CN110628715A - 体外扩增自然杀手细胞及自然杀手t细胞的方法及其医药组成物 - Google Patents

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Abstract

本发明关于一种体外扩增自然杀手细胞及自然杀手T细胞的方法，该方法以0.5x106～5x106cells/mL的初始细胞密度进行培养，并于培养后特定时间点将细胞密度再次调整为0.5x106～5x106cells/mL，以维持较佳的细胞生长环境，进而提升细胞的扩增效率，据此，本发明的方法，相较于已知技术而言，得以于较短的时间获得较多的细胞总数，且细胞存活率以及NK/NKT细胞比例皆较高，处于活化态而具备细胞毒杀性的NK/NKT细胞比例亦较高。

Description

体外扩增自然杀手细胞及自然杀手T细胞的方法及其医药组 成物
技术领域
本发明关于一种体外扩增自然杀手细胞(NK细胞)及自然杀手T细胞(NKT细胞)的方法，尤其指一种可于体外扩增三至七千倍NK/NKT细胞的方法，且该方法所扩增的NK/NKT细胞，其细胞存活率高于85％，具活性的NK/NKT细胞达50％以上，对癌细胞的毒杀效果更达76％以上。
背景技术
免疫治疗(Immunotherapy)，泛指通过强化生物体自身免疫系统，或是外加式地赋予生物体免疫能力来预防及治疗疾病的方式，其具备高度专一性、高效率以及持久性等特性；近十年来，由免疫治疗的概念所衍生的免疫细胞治疗(immune cell therapy)亦逐渐被广为探讨。
2011年，免疫细胞治疗首先于国际期刊Nature中被提出具潜力的评论，其被视为可能治愈癌症的治疗方法；免疫细胞疗法着重于刺激免疫系统，而能破坏手术(如放射线治疗或化学治疗)后残留的癌细胞，进而提高疗效，并减少手术或化、放疗的毒性作用，以提升病患的生活质量及预后；举例而言，以免疫细胞疗法治疗癌症，为自患者的血液中分离出免疫细胞，经适当的体外培养、放大及活化后，再次输回患者体内，以对体内特定组织的肿瘤产生专一性的免疫反应，利用自身的免疫细胞回输以进行治疗亦可避免产生免疫排斥反应；所述的免疫细胞中，由于自然杀手细胞(Nature killer cells,NK cells)无须通过抗原呈现细胞呈现抗原即可直接对标的细胞进行毒杀，因此被预测其相较于T细胞而言具有更高的抗肿瘤效率。
自然杀手细胞在人体免疫系统中作为对抗外来物质的第一道防线，由于其细胞表面缺乏专一性的抗原受体(TCR)，故其所引发的免疫反应为非专一性的防御，自然杀手细胞位于周边血液循环中，可攻击受病毒感染的细胞，使人体免于病毒的感染，亦可对肿瘤细胞及骨髓移植产生排斥反应以攻击此些外来细胞，当自然杀手细胞与此些异质细胞接触后，即驱动其活化受体(activating receptor)，因而活化其自身，并促使自然杀手细胞释出穿孔素(perforin)及颗粒酶(granzyme)等因子；穿孔素将在标的异质细胞膜形成孔洞，接着颗粒酶进入该标的异质细胞后，改变粒线体膜的通透性，并活化细胞凋亡(apoptosis)相关的蛋白质以启动细胞凋亡(apoptosis)反应，进而使标的异质细胞中DNA片断化并导致细胞分解；此外，自然杀手T细胞为一群同时表现T细胞表面抗原(如：CD3、TCRαβ)及自然杀手细胞表面抗原(如：CD56)的异质性免疫细胞，因此其可同时诱发如同T细胞的专一性免疫反应，以及如同NK细胞的非专一性免疫反应，亦被视为发展免疫细胞治疗的一大重点。
然而，自然杀手细胞仅占人体周边血液中淋巴球的5～10％，且自然杀手T细胞更仅占不到1％，因此，能够于体外高效率扩增自然杀手细胞及自然杀手T细胞为一重大课题，至目前为止，研究者仍极力于提升自然杀手细胞及自然杀手T细胞的体外扩增效率，其细胞存活率、细胞纯度以及细胞毒杀能力，进而更提升其于医药及医疗上的应用性。
发明内容
本发明于一方面，提供一种体外扩增自然杀手细胞(NK细胞)及自然杀手T细胞(NKT细胞)的方法，该方法以0.5x106～5x106cells/mL的一初始细胞密度进行培养，以提供细胞较佳的生长环境，并于细胞总数达到2.5x106～5x106cells/mL时，首次更新细胞培养液并重新调整细胞密度为0.5x106～5x106cells/mL，亦即当细胞处于稳定状态后，再重新调整细胞密度，如此以提升细胞的生长效率。
本发明于另一方面，提供一种体外扩增自然杀手细胞及自然杀手T细胞的方法，该方法每隔2至3天更新该细胞培养液，并重新将细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL，如此能持续提供细胞较佳的生长环境。
