JPS623785A - 活性細胞及び生鮮組織の保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は活性細胞及び生鮮組織の保存方法に係り、殊に
動物、植物及び微生物の生存細胞や生鮮組織を長期保存
する方法に係る。

本発明方法において、活性細胞又は生鮮組織が基本的に
は冷凍して保存されるが、本発明方法によれば細胞や組
織は活性状態を維持した状態で保存され、解凍後におい
ても活性の低下は殆んど生しない。

従って本発明は各種の産業分野において利用可能であり
、例えば、動物に関しては精子、卵子、受精卵等の保存
に、植物に関してはカルスの保存による人工種子の応用
等に、又微生物に関しては静磁（パンＷ９母や酒用酵母
）、麹、乳酸菌、納豆菌等の産業上取扱う殆んどの微生
物保存に、又生鮮組織に関しては魚肉、畜肉及び野菜等
の保存、更には組織標本の保存等の学術的用途に適用す
ることができる。

（従来の技術） 動物の組織培養や植物のカルス培養は近年著しく発展し
つつあるが、培養中に有していた活性を維持した優で長
期保存する方法は未だ開発されるに至っていないのが実
情である。

肉類や野菜等の生鮮組織の保存に関しては従来急速冷凍
法が採用されて来たが、適切な解凍が難しくその結果変
質が生じたり、殊に肉類においては味、外観及びテクス
チャーに劣化が生ずる等の解決すべき問題点が多々ある
。一方、凍結をもたらさないＯ〜数震度Ｃ程度低温保存
も行われているが、この保存法は長期保存には不適当で
ある。

更に、微生物の保存方法としては、胞子化させるか或い
は細胞を休眠化させて乾燥又は冷凍保存　　　−する方
法が採用されて来た。この方法は保存法自体としては好
ましいが微生物の再使用に際して難がある、即ちこの方
法で保存されている微生物を使用するためには胞子又は
休眠化細胞を処理して再活性化させねばならないが、こ
のためには多くの時間と工程とを必要とするのみならず
、時には世代交替等による性質変化を来たして元の活性
が著しく低下し、場合によっては全く失われてしまうこ
とも少なくなかった。

（発明が解決しようとする問題点） 従って、本発明の主たる課題は、冷凍時の氷結による障
害発生を最小ならしめ、これによって長期保存を可能と
し、又解凍が容易であると共に解凍時における障害発生
を最小ならしめ、これによって解凍後にも冷凍保存前の
活性が略完全に維持される、活性細胞及び生鮮組織の保
存方法を提供することにある。

本発明の付随的課題は細胞や組織をその活性状態が維持
された侭保存し、従って解凍後に格別な再活性化処理を
必要としない、活性細胞及び生鮮組織の保存方法を提供
することにある。

（問題点を解決するための手段及び作用）活性細胞や生
鮮組織を凍結させたり、又これを解７Ｎ！する場合に生
ずる各種障害の主たる原因としては、一般に ａ＞　凍結処理に際して常温から急に低温１．ｍｌらし
て冷却を行うために、細胞自体が低温適応をする余地が
ないこと、 ｂ）　冷凍時に細胞内外の水分が結晶化して細胞膜が傷
を受けたり或いは破壊されてしまう場合があること、並
びに Ｃ）　解凍時の脱水により細胞内の浸透圧が上昇して細
胞の萎縮や代謝障害の生ずることが知られている。

これらの主原因を排除するためには凍結処理に先立ち、
予冷を施すこと、細胞外殊に細胞膜周辺の水の結晶化を
遅延させると共に生成する結晶を微小な状態に抑えるこ
とが考えられる。

従って、本発明者はこれらの点に関連して鋭意研究を重
ねた結果、本発明を完成するに至ったのである。

即ち、本発明によれば、上記課題は、水溶性蛋白質を含
有する水溶液又は脂質の水分散液で、若しくは脂質を分
散含有している水溶性蛋白質水溶液で活性細胞又は生鮮
組織を処理してその表面部を保護し、この表面保護され
た活性細胞又は生鮮組織を天然由来のゲル化剤で処理し
てゲル構造体内に封入し、活性細胞又は生鮮組織が上記
脂質の水分散液で処理されていなかった場合にはこの封
入体を脂質の水散液で処理し、次いで封入体をＯ−５℃
で予冷保存し、この予冷された封入体が水溶性蛋白質を
含有する上記水溶液で予め処理されていなかった場合に
は水溶性蛋白質含有水溶液で処理し、次いでこの封入体
を徐々に冷却して凍結保存することを特徴とする、活性
細胞及び生鮮組織の保存方法により解決される。

