JPH10508190A - 細胞分離装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞混合物から特定の細胞型を富化する方法が開示される。この方法には、正確に規定された細胞分離培地の使用、下方領域を定める収縮を有する細胞分離装置、および規定された細胞分離培地が、包含される。収縮は、チューブの上方部分と下方部分との間の混合を防ぐ。上記の方法を強化するために使用される、密度調整細胞分離技法もまた開示される。さらに、本発明は、CD34⁺造血前駆細胞、有核胎児細胞、および乳腫瘍細胞を単離するための特定の方法を包含する。単離方法は、種々の診断および治療レジメに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞分離装置および方法 １．発明の分野 本発明は、体液、分散組織標本、および培養細胞のような細胞供給源から、所 望の細胞集団を富化するための方法に関する。特に、この方法は、細胞集団から より低い密度の細胞を分離するための特定密度の培地を含有する、細胞捕捉遠心 分離装置を使用する。本方法は、共有結合された細胞付着分子を有する微粒子を 使用して、所望しない低密度細胞の密度を選択的に増大することのよって、改良 され得る。 ２．背景 生物学的液体および組織からの特定の細胞型の単離は、臨床診断への適用およ び治療への適用にしばしば望まれる。臨床診断の分野では、例えば、腫瘍細胞の 形態学的分析、胎児核型分析、および組織型分析手順に必要性が存在する。治療 的には、例えば、自己細胞または組織の輸注または移植での使用を意図した、細 胞または組織の浄化、例えば、ウイルス抗原および腫瘍細胞の組織の浄化に、必 要性が存在する。さらに、移植での使用のため、例えば、同種移植および自己移 植に意図された造血細胞のエクスビボでの増殖における使用のための所望の細胞 の富化または単離に必要性が存在する。 所望の細胞を体液から分離するためのいくつかの方法は、当該分野で公知であ る。このような方法は、細胞分離組成物中での浮遊密度に基づく細胞分離（米国 特許第4,927,750号）、抗血清因子でコートされたラテックスビーズを使用する 密度勾配での血清因子の分離（米国特許第3,862,303号）、磁場の使用を介する 細胞分離（米国特許第4,777,145号）、および密度勾配でのTおよびB細胞の分離 （米国特許第4,511.662号）を包含する。当該分野で公知の細胞分離方法は、細 胞のチューブおよびピペットへの付着による細胞損失の不利益を有し得る。 診断手順および治療手順のための比較的希な細胞集団の単離の迅速かつ効率的 な手段の必要性が存在する。本発明は、複数の細胞集団を含有する細胞供給源ま たは混合物から、量の少ない所望の細胞集団を単離または富化するための方法を 提供することによって、この必要性を満たす。さらに、本発明は、富化された細 胞の高収量の回収を提供する。 詳細には、本発明の発見は、正確に測定された特異的密度を有する、高度に限 定された細胞分離培地を提供することによって、特に限定された細胞集団が単離 され得ることである。さらに、本発明は、このプロセスによって細胞の回収を顕 著に増強する、細胞捕捉遠心分離装置を提供する。あるいは、またはさらに、こ のプロセスは、密度調整細胞分離工程（DACS）を用いることにより増強されて、 分離プロセスに対してより高いレベルの特異性を提供する。本発明はまた、診断 方法および治療方法に重要な３つの特異的な細胞型、すなわち、胎児有核細胞、 造血前駆細胞（CD34⁺）、および乳腫瘍細胞の単離のための特定の方法を提供す る。 ３．発明の要旨 １つの局面では、本発明は、密度法による細胞単離に有用な細胞分離装置に関 する。装置は、チューブ内に設置された収縮領域を有する遠心分離チューブを含 む。収縮部材は、チューブが倒置されるときに、チューブの底部に液体を保持す るように、構築および配置される。この特徴は、コンパートメント間で内容物を 実質的に混合することなく、チューブをデカンテーションすることを可能にする 。好ましくは、収縮部分は、開口部を定めるより低い縁領域を有する、１つ以上 の下方向傾斜表面を定め、それは任意の形状であり得るか、またはチューブの倒 置の際に液体を保持するように操作する限り、複数の開口部を形成し得る。好ま しい実施態様では、収縮部分は、環状リングである。好ましくは、環は、チュー ブ内での種々の配置のためにチューブに強制密着されるように構築される。 装置はまた、チューブの底部に含有された細胞分離培地を含む。培地は、収縮 部分によって形成される開口部より上のレベルに、チューブ中に存在する。この 方法では、細胞分離培地と、より低い密度の細胞負荷培地との間の界面に捕捉さ れる細胞は、チューブが倒置されるときに、チューブの底部の内容物を混合せず に、より低い密度の培地によって取り出され得る。 より特定の実施態様では、遠心分離装置は、そこに配置される環部材を有する チューブを含む。環部材は、チューブの断面領域より小さい領域を有する開口部 を規定する。環部材は、チューブ内に組み込まれて形成され得るか、または、容 積の調節のためにチューブの内部長に沿って移動可能であり得る。チューブはま た、少なくとも環部材の開口部より上のレベルまで、チューブの下方部分および 上方部分を満たす、密度勾配溶液を含有する。特定の細胞型の分離のために、密 度勾配溶液は、浸透圧280±10 mOsm/kg H₂Oおよび所望細胞の特異的密度の0.000 5 gr/ml以内の特異的密度を有する。 本発明の装置の特定の実施態様は、収縮部材および閉じられた頂部を有するチ ューブを含む、閉じられたシステムを含む。頂部のポートは、このチューブの実 施態様へ液体を導入する導管として作用し、それはまた、チューブの底部に連通 するポートを含み得る。あるいは、本発明の装置の別の実施態様は、本明細書に 記載の遠心分離シリンジである。シリンジは、上記のチューブ装置中の収縮部分 によって形成される液体受容空間と同様に、シリンジ底部に液体受容空間を形成 する、収縮領域を有するプランジャを含む。 本発明はまた、特異的な細胞型の単離または富化のために規定された、特定の 形状の上記の装置を含む。特異的な細胞型の単離には、装置は所望の細胞の特異 的密度の少なくとも±0.0005 gr/ml以内、好ましくは少なくとも±0.0002 gr/ml 以内の特異的密度を有する細胞分離培地を含む。好ましい実施態様では、CD34⁺ 造血前駆細胞の単離には、培地は、浸透圧280±10 mOsm/kg H₂Oおよび特異的密 度1.0605 gr/mlを有し；胎児有核細胞の母血液からの単離には、特異的密度は、 浸透圧280±10 mOsm/kg H₂Oおよび特異的密度1.0720 gr/mlを有し；そして、乳 腫瘍細胞の単離には、分離培地は、浸透圧280±10 mOsm/kg H₂Oおよび1.0490-1. 0580 gr/mlの範囲から選択され、そしてより好ましくは1.0580 gr/mlの特異的密 度を有する。 関連の実施態様では、本発明は、上記に規定される装置を使用することにより 、 細胞混合物から選択された細胞を単離する方法を包含する。本方法は、装置へ細 胞混合物を添加すること、チューブ中の密度勾配物質の特異的密度より高い特異 的密度を有する細胞をペレット化するために十分な重力で装置の遠心分離するこ と、および、チューブの上方部分から選択された細胞を回収することを包含する 。 特定の実施態様において、本発明の方法はさらに、CD34⁺造血前駆細胞、乳腫 瘍細胞、および胎児有核細胞を細胞混合物から単離または富化する方法を包含す る。高度に限定された培地が特定の細胞型の単離に使用され得るという出願人の 発見に基づき、本発明は、単一特異的密度培地において細胞を分離するために、 上記の特異的密度および浸透圧条件を使用すること、すなわち、±0.0005 gr/ml 、または好ましくは±0.0002 gr/mlに限定された培地を使用することを包含する 。