本发明于另一方面，提供一种体外扩增自然杀手细胞及自然杀手T细胞的方法，该方法所使用的细胞培养液包含人类重组介白素-2(rhIL-2)，用以活化NK/NKT细胞，进而促进NK细胞分泌穿孔素以结合标的细胞并造成细胞毒杀效应，同时有助于免疫细胞生长，以增加扩增后的NK/NKT细胞总数。
本发明于另一方面，提供一种体外扩增自然杀手细胞及自然杀手T细胞的方法，该方法所使用的细胞培养液更包含Anti-CD3单株抗体，用以促进NK/NKT细胞的活化，以提升NK/NKT细胞对癌细胞的细胞毒杀性，且不影响NK/NKT细胞的生长。
于是，本发明的一方面关于一种体外扩增自然杀手细胞及自然杀手T细胞的方法，其包含步骤：将一周边血单核球细胞(peripheral mononuclear cells,PBMCs)悬浮于一细胞培养液中以获得一细胞混合液；将该细胞混合液的细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL，做为一初始细胞密度，并使用该细胞培养液将该细胞混合液培养于一细胞培养盘中；当该细胞培养盘中的总细胞数达2.5x106～5x106cells/mL时更新该细胞培养液，并重新将细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL；每隔2至3天更新该细胞培养液，并重新将细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL，培养至少10至16天；以及清洗该细胞混合液并取得该细胞混合液中的一细胞群落，该细胞群落即一经扩增的该自然杀手细胞及自然杀手T细胞混合物。
于本发明的一些具体实施态样，于悬浮该周边血单核球细胞的步骤前，更包含收集该周边血单核球细胞的步骤，其包含：离心一周边血液检体，使该周边血液检体分层为一血浆层、一白细胞层(buffy coat)及一红血球层；去除该血浆层并取得该白细胞层，将该白细胞层混合于Hanks平衡盐溶液(HBSS)及一单核球细胞分离液中以获得一白细胞混合液；离心以分层该白细胞混合液；以及去除上清液，并取得中间层白色液体，即获得该周边单核球细胞。
于本发明的其它具体实施态样，所述的细胞培养液包含：一干细胞生长培养基(SCGM)；一人类介白素-2重组蛋白(rhIL-2)，其浓度范围介于250至1,000IU/mL；一血清，其体积百分比介于1～10％；以及一抗CD3单株抗体(anti-CD3monoclonal antibody)，其浓度范围介于10至500ng/mL。
于本发明的其它具体实施态样，于调整该初始细胞密度的步骤中，将该细胞混合液的细胞密度调整为0.5x106～2.5x106cells/mL。
于本发明的其它具体实施态样，于更新该细胞培养液并重新调整细胞密度的步骤中，将该细胞混合液的细胞密度调整为0.5x 106～2.5x 106cells/mL。
于本发明的其它具体实施态样，于培养该细胞混合液的步骤中，将该细胞混合液置于37℃及5％二氧化碳的环境中培养。
于本发明的其它具体实施态样，于取得该细胞群落的步骤前，更包含：分析该自然杀手细胞及该自然杀手T细胞于该细胞混合液中的细胞数比例，且比例介于30至90％，该自然杀手细胞是细胞表面抗原为CD16+CD56+CD3-的细胞群落，且该自然杀手T细胞是细胞表面抗原为CD16+CD56+CD3+的细胞群落。
于本发明的其它具体实施态样，于清洗该细胞混合液并取得该细胞群落的步骤之后，更包含以一保存液悬浮该细胞群落的步骤，该保存液为一磷酸缓冲溶液或一细胞外液(Plasma-Lyte A)。
于本发明的其它具体实施态样，所述的经扩增的该自然杀手细胞及自然杀手T细胞混合物的细胞存活率达到至少80％，且该自然杀手细胞及自然杀手T细胞混合物中具细胞毒杀性的该自然杀手细胞及自然杀手T细胞达到至少50％。
本发明的另一方面关于一种自然杀手细胞及自然杀手T细胞的医药组成物，其包含以前述的方法制备所得的该经扩增的该自然杀手细胞及自然杀手T细胞混合物；以及医药上可接受的溶剂。
附图说明
图1为本发明的第一实施例的流程示意图；
图2为本发明的第二实施例的流程示意图；
图3A-3B为经扩增的自然杀手细胞(NK细胞)/自然杀手T细胞(NKT细胞)的比例分析；
图4A-4B为经扩增的自然杀手细胞(NK细胞)/自然杀手T细胞(NKT细胞)的比例分析；
图5A-5B为经扩增的自然杀手细胞(NK细胞)/自然杀手T细胞(NKT细胞)的细胞毒杀能力分析。
其中，
步骤S10～S18；
步骤S101～S104。
具体实施方式
下列实施例将进一步说明本发明的其它特征和优点，但该等实施例仅为示例而用，并非对本发明的限制。