本発明方法にみいて、保護剤の主剤である水溶性蛋白質
としてはゼラチン、カゼイン、牛乳、卵黄、卵白、アル
ブミン、グロブリン等又はこれらの混合物を用いること
ができる。この蛋白質は細胞膜周辺の水の結晶化を遅延
させ且つ氷結時の結晶構造を微細化させて細胞膜の破損
を抑制すると共に、解凍時に細胞内から水分が流出する
のを阻止するために役立つものと推定される。一方、保
護剤の副剤である脂質としてはステロール、不飽和脂肪
酸、燐脂質（レシチン等）等又はこれらの混合物を用い
ることができ、これは低温耐性の向上に役立つものと解
される。即ち、これら脂質の１部及び上記蛋白質の１部
は細胞に取込まれるので細胞膜、延いては細胞自体の低
温耐性が向上し、又解凍時において水分及び水溶性物質
が細胞内から流出するのを抑制するのである。

本発明方法において、ゲル化剤としてはゼラチン、カラ
ギーナン、キサンタンガム、アルギン酸塩等又はこれら
の混合物を用いることができる。

これらゲル化剤は水溶性高分子物質であり、温度に依存
して又は金属イオンの存在等によってゾルからゲルへの
相転換が生じ、このゲル化に際しては分子内に一重又は
二重の螺旋構造を生じ、格子状のマトリクスを形成する
ことにより固化する。

従って、本発明方法においてこれらゲル化剤を用いれば
、蛋白質及び（又は）脂質で表面の保護された活性細胞
や生鮮組織は上記ゲル構造体（マトリクス）内に云わば
抱込まれる形で封入されることになる。この場合に封入
体の外部を構成するゲル構造体は比較的強度が高く通例
の環境変化で破壊されるこ′とはなく、従って内容物の
放出を生じることはない。更に上記のようなゲル化剤を
用いる場合には小粒子状、フレーク状等に任意の成形が
可能であり、且つ形成されるゲル構造体は冷凍耐性に優
れていることが判明した。

本発明方法において、上記ゲル構造体に更に別の非水溶
性皮膜を形成させることもできる。この非水溶性皮膜の
形成は、ゲル構造体による封入体を更に天然由来の水溶
性のポリアニオン性物質又はポリカチオン性物質を含有
する水溶液で処理することにより行なうことができる。

この場合に、保護剤として添加された蛋白質がゲル構造
体の表面に多く露出している時にはポリアニオン性物質
含有水溶液が処理液として用いられ、このポリアニオン
性物質が蛋白質の遊離アミノ基（カチオンとして作用）
と反応して非水溶性皮膜が形成される。この場合のポリ
アニオン性物質としてはカルボキシメチルセルロース、
カラギーナン、キサンタンガム、アルギン酸塩等又はこ
れらの混合物を使用することができる。一方、ゲル構造
体自体がアルギン酸塩やカラギーナンのようなポリアニ
オン性物質で形成されている場合には、ポリカチオン性
物質含有水溶液が処理液として用いられ、このポリカチ
オン性物質がゲル構造体の遊離アニオン基と反応して非
水溶性皮膜が形成される。この場合のポリカチオン性物
質としてはゼラチン、キトサン、ムラミン酸、カゼイン
等を挙げることができる。

このようにして処理された活性細胞や生鮮組織は予冷さ
れた後に冷凍処理される。予冷は低温適応性を与えるた
めであって、０〜５℃の温度で８〜２４時間行うのが適
当であり、その後の冷凍処理は−１０〜−２０℃で行わ
れる。

尚、本発明方法により冷凍保存された活性細胞又は生鮮
組織の解凍は０．１〜５％程度のクエン酸ナトリウム溶
液、１％以上の食塩液又は０．０５〜１．０％程度のヘ
パリン水溶液に浸漬し、徐々に温痕を上げることにより
行うことができ、このような解凍処理によれば解凍時に
生ずる障害の程度を著しく小ならしめることができる。