単離され得るCD34⁺細胞は、コロニー形成細胞および長期開始能力を有する細 胞を含む。胎児有核細胞は、有核赤血球および栄養芽細胞を包含する。別の実施 態様では、本発明は、密度1.0605±0.0005 gr/mlおよび浸透圧280±10 mOsm/kg H₂Oを有する培地を使用して、ナチュラルキラー細胞またはナチュラルサプレッ サー細胞を単離する方法を包含する。 さらなるその他の実施態様では、本発明の方法は、細胞分離培地を介する遠心 分離前に、細胞が単離されるべき細胞混合物と、キャリア粒子に連結された細胞 型特異的結合因子とのインキュベーションを包含する。好ましい実施態様では、 結合因子に関する所望しない細胞の堆積のために、粒子は、細胞分離培地の特異 的密度より少なくとも0.001 gr/ml大きな特異的密度を有する。本発明のこの局 面に使用される結合因子は、抗体、レクチン、サイトカインなどを包含し得る。 白血球を涸渇させるのに有用な特異的結合因子は、抗CD45抗体である。あるいは 、特異的結合因子は、それらの選択的堆積のための目的の細胞に関し得る。特定 の実施態様は、生理食塩水活性化シリカ、および好ましくは3-アミノプロピルト リエトキシ生理食塩水活性化シリカで形成されたキャリア粒子を包含する。 ４．図面の簡単な説明 図1A-Cは、本発明の１つの方法に従って、細胞を単離するか、または分離する 工程を例示する、本発明の遠心分離装置の断面図を示す； 図2Aおよび2Bは、シールドを含む遠心分離チューブ装置の実施態様の概略の断 面図（2A）および透視図（2B）を示す； 図３は、バルブを有する遠心分離装置の収縮部材の代替的実施態様の断面図を 示す； 図4A-Fは、本発明のチューブの下方部分および収縮部材の代替的実施態様の断 面図を示す； 図5Aおよび5Bは、多数の収縮部材を有する、本発明のさらなる代替的実施態様 の断面図を示す； 図６は、滅菌標本のプロセシングに適している閉じられたシステムの遠心分離 チューブ装置の代替的実施態様を示す； 図７は、本発明の遠心分離装置の遠心分離シリンジ実施態様を示す； 図8（A-D）は、従来法（8A、B）を密度調整細胞分離手順（8C、D）とを比較し た概略図を示す； 図9A-9Cは、密度材料として「FICOLL」（図9A）、「FICOLL」＋細胞捕捉チュ ーブ（図9B）、および調整「PERCOLL」密度勾配＋細胞捕捉チューブ（図9C）を 使用する、従来法によって単離された３つの細胞調製物中の細胞数の比較を示す ； 図10は、界面およびペレット画分中のコロニー形成ユニット（CFU）の分布を 示す； 図11は、界面およびペレット画分中の異なる型のCFUの分布を示す； 図12は、界面およびペレット画分中の長期培養開始能力（LTC-IC）の分布を示 す； 図13は、界面およびペレット画分中のT細胞の分布を示す； 図14は、異なる密度画分中のナチュラルサプレッサー活性の分布を示す； 図15は、異なる密度画分中のナチュラルキラー活性の分布を示す； 図16A-16Fは、密度勾配遠心分離＋密度調整細胞分離後の、CD34⁺細胞富化物の フローサイトメトリー分析を示す； 図17A-17Dは、本発明の細胞分離法を用いる、乳腫瘍細胞の４つの型の富化物 を示す；そして 図18A-18Dは、特異的密度1.0580 g/mlで細胞においてスパイクされた乳腫瘍細 胞の乳腫瘍細胞富化物を示す。 商標登録された用語は、「 」内に大文字で明示している。 ５．発明の詳細な説明 本発明は、体液、分散組織標本、培養細胞、およびそれらの成分から、所望の 細胞集団を、迅速かつ高収量で単離または富化するための方法に関する。この方 法は、高度に限定された密度勾配培地を使用する、選択された細胞混合物の密度 勾配遠心分離に基づく。さらに詳細には、本発明は、収量を最大にし、そして回 収プロセスの効率を改良する、密度勾配溶液を含有する特に設計された細胞捕捉 遠心分離チューブ装置を含む。 本発明はまた、特異的な細胞型、すなわち、胎児細胞、造血前駆細胞CD34⁺細 胞、および乳腫瘍細胞の単離のための細胞分離法を包含し、そしてそれによって 例示される。これらの各細胞型は、本発明の方法によって単離された細胞の、重 要な診断および／または治療での使用を示す。例えば、本明細書に記載されてい るように、有核胎児細胞が、循環母血液から、種々の遺伝子分析、例えば核型分 析を実施する目的のために、単離され得る。乳腫瘍細胞は、診断テスト、例えば 細胞学的実験を実施する目的、または後の再注入、例えば、輸注または移植を意 図した血液サンプルからの腫瘍細胞の浄化目的のために、循環血液から単離され 得る。造血前駆細胞は、骨髄移植におけるドナー細胞としての使用のために、血 液または骨髄から単離され得る。 ５.１ 密度勾配細胞分離法 このセクションは、本発明に従って特異的密度勾配を用いる細胞分離方法を記 載する。より詳細には、このセクションは、以下の本発明の特定の局面の記載を 包含する：（1）特異的な細胞型を単離するための限定された細胞分離培地と組 み合わせた細胞捕捉遠心分離チューブの使用（セクション５.１.Ａ）；（2）特 定の細胞型を単離するための単一工程の正確な密度勾配培地の使用（セクション ５.１.Ｂ）；および（3）本発明の細胞分離プロセスの効率を増進するための特 異的結合因子に結合されたキャリア粒子の使用（セクション５.２）。さらに、 本発明の方法を使用する例示されている細胞型の単離は、セクション５.３に記 載されている。 ５.１.Ａ．細胞捕捉遠心分離装置 好ましい実施態様では、本発明は、遠心分離装置および選択された細胞型の密 度分離のためのその使用を包含する。本発明の目的のために、用語「細胞捕捉チ ューブ」は、装置の部分を形成する遠心分離チューブをいい、それは、チューブ の底部に「捕捉」または液体受容領域を形成する収縮部分を含む。以下の特定の 実施態様の記載および図面によって例示されるように、収縮部分の重要な特徴は 、チューブが倒置されるときに、収縮部材より下のチューブの底部に液体が保持 されるような様式で、チューブ内に配置されていることである。本発明の装置は また、細胞の密度分離のための細胞分離材料を含む。 本発明の遠心分離装置の好ましい実施態様は、図1AおよびB中の断面図に示さ れている。示されているように、チューブ１０は、中央の開口部１４を規定する 収縮部材１２を含む。収縮部材１２は、好ましくは収縮開口部１４を規定する下 方縁領域を有する、１つ以上の下方向傾斜面を規定する。 収縮部材の底表面はまた、同様にわずかに歪曲され得る（図にはそのように示 されていないが）。例示される実施態様では、内径約2.8 cmを有するチューブを 有する、収縮部材１２によって形成される開口部１４の直径は、好ましくは約0. 5 cmである。開口部１４のサイズは、一般に、密度勾配溶液の頂部に重層される サンプルのより重い成分が、実際の遠心分離前に開口部を介して通過するのを阻 むほどには小さくはない。このような成分の移動は、通常の重力によって生じ得 る。一般に、開口部１４の直径は、開口部を横切る増大された表面張力を形成す る能力によって示される。円筒の内面まわりの縁程の制限でも、このような表面 張力を与え得るのに十分であり得る。従って、収縮部材によって形成される装置 の断面積は、小さくてチューブの水平断面表面積の約５％、または大きくて約95 ％であり得る。 図1A-Dおよび2A-Bに示されている収縮部材は、環状（例えば、リング状）であ るが、収縮部材が多数の開口部の形状または複数の開口部を形成し得ることは明 白である。開口部１４の形状は、円形に限定されないが、一般的ではあるが、お およそ環形状を形成するロート形状の収縮部材が好ましい。開口部はまた、楕円 形、矩形、星型、またはチューブ内に制限された通路を作製し得る任意の他の形 状であり得、ただし、上記のように、外形が、倒置の際にチューブの底部での液 体放出を妨害するのに十分な表面張力を与える。さらに、収縮部材は、チューブ の水平断面に及ぶメッシュ(mesh)またはふるいを有し得る。