法 |
JP2000502892A (ja) * | 1995-12-11 | 2000-03-14 | デンドレオン コーポレイション | 細胞分離の組成物、キット、および方法 |
JPH1156351A (ja) * | 1997-08-11 | 1999-03-02 | Asahi Medical Co Ltd | 細胞捕捉・回収方法 |
JP2003334067A (ja) * | 2002-05-21 | 2003-11-25 | Haemonetics Japan Co Ltd | 細胞の稀釈洗浄方法及び稀釈洗浄装置 |
JP2005139092A (ja) * | 2003-11-05 | 2005-06-02 | Japan Science & Technology Agency | 腎機能障害予防・治療用細胞製剤とその製造方法、腎機能障害の予防・治療方法 |
JP2008501011A (ja) * | 2004-06-01 | 2008-01-17 | アイエヌ モーション インベストメント,リミティド | 幹細胞を用いるinvitro技術 |
JP2009517078A (ja) * | 2005-11-29 | 2009-04-30 | ガミダ セル リミテッド | 幹細胞のホーミングおよび生着を改善する方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6014045756; Analytical Biochemistry vol.332, 2004, p.226-233 * |
JPN6014045758; J. Equine Sci. vol.15, no.1, 2004, p.1-5 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016106622A (ja) * | 2014-11-26 | 2016-06-20 | 東ソー株式会社 | 細胞の分離回収方法 |
JP2016174596A (ja) * | 2015-03-20 | 2016-10-06 | 東ソー株式会社 | 細胞の回収方法 |
JP2017046685A (ja) * | 2015-09-03 | 2017-03-09 | 東ソー株式会社 | 細胞の分離回収方法 |
WO2018047884A1 (ja) * | 2016-09-09 | 2018-03-15 | 米満 吉和 | 単核球の調製方法 |
CN113502264A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-10-15 | 无锡华精生物科技有限公司 | 一种淋巴细胞分离液及其制备方法 |
CN113755435A (zh) * | 2021-10-15 | 2021-12-07 | 苏州药明康德新药开发有限公司 | 一种食蟹猴pbmc分离方法 |
CN113755435B (zh) * | 2021-10-15 | 2023-10-13 | 苏州药明康德新药开发有限公司 | 一种食蟹猴pbmc分离方法 |
CN114410580A (zh) * | 2022-02-07 | 2022-04-29 | 无锡观合医学检验所有限公司 | 一种pbmc的提取方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5763894B2 (ja) | 2015-08-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5763894B2 (ja) | 細胞の分離方法 | |
Copland et al. | The effect of platelet lysate fibrinogen on the functionality of MSCs in immunotherapy | |
Flemming et al. | Immunomodulative efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in human platelet lysate | |
WO2013168767A1 (ja) | 赤血球除去方法および採血用遠沈管 | |
JP6142142B2 (ja) | メモリーt細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法 | |
CN113164517A (zh) | 源自死亡供体的用于促进移植物耐受性的细胞组合物及其制造和用途 | |
EP2935614A1 (en) | Blood cell preparations and related methods (gen 8) | |
WO2018047884A1 (ja) | 単核球の調製方法 | |
Zingsem et al. | Cord blood processing with an automated and functionally closed system | |
EP2859092B1 (en) | Therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 in children, application of the cell sorter and the method of multiplying treg cells to produce therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 | |
US7598089B2 (en) | Methods and compositions for separating cells | |
He et al. | Characterization of peripheral blood mononuclear cells isolated using two kinds of leukocyte filters | |
US10406181B2 (en) | Method for reducing the inflammatory activity of a stem cell transplant and use thereof | |
US20150320918A1 (en) | Point of care isolation and concentration of blood cells | |
US20130288227A1 (en) | Methods and compositions for cell separation of blood tissues | |
WO2011087103A1 (ja) | 間葉系幹細胞の増殖促進剤、それを用いた間葉系幹細胞の増殖促進方法および製造方法 | |
Vliet et al. | Factors in the liquid portion of stored blood inhibit the proliferative response in mixed lymphocyte cultures | |
RU2702609C1 (ru) | Способ моделирования туберкулезной инфекции in vitro | |
Christensen et al. | Red Cell Depletion of Major ABO Incompatible Bone Marrow Hematopoietic Progenitor Cells HPC (M) with the Spectra Optia® | |
CN106661555B (zh) | 一种自体cik细胞高效扩增方法 | |
EP3556851A1 (en) | Method for manufacturing natural-killer-t (nkt)-cell stimulating dendritic cell and method for manufacturing cell composition containing nkt-cell stimulating dendritic cell and nkt cell | |
CN115475181A (zh) | 羊膜间充质干细胞源外泌体及其用途 | |
CN113957049A (zh) | 一种人类γδT细胞培养方法 | |
CN110628715A (zh) | 体外扩增自然杀手细胞及自然杀手t细胞的方法及其医药组成物 | |
Schlinker | In Vitro Platelet Production: Promoting Megakaryocyte Terminal Differentiation, Demonstrating Platelet Functionality, and Developing an Automated Process for Platelet Harvest |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130620 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141029 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141224 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150515 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150612 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5763894 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |