JP2008501011A - 幹細胞を用いるinvitro技術 - Google Patents
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- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
Abstract
Description
本発明は全般的に、血管障害に罹患したヒト患者を治療する方法及び装置、特に血管新生及び/又は新脈管化及び/又は脈管新生を促進する方法及び装置に関する。
本出願は、以下の優先権を請求するものである:
(a)2004年6月1日に出願された米国特許仮出願第60/576,266号、「幹細胞と共に使用するin vitro技術」、及び
(b)2004年7月15日に出願された米国特許仮出願第60/588,520号、「幹細胞使用の指示」。
これらの出願は両方とも、本明細書の譲受人に譲渡されており、これらは本明細書に参照として組入れられている。
一部の動脈機能障害は、脂肪沈着による動脈の狭窄及び他の血管の異常により生じる。これは、血流を妨げ、並びに/又は組織及び臓器に十分な栄養素及び酸素が供給されることを妨害する。
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本特許出願は、組織由来の幹細胞を、単離、分化及び拡大する方法を詳述している。例えば、幹細胞は、内皮前駆細胞(EPC)を含んでよい。あるいは又は加えて、組織は、ヒト末梢血を含んでよい。典型的には、幹細胞は、ドナーへ又は他の個体へ移植される(例えば、脈管新生及び/又は血管新生及び/又は新脈管化を増強するため)。本特許出願は、適切な数の機能性EPCを含有する生成物を得るためのプロトコールを提供する。説明された方法は、(a)組織から細胞亜-集団を抽出する工程;(b)強化された培養培地において、培養物中のEPCを1〜30日間(又は3〜30又は4、5、6、7もしくは8日間)拡大及び分化する工程;並びに/又は、(c)培養物の細胞成分を同定する工程;(d)適切な数のEPCを患者へ移植する工程を含む。本明細書に説明された一部の態様は、特に血液由来のEPCへ関連しているが、本発明の範囲は、必要な変更を加えて、様々な体組織由来の幹細胞と共に使用する技術を含むことは理解されるべきである。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞の数を、2回通過細胞を3〜30日間の期間培養することにより増加させる工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
ある態様において、初回通過細胞の第二の勾配への適用は、初回通過細胞を、ポリビニルピロリドン-コートしたシリカコロイド、例えばパーコール(商標)(Amersham Biosciences, ウプスラ, スウェーデン)などを含む勾配へ適用することを含む。
幹細胞を含有する組織を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配へ適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配へ適用する工程;
2回通過細胞を、密度1.055〜1.068g/mlを有する3回通過細胞の選択に好適な第三の勾配へ適用する工程;
密度1.055〜1.068g/mlを有する細胞の数を、3回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させる工程;を含む、幹細胞を抽出するために使用する方法が提供される。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;並びに
血漿及び/又は抗体を含有する(例えば、被覆された)表面上で2回通過細胞をインキュベーションする工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;並びに
コラーゲン又はフィブロネクチン以外の増殖促進分子を含有する表面上で2回通過細胞を培養する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
2回通過細胞を、最大5%血清(例えば、無血清、1%未満の血清、又は1〜5%の血清)を含む培養培地において、1〜5日の持続する期間培養する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
2回通過細胞を、10%を超える血清を含む培養培地において、1〜5日の持続する期間培養する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
ある態様において、2回通過細胞の培養は、20%未満の血清を含む培養培地で2回通過細胞を培養することを含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
低-血清期間中に、2回通過細胞を、10%未満血清を含む培養培地において培養する工程;
高-血清期間中に、2回通過細胞を、10%より大きい血清を含む培養培地において培養する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
少なくとも2時間持続する低酸素及び/又は高炭酸(H/H)期間、2回通過細胞をH/H条件下で培養する工程;
少なくとも1日間持続する非-H/Hの期間、2回通過細胞を非-H/H条件下で培養する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
2回通過細胞を、エリスロポイエチン、VEGF、IGF、FGF、エストロゲンファミリー分子(例えば、17-β-エストラジオール、エストロン、エストリオール、エストラジオール誘導体、吉草酸エストラジオール、エストラジオールシピオネート、メストラノール、キネストロール)、プロゲスチン-ファミリーの分子(例えば、プロゲステロン、カロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン)、スタチン(例えば、シムバスタチン、アトロバスタチン)、及び糖尿病治療薬(例えば、ロシグリタゾン)の少なくとも1種を含む培養培地において培養する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
幹細胞を含有する組織を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;並びに
密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞の数を、2回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させる工程;を含む、幹細胞を抽出するために使用する方法が提供される。
ある態様において、この方法は、幹細胞の抽出を促進するために、骨髄由来の幹細胞を動員することを含む。
ある態様において、この方法は、幹細胞を、血液、臍帯血、胚、胎児もしくは胎盤から抽出することを含む。
2回通過細胞を、第一の容器内で、その期間の第一の部分の間培養する工程;
その期間の第一の部分の最後に、第一の容器から2回通過細胞の少なくとも一部を除去する工程;並びに
第一の容器から除去された細胞を、第二の容器において、その期間の第二の部分培養する工程;を含む。
ある態様において、増殖促進分子は、血漿(これは、自家、同種又は異種であることができる)、コラーゲン、フィブロネクチン、増殖因子及び幹細胞表面受容体に対する抗体からなるリストより選択される。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
2回通過細胞を、3〜30日の持続する期間培養することにより、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞の数を増加させる工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
ある態様において、初回通過細胞の第二の勾配への適用は、初回通過細胞を、イオジキサノールの水溶液へ適用することを含む。
ある態様において、初回通過細胞の第二の勾配への適用は、初回通過細胞を、ポリビニルピロリドン-被覆されたシリカコロイドを含む段階密度溶液へ適用することを含む。
ある態様において、初回通過細胞の第二の勾配への適用は、初回通過細胞のオプティプレップ-様勾配への適用を含む。
ある態様において、初回通過細胞の第二の勾配への適用は、初回通過細胞のパーコール-様勾配への適用を含む。
幹細胞を含有する組織を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配へ適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配へ適用する工程;
2回通過細胞を、密度1.055〜1.068g/mlを有する3回通過細胞の選択に好適な第三の勾配へ適用する工程;
密度1.055〜1.068g/mlを有する細胞の数を、3回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させる工程;並びに
培養された細胞中の内皮前駆細胞を同定する工程;を含む、幹細胞を抽出するために使用する方法も提供される。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
血漿を含有する表面上で2回通過細胞を培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
組織を、血漿を含む表面上で培養する工程;を含む、組織と共に使用する方法が提供される。
ある態様において、組織は血液を含む。
ある態様において、血漿は自家血漿を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
抗体を含有する表面上で2回通過細胞を培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
ある態様において、培養は、表面が自家血漿で被覆された場合に、表面上で2回通過細胞を培養することを含む。
ある態様において、培養は、表面が同種血漿及び異種血漿からなるリストより選択される少なくとも1種の血漿で被覆された場合に、表面上で2回通過細胞を培養することを含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
コラーゲン又はフィブロネクチン以外の増殖促進分子を含有する表面上で2回通過細胞を培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
ある態様において、2回通過細胞の培養は、増殖促進分子に加え、コラーゲン及びフィブロネクチンの少なくとも1種を含む表面上での、2回通過細胞の培養を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
2回通過細胞を、最大5%血清を含む培養培地において、1〜5日の持続する期間培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