有鉴于已知技术对于体外扩增自然杀手细胞(NK细胞)以及自然杀手T细胞(NKT细胞)仍存在诸多待改善之处，由于NK细胞仅占人体免疫细胞约5～10％，NKT细胞更不及1％，为使其更符合医药的应用，需于较短的培养时程获得较大量的细胞总数，并需能针对细胞群落中的NK/NKT细胞进行扩增，以提升NK/NKT细胞的比例，进而提高细胞纯度，此外，亦须维持扩增所得的细胞存活率，并于细胞扩增的过程中，有效地刺激并活化NK/NKT细胞，以提升其免疫毒杀的效能；据此，本发明提出一种体外扩增自然杀手细胞(NK cell)/自然杀手T细胞(NKT cell)的方法，以改善已知技术的不足；以下，将针对本发明的技术手段及特点进行说明。
定义
用于本说明书，术语”自然杀手细胞”(Nature killer cell,NK cell)意指一种隶属于先天免疫系统(innate immune system)的毒杀性淋巴球(cytotoxic lymphocyte)，可被诱发以执行非专一性细胞毒杀效应。
用于本说明书，术语”自然杀手细胞”(Nature killer T cell,NKT cell)意指一种同时表达αβT细胞受体(TCR)以及与自然杀手细胞相关分子标记的免疫细胞，其同时具备专一性的细胞免疫毒杀性以及非专一性的细胞免疫毒杀性。
用于本说明书，术语”单核球细胞”(peripheral mononuclear cells,PBMCs)意指一种具单一细胞核且细胞核形态为圆形的细胞，其包含T细胞、B细胞及NK细胞等淋巴细胞(lymphocyte)、单核细胞(monocyte)及树突细胞(dendritic cell)，位于周边血中的单核球细胞又可称周边血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。
材料与方法
试剂制备
细胞培养基(medium)
本发明的一实施例使用CloneticsTM SCGM BulletKitTM(CC-3205)做为基础培养基，其容量500毫升(mL)的包装中包含基底细胞基础培养基(Stromal CellBasal Medium)、0.5mL的人类纤维母细胞生长因子(h-FGF-B)、0.5mL的胰岛素(Insulin)、0.5mL的胎牛血清(FBS)及0.5mL的庆大霉素/两性霉素(Gentamicin sulfate/Amphotericin；GA-1000)。
人类重组介白素-2(recombinant human interleukin-2,rhIL-2)
于无菌作业环境下，取无菌针筒取1毫升(mL)无菌水，注入含有1.1毫克(mg)rhIL-2粉末的容器中，均匀溶解后获得浓度为1.1毫克/毫升(mg/mL)的rhIL-2原液，接着以无菌针筒将rhIL-2原液取出，并放置于50mL离心管中，再加入43mL的细胞培养基以将rhIL-2溶液的浓度调整为500单位/微升(U/μl)，以获得rhIL-2稀释溶液；将rhIL-2稀释溶液分装至微量无菌离心管中，保存于-20℃冰箱备用。
抗-分化簇3的单株抗体(Anti-cluster of differentiation-3 monoclonalantibody,Anti-CD3mAb)
于无菌作业环境下，将Anti-CD3单株抗体原液(浓度为1mg的Anti-CD3单株抗体溶于1mL溶剂中)自原始包装(Takara)中取出，接着将Anti-CD3单株抗体原液混合至4mL的细胞培养基中，以将Anti-CD3单株抗体溶液的浓度稀释为20μg/mL；将Anti-CD3单株抗体溶液稀释溶液分装至微量无菌离心管中，保存于-20℃冰箱备用。
扩增自然杀手细胞(NK cell)/自然杀手T细胞(NKT cell)的细胞培养液
取前述的rhIL-2稀释溶液、Anti-CD3单株抗体稀释溶液及血清加入细胞培养基中，均匀混合以配置成用以扩增自然杀手细胞/自然杀手T细胞的细胞培养液，所述的细胞培养液包含终浓度为250～1,000IU/mL的rhIL-2、终浓度为10～500ng/mL的Anti-CD3单株抗体以及终浓度为1～10％的血清。
周边血检体
由医院医师门诊采集受试者的周边血检体并保存于无菌采血管中，依据规范将检体运输至人体细胞组织优良操作(Good Tissue Practice,GTP)核心实验室，以进行后续处理。
细胞(cell)
制备周边血单核球细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)