この場合には、環部 材もまた、複数の開口部を有するといわれている。 さらに、開口部は、好ましくはチューブ内で水平に中央に配置されるが、開口 部はまた、中央から外れていてもよく、実質的に同じ結果を達成し得る。垂直収 縮部分およびチューブ内の配置に関して、収縮部材は、チューブ内により組み込 まれて形成されるか、または強制密着されるように構築され得る。例えば、環状 収縮部材は、エラストマーシリコン材料から形成され得、チューブ長に沿って任 意の位置で強制密着されることによってチューブ内に挿入される。 さらに図1Aに関して、チューブ１０は、細胞分離密度勾配溶液１６で、収縮部 材１２を超えるレベルまで、または最低でも少なくとも開口部１４を超えるレベ ルまで満たされる。好ましくは、標準的な50 ml遠心分離チューブについて、密 度勾配溶液１６は、収縮部材を超えて少なくとも約１mmのレベルまで満たされる 。分離されるべき液体サンプル１８は、密度勾配溶液１６の頂部に重層され、そ してチューブおよびその内容物が遠心分離に供せられる。好ましくは、サンプル は、サンプルと重層後の収縮部材の頂部との間に、少なくとも約１mmの密度勾配 溶液が保持されるように、注意深く重層される。 図1Bに関して、遠心分離後に、勾配溶液の密度より大きな密度を有する成分は 、チューブ１０の底でペレット２０中に見出される。密度勾配溶液１６の密度よ り 小さな密度を有する細胞成分は、勾配溶液と液体サンプル溶液の残留部分との界 面２２において、溶液の頂部に浮遊したままでいる。次に、界面部分が取り出さ れる。このような除去物は、図1Cで矢印24によって示されるように、チューブの デカンテーションによってなされ得る。上記のように開口部を越えるレベルまで の密度勾配溶液の供給は、収縮部材１２の下の界面部分の形成を妨害するのに役 立つ。 チューブの操作性のいずれの特定の基本理論に原因を帰することなく、収縮部 材１２が、チューブが流出のために傾けられるときに、開口部１４の表面を横切 る中間表面張力の形成のための、支持体または核を提供することによって、上方 部分の流出を促進する。この表面張力は、上方部分の内容物がチューブから流出 されるときに、チューブの上方および下方部分の混合を防ぐ。収縮部材１２は、 垂直壁のチューブ(straight-walled tube)へ配置される挿入物として提供され得 る。あるいは、収縮部材１２は、チューブ自体を作製するときの鋳造プロセスの 間に、チューブ壁の収縮部分として形成され得る。収縮部材が挿入物によって提 供されるときは、挿入物は、実験条件に従って、チューブ１０の下方部分２６お よび上方部分２８の相対容積を操作者が変化し得るように移動可能であり得る。 鋳造されたチューブ中の収縮部材の位置はまた、製造プロセスの間に、上方およ び下方部分の異なる相対容積のチューブを提供するために変化され得る。例えば 、末梢血からの細胞の単離では、血液の20 mlサンプルは、遠心分離される比較 的多量の赤血球を収容するために、約15 mlである下方部分２６を必要とする。 比較すると、アフェレーシス(apheresis)またはバフィーコート血液の20 mlサン プルは、下方部分に約10 mlのみを必要とする。 多くの適用において、界面部分を含有する上清画分のみを回収することが望ま れる。このような場合には、ペレットは、チューブとともに捨てられる。他の場 合には、ペレットは、機械的操作／粉砕によって除去され得る。例えば、チュー ブは倒置され、そしてボルテックスミキサーに供される。このような混合は、ペ レットを隣接液相へ撹乱させ、そしてこの液相の移動を誘導し、そしてチューブ の下方部分または回収部分からチューブの上方部分へ細胞を撹乱させる。 本発明の利点は、収縮部材より上の低密度材料が、チューブの上方部分の内容 物の流出またはデカンテーションの簡単な操作によって、下方の材料から分離さ れることである。これは、垂直壁を有する標準的な遠心分離チューブを使用して 勾配分離物を取り出す多くの従来法とは対照的であり、ここでは、材料は注意深 くピペットでチューブから取り出されるか、またはチューブの底に穴を開け、そ してチューブの内容物を回収容器にゆっくりと滴下させることによって分離され る。従って、本発明は、個別に分離される材料を取り出すための便利で簡単な手 段を提供する。 一般に、本発明のチューブを使用する密度遠心分離によって細胞を分離する場 合には、図１Aの溶液１８のような、チューブ中の密度勾配培地または材料にロ ードされる細胞混合物を含有する溶液は、チューブ中の密度勾配または細胞分離 培地の特異的密度より小さな特異的密度を有する。遠心分離の間に、細胞分離培 地の密度より小さいかまたは等しい特異的密度を有する細胞は、ロードされる溶 液と密度勾配材料との間に形成される界面内にとどまる。 従来の垂直壁チューブとは異なる、本発明のチューブの他の利点は、チューブ が落下されるか、または誤って倒置されるときに、収縮部材が存在するために、 分離される上方または下方部分の内容物は、容易に混合されないことである。さ らに、一旦分離がなされると、収縮部材のより上に存在する溶液は、収縮部材の より下のチューブの内容物を撹乱することなく（または、それによる夾雑の恐れ なく）チューブ内で混合され得る。 好ましい代替的実施態様では、チューブ１０は、図2Aおよび2Bに示されている ような、挿入物またはシールド３０を提供され得る。シールド３０は、勾配溶液 上へサンプルを重層するのを容易にするために、収縮部材１２の上方に与えられ る。シールド３０は、チューブの上方部分に設置され、そしてチューブの周囲に 少なくとも部分的に拡張するほぼ同心円の挿入物の形態を取り得る。使用におい て、操作者は、シールド３０とチューブ壁との間の材料をピペッティングする。 シールドは、材料をチューブの側面に沿って密度勾配溶液の頂部へ導き、一方、 溶液の撹乱は最少限にする。図2Bに示されているように、チューブ１０は、分離 シリコン挿入物として形成された収縮部材１２を有する、透明のプラスチックま たはガラスである。シールド３０は、チューブの上方部分に、例えば、チューブ 壁に対して斜めのスペーサー３１との干渉フィット(fit)によって保持され得る 。あるいは、シールド３０は、チューブの一部として形成され得る。 材料の分離は、図３に示されているような、バルブ４０の収縮部材への付加に よってさらに促進される。バルブ４０は、開口部１４を横切って配置される。バ ルブ４０は、一方向バルブであるか、または、限界遠心力(threshold centrifug al force)が適用されるときのみに開くバルブであり得る。バルブは、開口部を 覆うより軟質の材料のフラップ(flap)を提供することにより形成され得る。好ま しい実施態様では、バルブ４０を開くのに必要な力は、通常の重力の約850倍で ある。従って、バルブ４０は、初期の遠心分離の間に重い細胞を通過させ、次い で、細胞を適切な場所に保持し、バルブ上方に位置する目的のより軽い細胞のさ らなるプロセシング（例えば、細胞の洗浄または混合）を可能にする。この方法 で、細胞の完全かつ最終的な操作が、単一の滅菌容器中で実施され得る。 図4A-Fは、本発明に従うチューブおよび収縮部材の代替的形状およびデザイン の例示である。図4Aは、細胞の至適回収を提供するために、ペレットを受容する ための分離した底コンパートメント４４を有する代替的チューブ４２を示す。収 縮部材１２は、上記のようである；それは、上方表面上においてロート形状にさ れ、プラスチックまたは好ましくはシリコンの分離した挿入物から形成される。 図4Bは、先端のとがった底壁を有するチューブ４６を示す。先端のとがった底壁 を有するチューブ４６はまた、より重い細胞を、細胞が回収されるべき場合に所 望され得る良好なペレットに形成することによって、細胞の回収を促進する。さ らに、収縮部材４８は挿入物であるが、しかし平面の上方表面およびより広い開 口部を有する。