ある態様において、前駆細胞は、内皮前駆細胞(EPC)を含み、前駆細胞の同定は、EPCの同定を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
2回通過細胞を、10%を超える血清を含む培養培地において、1〜5日の持続する期間培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
ある態様において、2回通過細胞の培養は、20%未満の血清を含む培養培地において、2回通過細胞を培養する工程を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
低-血清期間中に、2回通過細胞を、10%未満血清を含む培養培地において培養する工程;
高-血清期間中に、2回通過細胞を、10%より大きいか又は等しい血清を含む培養培地において培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
ある態様において、低-血清期間中の2回通過細胞の培養は、2回通過細胞の、血清を含有しない培養培地における培養を含む。
ある態様において、低-血清期間中の2回通過細胞の培養は、2回通過細胞の、1〜5日間の培養を含む。
ある態様において、低-血清期間の2回通過細胞の培養は、高-血清期間の2回通過細胞の培養前に行われる。
ある態様において、低-血清期間の2回通過細胞の培養は、高-血清期間の2回通過細胞の培養後に行われる。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
少なくとも2時間持続する低酸素期間、2回通過細胞を低酸素条件下で培養する工程;
少なくとも1日間持続する非低酸素の期間、2回通過細胞を非低酸素条件下で培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
ある態様において、低酸素及び非低酸素期間は、30日未満持続する培養期間以内であり、並びに2回通過細胞の低酸素条件下での培養は、培養期間の最初の2日間、2回通過細胞を低酸素条件で培養することを含む。
ある態様において、低酸素及び非低酸素期間は、30日未満持続する培養期間以内であり、並びに2回通過細胞の低酸素条件下での培養は、培養期間の最後の2日間、2回通過細胞を低酸素条件で培養することを含む。
ある態様において、2回通過細胞の低酸素条件下での培養は、2回通過細胞の非低酸素条件下での培養以前に行われる。
ある態様において、2回通過細胞の低酸素条件下での培養は、2回通過細胞の非低酸素条件下での培養以後に行われる。
第一の所望の密度範囲を有する細胞を選択するために、血液を勾配に適用する工程;
選択された細胞を、エストロゲンを含む培地において、及び引き続きプロゲスチンを含む培地において培養することにより、第二の所望の密度範囲を有する細胞の数を増加させる工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
第一の所望の密度範囲を有する細胞を選択するために、血液を勾配に適用する工程;
選択された細胞を、プロゲスチンを含む培地において、及び引き続きエストロゲンを含む培地において培養することにより、第二の所望の密度範囲を有する細胞の数を増加させる工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
第一の所望の密度範囲を有する細胞を選択するために、血液を勾配に適用する工程;
選択された細胞を、エストロゲン及びプロゲスチンを含む培地において培養することにより、第二の所望の密度範囲を有する細胞の数を増加させる工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
ある態様において、エストロゲンは、エストラジオールを含む。
ある態様において、培養は、3〜30日の持続する期間培養することを含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
少なくとも2時間持続する高炭酸期間、2回通過細胞を高炭酸条件下で培養する工程であり、この高炭酸期間が、5%よりも高いCO2レベルで特徴付けられる、工程;
少なくとも1日間持続する非高炭酸の期間、2回通過細胞を非高炭酸条件下で培養する工程であり、この非高炭酸期間が、5%未満か又は等しいCO2レベルで特徴付けられる、工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
2回通過細胞を、エリスロポイエチン、VEGF、IGF、FGF、エストロゲン、17-β-エストラジオール、エストロン、エストリオール、エストラジオール誘導体、吉草酸エストラジオール、エストラジオールシピオネート、メストラノール、キネストロール、プロゲスチン、プロゲスチンファミリー由来の分子、プロゲステロン、合成プロゲステロン、カロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、スタチン、シムバスタチン、アトロバスタチン、糖尿病治療薬、及びロシグリタゾンからなるリストより選択される少なくとも1種の物質を含む培養培地において培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法が提供される。
幹細胞を含有する組織を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞の数を、2回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させる工程;並びに
培養された細胞中の内皮前駆細胞を同定する工程;を含む、幹細胞を抽出するために使用する方法も提供される。
ある態様において、組織の適用は、胚細胞を第一の勾配へ適用することを含む。
ある態様において、組織の適用は、胎盤細胞を第一の勾配へ適用することを含む。
ある態様において、組織の適用は、胎児細胞を第一の勾配へ適用することを含む。
ある態様において、幹細胞の抽出を促進するために、骨髄由来の幹細胞を動員する。
ある態様において、幹細胞を、末梢血から抽出する工程を含む。
ある態様において、2回通過細胞の培養は:
2回通過細胞を、第一の容器内で、その期間の第一の部分の間培養する工程;
その期間の第一の部分の最後に、第一の容器から2回通過細胞の少なくとも一部を除去する工程;並びに
第一の容器から除去された細胞を、第二の容器において、その期間の第二の部分培養する工程;を含む。
ある態様において、2回通過細胞の少なくとも一部の除去は、第一の容器の表面に接着しない除去細胞の選択を含む。
ある態様において、増殖促進分子は、血漿、コラーゲン、フィブロネクチン、増殖因子及び幹細胞表面受容体に対する抗体からなるリストより選択される。
ある態様において、増殖促進分子は、血漿、コラーゲン、フィブロネクチン、増殖因子及び幹細胞表面受容体に対する抗体からなるリストより選択される。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;並びに
密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞の数を、2回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させる工程;によるEPCの生成を含む。
幹細胞を含む組織を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
2回通過細胞を、密度1.055〜1.068g/mlを有する3回通過細胞の選択に好適な第三の勾配に適用する工程;並びに
密度1.055〜1.068g/mlを有する細胞の数を、3回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させる工程;によるEPCの生成を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;並びに
2回通過細胞を、抗体を含む表面上で培養する工程;によるEPCの生成を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;並びに
2回通過細胞を、コラーゲン又はフィブロネクチン以外の増殖促進分子を含む表面上で培養する工程;によるEPCの生成を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;並びに
2回通過細胞を、最大5%血清を含む培養培地において、1〜5日の持続する期間培養する工程;によるEPCの生成を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;並びに
2回通過細胞を、10%よりも多い血清を含む培養培地において、1〜5日の持続する期間培養する工程;によるEPCの生成を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
低-血清期間中、2回通過細胞を、10%未満血清を含む培養培地において培養する工程;並びに
高-血清期間中、2回通過細胞を、10%よりも多いか又は等しい血清を含む培養培地において培養する工程;によるEPCの生成を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
少なくとも2時間持続する低酸素の期間中、2回通過細胞を、低酸素条件下で培養する工程;並びに
少なくとも1日持続する非低酸素の期間中、2回通過細胞を、非低酸素条件下で培養する工程;によるEPCの生成を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
少なくとも2時間持続する高炭酸の期間中、2回通過細胞を、高炭酸条件下で培養する工程であり、高炭酸期間が、5%を超えるCO2レベルを特徴とする工程;並びに
少なくとも1日持続する非高炭酸の期間中、2回通過細胞を、非高炭酸条件下で培養する工程であり、非高炭酸期間が、5%未満か又は等しいCO2レベルを特徴とする工程;によるEPCの生成を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;並びに
2回通過細胞を、エリスロポイエチン、エストロゲン、エストロゲン-ファミリー分子、17-β-エストラジオール、エストロン、エストリオール、エストラジオール誘導体、吉草酸エストラジオール、エストラジオールシピオネート、メストラノール、キネストロール、プロゲスチン、プロゲスチンファミリー由来の分子、プロゲステロン、合成プロゲステロン、カロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、スタチン、シムバスタチン、アトロバスタチン、糖尿病治療薬、及びロシグリタゾンからなるリストより選択される少なくとも1種の物質を含む培養培地において培養する工程;
幹細胞を含む組織を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;並びに
2回通過細胞を、3〜30日の持続する期間培養することにより、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞の数を増加させる工程;によるEPCの生成を含む。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞の数を、2回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させる工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用する工程;