将周边血从采血管转移到50mL离心管中进行梯度离心，其设定离心机(AUBOCA,4000/4200)的离心力为600xg，并关闭离心机的煞车功能，于室温下离心10分钟以将周边血检体分为三层，由上而下分别为血浆(Plasma)、白细胞层(Buffy coat)与红血球(Erythrocytes)；接着将血浆层去除并转移白细胞层至新的无菌离心管中，再使用Hanks平衡盐溶液(HBSS)缓慢地将白细胞混合以获得白细胞稀释溶液；另一方面，取1～3mL的单核球细胞分离液(Ficoll-Paque Plus)置于单核球分离离心管中，于室温下以600xg离心力离心30秒后备用；接着，取前述的白细胞稀释溶液加入含有单核球细胞分离液的单核球分离离心管中，于室温下以600xg离心力离心10分钟以分层，接续移除上清液，转移白色中间层(即周边血单核球细胞)至新的无菌离心管中，加入HBSS均匀混合以清洗细胞，于室温下离心10分钟后去除上清液，接着再次以HBSS重新悬浮细胞，于室温下离心10分钟，分别收集上清液及周边血单核球细胞以备用。
细胞测试
细胞表面抗原分析
取1x106cells于15mL离心管中，以离心力500g离心5分钟后去除上清液，再以4mL杜比可磷酸缓冲溶液(Dulbeccos Phosphate Buffered Saline,DPBS)重新悬浮细胞，并重复此步骤两次，接着加入5μl的细胞荧光标记试剂，于4℃中避光反应15分钟，接着，加入4mLDPBS清洗细胞，以离心力500g离心5分钟后去除上清液，最后加入0.5mL DPBS重新悬浮细胞，接续以流式细胞仪(SONY；SH800Z)分析并定量细胞表面的荧光标记；前述的细胞荧光标记试剂包含与T细胞相关的荧光标记Anti-CD3mAb(Invitrogen；Cat#11-0038-42)，以及与NK细胞相关的荧光标记Anti-CD16mAb(Invitrogen；Cat#17-0168-42)、Anti-CD56mAb(Invitrogen；Cat#12-0567-41)及Anti-CD314(NKG2D)mAb(BD；Cat#562365)。
细胞计数
自细胞培养盘中取得欲分析细胞存活率的细胞样本，以微量吸管将细胞样本均匀悬浮以获得细胞悬浮液，接着取20μl的细胞悬浮液与20μl的0.4％台盼兰染剂(Trypanblue；Gibco；Cat#15250-061)均匀混合以获得细胞混合液，再以微量吸管取10～20μl的细胞混合液注入盖玻片与细胞计数盘(Marienfeld；Cat#AP-0650030)之间的凹槽，接着将细胞计数盘置于显微镜下观察，待细胞静止后即开始计数细胞。
细胞计数盘的四个角落分别包括一4*4的区域，计数范围则包括所述的四个区域；计数四个区域中的亮细胞，获得活细胞的数量，再计数四个区域中的暗色细胞及深蓝色细胞，获得死细胞的数量，再以此些数值计算细胞密度、细胞总数及细胞存活率等参数值；其中，细胞密度(cells/ml)＝(四区域活细胞数/4)x(稀释倍数2)x 104/mL；细胞总数(cells)＝细胞密度(cells/ml)x细胞培养液体积(mL)；细胞存活率％＝活细胞数(cells)/(活细胞数+死细胞数)(cells)x％。
细胞毒杀性测试
实验以扩增后的NK/NKT细胞做为效应细胞(effector cells)，并以K562细胞株做为毒杀标的细胞(target cells)，将效应细胞及标的细胞以1：1混合后培养，反应4小时后，再以染剂7-AAD进行细胞染色，由于7-AAD无法通透正常细胞的细胞膜，仅能通透处于细胞凋亡过程或者已死亡的细胞，因此可藉由侦测细胞中7-AAD的讯号以做为细胞凋亡的依据。
接着，请参阅图1，其为本发明的第一实施例的流程示意图；如图所示，本实施例所述的体外扩增自然杀手细胞(NK cells)及自然杀手T细胞(NKT cells)的方法，包含步骤如下：
步骤S10：将一周边血单核球细胞(peripheral mononuclear cells,PBMCs)悬浮于一细胞培养液中以获得一细胞混合液；
步骤S12：将该细胞混合液的细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL，做为一初始细胞密度，并使用该细胞培养液将该细胞混合液培养于一细胞培养盘中；
步骤S14：当该细胞培养盘中的总细胞数达2.5x106～5x106cells/mL时更新该细胞培养液，并重新将细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL；
步骤S16：每隔2至3天更新该细胞培养液，并重新将细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL，培养至少10至16天；以及
步骤S18：清洗该细胞混合液并取得该细胞混合液中的一细胞群落，该细胞群落即一经扩增的该自然杀手细胞及自然杀手T细胞混合物。