（実施例等） 次に、試験例及び実施例に関連して本発明を更に具体的
に説明する。

試験例 （冷凍耐性を向上させる保護剤） パン酵母を対象とし、汎用のマイセル法を基本として、
冷凍耐性を向上させるための保護剤について検討した。

ａ）培地 グルコース８．０ｇ、酸性燐酸カリウム及び燐酸アンモ
ニウム各０．５９を蒸留水３０ｉＱに溶解させて調製。

ｂ〉供試液 保護剤としての各種天然物の飽和水溶液を調製し、上記
培地と各３０−Ｑづつ混合する。別途に、市販の圧搾パ
ン酵母（オリエンタル醇母株式会社製＞３．０（＋に蒸
留水を添加し攪拌して４０ｍＱの酵母分散液を調製する
。この酵母分散液と上記混合液とを混合して１００１Ｑ
の供試液とする。

Ｃ）操作方法 上記供試液にゲル化剤としてのアルギン酸ナトリウムを
添加溶解させた後に、この液を、別途調製した５％乳酸
カルシウム溶液上に噴霧すれば直径約０．５〜１．０ｍ
ｌの粒子が形成される。

この粒子を採取して水洗し、１℃で一昼夜保存後、冷凍
させ、−２０℃に至った後に、この温度下に３週間保存
した。次いで粒子を５％クエン酸ナトリウム溶液に５分
間浸漬して解凍させると共にゲルを破壊させ、３０℃の
温度条件下に容量法［佐藤友太部著「パン酵母」第１６
９−１７０頁、光導書院］に従って、１時間当りの炭酸
ガス発生量を測定する。

ｄ〉結果及び考察 結果は下記表１に示される通りであり、冷凍による酵母
の失活を抑制する保護剤としては蛋白質が好適であり、
殊に卵白が優れていることが判る。

表１ 塞ＪＬＬＬ （ウシ精子の保存） ウシの活性精子６Ｘｉ０５個を採取し、これを生鮮卵白
５０−Ｑと燐酸緩衝液（ｐト１６．．２）５０ａｋとの
混合物に添加し攪拌して分散させた。

この精子分散液に１．４％アルギン酸ナトリウム水溶液
５０ｍＱを添加して混合後、これを２区に分割した。

第１区については、これにエルゴステロール５０ＩＩｇ
及びリノール１１１２０ｍｇを添加し、先ず１℃に冷却
して８時間保持し、次いで一２０℃に冷却して冷凍保存
した。

一方、第２区については上記混合物を直ちに一２０℃に
冷却して冷凍保存したく対照体）。

上記の本発明による試料（第１区）と対照試料〈第２区
）とを５週間後にそれぞれ取出して解凍させ、採取直後
の新鮮精子における精子の活動性及び脱水素酵素活性を
１００としてこれらを比較した。

結果は下記表２に示される通りであり、脂質の添加や予
冷が活性細胞の低温耐性を著しく向上させることが判る
。

−Ｌユ （パン酵母の保存） 製パン用圧搾酵母（オリエンタル酵母株式会社製＞３０
を、生卵白５０輸Ｑと４ｇの砂糖と０゜２ｇの食塩とを
含有する水溶液５０膳悲との混合物に分散させ、エルゴ
ステロールを０．１％濃度で且つリノール酸を０．３％
濃度で添加し、１℃に冷却して８時間保持し、次いでゼ
ラチン２．０ｇを添加してゲル化させた。

このゲル化物を小麦粉１００ｇと混合し、イースト工業
会規定の方法に従って充分に練合し、３０℃で２時間醗
酵させた後に一２０℃で冷凍保存したく第１区、本発明
による試料１）。

上記と同様にして、但しゲル化物を直径約ＩＣＩの粒状
に整形し、この粒状体を０．５％アルギン酸ナトリウム
溶液に１０分間浸漬して粒状体の表面に非水溶性皮膜を
形成せしめた後に、小麦粉と混合し、充分に練合し、醗
酵させ、冷凍保存したく第２区、本発明による試料２）
。

一方、試料１（第１区）と同様にして、但しゲル化物と
しないで小麦粉と混合し、練合し、醗酵させ、冷凍保存
したものを対照試料１（第３区）とした。

これらを１ケ月後にそれぞれ解凍し、直径５゜７ｃｍの
シリンダ内に詰め、３０℃で８０分間に亘り１次ＷＪ酵
させて、酵母の炭酸ガス発生によるパン生地の膨張体積
を比較した。

尚、圧搾酵母と、小麦粉と、砂糖と、食塩とを配合し、
常法により練合して調製し、冷凍保存を行わなかった試
料（対照試料２、第４区）についても同様にパン生地の
膨張体積を測定した。