図4Cは、組み込まれて鋳造された収縮部材５２を有する代替的チ ューブ５０を示す。図4Dは、チューブ５５内の上方および下方部分の相対容積を 調節するための移動を促進する、代替的な収縮部材５４を示す。この理由により 、収縮部材５４は、環状に広がる接触点５６を有する。収縮部材は、これらの点 でのみチューブと接触し、これらは、液体の厳重なシールを作製するが容易に調 節 し得る。チューブ５５もまた平底を有する。図4Eは本発明のさらなる代替的実施 態様を示し、ここでは、チューブ６０は、スポンジまたはゲルのような、細胞捕 捉材料６２を含む。材料６２は、ある細胞型に結合する化合物、あるいは特異的 な細胞型を殺傷する毒素を含有し得る。材料６２はまた、所望であれば磁気材料 から作製され得る。図4Fに示されているように、チューブ６４は、平底壁６８を 有するチューブ中の、組み込まれて形成された収縮部材６６のさらなる例を示す 。収縮部材６６は、下方部分２６がより小さな相対容積を有するように配置され る。 図5Aおよび5Bは、本発明に従うチューブのさらなる代替的実施態様を示す。各 々では、２つの収縮部材が提示される。第二の収縮部材12Aは、第一の収縮部材1 2Bの上方に配置され、異なる密度の細胞の分離を可能にするためのさらなるコン パートメントをつくる。図5Aでは、収縮部材は、分離挿入物として示され、一方 、それらは、図5Bのチューブにより組み込まれて形成される。さらなる収縮部材 もまた、いくつかの異なる密度のサンプルが分離されるべき場合に、付加され得 る。 図６は、閉じられたシステムに取り込まれた本発明の遠心分離装置を示す。こ のようなシステムは、例えば、血液サンプルまたは後に患者へ輸注されるサンプ ルのような、サンプルの滅菌処理に特に有用である。示されているように、閉じ られたシステム７０は、公知技術によって予め回収された血液７２を含有し、閉 じられた頂部７７を有する「バケット」型遠心分離チューブとして示されている 遠心分離チューブ７６へ、滅菌接続チューブ７４によって接続されている、貯蔵 容器７１（滅菌バックとして示される）を含む。閉じられた頂部は、下記のよう に、サンプルの導入および除去、ならびに通気に有用である、少なくとも１つ、 好ましくは少なくとも２つの進入ポートを有する。示されてる実施態様では、閉 じられた頂部７７から上方に突き出した堅固な隆起部７９が、進入ポートに対す る防御バリアを形成するために、そして輸送および貯蔵中の可能性のある夾雑を 減少させるように働く装置について、防御可動性蓋への接続点として、包含され る。 さらに図６に関して、チューブ７４は、進入ポート７８を介してチューブ７６ に接続され、付属器具８０によって適応され、それは、例えば、Luer-Lock^TMシ リンジコネクターのような、滅菌接続について適応されたロッキングチップの任 意のタイプであり得る。あるいは、付属器具８０は、滅菌液体バッグおよびチュ ーブの接続に適応された滅菌隔壁であり得、例えば、逆流バルブを有するSAFSIT E^TMスモールワイヤー拡張セット、およびBurron Medical Inc.，Bethlehem，Pen nsylvaniaから入手可能なSpin-Lock^TMアダプターである。遠心分離チューブ７６ への液体流入を容易にするために、装置は、通気進入ポート８２を含有する。示 されているように、空気フィルター８４は、夾雑を防ぐために通気進入ポート８ ２へ接続されている。 本発明に従って、チューブ７６は、上記のように形成された収縮部材８８を含 み；それは、上方表面てロート形状である。示されているように、収縮部材８８ は、チューブの外面上に刻み目８９を形成してチューブト７６により組み込まれ て形成される。収縮部材は、支持体９０によって支持され、遠心分離の間の圧縮 を防ぐ。バケットはまた、収縮部材８８の上方および下方の両方でチューブ内で 配置される密度材料９１を含有する。 チューブ７６のさらなる特徴は、進入ポート９２である。この進入ポートは、 閉じられた液体チャンネル９４を介してチューブ７６の底部９５に連通する。進 入ポートおよびチャンネルは、例えば、密度勾配細胞分離培地で、チューブ９５ の下方部分を満たすために使用される。あるいは、そのポートおよびチャンネル は、遠心分離後のチューブの底からの、細胞ペレット材料を含む、材料の除去に 使用され得る。このチューブの特徴は、例示されている閉じられたシステム関連 に限定されない。 貯蔵容器７０からチューブ７６へ流れる液体は、通気進入ポート８２上に吸引 管を適用して開始され得るか、または重力を包含する、当該分野で公知の方法に よって開始され得る。流速は、２つの容器間の圧力ヘッドを変えるか、またはチ ューブ内に配置された、もしくは貯蔵容器７０と進入ポート７８との間の位置で 、進入ポートに配置されたバルブを調節して、調節される。流速は、密度勾配溶 液のレベルを越えて、バケット７６の上方部分を満たすか、または部分的に満た すように、最適に調節される。十分な液体サンプルがチューブに進入したときに 、 流入は、バルブによるかまたは圧力ヘッドの降下によるような、当該分野で公知 の多数の方法のいずれかによって、停止される。次に、チューブがバケットから 除去され、ポート７８はシールされ、バケットは、下記のように遠心分離に供さ れる。 他の好ましい実施態様では、細胞捕捉チューブが、図７に示されている遠心分 離シリンジ１１０ような、遠心分離可能なシリンジの形態で使用され得る。示さ れているように、遠心分離シリンジ１１０は、針１１３を受容するために適応さ れた付属器具１１２によって囲まれた中央のオリフィス(orifice)を有する標本 容器１１４、ハンドル１１６、およびプランジャ１１８を含む。付属器具１１２ は、針を保持するために適応されたロッキングチップのいずれかのタイプ、例え ば、Luer-Lock^TMシリンジチップであり得る。あるいは、付属器具１１２は、減 菌液体バッグおよびチューブとの接続に適応された滅菌隔壁、例えば、逆流バル ブを有するSAFSITE^TMスモールワイヤー拡張セット、およびBurron Medical Inc. ，Bethlehem，Pennsylvaniaから入手可能なSpin-Lock^TMアダプターであり得る。 さらに、ハンドル１１６は、好ましくはノブ１２２およびプランジャ１１８へ の取り外し可能な連結部１２４を有する。示されているように、プランジャ１１ ８は、プラスチック材料から機械的または鋳造によって作製される単一部品であ る。プランジャは、好ましくは、接続部１２４に取り外し可能に接続されている ロート形状の底壁１２６を有する。側壁１２７は、好ましくは、滑動可能である が、その周りはまだ本質的に液体の厳密なバリアを提供するように、容器壁に密 接に組み合わされた。頂部壁は収縮部材１２８によって形成され、これは中央開 口部１２９を規定する。あるいは、側壁１２７の外径は、滑動を促進するのにわ ずかに小さく、Ｏリングシールが、側壁１２７と容器１１４との間に提供された 。取り外し可能な接続部１２４は、例えば、スクリュー付属器具またはスナップ 付属器具の形状を取り得る。好ましくは、接続部２４はまた、ハンドル１１６の 再結合のために提供される。 プランジャ１１８は、標本の導入の前に、密度勾配材料１２０で満たされる。 好ましくは、密度勾配材料は、収縮部材を超えるレベルまで、または少なくとも 開口部１２９の頂部を超えて満たされる。例えば、約2.8 cmの内径を有する、標 準の50 mlシリンジを使用するときは、勾配材料は、好ましくは、界面が収縮部 材１２８の上方に形成されるように、収縮部材の上方に少なくとも約１mmまたは それを超えるレベルに満たされる。 ５.１.Ｂ．密度勾配材料および調製 本発明の重要な局面に従って、特定の細胞の有意な富化が、十分に限定された 特異的密度を有する、単層細胞分離培地上での細胞混合物の遠心分離によって達 成され得ることが発見された。規定された特異的密度はほぼ単離されるべき所望 の細胞型の密度である。