其中，于步骤S10之前，更包含如图2所示的第二实施例的流程示意图；如图所示，本实施例的收集该周边血单核球细胞包含步骤如下：
步骤S101：离心一周边血液检体，使该周边血液检体分层为一血浆层、一白细胞层(buffy coat)及一红血球层；
步骤S102：去除该血浆层并取得该白细胞层，将该白细胞层混合于Hanks平衡盐溶液(HBSS)及一单核球细胞分离液中以获得一白细胞混合液；
步骤S103：离心以分层该白细胞混合液；以及
步骤S104：去除上清液，并取得中间层白色液体，即获得该周边单核球细胞。
本实施例如材料与方法中所述制备周边血单核球细胞的流程；其中，于步骤S11获得分层的周边血检体，接着于步骤S12中，以10mL无菌吸管搭配辅助器去除血浆，在吸除的过程中，当液面接近距离该白细胞层0.4～0.5公分时即停止，以避免消耗白细胞，亦避免破坏周边血分层的接口，接着将白细胞以HBSS混合并稀释，以适于后续分离单核球之用；而于步骤S14中，于吸除上清液的过程中，当液面接近距离中间层白色液体0.5～1公分时即停止，同样为避免消耗白细胞，以及避免破坏分层的接口；通过本实施例的方法，即可获得周边血单核球细胞，即为第一实施例中用以扩增NK/NKT细胞的初始细胞来源。
接着，于步骤S10中，将步骤S11～S14所获得的周边血单核球细胞悬浮于该细胞培养液中，该细胞培养液需于细胞生长过程中提供充足的养分，并且于扩增细胞的同时提供适当的因子刺激并活化NK/NKT细胞，基于上述的目的，本实施例的该细胞培养液选用一干细胞生长培养基(SCGM)作为基础培养基，另添加浓度范围介于150～1,500IU/mL的一人类介白素-2重组蛋白(rhIL-2)，以及浓度范围介于10至800ng/mL的一抗CD3单株抗体(anti-CD3monoclonal antibody,anti-CD3mAb)作为活化NK/NKT细胞的刺激因子，同时于本实施例中，rhIL-2亦可促进NK/NKT细胞的生长，以增加NK/NKT细胞的细胞总数，此外，本实施例亦加入体积百分比介于1～10％的一血清；上述的添加物，于一较佳实施例中，其所添加的最终浓度为250～1,000IU/mL的rhIL-2、50～500ng/mL的anti-CD3mAb以及1～5％的血清，该血清可为周边血检体的提供者的自体血清，或可为其它动物源的血清。
接续于步骤S12中，将步骤S11获得的该细胞混合液的细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL，并以此初始细胞密度放置于载有该细胞培养液的该细胞培养盘中，再将该细胞培养盘放置于细胞培养箱中，以37℃及5％二氧化碳的环境开始单核球细胞的培养，并将此步骤定义为培养第0天，此初始细胞密度能提供细胞与细胞之间适当的接触以及良好的生长空间，以促进细胞趋向稳定的状态，以利后续生长分裂；于一较佳实施例中，以0.5x106～2.5x 106cells/mL的细胞数作为初始细胞密度，并将细胞置于细颈培养盘中(flask)进行培养。
接续于步骤S14中，当该细胞培养盘中的总细胞数成长至约2.5x106～5x106cells/mL，即更新细胞培养盘中的该细胞培养液，并将细胞密度再次调整为0.5x106～5x106cells/mL，以维持细胞培养盘中良好的生长环境以及充足的生长养分；于一较佳实施例中，于总细胞数成长至2.5x106～3.5x106cells/mL，或培养至第5天，此时，细胞已处于稳定的状态，并具有较佳的细胞生长分裂的效能，即再次将细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL，持续扩增NK/NKT细胞。
接续，在步骤S14之后，每隔2至3天更新该细胞培养液，并重新将细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL，以持续维持细胞培养盘中良好的生长环境以及充足的生长养分，并持续培养至第10天～第16天；于一较佳实施例，在扩增NK/NKT细胞的流程中，于培养后第5天、第7天、第9天、第12天、第14天及第16天重新调整细胞密度，且将细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL。
接续，在步骤S16之前，先取得该细胞培养盘中部分细胞均匀混合液作为测试样本，以进行细胞计数及细胞特性分析；所述的细胞特性分析如材料与方法所述，通过分析细胞表面抗原CD16、CD56及CD3来定义所扩增的细胞群落中所包含的NK/NKT细胞，以分析NK细胞及NKT细胞所占的比例，其中NK细胞为细胞表面抗原CD16+CD56+CD3-的细胞群落，而NKT细胞则为细胞表面抗原CD16+CD56+CD3+的细胞群落，通过本实施例的流程所扩增的细胞群落，其NK/NKT细胞所占的比例最高可达到90％。