初回通過細胞を、各々それらの第一部分及び第二部分に分割する工程;
初回通過細胞の第一部分を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用する工程;
初回通過細胞の第二部分を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞と混合する工程;
密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞の数を、2回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させる工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
血液を、第一の所望の密度範囲を有する細胞を選択するための勾配に適用する工程;
選択された細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより第二の所望の密度範囲を有する細胞の数を増加させる工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
ある態様において、血液の勾配への適用は、血液を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞を選択するのに好適な勾配へ適用することを含む。
ある態様において、細胞数の増加は、細胞を4〜8日の持続する期間培養することを含む。
ある態様において、血液の勾配への適用は、血液を、ショ糖とエピクロロヒドリンとのコポリマーを含む溶液へ適用することを含む。
ある態様において、血液の勾配への適用は、血液を、イオジキサノールの水溶液へ適用することを含む。
ある態様において、血液の勾配への適用は、血液を、フィコール-様勾配へ適用することを含む。
ある態様において、血液の勾配への適用は、血液を、オプティプレップ-様勾配へ適用することを含む。
ある態様において、血液の勾配への適用は、血液を、パーコール-様勾配へ適用することを含む。
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用する工程;
選択された細胞を、3〜30日の持続する期間、自家血漿を含む表面上で培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用する工程;
選択された細胞を、抗体を含む表面上で培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用する工程;
選択された細胞を、コラーゲン又はフィブロネクチン以外の増殖促進分子を含む表面上で培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用する工程;
選択された細胞を、最大5%の血清を含む培養培地において1〜5日の持続する期間培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用する工程;
選択された細胞を、10%よりも多い血清を含む培養培地において1〜5日の持続する期間培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用する工程;
低-血清期間中に、10%未満の血清を含む培養培地において選択された細胞を培養する工程;
高-血清期間中に、10%よりも多いか又は等しい血清を含む培養培地中で選択された細胞を培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
ある態様において、低-血清期間中の細胞の培養は、血清-非含有培養培地において細胞を培養することを含む。
ある態様において、低-血清期間中の細胞の培養は、1〜5日の期間細胞を培養することを含む。
ある態様において、高-血清期間中の細胞の培養は、1〜30日の期間細胞を培養することを含む。
ある態様において、低-血清期間中の細胞の培養は、高-血清期間中の細胞培養以前に行われる。
ある態様において、低-血清期間中の細胞の培養は、高-血清期間中の細胞培養以後に行われる。
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用する工程;
少なくとも2時間持続する低酸素の期間中、選択された細胞を低酸素条件下で培養する工程;
少なくとも1日間持続する非低酸素の期間中、選択された細胞を非低酸素条件下で培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用する工程;
少なくとも2時間持続する高炭酸の期間中、選択された細胞を高炭酸条件下で培養する工程であり、高炭酸期間は、5%よりも大きいCO2レベルにより特徴付けられる工程;
少なくとも1日持続する非高炭酸の期間中、選択された細胞を非高炭酸条件下で培養し、非高炭酸期間は、5%未満か又は等しいCO2レベルにより特徴付けられる工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
血液を、第一の所望の密度範囲を有する細胞の選択に好適な勾配に適用する工程;
選択された細胞を、VEGF、IGF、FGF、エリスロポイエチン、エストロゲン、エストロゲン-ファミリー分子、17-β-エストラジオール、エストロン、エストリオール、エストラジオール誘導体、吉草酸エストラジオール、エストラジオールシピオネート、メストラノール、キネストロール、プロゲスチン、プロゲスチンファミリー分子、プロゲステロン、合成プロゲステロン、カロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、スタチン、シムバスタチン、アトロバスタチン、糖尿病治療薬、及びロシグリタゾンからなるリストより選択される少なくとも1種の物質を含む培養培地において培養する工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、血液を抽出するために使用する方法も提供される。
ある態様において、血液の勾配への適用は、血液を、密度1.077g/ml未満を有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む。
ある態様において、血液の勾配への適用は、血液を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む。
幹細胞を含有する組織を、第一の所望の密度範囲を有する細胞の選択に好適な勾配に適用する工程;
選択された細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより、第二の所望の密度範囲を有する細胞の数を増加させる工程;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定する工程;を含む、幹細胞を抽出するために使用する方法も提供される。
ある態様において、組織の適用は、胚細胞の勾配への適用を含む。
ある態様において、組織の適用は、胎児細胞の勾配への適用を含む。
ある態様において、組織の適用は、胎盤細胞の勾配への適用を含む。
ある態様において、方法は、幹細胞の抽出を促進するために、骨髄由来の幹細胞を動員することを含む。
ある態様において、方法は、血液から幹細胞を抽出することを含む。
細胞を、第一の容器において、その期間の第一の部分の間培養する工程;
その期間の第一の部分の終了時に、第一の容器から細胞の少なくとも一部を除去する工程;並びに
第二の容器内で、その期間の第二の部分、第一の容器から除去した細胞を培養する工程;を含む、細胞を培養することを含む。
ある態様において、細胞の少なくとも一部の除去は、第一の容器の表面に接着しない除去細胞を選択する工程を含む。
ある態様において、第一の容器は、それらの表面上に増殖促進分子を含み、並びに第一の容器における細胞の培養は、増殖促進分子を含む第一の容器において細胞を培養することを含む。
ある態様において、増殖促進分子は、血漿、コラーゲン、フィブロネクチン、増殖因子及び幹細胞表面受容体に対する抗体からなるリストより選択される。
ある態様において、増殖促進分子は、血漿、コラーゲン、フィブロネクチン、増殖因子及び幹細胞表面受容体に対する抗体からなるリストより選択される。
本発明の態様に従い、内皮前駆細胞(EPC)を、ヒト末梢血から単離、分化、及び増殖する方法が提供される。EPCは典型的には、脈管新生及び/又は血管新生及び/又は新脈管化を誘導するために、患者に移植される。典型的には、フィコール(Ficoll)のような密度勾配により分離される末梢血単核細胞(PBMC)は、更に1種又は複数の他の密度勾配(例えば、パーコール(Percoll)、オプティプレップ(OptilPrep)、又はNycodenzなど)により濃縮され、その後組織培養皿に接着することが可能になる。細胞は典型的には、強化培養培地において3〜30日間増殖される。培養期間のいくつかの時点で、表現型評価のための試料が採取される。拡大された細胞は収集され、患者へ移植されるまで保存される。
培養皿のような適当な容器は、EPC-増殖促進分子の1種又は組合せでコーティングされてもよい。これらの分子は、CD34、CD133、Tie-2、VEGFR-2(KDR)、CD144などの前駆体細胞表面受容体に対する抗体、又はLDL、VEGF、FGF、IGF、もしくは血小板-由来増殖因子(PDGF)などの分子を含むことができる。
20個のT-75フラスコに関して:細胞調製日に調製。
T-75フラスコ表面の血漿によるコーティングは、遠心分離された組織試料から除去された自家血漿、あるいは、Chemicon(Temecula, CA, US)から市販されている血漿など、様々な供給業者からの血漿を用いて行うことができる。
フィコールチューブの上側画分から血漿を収集する。
各フラスコへ血漿2〜5mlを充填する。
37℃で少なくとも30分間インキュベーションする。
血漿を廃棄する。
フラスコを10ml PBSにより2回洗浄する。
フラスコはそのまま使用することができる。
20個のT-75フラスコに関して:(a)細胞調製日、又は(b)細胞調製の前日に調製。
PBS中25μg/mlフィブロネクチン溶液50mlを調製する。
250μlフィブロネクチン5mg/mlをPBS 50mlへ添加する。
各フラスコへフィブロネクチン25μg/mlの2〜5mlを充填する。
37℃で少なくとも30分間インキュベーションする。
フィブロネクチン溶液を収集する。
フィブロネクチン溶液は、滅菌50mlチューブ中で4℃で貯蔵される場合は、典型的には最大1週間、再使用することができる。
フラスコをPBSで2回洗浄する。
乾燥したフラスコを室温で保管する。
乾燥したフラスコは、室温(RT)で1週間保存することができる。
20個のT-75フラスコに関して:(a)細胞調製日、又は(b)細胞調製の前日に調製。
実施例1に説明されたように、フラスコをフィブロネクチンによりコーティングする。
PBS中5μg/ml抗-CD34溶液25mlを調製する。