結果は下記表３に示される通りであり、蛋白質や脂質を
保護剤として加えてもゲル化処理を行わないと生地の主
材料である小麦粉との練合により保護剤が分散してしま
い酵母に対する保護効果が低下してしまうこと、並びに
本発明方法により処理すれば１ケ月の保存後においても
新鮮酵母に優るとも劣らない活性を酵母は有しているこ
とが判明した。

表３ 宜」Ｌ医二Ｌ （ヒト肝細胞の保存） 低温耐性が低いとされているヒトの肝臓実質細胞を１０
％子牛血清添加イーグル培地で培養する。

即ち、肝細胞を先ず１個１個バラバラに分離させて上記
血清添加培地に投入し、次いでこの培地に０．５％アル
ギン酸ナトリウム水溶液を添加し、とベットで採取し無
菌的に３％乳酸カルシウム水溶液中に滴下して肝細胞の
封入された直径約１−一のゲル粒子を形成させ、その後
、このゲル粒子を採取して０．８％キトサン水溶液内に
１０分間浸漬して皮膜を形成させ、これを採取して０．
５％クエン酸ナトリウム水溶液で洗浄し、再び血清添加
イーグル培地に投入し、３７℃で静置培養を７日間行な
った（但し、３日めに培地を新鮮培地と交換）。

上記培養後に、この培地にエルゴステロール及びリノー
ル酸を０．３％及び０．６％濃度で添加し、毎時１℃の
割合で緩徐に５℃迄冷却して、８時間予冷保存した。次
いで別途調製した１％卵レシチンのドデカン溶液に、上
記予冷粒状体を１分間浸漬して引上げ、血清中に浸漬し
た上で緩徐に一１０℃まで冷却して保存したく試験区）
。

一方、上記の卵レシチン処理を行わずに一１０℃に冷却
して保存し゛たものを対照第１区とし、培養終了後に粒
状体を採取して直ちに血清中に浸漬し、−１０℃に冷却
して保存したものを対照第２区とした。

１０日の保存期間後に、試験区及び対照区につき毎時１
℃の割合で徐々に昇温させて解凍し、０゜５％ヘパリン
水溶液にそれぞれ３分間浸漬して肝細胞を分散状態とな
した後に、標準シャーレ内に寒天で固化させた１０％血
清添加イーグル培地に塗付け、これらのシャーレを瞬卵
器内において３７℃で２４時間保温し、次いで細胞コロ
ニー８１０個を顕微鏡下に観察して肝細胞の分散頻度を
測定した。

一方、各区から得た解凍肝細胞１〜６Ｘ１０３個を０．
５％三塩化テトラゾリウム水溶液２０■Ｑに投入して６
０分間放置し、赤色変色を光電比色して肝細胞の脱水素
酵素活性を測定した。

結果は下記表４に示される通りであり、低温耐性が低い
とされる肝細胞であっても、これをゲル化剤で処理して
封入し蛋白質や脂質で処理することにより、低温耐性を
著しく向上させ得ることが判明した。尚、本試験例の場
合に、レシチンは２分子膜を形成し、この２分子膜間に
水が配位して一１０℃においてもこの配位水が略不凍状
態に維持され、その結果肝細胞内の水分が凍結し難くな
り、保存性の向上となって表われるものと推定される。

表４ 注１＞　　２００個の細胞中で有糸分裂を示した細胞数
で表示。因みに培養終了後であって冷凍処理前の試料に
おける分裂類−は２９であった。

注２〉　光電比色計によるＴ％値を、冷凍処理前めもの
を１００とした残存率で表示。

実施例４ （魚切身の保存） アルギン酸ナトリウム０．７％と、リノール酸０．６％
、エルゴステロール０．１％とを卵白に加えた処理液を
準備し、生鮮鰹を３枚におろして得た切身を直ちに上記
処理液に浸漬した。次に、処理液から引上げた切身を４
％乳酸カルシウム水溶液及び０．５％キトサン水溶液に
浸漬すれば、切身上にはゲル皮膜が形成される。別途調
製された５％レシチンのエタノール溶液に上記の処理済
み切身を浸漬すれば上記ゲル皮膜の表面及び小孔内部に
は脂質２分子膜が形成される。この切身封入体を引上げ
て水洗し、０℃で８時間予冷した後に一１０℃で冷凍処
理し、この温度で保存した。