最后，于步骤S18中，于清洗该细胞群落后，获得该经扩增的该自然杀手细胞及自然杀手T细胞混合物，其以生理等级无菌磷酸缓冲溶液悬浮该细胞群落，离心10分钟以移除上清液，重复此步骤至少三次，以确保去除该细胞培养液及其所包含的添加物质。
经前述步骤所获得的该扩增的该自然杀手细胞及自然杀手T细胞混合物可混合于适当的溶剂中保存，或进一步制备为医药组成物，所述的溶剂可为一磷酸缓冲溶液或一细胞外液(Plasma-Lyte A)。
本发明的其它特色及优点将于下列实施范例中被进一步举例与说明，而该实施范例仅作为辅助说明，并非用于限制本发明的范围。
实施例
实施例1、初始细胞数的优化
本实施例的目的为建立本发明的体外扩增自然杀手细胞(NK cell)/自然杀手T细胞(NKT cell)的方法所使用的较佳初始细胞密度，其如前述方法取得周边血单核球细胞，以该周边血检体来源者的自体血清(包含250IU/ml的rhIL-2及50ng/ml的Anti-CD3单株抗体)进行培养，再通过前述的细胞计数方法进行细胞密度评估；如表一所示，其分别以初始细胞密度1.00x106、2.00x106、3.00x106及5.00x106cells/ml进行培养，并于培养后第5、7、9、12、14、16、18及20天自培养盘取出细胞进行计数，并将细胞密度重新调整为1.00x106cells/ml，由结果可以得知，以此些初始细胞密度进行体外扩增NK/NKT细胞时，皆能将细胞存活率维持在90％以上，其中，以1.00x106cells/ml的初始细胞密度进行培养时，其细胞扩增效率最好，扩增后所能获得的细胞数亦为最多；据此，本发明的一较佳实施例中，可选用1.00x106、2.00x106、3.00x106及5.00x106cells/ml的初始细胞密度进行培养。
表一：
实施例2、细胞培养天数的优化
承上，为了达到较佳的细胞生长效率，本实施例接续探讨所需的细胞培养天数，以及重新调整细胞密度的时间间隔；于本实施例中，取得前述的周边血单核球细胞，以一较佳实施例1.00x106cells/mL为初始细胞密度，使用该周边血检体来源者的自体血清(包含250IU/ml的rhIL-2及50ng/ml的Anti-CD3单株抗体)进行培养，于表二中各组别所标示的培养时间进行细胞计数，并于细胞计数后将培养盘中的细胞密度重新调整为1.00x106cells/mL继续培养。
如表二所示，其分为三个测试组别，其中，第一组在细胞放置于培养盘后第5天进行第一次细胞密度调整，接着每隔2天重新调整细胞密度为1.00x106cells/mL，接着在第9天时连续培养3天，再于培养第12天起每隔2天重新调整细胞密度为1.00x106cells/mL，由结果可以得知，与第二组及第三组相比，第一组的细胞总数在培养第12天后，其细胞总数仍持续稳定地上升，于第20天时所达到的细胞总数较其它组别多了2～20倍，且细胞存活率亦维持在95％以上；据此，于本发明的一较佳实施例中，如表二第一组所述的细胞密度调整间隔作为扩增NK/NKT细胞的培养条件，以达到较佳的细胞生长效率。
表二：
实施例3、细胞培养液中人类重组介白素-2(rhIL-2)浓度的优化
由于细胞扩增培养时，细胞培养液中的添加物的使用量亦影响细胞生长效率，因此本实施例接续探讨，在实施例1及2所建立的初使细胞密度及调整细胞密度时间间隔的培养条件下，可进一步提升细胞生长效率的rhIL-2浓度；其取得前述的周边血单核球细胞，以一较佳实施例1.00x106cells/mL为初始细胞密度，使用该周边血检体来源者的自体血清(包含rhIL-2及50ng/ml的Anti-CD3单株抗体)进行培养，试验组别分别为包含250、500、750或1,000IU/ml的rhIL-2。
如表三所示，使用500IU/ml rhIL-2进行培养的组别，其细胞扩增趋势最为稳定，且于培养第20天时所能获得的细胞总数较其它组别多1～3倍；据此，本发明的一较佳实施例可以250至1,000IU/ml的rhIL-2进行培养，此外，由本实施例的结果亦可得知，本发明所用以扩增细胞的细胞培养液，可进一步帮助免疫细胞生长，亦即，本发明的一实施例中所选用的rhIL-2浓度得以提高扩增后的细胞群中NK/NKT细胞总数。
表三：
实施例4、细胞培养液中抗-分化簇-3(Anti CD-3)的单株抗体浓度及添加次数的优化