抗-CD34 1mg/mlの125μlをPBS 25mlへ添加する。
各フラスコへ抗-CD34 5μg/mlの5mlを充填する。
37℃で2時間又は4℃で一晩、インキュベーションする。
抗体溶液を除去する。
フラスコをPBSで2回洗浄する。
フラスコはそのまま使用することができる。
血液バッグを上下に穏やかに反転することにより、血液を混合する。
血液をバッグから、滅菌500mlボトルへ移す。
血液をフィコール勾配に負荷する。
チューブに、血液を最大50ml充填する。
チューブを1050gで20分間、室温で回転する。
上側層からほとんどの血漿を、空の50mlチューブへ収集する。
白血球リング(例えばPBMC)画分を各チューブから収集する。
各PBMCを、PBS 15〜20mlを予め充填した新たな50mlチューブへ移す。
PBSを用い1本のチューブの容積を30mlに調節する。
チューブを、580gで15分間、室温で回転し、上清を廃棄する。
細胞ペレットを穏やかに混合し、PBS 1〜5mlに再懸濁する。
4本毎のチューブの内容物を、1個の50mlチューブにまとめ、チューブにPBSを最大50mlまで充填する。
(1)オプティプレップ勾配1.072g/mlの調製
1.072g/mlのオプティプレップ勾配36mlに関して
(i)0.5%ヒト又はウシ血清アルブミン、0.8% NaCl、10mM Hepes、1mM EDTA(pH7.4へ緩衝)の溶液25ml;を、(ii)10ml オプティプレップ溶液+0.5%ヒト又はウシ血清アルブミン、0.8% NaCl、10mM Hepes、1mM EDTA(pH7.4へ緩衝)溶液5mlの混合物11mlと;一緒に混合することにより、1.072g/mlの勾配を調製。
(a)先に説明された細胞調製工程からの細胞10ml;を、(b)10ml オプティプレップ溶液+0.5%ヒト又はウシ血清アルブミン、0.8% NaCl、10mM Hepes、1mM EDTA(pH7.4へ緩衝)溶液5mlの混合物10ml;と一緒に混合。
(a)及び(b)20mlの混合物を、工程(i)及び(ii)で調製した1.072g/mlのオプティプレップ勾配の表面に配置し、並びにこの表面へ、0.5%ヒト又はウシ血清アルブミン、0.8% NaCl、10mM Hepes、1mM EDTA(pH7.4へ緩衝)の1.5ml溶液を配置する。
例えば室温又は4℃での、ブレーキを使用しない、70Ogで30分間の遠心分離。
単離された細胞を、勾配と、0.5%ヒト又はウシ血清アルブミン、0.8% NaCl、10mM Hepes、1mM EDTA(pH7.4へ緩衝)の溶液の境界面から収集する。
395gで10分間、室温で遠心分離する。
上清を廃棄、及びペレットを培養培地10mlへ再懸濁する。
例えば、30ml連続パーコール勾配調製物について:50mlチューブにおいて13.5ml パーコール (Amersham)、15.0ml MEM Spinner修飾物、1.5ml 10xEarle's塩溶液を混合し、
固定角ローターを使用し、ブレーキをかけず、14000 x gで10分間遠心分離する。
ローターの外側の勾配を慎重に採取する。この勾配はすぐに使用される。
このチューブは、14000 x gでの遠心分離に耐えることができなければならない。パーコール勾配上に細胞全てを適用する。
ブレーキをかけず、400 x gで30分間遠心分離する。
濃縮されたPBMCを収集し、50mlチューブへ移す。
チューブにPBSを充填し、300 x gで10分間遠心分離する。
PBS 50ml中に再懸濁し、200 x gで10分間遠心分離する。
PBS 50ml中に再懸濁し、200 x gで10分間遠心分離する。
細胞カウントのために試料50μlを採取する。
血清は、患者の凝固した血漿から直接得るか(「血餅除去」血清)、又は抗凝固剤で前処理された血液から作製された血漿から調製することができる。
例えば、抗凝固剤で前処理された血液からの血清の調製に関して:
フィコールチューブ(前記細胞調製の説明参照)の上側画分から収集した血漿を採取する。
各50ml血漿に関して、凝固機構を触媒するために、0.8M CaCl22H2Oを1.2ml、又は塩化カルシウム、トロンボプラスチン、トロンビンアゴニストペプチドもしくはそれ以外などのいずれか他の化学/生物学的凝固誘導剤を添加する。
37℃で0.5〜4時間インキュベーションする。
凝固された血漿を、3500gで10分間回転する。
新たなチューブに血清を収集する。血餅が、血清と混合しないようにする。
培地調製のために収集された血清を使用するか、又は等分し、使用時まで-20℃で保存する。
4個の96ウェルプレートに、トリパンブルー(TB)50μlを各々に予め充填する。
細胞試料20μlを、1個のTB含有ウェルに移し、1:5希釈液を作製し、上下のピペッティングにより穏やかに混合する。
希釈した細胞10μlを、血球計算盤の2チャンバーの各々に負荷する。
上下チャンバーの中心25四角に存在する、透明な(生存)及び青色(死滅)細胞をカウントする。
10細胞よりも少ない数がカウントされた場合は、細胞試料50μlを、TB 50μlに移すことにより1:2希釈する。
200細胞よりも多い数がカウントされた場合は、1:5懸濁液20μlを、1個のTB-含有ウェルに移し、上下のピペッティングにより穏やかに混合することにより、1:25希釈液を作製する。
下記式に従い、各チャンバーの細胞数を計算する:
生存細胞数 x 10,000 x 希釈係数 = 生存細胞数 /ml
死滅細胞数 x 10,000 x 希釈係数 = 死滅細胞数 /ml
死滅細胞率(%)=死滅細胞数/(生存細胞数 + 死滅細胞数)x100
死滅細胞率(%)は典型的には、30%を超えてはならない。
平均細胞数を計算する。
カウント結果の記録。
最終の細胞数及び細胞収量/ml血液のまとめ。
必要な培地容積を計算する。
培養培地の調製。
培地は、1〜20%自家血清を含まなければならない。
培地は、下記添加剤を、0.5pg/ml〜1ng/ml、又は1ng/ml〜100μg/mlの様々な濃度で含有することができ:例えば、EPO(0.01〜10 IU/ml)、IGF(1〜100ng/ml)、FGF 10〜100ng/ml、VEGF (0.5〜20 ng/ml);ヘパリン5〜100 IU/ml;様々な分子は、それらの質量により左右され、及び望ましいモル濃度は、pg〜μgの範囲であるか、又はこれと対応するモル濃度であることができる:スタチン分子(例えば、シムバスタチン5〜500μg/ml)、糖尿病治療薬(例えば、ロシグリタゾン5〜500μg/ml)、及び/又はステロイドホルモン、例えばエストロゲン(例えば、17-β-エストラジオール(2〜2000ng/ml)及びプロゲスチン(例えば、プロゲステロン2〜2000ng/ml)、並びにそれらの組合せ。
培地100mlに関して以下が添加される:
VEGF 100μg/mlを2μl(最終濃度10μg/ml)
ヘパリン5000U/ml 100μl(最終濃度5U/ml)
自家血清5ml
血清-非含有培地94.9ml
培地100mlに関して以下が添加される:
VEGF 100μg/mlを2μl(最終濃度10μg/ml)
ヘパリン5000U/ml 100μl(最終濃度5U/ml)
自家血清20ml
血清-非含有培地79.9ml
培地100mlに関して以下が添加される:
VEGF 100μg/mlを5μl(最終濃度10μg/ml)
ヘパリン5000U/ml 100μl(最終濃度5U/ml)
プロゲステロン5mg/ml 4μl (最終濃度0.2μg/ml)
自家血清10ml
血清-非含有培地89.9ml
培地100mlに関して以下が添加される:
VEGF 100μg/mlを5μl(最終濃度10μg/ml)
ヘパリン5000U/ml 100μl(最終濃度5U/ml)
17-β-エストラジオール0.05mg/ml 4μl (最終濃度0.002μg/ml)
自家血清10ml
血清-非含有培地89.9ml
培地100mlに関して以下が添加される:
VEGF 100μg/mlを5μl(最終濃度10μg/ml)
ヘパリン5000U/ml 100μl(最終濃度5U/ml)
プロゲステロン0.05mg/ml 4μl (最終濃度0.002μg/ml)
17-β-エストラジオール0.005mg/ml 4μl (最終濃度0.0002μg/ml)
自家血清10ml
血清-非含有培地89.9ml
培地100mlに関して以下が添加される:
VEGF 100μg/mlを2μl(最終濃度10μg/ml)
ヘパリン5000U/mlを100μl(最終濃度5U/ml)
シムバスタチン 570μMを330μl(最終濃度0.95μM)
自家血清10ml
血清-非含有培地89.6ml
一緒にした細胞懸濁液から細胞を分離する。
チューブを50Ogで15分間、室温で回転し、上清を廃棄する。
細胞ペレットを穏やかに混合し、細胞を5〜50x106/mlに再懸濁する。
1〜5x106細胞/mlで播種する。
フラスコを37℃、5% CO2でインキュベーションする。
細胞を低血清レベル(例えば最大5%)含む培地においてインキュベーションする。あるいは又は加えて、高(>10%)血清レベルを使用する。
本発明の態様に従い、細胞は、低-血清培地中でインキュベーションし、その後高-血清培地中でインキュベーションする。
培養物の形態の試験を行う。
培地の交換は、2〜3日毎に行う。
例えば、細胞がT-75フラスコ中で培養される場合:
1. 細胞を50mlチューブ中に収集する。
2. 各フラスコに新鮮な培地5mlを充填する。
3. チューブを450gで10分間、室温で回転し、上清を廃棄する。
4. 細胞ペレットを穏やかに混合し、各フラスコについて新鮮な培地5mlに細胞を再懸濁する。
5. 細胞懸濁液5mlを各フラスコに戻す。
6. 蛍光標示式細胞分取器(FACS)及び/又は免疫組織化学分析のための細胞を、数日毎(例えば、6、9、13、16、20、24及び30日目)に採取する。
7. 培養物が処理される限りは、培養物の形態を調べ記録する。
8. 手技の最初及び最後、並びに培養期間中10日毎に、無菌試験のために増殖皿から培養培地を採取する。
9. 全ての培養細胞を収集する(下記項目参照「FACS染色のための細胞の収集」)。
一部の適用に関して、細胞の増加した拡大及び分化は、細胞培養物を、低酸素条件(例えば、1〜5%又は5〜15%酸素)及び/又は高炭酸条件(例えば、6〜10% CO2)に2〜48時間曝露することにより得られる。これは典型的には、細胞培養時の異なる時点で、1回又は複数回行われる。
培養1日目に、酸素管理したインキュベーター内でT-75 フラスコをインキュベーションする。酸素圧5%に設定及び/又はCO2濃度を5%を上回るように設定(例えば、6%〜8%、又は8%〜10%)し、これをこのレベルで6時間維持する。インキュベーターからフラスコを取り出し、培養物を試験する。細胞の試料を採取し、トリパンブルー排除法により生存度について試験する。インキュベーターの酸素圧を21%に設定し、及び/又はCO2濃度を5%に設定する。フラスコをインキュベーターへ再挿入し、その期間の残りの時間インキュベーションを継続する。この手法は、例えば、培養期間中週1回及び/又は培養終了前24、48、又は72時間以内に反復することができる。
例えば:
一部の適用に関して、細胞の増加した拡大及び分化は、培養培地中の新たな予め被覆された皿上に収集された細胞を再播種することにより、実現することができる。