２０日間に亘る保存後に常法により解凍し、切身の赤味
度を測定した。

結果は下記表５に示される通りであり、上記本発明方法
を実施した試験区では、冷凍前の状態〈対照第１区〉と
略同様であるに対し、おろした鰹切身を直ちに一１０℃
で冷凍保存したもの（対照第２区）では赤味度が増加し
く現実には黒味を帯びてくる）、従って変質の生じてい
ることが判る。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）水溶性蛋白質を含有する水溶液又は脂質の水分散
   液で、若しくは脂質を分散含有している水溶性蛋白質水
   溶液で活性細胞又は生鮮組織を処理してその表面部を保
   護し、この表面保護された活性細胞又は生鮮組織を天然
   由来のゲル化剤で処理してゲル構造体内に封入し、活性
   細胞又は生鮮組織が上記脂質の水分散液で処理されてい
   なかった場合にはこの封入体を脂質の水散液で処理し、
   次いで封入体を０−５℃で予冷保存し、この予冷された
   封入体が水溶性蛋白質を含有する上記水溶液で予め処理
   されていなかった場合には水溶性蛋白質含有水溶液で処
   理し、次いでこの封入体を徐々に冷却して凍結保存する
   ことを特徴とする、活性細胞及び生鮮組織の保存方法。
2. （２）水溶性蛋白質がゼラチン、カゼイン、牛乳、豆乳
   、卵黄、卵白、アルブミン、グロブリン及びこれらの混
   合物から選択されることを特徴とする、特許請求の範囲
   第１項に記載の保存方法。
3. （３）脂質がステロール、不飽和脂肪酸及び燐脂質から
   選択されることを特徴とする、特許請求の範囲第１又は
   ２項に記載の保存方法。
4. （４）ゲル化剤がゼラチン、カラギーナン、キサンタン
   ガム、アルギン酸塩及びこれらの混合物から選択される
   ことを特徴とする、特許請求の範囲第１−３項の何れか
   １つに記載の保存方法。
5. （５）水溶性蛋白質を含有する水溶液又は脂質の水分散
   液で、若しくは脂質を分散含有している水溶性蛋白質水
   溶液で活性細胞又は生鮮組織を処理してその表面部を保
   護し、この表面保護された活性細胞又は生鮮組織を天然
   由来のゲル化剤で処理してゲル構造体内に封入し、この
   封入体を更に天然由来の水溶性のポリアニオン性物質及
   びポリカチオン性物質の何れかを含有する水溶液で処理
   して上記封入体に非水溶性皮膜を形成させ、活性細胞又
   は生鮮組織が上記脂質の水分散液で処理されていなかっ
   た場合にはこの封入体を脂質の水散液で処理し、次いで
   封入体を０−５℃で予冷保存し、この予冷された封入体
   が水溶性蛋白質を含有する上記水溶液で予め処理されて
   いなかった場合には水溶性蛋白質含有水溶液で処理し、
   次いでこの封入体を徐々に冷却して凍結保存することを
   特徴とする、活性細胞及び生鮮組織の保存方法。
6. （６）保護剤として添加された蛋白質がゲル構造体の表
   面に多く露出している場合には、ポリアニオン性物質含
   有水溶液で封入体を処理してこのポリアニオン性物質と
   蛋白質の遊離アミノ基とを反応させて非水溶性皮膜を形
   成することを特徴とする、特許請求の範囲第５項に記載
   の保存方法。
7. （７）ゲル構造体がポリアニオン性物質で形成されてい
   る場合には、ポリカチオン性物質含有水溶液で封入体を
   処理してこのポリカチオン性物質とゲル構造体のアニオ
   ン性物質とを反応させて非水溶性皮膜を形成することを
   特徴とする、特許請求の範囲第５項に記載の保存方法。
8. （８）皮膜形成剤としてのポリアニオン性物質がカルボ
   キシメチルセルロース、カラギーナン、キサンタンガム
   、アルギン酸塩及びこれらの混合物から選択されること
   を特徴とする、特許請求の範囲第５又は６項に記載の保
   存方法。
9. （９）皮膜形成剤としてのポリカチオン性物質がゼラチ
   ン、キトサン、ムラミン酸、カゼイン及びこれらの混合
   物から選択されることを特徴とする、特許請求の範囲第
   ５又は７項に記載の保存方法。