体外扩增的免疫细胞应用于人体中以提升免疫力，进而对肿瘤细胞进行毒杀作用，为了能提高体外扩增的免疫细胞进入人体后所产生的免疫毒杀效能，除了需增殖大量的细胞外，所获得的细胞亦需具备细胞毒杀性，于此，本实施例进一步探讨用以于体外活化NK/NKT细胞的Anti CD-3单株抗体，其于扩增培养细胞的过程中较佳的用量；其取得前述的周边单核球细胞，以一较佳实施例1.00x106cells/mL为初始细胞密度，使用该周边血检体来源者的自体血清(包含500IU/ml的rhIL-2及Anti-CD3单株抗体)进行培养，试验组别分别为包含50、100、250或500ng/ml的Anti-CD3单株抗体。
如表四所示，使用50ng/ml及500ng/ml的Anti-CD3单株抗体进行培养的组别，相较于其它组别而言，于培养第20天时可达到较高的细胞总数，而为了能降低制备成本，并减少所制备的细胞群中外来物质的残留，进而降低因外来物质所诱发的免疫反应，以减少施用于人体时产生副作用的风险，于本发明的较佳一实施例中，选用50至500ng/ml的Anti-CD3单株抗体进行培养，此外，又如表五所示，于细胞培养液中添加50ng/ml的Anti-CD3单株抗体的条件，于细胞培养后分别于第0、5及7天各添加一次，相较于其它组别更能稳定地扩增细胞，除了维持实施例3能达到的扩增后细胞总数，同时提升扩增后的细胞群中具有毒杀活性的NK/NKT细胞的比例。
表四：
表五：
实施例5、扩增所得的自然杀手细胞(NK cell)及自然杀手T细胞(NKT cell)比例
经上述实施例的数据说明，本发明的体外扩增自然杀手细胞及自然杀手T细胞的方法，在取得周边单核球细胞并于培养18天内，细胞扩增量可达3,000至7,000倍，且细胞存活率高于85％；接着，本实施例进一步确立本发明的方法确实能针对初始细胞(即周边单核球细胞)中的NK/NKT细胞进行扩增。
于本实施例中，先经前述的实施例获得经扩增的细胞群落，再利用流式细胞仪(Flow cytometry)分析所扩增的细胞群落中有效细胞(即NK/NKT细胞)的占比；其分别依据NK细胞及NKT细胞的细胞专一性标记(cell marker)，通过流式细胞仪定量经扩增的细胞群落中NK/NKT细胞的比例，该NK细胞专一性标记分别为CD56及NK细胞活化受体CD16与NKG2D，此外，亦以CD3作为T细胞专一性标记以分析NKT细胞；试验以材料与方法所述的细胞表面抗原分析流程进行细胞群分析。
请见图3A及图3B，图3A为细胞表面颗粒性及细胞颗粒大小的分析结果，如结果所示，本实施例所分析的细胞样本，大多集中在同一群落，显示其细胞型态一致，且细胞样本并未明显区分为多个群落，显示其细胞存活率的一致性；图3B则为NK/NKT细胞于细胞群落中占比的分析结果，如图所示，左上角的细胞群如图3A所搜集的细胞群落中，不表现CD3但表现CD56的细胞群(CD3-CD56+)，其即为NK细胞，其占总细胞的比例为5.64％，此外，右上角为表现CD3亦表现CD56的细胞群(CD3+CD56+)，其即为NKT细胞，且其细胞比例为55.82％，由此可知，经本发明的方法所扩增的细胞群落中，NK/NKT细胞的比例达62.5％(NK细胞5.64+NKT细胞55.82)。
请接续参阅4A及4B，图4A右上角为显示细胞群落中同时表现CD16及CD56的细胞，其比例为总细胞的23.03％，接续自图4A选取CD16+CD56+的细胞群后，分析CD16+CD56+的细胞群中，表现NKG2D及CD3的细胞分布状态，结果如图4B所示，左上角为CD16+CD56+NKG2D+CD3-的细胞群，其即为NK细胞，右上角则为CD16+CD56+NKG2D+CD3+的细胞群，其即为NKT细胞，依据流式细胞仪的定量结果可以得知，同时表现NK细胞专一性标记CD16、CD56及NKG2D的NK/NKT细胞比例达16.9％(23.03％*(15.37+58.3)％＝16.9％)。
实施例6、扩增所得的自然杀手细胞(NK cell)及自然杀手T细胞的细胞毒杀能力
最后，为能确立本发明的体外扩增NK/NKT细胞的方法，其所制备的NK/NKT细胞得以符合制备为医药组成物的需求，本实施例利用材料与方法中所述的细胞毒杀性测试，进一步分析经扩增所得的NK/NKT细胞对于癌细胞的毒杀效果；请见图5A及5B，图5A显示了细胞样本呈现一致的细胞型态及细胞存活率，图5B则可清楚获知，与扩增所得的NK/NKT细胞共同培养的K562细胞，其细胞状态处于早期凋亡或凋亡过程的比例约为76.30％，亦即扩增所得的NK/NKT细胞对于癌细胞的毒杀效果可达76.30％。