培養の3日目又は4日目に、全ての培養された細胞を収集する(下記「FACS染色のための細胞収集」の項参照)。チューブを、450gで10分間、室温で回転する。上清を廃棄する。その後、ペレットを穏やかに混合し、細胞を、フラスコ1個につき新鮮な培地10ml中に再懸濁する。最後に、懸濁した細胞を、新たな予めコートしたT-75フラスコへ播種する。細胞の培養を継続し、本明細書に説明されたように、適宜、他の活動を全て行う(例えば、培地交換、目視検査、及び/又はフローサイトメトリー)。
この手技は、培養期間中週1回及び/又は培養終了前24、48、又は72時間以内に行うことができる。
細胞は、保存培地に維持するか、又は使用するまで、例えば患者への移植するまで凍結緩衝液中で凍結することができる。
細胞を50mlチューブ中に収集する。
冷PBSでピペッティングすることにより、慎重にフラスコ表面を洗浄し、接着細胞を剥離する。
洗浄した接着細胞を50mlチューブに収集する。
冷PBS 5mlを添加する。
細胞スクレーパーを用い穏やかに円を描くことにより、接着細胞の剥離を維持する。
適当ならば、5ml EDTAを添加し、37℃で5分間インキュベーションする。剥離した細胞を収集し、これらをチューブに加える。
チューブを450gで5分間、室温で回転する。ペレットを2〜5ml PBS中に再懸濁する。
細胞をカウントし、カウント結果を記録する。
各操作日について、最終の細胞数及び播種した細胞の収量数をまとめる。
FACSのために細胞を当量に分ける。
細胞をPBSで洗浄する。
チューブを450gで5分間、4〜8℃で回転する。
緩衝液を注傾し、及び残りを組織上に吸収することにより、上清全体を廃棄する。
細胞ペレットを穏やかに混合する。
染色試薬(染色表に従う)を添加し、細胞ペレットを混合する。
チューブを15〜30分間氷上、暗所でインキュベーションする。
細胞をPBSで洗浄する。
チューブを450gで5分間、4〜8℃で回転する。
緩衝液を注傾し、及び残りを組織上に吸収することにより、上清全体を廃棄する。
細胞ペレットを穏やかに混合する。
1本のチューブにつき0.5ml PBS (又は、チューブが1x106個未満の細胞を含む場合は、これ未満)を添加する。
凝集物が視認できる場合は、細胞懸濁液を、200μmメッシュを通して移す。
FACS装置を用い染色結果を判読する。
FACS結果をまとめ記録する。
1. 培養された細胞を収集する(「FACS染色のための細胞収集」の項参照)
2. M199中に50ng/ml SCF、2IU/ml EPO、5ng/ml IL-3及び25mg/ml BTI-内皮細胞増殖補因子(ECGS)を含有する強化培地0.7ml中に 100x103個細胞を懸濁する。
3. 丸底チューブへ、下記成分を添加し、穏やかに混合する;
3.1. メチルセルロース2%−1.4ml
3.2. FCS−0.9ml
3.3. 細胞懸濁液−0.7ml
4. 2個の35mmペトリ皿に混合物各3mlを播種した(各々中1.5ml)。
5. ddH2Oを予め充填した別の35mmペトリ皿を含む100mmペトリ皿中に、35mmペトリ皿の両方を配置した。
6. 37℃、5% CO2、湿度97%下でインキュベーションする。
7. 10〜14日後に、倒立顕微鏡を用いて、コロニーをスコア化する。
1. ECMatrixを4℃で一晩解凍する。
2. 滅菌微量遠心チューブ中のECMatrix溶液900μlへ、10x希釈緩衝液を100μl添加する。
3. 穏やかに混合;この溶液はピペッティングしない。溶液は固化を避けて、氷上に維持する。
4.緩衝したECMatrix溶液40μlを、予め4℃で一晩冷却した96-ウェル組織培養プレートの各ウェルに移す。
5. 37℃で少なくとも1時間インキュベーションし、マトリックス溶液を固化させる。
6. 培養された細胞を収集する(「FACS染色のための細胞収集」の項参照)。
7. M199中に10%ヒト血清、25μg/ml BTI-内皮細胞増殖補因子(ECGS)及び5IU/mlヘパリンを含有する強化培地中に、0.15x106個になるよう細胞を懸濁する。
8.重合したECMatrixの表面上に1個のウェルにつき150μlの細胞懸濁液をピペッティングする。
9. 37℃、5% CO2、湿度97%下で一晩インキュベーションする。
10. 倒立顕微鏡下、倍率40X-200Xで、管形成を観察する。
細胞がヒトへ移植される場合、典型的には下記の条件に合致しなければならない:
(I)細胞は一般に、あらゆる細菌又はウイルスの夾雑を含まないこと。
(II)細胞は、(a)リンパ球よりもより大きいサイズ、及び/又は(b)長い、紡錘型もしくは不規則型、及び/又は(c)顆粒状もしくは暗い核、及び/又は(d)鞭毛様構造もしくは原虫、及び/又は(e)線維芽細胞様もしくは多角形の形で、形態学的に特徴付けられること。
(III)最終的細胞懸濁液は一般に、以下の1種又は複数のマーカーを発現している細胞を少なくとも1x106個含むこと:CD31、及び/又はCD34、及び/又はCD133及び/又はCD34+CD133、及び/又はKDR、及び/又はCD34+KDR、及び/又はCD144、及び/又はvon Willebrand因子、及び/又はSH2(CD105)、及び/又はSH3、及び/又はフィブロネクチン、及び/又はコラーゲン(I、III及びIV型)、及び/又はICAM(1又は2型)、及び/又はVCAM1、及び/又はビメンチン及び/又はBMP-R IA及び/又はBMP-RII及び/又はCD44及び/又はインテグリンb1及び/又はaSM-アクチン及び/又はMUC18及び/又は酵素反応Dil-Ac-LDLに陽性。
実施例1. EPCの2回通過単離を、先に説明されたような、フィコール(初回通過)及びオプティプレップ(2回通過)を使用する7回の個別の実験で行った。表1の結果は、2回通過細胞におけるCD34+細胞の割合の濃縮を示している。濃縮は、2回通過後のCD34+細胞の割合を、オプティプレップを使用する初回通過後のCD34+細胞の割合により除算したものとして定義している。
図1は、培養物中の初回通過EPC濃縮からの管形成試験を示す。
・緑内障。本疾患は、視神経乳頭の虚血に関連した視神経繊維の進行性死滅からなる。視神経乳頭の脈管構造の回復につながる治療は、一般に、本疾患の進行を停止し、並びに視神経機能の一部を回復する(それらの軸索は神経乳頭部で損なわれているにもかかわらず、その視神経線維の少なくとも一部において細胞体がまだ死んでいない)。本発明の態様において、EPCの視神経乳頭及び/又はその周囲への注射は、一般に、所望の脈管構造の誘導に作用する(前記Flammera Jらの論文参照)。
(a)2004年6月1日に出願された米国特許仮出願第60/576,266号「In vitro techniques for use with stem cells」、並びに
(b)2004年7月15日に出願された米国特許仮出願第60/588,520号「Indications for stem cell use」。
これらの両出願は、本特許出願の譲渡人に譲渡されており、本明細書に参照として組入れられている。
一部の適用に関して、本明細書に説明された技術は、動物組織に適用される。
Claims (176)
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞数を、2回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させ;及び
培養された細胞中の内皮前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 血液の第一の勾配への適用が、血液を、ショ糖とエピクロロヒドリンとのコポリマーを含有する溶液に適用することを含む、請求項1記載の方法。
- 初回通過細胞の第二の勾配への適用が、初回通過細胞をイオジキサノール水溶液に適用することを含む、請求項1記載の方法。
- 初回通過細胞の第二の勾配への適用が、初回通過細胞をポリビニルピロリドン-被覆されたシリカコロイドを含む段階密度溶液に適用することを含む、請求項1記載の方法。
- 血液細胞の第一の勾配への適用が、血液細胞をフィコール(Ficoll)-様勾配に適用することを含む、請求項1記載の方法。
- 初回通過細胞の第二の勾配への適用が、初回通過細胞をオプティプレップ(OptilPrep)-様勾配に適用することを含む、請求項1記載の方法。
- 初回通過細胞の第二の勾配への適用が、初回通過細胞をパーコール(Percoll)-様勾配に適用することを含む、請求項1記載の方法。
- 幹細胞を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
幹細胞を含む組織を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配へ適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配へ適用し;
2回通過細胞を、密度1.055〜1.068g/mlを有する3回通過細胞の選択に好適な第三の勾配へ適用し;
密度1.055〜1.068g/mlを有する細胞数を、3回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させ;及び
培養された細胞中の内皮前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記の第三の勾配が、密度1.059〜1.068g/mlを有する細胞の選択に適し、及びここで前記の2回通過細胞の第三の勾配への適用が、密度1.059〜1.068g/mlを有する細胞を選択することを含む、請求項8記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
血漿を含む表面上で2回通過細胞を培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記培養が、表面が自家血漿で被覆された時に、表面上で2回通過細胞を培養することを含む、請求項10記載の方法。
- 前記培養が、表面が同種血漿及び異種血漿からなる群から選択される少なくとも1種の血漿で被覆された時に、表面上で2回通過細胞を培養することを含む、請求項10記載の方法。
- 血漿を含む表面上で組織を培養するステップを含む、組織と共に使用する方法。
- 前記組織が、血液を含む、請求項13記載の方法。
- 前記血漿が、自家血漿を含む、請求項13記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
抗体を含有する表面上で2回通過細胞を培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項16記載の方法。
- 前記培養が、表面が自家血漿で被覆された時に、表面上で2回通過細胞を培養することを含む、請求項16記載の方法。
- 前記培養が、表面が同種血漿及び異種血漿からなるリストより選択される少なくとも1種の血漿で被覆された時に、表面上で2回通過細胞を培養することを含む、請求項16記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
コラーゲン又はフィブロネクチン以外の増殖促進分子を含有する表面上で2回通過細胞を培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項20記載の方法。