重要なのは、細胞分離培地は、所望の特異的な細胞型の 特異的密度の±0.0005 gr/mlの精度、好ましくは±0.0002 gr/mlの精度に調製さ れなければならない。このような十分に限定された培地を使用して、特異的な細 胞型は、従来の遠心分離チューブ中で、単一密度培地上における遠心分離によっ て単離され得る。しかし、本明細書に示されているように、このような培地と組 み合わされた細胞捕捉チューブの使用は、一般的に操作および収量の改善を促進 する。 本発明の細胞分離の装置および方法は、1.0000 gr/mlと2.0000 gr/mlとの間の 特異的密度、好ましくは1.0300 gr/mlと1.2000 gr/mlとの間の特異的密度（これ は、所望の細胞の特異的密度の±0.0005の精度、好ましくは±0.0002の精度であ る）を有する、密度勾配材料のような、細胞分離材料の使用を包含する。種々の 市販の勾配物質が、所望の細胞集団の規定された密度に基づく細胞の単離を達成 するために使用され得、このような物質は、Pharmaciaから入手可能な「PERCOLL 」；「FICOLL HYPAQUE」；スクロースのような任意の糖溶液；デキストラン；ウ シ血清アルブミン（BSA）のような任意のタンパク質溶液；Metrizamideのような ヨウ化低分子化合物；および、塩化セシウムのような重金属塩を包含するが、こ れらに限定されない。 本発明の重要な特徴に従って、密度勾配溶液が調製され、そして、使用の前に 、生理学的等張密度勾配を維持するために、予め定められた密度；浸透圧、最も 好 ましくは280〜320 mOsm/kg H₂Oの範囲；および、pH、好ましくは6.8〜7.8、そし て最も好ましくはpH 7.4；に調整されるべきである。浸透圧およびpHは、密度勾 配分離法が実施される特定の条件に依存して、変化し得る。例えば、サンプルが 保持または遠心分離される温度は、適切な密度を維持するために、密度勾配材料 の浸透圧および／またはpHの改変を必要とし得る。浸透圧およびpHのこのような 改変は、当業者に明白である。 細胞の密度は、培養、回収、または貯蔵の条件に従って変化し得るので、細胞 サンプルは回収後比較的短時間に処理されるべきである。所望の細胞の、体液か らの最適な単離のために、血液サンプルは、回収後４８時間以内に使用されるこ とが望ましい。最も好ましくは、体液は、回収後数時間以内に密度勾配遠心分離 に供されるべきである。調整された勾配溶液は、遠心分離の間に、それに積層さ れる全細胞が分離されるのに十分な容積で、遠心分離チューブに添加されるべき である。例えば、溶液の約20-25 mlの容積は、一般に、全血20 ml中の所望の細 胞を分離するのに適している。 コロイドシリカとして分類される「SILAN PERCOLL」（S-Percoll； Pharmacia Fine Chemicals，Piscataway，NJ）は、１つの好ましい密度勾配材料である。S -Percollは、反応、すなわちシラノール基をアルキルトリメトキシシラン試薬で ブロッキングすることによってコロイドシリカから調製され、そして以下の構造 式を有する： 関連のコロイドシリカおよびその調製方法は、Dornの米国特許第4,927,749号 に開示されている。浸透圧280-320 mOs/kg H₂Oを有する「PERCOLL」ストック溶 液は、ヒト細胞に対しては、１量部のCaおよびMgを含まない10×PBSまたは1.5 M NaClを加えた12量部の「PERCOLL」を添加するか、または、非ヒト動物細胞に対 しては、１量部のCaおよびMgを含まない10×PBSまたは1.5 M NaClとともに9量部 の「PERCOLL」を添加することによって、作製され得る。 本発明の細胞分離方法の実施では、細胞分離材料の特異的密度は、回収される べき細胞の特異的密度の約±0.0005 gr/ml、好ましくは±0.0002 gr/ml内である ことが、一般的に好ましい。ストック溶液の４桁までの特異的密度が、適切な装 置、例えば、±0.0002 gr/mlの精度で密度を測定する、DMA48（Anton PAAR USA ，Ashland，VA）のような高精度デジタル密度計を使用して決定され得る。本発 明のこの局面は、下記のセクション５.３においてさらに考察されている。 ストック溶液の浸透圧は、例えば、ヒトでの使用に対しては280 mOsm/kg H₂O ±10、または動物での使用に対しては320 mOsm/kg H₂O±10に、適切に調整され 得る。pHは、生理学的等張溶液が所望される場合には、優先的に7.4に調整され 得る。 上記のように調製された、細胞分離材料の適当量が、必須ではないが、好まし くは細胞捕捉チューブである、遠心分離チューブ中に置かれる。分離されるべき 細胞混合物は、チューブに重層され、そしてそのチューブは、一般に約500-1500 ×gの低速で遠心分離に供せられる。細胞分離材料の特異的密度より、より大き な密度を有する細胞は、チューブのペレット部分に移動し、一方、その材料より 、より小さい密度を有するのもは、細胞希釈物と材料との間の界面にとどまる。 一般に、本発明の方法は、界面に存在するより軽い細胞の画分の回収に関する。 ５.２ 密度調整細胞分離 本発明のさらなる局面に従って、本明細書に記載の密度分離法は、分離される べき細胞混合物に、混合物中の選択された細胞に効率よく結合する細胞特異結合 分子に結合する微粒子キャリアを加えることによって、改良される。好ましい方 法では、使用されるこのような結合分子は、目的細胞とほぼ等しいかまたは軽い 密度を有する細胞を、夾雑する混合物から、遠心分離の間に取り出す。本明細書 で「密度調整細胞分離（DACS）」と呼ばれるこのプロセスは、以下のセクション に記載されている。 ５.２.Ａ．密度調整細胞分離（DACS）を使用する細胞の単離 図８（A-D）は、密度調整細胞分離（図8Cおよび8D）と、従来の密度勾配遠心 分離（図8Aおよび8B）とを比較する。両方の方法では、所望しない細胞１３２お よび所望の細胞１３４を含有する溶液１３０は、密度勾配材料１３１上に重層さ れる。図8Bに関して、従来の勾配遠心分離による遠心分離後に、目的の細胞１３ ４との界面で捕捉された比較的多量の所望しない細胞型１３２が、なお存在する （図8B）。 DACSを使用して、親和性を改変したキャリア粒子が、所望しない細胞に結合す るように、細胞混合物に添加される。図8Cに示されているように、キャリア１３ ６は、所望しない細胞に結合して密度調整細胞１３８を形成する。これらの細胞 はより濃密にされ、従って、遠心分離の間に沈澱し得る（図8D）。あるいは、勾 配密度より重い細胞に対しては、軽いキャリア粒子、例えば、細胞型特異的結合 因子の直接または間接結合によって細胞型特異性が与えられる、高度の多孔質シ リカ粒子を使用して、より軽い密度が与えられ得る。 所望しない細胞に特異的なキャリア粒子が細胞または組織サンプルと混合され 、次いで本明細書に記載の本発明の方法に従って、事情に応じて設定された密度 勾配に重層される、単一の遠心分離工程が、サンプルからの目的の細胞の実質的 な富化を可能にする。上記は、負の親和性様式で適用された密度調整細胞分離の 例であり、すなわち、所望しない細胞（例えば、腫瘍細胞）を、所望しない細胞 集団に特異性を有する改変キャリア粒子を使用することによって、サンプルから 浄化することの例である。あるいは、密度調整細胞分離は、正の親和性様式で適 用され得、すなわち、所望の細胞集団に対して特異性を有する改変キャリア粒子 を使用することによって、サンプルから所望の細胞を回収するために適用され得 る。ビーズは、酵素的または化学的切断によって、所望の細胞から除去され得る 。例えば、パパインは、免疫グロブリンから所望の細胞を切断するために使用さ れ得る。第一回目の遠心分離および富化細胞の回収後に、密度調整細胞分離を包 含す る第二回目の遠心分離が、所望の細胞集団をさらに富化するために実施され得る 。