综合上述实施例的说明，本发明所揭示的体外扩增自然杀手细胞及自然杀手T细胞的方法，经测试证实，其步骤中所使用的初始细胞密度，以及于特定的时间点更新细胞培养盘中的细胞密度，确实能够给予细胞较佳的生长环境，进而提升细胞的扩增效率，此外，该方法的细胞培养液所包含的添加物rhIL-2及anti-CD3单株抗体，除可更提升细胞生长效率外，亦能活化所扩增的NK/NKT细胞，如此，通过本发明的方法所获得的细胞，相较于已知技术，不仅可获得较高的细胞总数，同时能维持较佳的细胞存活率，以及较高的NK/NKT细胞比例，更甚者，经扩增后的NK/NKT细胞亦具有较佳的细胞毒杀性，亦即，本发明的方法确实可针对细胞群落中的NK/NKT细胞进行有效地扩增及活化，进而可进一步应用于医药组成物的制备。
虽然前述说明书已举出并详述多种不同的实施范例，使得本发明所属领域具通常知识者可以很容易地了解本发明的本质及特征。然而应了解，在不脱离其发明精神和范围的情况下，本发明亦可以从前述的描述再经过某些变化和修改，而使其更适用于各种用途和条件。因此，本说明书及其所述的申请专利范围应为示范用途，而非以任何方式限制本发明的范围。

Claims (10)

1.一种体外扩增自然杀手细胞及自然杀手T细胞的方法，其特征在于，包含以下步骤：
将一周边血单核球细胞悬浮于一细胞培养液中以获得一细胞混合液；
将该细胞混合液的细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL，做为一初始细胞密度，并使用该细胞培养液将该细胞混合液培养于一细胞培养盘中；
当该细胞培养盘中的总细胞数达2.5x106～5x106cells/mL时更新该细胞培养液，并重新将细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL；每隔2至3天更新该细胞培养液，并重新将细胞密度调整为0.5x106～5x106cells/mL，培养至少10至16天；以及清洗该细胞混合液并取得该细胞混合液中的一细胞群落，该细胞群落即一经扩增的该自然杀手细胞及自然杀手T细胞混合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，于悬浮该周边血单核球细胞的步骤前，更包含收集该周边血单核球细胞的步骤，其包含：
离心一周边血液检体，使该周边血液检体分层为一血浆层、一白细胞层及一红血球层；
去除该血浆层并取得该白细胞层，将该白细胞层混合于Hanks平衡盐溶液及一单核球细胞分离液中以获得一白细胞混合液；
离心以分层该白细胞混合液；以及
去除上清液，并取得中间层白色液体，即获得该周边单核球细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该细胞培养液包含：
一干细胞生长培养基；
一人类介白素-2重组蛋白，其浓度范围介于250至1000IU/mL；
一血清，其体积百分比介于1～10％；以及
一抗CD3单株抗体，其浓度范围介于10至500ng/mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，于调整该初始细胞密度的步骤中，将该细胞混合液的细胞密度调整为0.5x106～2.5x106cells/mL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，于更新该细胞培养液并重新调整细胞密度的步骤中，将该细胞混合液的细胞密度调整为0.5x106～2.5x106cells/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，于培养该细胞混合液的步骤中，将该细胞混合液置于37℃及5％二氧化碳的环境中培养。
7.如权利要求1所述的方法，其中特征在于，于取得该细胞群落的步骤前，更包含：分析该自然杀手细胞及该自然杀手T细胞于该细胞混合液中的细胞数比例，且比例介于30至90％，该自然杀手细胞是细胞表面抗原为CD16+CD56+CD3-的细胞群落，且该自然杀手T细胞是细胞表面抗原为CD16+CD56+CD3+的细胞群落。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，于清洗该细胞混合液并取得该细胞群落的步骤之后，更包含以一保存液悬浮该细胞群落的步骤，该保存液为一磷酸缓冲溶液或一细胞外液。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该经扩增的该自然杀手细胞及自然杀手T细胞混合物的细胞存活率达到至少60％，且该经扩增的该自然杀手细胞及自然杀手T细胞混合物中具细胞毒杀性的该自然杀手细胞及自然杀手T细胞达到至少50％。
10.一种自然杀手细胞及自然杀手T细胞的医药组成物，其特征在于，包含以权利要求1所述的方法制备所得的该经扩增的该自然杀手细胞及自然杀手T细胞混合物；以及一医药上可接受的溶剂。
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