- 2回通過細胞の培養が、前記増殖促進分子に加え、コラーゲン及びフィブロネクチンの少なくとも1種を含む表面上で、2回通過細胞を培養することを含む、請求項20記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
2回通過細胞を、最大5%血清を含む培養培地において、1〜5日の持続する期間培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定が、EPCの同定を含む、請求項23記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
2回通過細胞を、10%を超える血清を含む培養培地において、1〜5日の持続する期間培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項25記載の方法。
- 2回通過細胞の培養が、20%未満の血清を含む培養培地において、2回通過細胞を培養する工程を含む、請求項25記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
低-血清期間中に、2回通過細胞を、10%未満の血清を含む培養培地において培養し;
高-血清期間中に、2回通過細胞を、10%以上の血清を含む培養培地において培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項28記載の方法。
- 低-血清期間中の2回通過細胞の培養が、2回通過細胞の、最大5%の血清を含む培養培地における培養を含む、請求項28記載の方法。
- 低-血清期間中の2回通過細胞の培養が、2回通過細胞の、無血清培養培地における培養を含む、請求項28記載の方法。
- 低-血清期間中の2回通過細胞の培養が、2回通過細胞の、1〜5日間の培養を含む、請求項28記載の方法。
- 高-血清期間中の2回通過細胞の培養が、2回通過細胞の、1〜30日間の培養を含む、請求項28記載の方法。
- 低-血清期間の2回通過細胞の培養が、高-血清期間の2回通過細胞の培養前に行われる、請求項28記載の方法。
- 低-血清期間の2回通過細胞の培養が、高-血清期間の2回通過細胞の培養後に行われる、請求項28記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
少なくとも2時間持続する低酸素期間中、2回通過細胞を低酸素条件下で培養し;
少なくとも1日持続する非低酸素期間中、2回通過細胞を非低酸素条件下で培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定が、EPCの同定を含む、請求項36記載の方法。
- 低酸素及び非低酸素期間が、30日未満持続する培養期間以内であり、そして2回通過細胞の低酸素条件下での培養が、培養期間の最初の2日間、2回通過細胞を低酸素条件で培養することを含む、請求項36記載の方法。
- 低酸素及び非低酸素期間が、30日未満持続する培養期間以内であり、そして2回通過細胞の低酸素条件下での培養が、培養期間の最後の2日間、2回通過細胞を低酸素条件で培養することを含む、請求項36記載の方法。
- 低酸素及び非低酸素期間が、30日未満持続する培養期間以内であり、そして2回通過細胞の低酸素条件下での培養が、培養期間の最初の2日間と最後の2日間の間で少なくとも2時間、2回通過細胞を低酸素条件で培養することを含む、請求項36記載の方法。
- 2回通過細胞の低酸素条件下での培養が、2回通過細胞の非低酸素条件下での培養以前に行われる、請求項36記載の方法。
- 2回通過細胞の低酸素条件下での培養が、2回通過細胞の非低酸素条件下での培養以後に行われる、請求項36記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
第一の所望の密度範囲を有する細胞を選択するために、血液を勾配に適用し;
選択された細胞を、エストロゲンを含む培地、及び引き続きプロゲスチンを含む培地において培養することにより、第二の所望の密度範囲を有する細胞数を増加させ;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
第一の所望の密度範囲を有する細胞を選択するために、血液を勾配に適用し;
選択された細胞を、プロゲスチンを含む培地、及び引き続きエストロゲンを含む培地において培養することにより、第二の所望の密度範囲を有する細胞数を増加させ;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
第一の所望の密度範囲を有する細胞を選択するために、血液を勾配に適用し;
選択された細胞を、エストロゲン及びプロゲスチンを含む培地において培養することにより、第二の所望の密度範囲を有する細胞数を増加させ;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項43〜45のいずれか1項記載の方法。
- 前記プロゲスチンが、プロゲステロンを含む、請求項43〜45のいずれか1項記載の方法。
- 前記エストロゲンが、エストラジオールを含む、請求項43〜45のいずれか1項記載の方法。
- 前記培養が、3〜30日の持続する期間培養することを含む、請求項43〜45のいずれか1項記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
少なくとも2時間持続する高炭酸期間、2回通過細胞を高炭酸条件下で培養し、この高炭酸期間が、5%よりも高いCO2レベルで特徴付けられ;
少なくとも1日間持続する非高炭酸の期間、2回通過細胞を非高炭酸条件下で培養し、この非高炭酸期間が、5%以下のCO2レベルで特徴付けられ;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項50記載の方法。
- 高炭酸期間のCO2レベルを少なくとも6%であるように設定することを含む、請求項50記載の方法。
- 高炭酸及び非高炭酸期間が、30日未満持続する培養期間以内であり、そして2回通過細胞の高炭酸条件下での培養が、培養期間の最初の2日間、2回通過細胞を高炭酸条件で培養することを含む、請求項50記載の方法。
- 高炭酸及び非高炭酸期間が、30日未満持続する培養期間以内であり、そして2回通過細胞の高炭酸条件下での培養が、培養期間の最後の2日間、2回通過細胞を高炭酸条件で培養することを含む、請求項50記載の方法。
- 高炭酸及び非高炭酸期間が、30日未満持続する培養期間以内であり、そして2回通過細胞の高炭酸条件下での培養が、培養期間の最初の2日間及び最後の2日間の間で少なくとも2時間、2回通過細胞を高炭酸条件で培養することを含む、請求項50記載の方法。
- 2回通過細胞の高炭酸条件下での培養が、2回通過細胞の非高炭酸条件下での培養以前に行われる、請求項50記載の方法。
- 2回通過細胞の高炭酸条件下での培養が、2回通過細胞の非高炭酸条件下での培養以後に行われる、請求項50記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
2回通過細胞を、エリスロポイエチン、VEGF、IGF、FGF、エストロゲン、17-β-エストラジオール、エストロン、エストリオール、エストラジオール誘導体、吉草酸エストラジオール、エストラジオールシピオネート、メストラノール、キネストロール、プロゲスチン、プロゲスチンファミリー由来の分子、プロゲステロン、合成プロゲステロン、カロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、スタチン、シムバスタチン、アトロバスタチン、糖尿病治療薬、及びロシグリタゾンからなるリストより選択される少なくとも1種の物質を含む培養培地において培養し;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項58記載の方法。
- 幹細胞を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
幹細胞を含有する組織を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞数を、2回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させ;及び
培養された細胞中の内皮前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項60記載の方法。
- 前記組織の適用が、臍帯血を第一の勾配へ適用することを含む、請求項60記載の方法。
- 前記組織の適用が、胚細胞を第一の勾配へ適用することを含む、請求項60記載の方法。
- 前記組織の適用が、胎盤細胞を第一の勾配へ適用することを含む、請求項60記載の方法。
- 前記組織の適用が、胎児細胞を第一の勾配へ適用することを含む、請求項60記載の方法。
- 幹細胞を、骨髄から抽出する工程を含む、請求項60記載の方法。
- 幹細胞の抽出を促進するために、骨髄由来の幹細胞を動員することを含む、請求項60記載の方法。
- 幹細胞を、末梢血から抽出する工程を含む、請求項60記載の方法。
- 2回通過細胞の培養が以下のステップ:
2回通過細胞を、第一の容器内で、その期間の第一の部の間培養し;
その期間の第一の部分の最後に、第一の容器から2回通過細胞の少なくとも一部を除去し;及び
第一の容器から除去された細胞を、第二の容器において、その期間の第二の部分中培養すること
を含む、請求項60記載の方法。 - 2回通過細胞の少なくとも一部の除去が、第一の容器の表面に接着する除去細胞の選択を含む、請求項69記載の方法。
- 2回通過細胞の少なくとも一部の除去が、第一の容器の表面に接着しない除去細胞の選択を含む、請求項69記載の方法。
- 第一の容器が、その表面上に増殖促進分子を含み、そして第一の容器内での細胞の培養が、増殖促進分子を含む第一の容器内で細胞を培養することを含む、請求項69記載の方法。
- 前記増殖促進分子が、血漿、コラーゲン、フィブロネクチン、増殖因子及び幹細胞表面受容体に対する抗体からなるリストより選択される、請求項72記載の方法。
- 前記第二の容器が、その表面上に増殖促進分子を含み、そして第二の容器内での細胞の培養が、増殖促進分子を含む第二の容器内で細胞を培養することを含む、請求項69記載の方法。
- 前記増殖促進分子が、血漿、コラーゲン、フィブロネクチン、増殖因子及び幹細胞表面受容体に対する抗体からなるリストより選択される、請求項74記載の方法。
- 症状を治療する方法であって:
内皮前駆細胞(EPC)を、対象の末梢神経組織、対象の中枢神経組織、対象の視神経、対象の脈絡膜組織、対象の網膜組織、対象の網膜下腔、対象の角膜組織、対象の腎組織、対象の損傷した骨の組織、対象の骨折した骨の組織、対象の炎症組織、対象の感染組織、対象の挫傷した組織、皮膚の損傷、潰瘍又は創傷組織、対象の脳組織、対象の四肢の組織、皮膚移植片の組織、及び対象の再び取付けた切断された四肢の組織からなるリストより選択される対象の組織近傍又は空隙へ適用するステップ
を含む、前記方法。 - 血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;及び