同じ密度を有する所望しない細胞はこの手順によって効率よく除去され得るこ とから、DACSの別の利点は、目的の細胞と上記に考察された細胞分離材料との特 異的密度の正確な一致があまり重要ではないことが、さらに理解され得る。 本発明の支持のもとに実施され、セクション５.３.Ａ.で考察され、そして実 施例1Eに説明されてる研究は、妊婦からの完全血液(complete blood)が、キャリ ア粒子コート抗CD45とともにインキュベーションされたときに、ほとんどの白血 球がサンプルから涸渇されたことを実証する。 実施例２に詳述されているさらなる研究は、CD34⁺細胞の単離について、ガン 患者からのアフェレーシスされた血液がキャリア粒子コート抗CD45抗体と直接イ ンキュベーションされ得、所望の白血球の涸渇を提供し得ることを実証する。 種々の細胞型特異的結合因子が、血液中の標的特異的細胞型に対して使用され 得ることが、理解され得る。このような結合因子の選択は、回収されるべき細胞 型および細胞混合物の細胞組成に基づいて、当業者に明白である。有用な因子は 、白血球特異抗体のような抗体、例えば、Ｔ細胞に特異的な抗CD3、抗CD4、抗CD 5、および抗CD8；Ｂ細胞に特異的な抗CD12、抗CD19、および抗CD20；単球に特異 的な抗CD14；ナチュラルキラー細胞に特異的な抗CD16、および抗CD56；ならびに 血小板に特異的な抗CD41を包含する。これらの抗体の多くは、すでに種々の型の 粒子と結合された形態で市販されている（AMAC，DYNAL）。さらに、細胞型特異 的結合因子は、小麦胚芽アグルチニンおよびダイズアグルチニンのようなレクチ ン、成長因子、およびサイトカインを包含する。 あるいは、本明細書に記載されている造血幹CD34⁺細胞の単離方法に関して、 ポジティブの選択手順が、細胞をより高い密度にするために使用され得、それに よりそれらは、遠心分離中にペレットにされる。この場合には、キャリア粒子に コートされたCD34に関する抗体が、残りのCD34⁺細胞をペレットにするために使 用される。さらに、任意の細胞表面マーカーに関する抗体が、当該分野で周知の コンジュゲート法後に、密度調整細胞分離での使用のための重い粒子に直接結合 され得る。密度調整細胞分離が適用されるときに、所望しない細胞が全て重くさ れる限り、勾配の特異的密度はあまり重要ではないことが注目される。 ５.２.Ｂ．キャリア粒子 市販の多数のキャリア粒子は、本発明に使用され得、例えば、有機ポリマー（ 例えば、ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリビニル化合物（例えば、ポリビニ ルクロリド、ポリアクリロニトリル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、 ポリカルボネート）およびそれらの共重合体；ポリスチレンラテックス；ナイロ ン：ポリテレフタレート；など、あるいは無機ポリマー（例えば、ガラスもしく はシリカ粒子）；セルロース、デキストラン、ポリサッカリド（例えば、アガロ ース、セルロース、セファロース、セファデックなど）、あるいはそれらの組合 せを包含する。キャルア粒子は、天然に存在するポリマー、修飾された天然のポ リマー、および合成付加および縮合ポリマー由来であり得る。本発明の好ましい キャリア粒子は、アミノプロピル基に結合され、1.08 gr/mlより大きい密度を有 する、0.1-5.0μmのシリカ粒子である。1990年5月22日に発行された米国特許第4 ,927,750号および同第4,927,749号は、本発明においてキャリア粒子として使用 され得る修飾シリカの例を記載している。種々のキャリア粒子が、例えば、Bang s Laboratories，Inc.、Carmel，IN.、Pharmacia、Sigma Chemical Company、Bi o-Rad、AMAC，Inc.などから市販されている。 本発明の好ましい重いキャリア粒子は、前記の方法に従って選択された、密度 勾配材料の密度よりより大きい密度を有し、キャリア粒子が遠心分離に際してペ レットになるように粒子のサイズが0.1μm〜5.0μmである、シリカビーズである 。このような粒子は、本明細書中の実施例4Bに記載されているように、さらにシ ラン化され得る。好ましい粒子はまた、細胞型特異的結合因子に、直接的または 間接的のいずれかに結合する能力を有するか、あるいはこのような因子に誘導体 化され得る。 本発明に有用な好ましい軽いキャリア粒子は、遠心分離に際して粒子が密度勾 配の上方に浮遊するように1.0未満の密度および0.1〜5.0μmの粒子サイズを有し 、ならびに、細胞型特異的結合因子に直接的または間接的に結合する能力を有す る ものである。このような低密度キャリア粒子は、「Scotchlite microbeads」と 呼ばれる、3M，St．Paul MNカタログ番号H50/1000から入手可能である。 ポリスチレンラテックス粒子（Sigma Chemical Companyから入手可能）もまた 低密度粒子として使用され得るが、表面の疎水性のために、このような粒子は、 非特異結合性を特徴的に示す。このような非特異結合性は、当該分野で公知であ る、タンパク質による予備吸収またはメタクリル酸基の付加のような処置方法に よって、減少され得る。ラテックス粒子は、金属基の付加によって高密度粒子に 転換され得る。 一級アミノ官能基（Affi-Gel 701ビーズ）またはカルボキシル官能基（Affi-G el 702ビーズまたはImmunobead Reagent）のいずれかに結合されたBio-Radポリ アクリルアミドビーズのような、ポリアクリルアミドキャリア粒子もまた、本発 明の使用のために入手可能である。 生体適合性である、すなわち、細胞またはその他の生物学的化合物と非特異的 に相互作用せず、そして特定のタンパク質および他の生化学的分子に共有結合さ れ得ない官能基を含む、小さくて安定な球形粒子が、1976年５月19日発行の米国 特許第3,957,741号に開示されている。ヒドロキシルおよびアミノ基が、タンパ ク質、およびアミノ基を有する他の化学物質のポリスチレンラテックスに対する 共有結合のために、臭化シアンによって活性化され得る。 1977年７月12日発行の米国特許第4,035,316号は、細胞特異的で可変密度の、 アミノヒドロキシルおよび／またはカルボキシル官能基によって誘導体化され、 そして、少なくとも1.30 gr/ml、好ましくは1.40 gr/mlを超える密度を有するか 、または、1.15 gr/ml未満、好ましくは1.08 gr/mlの密度を有する、ポリマー性 マイクロスフェアを作製する方法を記載している。 高均質シリカ粒子を形成するプロセスは、1991年１月８日発行の米国特許第4, 983,369号に記載されている。 磁場の使用を介する細胞の分離を促進する、磁気物質を結合するキャリア粒子 もまた、本発明の範囲内に包含される。1988年10月11日発行の米国特許第4,777, 145号は、磁気粒子を使用する免疫学的アッセイを記載している。AMAC，Inc.，I MMUNOTECH，S.A.(France)の系列子会社は、モノクローナル抗体、例えば、抗CD4 、抗CD8、抗CD19、抗CD45などでコートされた磁気マイクロスフェアを提供する 。 ５.２.Ｃ．細胞型特異的結合因子 本発明の細胞分離方法は、以前のセクションに記載したように、直接的または 間接的のいずれかでキャリア粒子に結合され得る、所望するまたは所望しない細 胞集団のいずれかに特異性を有する、細胞型特異的結合因子の使用を包含する。 本明細書に定義されているように、「細胞型特異的結合因子」は、例えば、抗体 または抗原；ペプチドまたはポリペチド；成長因子またはサイトカイン；レクチ ンおよびアグルチニン、あるいは所望の細胞集団または所望しない細胞集団のい ずれかに特異性を有する当該分野で公知の他の親和性分子を包含する。