密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞数を、2回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させること
により、EPCを生成させるステップを含む、請求項76記載の方法。 - 幹細胞を含む組織を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
2回通過細胞を、密度1.055〜1.068g/mlを有する3回通過細胞の選択に好適な第三の勾配に適用し;及び
密度1.055〜1.068g/mlを有する細の数を、3回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させること
により、EPCを生成させるステップを含む、請求項76記載の方法。 - 血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し、
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;及び
2回通過細胞を、抗体を含む表面上で培養すること
により、EPCを生成させるステップを含む、請求項76記載の方法。 - 血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;及び
2回通過細胞を、コラーゲン又はフィブロネクチン以外の増殖促進分子を含む表面上で培養すること
により、EPCを生成させるステップを含む、請求項76記載の方法。 - 血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;及び
2回通過細胞を、最大5%血清を含む培養培地において、1〜5日の持続する期間培養すること
により、EPCを生成させるステップを含む、請求項76記載の方法。 - 血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;及び
2回通過細胞を、10%よりも多い血清を含む培養培地において、1〜5日の持続する期間培養すること
により、EPCを生成させるステップを含む、請求項76記載の方法。 - 血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
低-血清期間中、2回通過細胞を、10%未満の血清を含む培養培地において培養し;及び
高-血清期間中、2回通過細胞を、10%よりも多いか又は等しい血清を含む培養培地において培養すること
により、EPCを生成させるステップを含む、請求項76記載の方法。 - 血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
少なくとも2時間持続する低酸素期間中、2回通過細胞を、低酸素条件下で培養し;及び
少なくとも1日持続する非低酸素期間中、2回通過細胞を、非低酸素条件下で培養すること
により、EPCを生成させるステップを含む、請求項76記載の方法。 - 血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
少なくとも2時間持続する高炭酸期間中、2回通過細胞を、高炭酸条件下で培養し、高炭酸期間が、5%を超えるCO2レベルを特徴とし;及び
少なくとも1日持続する非高炭酸期間中、2回通過細胞を、非高炭酸条件下で培養し、非高炭酸期間が、5%以下のCO2レベルを特徴とすること
により、EPCを生成させるステップを含む、請求項76記載の方法。 - 血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
2回通過細胞を、エリスロポイエチン、エストロゲン、エストロゲン-ファミリー分子、17-β-エストラジオール、エストロン、エストリオール、エストラジオール誘導体、吉草酸エストラジオール、エストラジオールシピオネート、メストラノール、キネストロール、プロゲスチン、プロゲスチンファミリー分子、プロゲステロン、合成プロゲステロン、カロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、スタチン、シムバスタチン、アトロバスタチン、糖尿病治療薬、及びロシグリタゾンからなるリストより選択される少なくとも1種の物質を含む培養培地において培養し;
幹細胞を含む組織を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;並びに
2回通過細胞を、3〜30日の持続する期間培養することにより、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞数を増加させること
により、EPCを生成させるステップを含む、請求項76記載の方法。 - 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞数を、2回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させ;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項87記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、密度1.077g/ml未満を有する初回通過細胞の選択に好適な第一の勾配に適用し;
初回通過細胞を、各々それらの第一部分及び第二部分に分割し;
初回通過細胞の第一部分を、密度1.055〜1.074g/mlを有する2回通過細胞の選択に好適な第二の勾配に適用し;
初回通過細胞の第二部分を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞と混合し;
密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞数を、2回通過細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより増加させ;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項89記載の方法。
- 初回通過細胞の分割が、第一部分を、第二部分よりも大きいように設定することを含む、請求項89記載の方法。
- 初回通過細胞の分割が、第一部分を、第二部分よりも小さいように設定することを含む、請求項89記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、第一の所望の密度範囲を有する細胞の選択のために勾配に適用し;
選択された細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより第二の所望の密度範囲を有する細胞数を増加させ;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項93記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.077g/ml未満を有する細胞を選択するのに好適な勾配へ適用することを含む、請求項93記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞を選択するのに好適な勾配へ適用することを含む、請求項93記載の方法。
- 細胞数の増加が、細胞を4〜8日の持続する期間培養することを含む、請求項93記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、ショ糖とエピクロロヒドリンとのコポリマーを含む溶液へ適用することを含む、請求項93記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、ポリビニルピロリドン-被覆されたシリカコロイドを含む段階密度溶液へ適用することを含む、請求項93記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、イオジキサノールの水溶液へ適用することを含む、請求項93記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、フィコール-様勾配へ適用することを含む、請求項93記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、オプティプレップ-様勾配へ適用することを含む、請求項93記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、パーコール-様勾配へ適用することを含む、請求項93記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用し;
選択された細胞を、3〜30日の持続する期間、自家血漿を含む表面上で培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項104記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用し;
選択された細胞を、抗体を含む表面上で培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項106記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.077g/ml未満を有する細胞を選択するのに好適な勾配へ適用することを含む、請求項104又は106記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞を選択するのに好適な勾配へ適用することを含む、請求項104又は106記載の方法。
- 前記培養が、表面が自家血漿で被覆された時に、表面上で細胞を培養することを含む、請求項106記載の方法。
- 前記培養が、表面が同種血漿及び異種血漿からなるリストより選択される少なくとも1種の血漿で被覆された時に、表面上で細胞を培養することを含む、請求項106記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用し;
選択された細胞を、コラーゲン又はフィブロネクチン以外の増殖促進分子を含む表面上で培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前駆細胞が、内皮前駆細胞(EPC)を含み、前駆細胞の同定が、EPCの同定を含む、請求項112記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.077g/ml未満を有する細胞を選択するのに好適な勾配へ適用することを含む、請求項112記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞を選択するのに好適な勾配へ適用することを含む、請求項112記載の方法。
- 細胞の培養が、細胞を、増殖促進分子に加え、コラーゲン及びフィブロネクチンの少なくとも1種を含む表面上で培養することを含む、請求項112記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用し;