これらの 多くの因子は市販されているか、または周知の方法に従って生成され得る。 本発明で使用され得る、市販の細胞型特異的結合因子は、抗体、抗原、ポリペ プチド、ペプチド、成長因子、膜結合レセプター、低有機分子、レクチン、およ びアグルチニンを包含するが、これらに限定されない。 市販のまたは細胞培養物寄託局、例えば、ACTT，Rockville，Md.またはNRLL， Peoria，Ilを介して入手可能な、当業者に公知である種々の抗体が、単離または 富化が望まれる細胞型に依存した細胞型特異的結合因子として、本発明で使用さ れ得る。これらの抗体は、Ｔ細胞に特異的な抗CD2、抗CD2R、抗CD3、抗CD4、抗C D5、および抗CD8、顆粒球、単球、および血小板に特異的な抗CDw17、白血球に特 異的な抗CD18、活性型ＴおよびＢ細胞に特異的な抗CD71のような造血およびリン パ球抗原に特異的な抗体、マクロファージ、増殖細胞、サイトカインおよび成長 因子（例えば、IL1、IL13、EGF、IGF IおよびII、TGF-αおよびβ、TNF-αおよ びβ、FGF、NGF、CIF、IFN-αおよびβ、CSF）に対する抗体、ホルモン、細胞ま たは腫瘍関連抗原またはマーカー、付着分子、止血分子、および内皮細胞を包含 するが、これらに限定されない。使用される正確な因子は、所望の細胞の抗原性 、およびそれが単離されるべき細胞混合物の組成に依存する。当業者は、これら の因子に基づいて、最適なキャリア因子を決定し得る。 親和性分子として有用な抗体は、当該分野で公知の標準的なポリクローナルま たはモノクローナル産生方法に従って産生され得る。有用な抗体は、ポリクロー ナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fab発現ライブラリーおよびファージ 発現ライブラリーにより産生されるFabフラグメントを包含するが、これらに限 定されない。 市販のアグルチニンは、本発明で使用され得る。これらは、小麦胚芽アグルチ ニン、ピーナッツアグルチニン、ダイズアグルチニン、フィトヘマアグルチニン 、および白血球アグルチニンを包含するが、これらに限定されず、例えば、Phar macia Fine Chemicals（Piscataway，NJ）から市販されている。 ５.２.Ｄ．細胞型特異的結合因子のキャリア粒子への結合 細胞型特異的結合因子のキャリア粒子への固定は、当業者に公知の種々の技術 によって達成され得る。このような方法は、例えば、Bangs（The Latex Course( 1992)、Bangs Laboratories，Inc.，Carmel，INから入手可能）；Yoshiokaら、1 991，Journal of Chromatography 566:361-368；Popeら、1993，Bioconjugate C hem. 4:16-171）；HarlowおよびLane，1988，Antibodies: Laboratory Manual， Colorado Spring Harbor Laboratory；Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook， 1992，Savageら編、PIERCE；Hermansonら、Immobilized Affinity Ligand Techn iqes ，1992、Academic Press，Inc.に記載されている。 結合技術は、例えば、単純な物理学的吸収または吸着（ここで、細胞型特異的 結合因子が官能基の使用なしにキャリアタンパク質に直接結合される）；第二の 結合因子、例えば、BSAがキャリア粒子に同時吸着され、官能基に結合するため の塩基を形成する、複合吸着；および、結合因子のキャリア粒子への共有結合； を包含するが、これらに限定されない。ビオチン-ストレプトアビジン（strepav idin）親和性システムもまた、細胞型特異的結合因子をキャリア粒子に結合する ために、本発明において使用され得る。共有結合のための種々の粒子表面化学反 応は、当該分野で公知であり、カルボン酸、一級または脂肪族アミン、芳香族ア ミンまたはアニリン、クロロメチル（ビニルベンジルクロリド）、アミド、アル デヒド、ヒドロキシル、チオ、ヒドラジド、エポキシ、サルフェート、およびス ルホネートを包含するが、これらに限定されない。他の化学結合反応は、Bangs ，Uniform Latex Particles(1984)に記載されている。 本発明での使用には、細胞型特異的結合因子のキャリア粒子への直接的または 間接的結合が、キャリア粒子の表面を最大被覆し得るように過剰結合因子にて実 施されることが好ましく、それによって、非特異結合およびビーズの凝集の可能 性を減少する。キャリア粒子はまた、ブロッキング剤、例えば、カゼイン、ゼラ チン、およびTWEEN界面活性剤に供せられ得、非特異結合を減少させるために、 満たされていない部位を埋める。 １つの例示的実施例では、キャリア粒子表面のカルボキシル基は、細胞型特異 的結合因子上の利用可能なアミノ基と反応され得る。細胞型特異的結合因子の粒 子表面への他の結合方法は、活性型カルボン酸、カルボジイミド、すなわち、（ 1-エチル-3-(3-ジ-メチルアミノプロピル)カルボジイミドまたはEDAC、イミドエ ステル、活性アルキルハライドなどの、アミド、アミジンまたはアミノ連結を形 成するための使用を包含する。 本発明の好ましいキャリア粒子は、アミノ基がグルタルアルデヒド連結を介し て結合されている、アミノプロピルシリカ粒子である（実施例４を参照のこと） 。 ５.３．選択細胞型の単離 本発明は、細胞型の特異的密度が既知であるときに、インビボおよびインビト ロの混合物から所望の細胞型を単離または富化するための方法を提供する。この 方法によって単離される例示的な特異的な細胞型が、以下に記載される。 好ましくは、本方法は、特異的な細胞型の特異的密度が±0.0005gr/ml内であ る特異的密度を有する細胞分離培地を用いての、セクション５.１.Ａ.に記載さ れている細胞捕捉細胞分離装置の１つの実施態様の負荷、次いで、その装置の遠 心分離を包含する。所望の細胞は次に、遠心分離チューブの上方部分から回収さ れる。 細胞捕捉遠心分離装置の使用は、本発明の方法の利便性および効率の助けとな るが、本発明は、一部、使用される密度勾配の特異性および精度に基づくことは 、注目されるべきである。すなわち、密度勾配は、規定された浸透圧のもとに、 それらの密度が、所望の細胞の特異的密度の、少なくとも±0.0005gr/ml、好ま しくは±0.0002gr/ml内の精度であるように調製されなければならない。従って 、本発明は、密度が十分に規定される限り、標準的な遠心分離チューブおよび細 胞捕捉チューブを使用して実施され得る。本明細書中の実施例１〜３は、細胞捕 捉を伴うかまたは伴わない、特異的密度細胞分離培地の使用を記載する。 遠心分離後、所望の細胞が、勾配物質溶液と細胞サンプル溶液との間の界面に 認められる。界面の物質は回収され得、次に所望すれば、それを富化するために 遠心分離する。あるいは、閉鎖システム中に所望の細胞物質をとどめるのが好ま しいとき、遠心分離は、閉鎖システム中、またはセクション５.１.Ａに記載され るような、細胞捕捉形態を有する遠心分離シリンジ中で実施され得る。 所望すれば、所望の細胞型の改善された純度が、セクション５.２.に記載のよ うに、上記の手順を、密度調整細胞分離手順に加えることによって達成され得る 。そこに記載されているように、遠心分離の前に、所望の細胞を含有する細胞サ ンプルを、所望しない細胞を効率よく結合および除去する細胞型特異的結合剤を それに結合させるキャリア粒子に曝す。 治療適用には、所望の細胞集団は、勾配物質溶液と細胞サンプル溶液との間の 界面にとどまることが好ましい。あるいは、所望の細胞がペレット内でビーズに 連結されているとき、それらは、タンパク質分解酵素（例えば、パパイン）の使 用を含む、当業者に公知の方法によって、酵素的または化学的にビーズから切断 され得る。 