選択された細胞を、最大5%の血清を含む培養培地において1〜5日の持続する期間培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項117記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.077g/ml未満を有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項117記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項117記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用し;
選択された細胞を、10%よりも多い血清を含む培養培地において1〜5日の持続する期間培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項121記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.077g/ml未満を有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項121記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項121記載の方法。
- 細胞の培養が、細胞を20%未満の血清を含む培養培地において培養することを含む、請求項121記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用し;
低-血清期間中に、10%未満の血清を含む培養培地において選択された細胞を培養し;
高-血清期間中に、10%以上の血清を含む培養培地中で選択された細胞を培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項126記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.077g/ml未満を有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項126記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項126記載の方法。
- 低-血清期間中の細胞の培養が、最大5%血清を含む培養培地において細胞を培養することを含む、請求項126記載の方法。
- 低-血清期間中の細胞の培養が、血清-非含有培養培地において細胞を培養することを含む、請求項126記載の方法。
- 低-血清期間中の細胞の培養が、1〜5日の期間細胞を培養することを含む、請求項126記載の方法。
- 高-血清期間中の細胞の培養が、1〜30日の期間細胞を培養することを含む、請求項126記載の方法。
- 低-血清期間中の細胞の培養が、高-血清期間中の細胞培養以前に行われる、請求項126記載の方法。
- 低-血清期間中の細胞の培養が、高-血清期間中の細胞培養以後に行われる、請求項126記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用し;
少なくとも2時間持続する低酸素の期間中、選択された細胞を低酸素条件下で培養し;
少なくとも1日間持続する非低酸素の期間中、選択された細胞を非低酸素条件下で培養し;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項136記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.077g/ml未満を有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項136記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項136記載の方法。
- 低酸素及び非低酸素期間が、30日未満持続する培養期間以内であり、そして低酸素条件下での細胞培養が、培養期間の最初の2日間、細胞を低酸素条件下で培養することを含む、請求項136記載の方法。
- 低酸素及び非低酸素期間が、30日未満持続する培養期間以内であり、そして低酸素条件下での細胞培養が、培養期間の最後の2日間、細胞を低酸素条件下で培養することを含む、請求項136記載の方法。
- 低酸素及び非低酸素期間が、30日未満持続する培養期間以内であり、そして低酸素条件下での細胞培養が、培養期間の最初の2日間及び最後の2日間の間、少なくとも2時間、細胞を低酸素条件下で培養することを含む、請求項136記載の方法。
- 低酸素条件下での細胞の培養が、非低酸素条件下での細胞培養以前に行われる、請求項136記載の方法。
- 低酸素条件下での細胞の培養が、非低酸素条件下での細胞培養以後に行われる、請求項136記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、所望の密度範囲を有する細胞を選択するために勾配に適用し;
少なくとも2時間持続する高炭酸期間中、選択された細胞を高炭酸条件下で培養し、高炭酸期間は、5%よりも大きいCO2レベルにより特徴付けられ;
少なくとも1日間持続する非高炭酸期間中、選択された細胞を非高炭酸条件下で培養し、高炭酸期間は、5%以下のCO2レベルにより特徴付けられ;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項145記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.077g/ml未満を有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項145記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項145記載の方法。
- 高炭酸期間中のCO2レベルが、少なくとも6%であるように設定することを含む、請求項145記載の方法。
- 高炭酸及び非-高炭酸期間が、30日未満持続する培養期間以内であり、そして高炭酸条件下での細胞培養が、培養期間の最初の2日間、細胞を高炭酸条件下で培養することを含む、請求項145記載の方法。
- 高炭酸及び非-高炭酸期間が、30日未満持続する培養期間以内であり、そして高炭酸条件下での細胞培養が、培養期間の最後の2日間、細胞を高炭酸条件下で培養することを含む、請求項145記載の方法。
- 高炭酸及び非-高炭酸期間が、30日未満持続する培養期間以内であり、そして高炭酸条件下での細胞培養が、培養期間の最初の2日間及び最後の2日間の間、少なくとも2時間、細胞を高炭酸条件下で培養することを含む、請求項145記載の方法。
- 高炭酸条件下での細胞の培養が、非高炭酸条件下での細胞培養以前に行われる、請求項145記載の方法。
- 高炭酸条件下での細胞の培養が、非高炭酸条件下での細胞培養以後に行われる、請求項145記載の方法。
- 血液を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
血液を、第一の所望の密度範囲を有する細胞の選択に好適な勾配に適用し;
選択された細胞の培養培地における培養が、VEGF、IGF、FGF、エリスロポイエチン、エストロゲン、エストロゲン-ファミリー分子、17-β-エストラジオール、エストロン、エストリオール、エストラジオール誘導体、吉草酸エストラジオール、エストラジオールシピオネート、メストラノール、キネストロール、プロゲスチン、プロゲスチンファミリー分子、プロゲステロン、合成プロゲステロン、カロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、スタチン、シムバスタチン、アトロバスタチン、糖尿病治療薬、及びロシグリタゾンからなるリストより選択される少なくとも1種の物質を含む培養培地において培養し;並びに
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項155記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.077g/ml未満を有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項155記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項155記載の方法。
- 幹細胞を抽出するために使用する方法であって、以下のステップ:
幹細胞を含有する組織を、第一の所望の密度範囲を有する細胞の選択に好適な勾配に適用し;
選択された細胞を3〜30日の持続する期間培養することにより、第二の所望の密度範囲を有する細胞数を増加させ;及び
培養された細胞中の前駆細胞を同定すること
を含む、前記方法。 - 前記前駆細胞が内皮前駆細胞(EPC)を含み、前記の前駆細胞の同定がEPCの同定を含む、請求項159記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.077g/ml未満を有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項159記載の方法。
- 血液の勾配への適用が、血液を、密度1.055〜1.074g/mlを有する細胞を選択するのに好適な勾配に適用することを含む、請求項159記載の方法。
- 組織の適用が、臍帯血の勾配への適用を含む、請求項159記載の方法。
- 組織の適用が、胚細胞の勾配への適用を含む、請求項159記載の方法。
- 組織の適用が、胎児細胞の勾配への適用を含む、請求項159記載の方法。
- 組織の適用が、胎盤細胞の勾配への適用を含む、請求項159記載の方法。
- 幹細胞を、骨髄から抽出することを含む、請求項159記載の方法。
- 幹細胞の抽出を促進するために、骨髄由来の幹細胞を動員する、請求項159記載の方法。
- 幹細胞を、血液から抽出する工程を含む、請求項159記載の方法。
- 細胞を培養することが以下のステップ:
細胞を、第一の容器内で、その期間の第一の部分の間培養し;
その期間の第一の部分の終了時に、第一の容器から細胞の少なくとも一部を除去し;及び
第二の容器内で、その期間の第二の部分中、第一の容器から除去した細胞を培養すること
を含む、請求項159記載の方法。 - 細胞の少なくとも一部の除去が、第一の容器の表面に接着する除去細胞を選択するステップを含む、請求項170記載の方法。
- 細胞の少なくとも一部の除去が、第一の容器の表面に接着しない除去細胞を選択するステップを含む、請求項170記載の方法。
- 第一の容器が、それらの表面上に増殖促進分子を含み、そして第一の容器における細胞の培養が、増殖促進分子を含む第一の容器において細胞を培養することを含む、請求項170記載の方法。
- 前記増殖促進分子が、血漿、コラーゲン、フィブロネクチン、増殖因子及び幹細胞表面受容体に対する抗体からなるリストより選択される、請求項173記載の方法。
- 第二の容器が、それらの表面上に増殖促進分子を含み、そして第二の容器における細胞の培養が、増殖促進分子を含む第二の容器において細胞を培養することを含む、請求項170記載の方法。
- 前記増殖促進分子が、血漿、コラーゲン、フィブロネクチン、増殖因子及び幹細胞表面受容体に対する抗体からなるリストより選択される、請求項175記載の方法。
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