本明細書中に記載の細胞分離法によって単離または富化された細胞は、種々の 診断使用および治療使用のために使用され得る。単離または富化された細胞は、 滅菌条件下で培養され得、そして細胞遺伝分析（例えば、染色体異常性の検出お よび性決定）に供せられ得る。単離または富化された細胞は、PCRおよびFISHを 使用するより感度のよい検出用の分子プローブと反応し得る。単離または富化さ れた細胞はまた、治療的に、例えば、同種および自己移植のために使用され得る 。 以下のセクションは、本発明の基本原理に従って単離される、治療および／ま たは診断に有用な３つの細胞型の単離のための特定の手引を提供する。 ５.３.Ａ．母体血液からの胎児細胞の単離 リンパ球、栄養芽細胞、および有核赤血球を含む少量の胎児細胞が、母体血液 中で循環することは、現在確立されている。これらの細胞は、出生前試験のため の遺伝子物質の代替供給源を提供する（SimpsonおよびElias，1993，JAMA 270:2 357）。しかし、母体血液中にこのような細胞が希にしか存在しないこと（10⁷〜 10⁸母体血液細胞中１個と見積もられる）は、単離および検出の増大された方法 の必要性を示す（Holzgreveら、1992，J ．Reprod．Med. 37;410）。ポリメラー ゼ連鎖反応（PCR）および蛍光インサイチュハイブリゼーション（FISH）を含む 、いくつかの検出方法が最近の進歩から入手可能になったが、出生前の診断のた めの母体血液の日常的な使用における主要な障害は、母体血液混合物中の少量の 胎児細胞を、確実な診断結果を得るために富化し得ないことである。 蛍光活性化細胞分離（Herzenbergら、1979，Proc ．Natl．Aca．Sci．USA 76:1 453）、磁気活性化細胞分離（Ganshirt-Ahlertら、1992，Am ．J．Obstet．Gynec ol. 166:1350）、またはこれらの手順の組合せ（Ganshirt-Ahlertら、1992，Am. J ．Hum．Genet. 51:A48）を含む、いくつかの技術が、この必要性に合わせて提 案されている。これらの手順は、部分的に胎児細胞を富化し得たが、それらは、 精巧な機器を使用するので経費がかかり、そして複数の関連工程のために扱いに くい。より重要なことに、このような方法は、実質的な細胞損失をもたらし、そ れによって、次の分析のために用いられる胎児の細胞数を減少させる。 妊娠中に母体血液中に存在することが知られている胎児の細胞型のうち、有核 赤血球は、富化および検出のための最も魅力的な候補物である。これらの細胞の 核は、PCRおよびFISHのような技術の適用のための遺伝子材料の供給源を提供す る。抗CD71および抗グリコホリンAのような、細胞を特徴づけるために使用され 得る、周知で、市販され、入手可能な抗体もまた、いくつか存在する。赤血球系 統での胎児細胞を標的するための他の主要な利点は、それらの比較的短い生存期 間である。リンパ球とは異なり、これらの細胞は、母体血液の分析を妨害するよ うには妊娠前から存在しないはずである。 本発明の装置および方法は、細胞混合物から胎児細胞を単離するために使用さ れ得る。特に、本方法は、遺伝子試験による出生前診断の目的のために母体血液 から希な胎児細胞を単離するために使用され得る。 本発明のこの局面は、一部、1.0720±0.0005gr/mlの密度、280mOsm/kg H₂Oの 浸透圧、およびpH 7.4に調整されたコロイドシリカ（PERCOLL）溶液が、予備分 離または希釈なしの全血が勾配溶液上に重層されるとき、大部分の成人血液細胞 から胎児細胞を効率よく分離するという、出願者の発見に基づく。さらに、本方 法は、細胞損失を増大するピペットの使用による細胞回収に対して、上方部分（ すなわち、収縮部分の上方）の細胞をデカンテーションによって取り出し得る収 縮部分を有する、本明細書中に記載の細胞捕捉遠心分離チューブの使用によって 改善される。 実施においては、末梢血が、抗凝固剤含有のチューブ中、またはアフェレーシ ス（apheresis）またはリューコフェレーシス（leukopheresis）によって、妊婦 から回収され得る。全血は、遠心分離前に、処理または希釈されることを必要と しない。しかし、本方法は、特定の浮遊密度に基づいて胎児細胞を富化するので 、回収後比較的短時間内に、細胞を分離に供することが重要である。なぜなら、 細胞の密度は、培養または貯蔵条件に従って変化するからである。従って、母体 血液からの胎児細胞の最適な富化を得るために、血液サンプルは、回収後４８時 間以内に使用されることが好ましい。最も好ましくは、血液サンプルは、回収の 数時間以内に密度勾配遠心分離に供されるべきである。 本発明は、細胞捕捉遠心分離チューブ内の規定された密度勾配上に全血を重層 することによって実施され得る。遠心分離後に、界面における細胞を回収し、そ してもう１回の遠心分離工程によってペレット化し、細胞破片、血小板、および 密度勾配物質の残存物を除く。その後、細胞は、抗CD45のような抗体との反応性 によって、大部分の白血球を涸渇させる；残存の赤血球はフローサイトメトリー によって分析され、そしてこの集団内の胎児細胞が、特異的分子プローブを使用 するFISHによって同定される。 本方法の効率は、上記のセクション５.２に記載される密度調整細胞分離と組 み合わされるとき、さらに改善され得る。従って、本発明のこの特定の実施態様 は、多量血液から胎児細胞を富化するための迅速かつ高収量の方法を提供する。 得られる細胞集団中の増加した胎児細胞数は、遺伝子試験に一般的に適用される 技術の感度および精度を増大させる。 さらに細胞損失を最少にするが、血小板除去を達成するための取り組みにおい て、胎児有核赤血球をペレット化する第２の遠心分離工程もまた、細胞捕捉チュ ーブ内で実施され得る。 実施例１は、本発明に従って有核胎児細胞を単離するための物質および方法を 詳しく説明する。表１は、「PERCOLL」が、本発明に従う１工程勾配分離におい て、密度勾配物質として使用された実験からの結果を示す。「PERCOLL」を、実 施例１の記載のように調製し、そして280mOsm/kg H₂Oの生理学的浸透圧およびpH 7.4の生理学的に調整した。 実施例１の記載の実験結果をまとめると、細胞分離培地の特異的密度は、記載 のように調整された。細胞を界面から回収し、そしてマーカー抗原特徴づけによ って、胎児およびペレットおよび界面のパーセントおよび収量について試験され た。表１にまとめるように、1.0720gr/mlまたはそれを超える密度は、遠心分離 前の全有核細胞集団から少なくとも約50%の有核細胞の回収をなし、勾配が1.075 0gr/mlまたはそれを超える密度に調整されたとき、成熟赤血球による界面の実質 的な夾雑が存在した。 前述から、開始細胞混合物から全有核細胞を高パーセントで回収し、しかし、 成熟赤血球混入を減少させるために、1.0720gr/mlの密度が最適であることが理 解される。さらに、この密度は、精度±0.0005gr/ml、好ましくは±0.0002gr/ml で規定されるべきである。 ４つの細胞分離方法が有核赤血球の収量について比較されたとき、本発明の２ つの方法が、従来法より実質的に高収量（パーセント）の有核赤血球を調製した 。表２は、細胞が４つの異なる方法によって単離された実験の結果を示す。DACS 処理サンプル以外の全てにおいて、当該分野での公知の方法に従って、遠心分離 されたサンプルは、磁気ビーズに結合された抗CD45抗体で涸渇された。これらの 結果から、1.0720±0.0002gr/mlの密度の「PERCOLL」を含有する細胞捕捉チュー ブは、1.077±0.001gr/mlの密度および320mOsm/kg H₂Oの浸透圧でストック「FIC OLL」を使用する従来法より、約20倍多数の有核赤血球を生成したことが理解さ れ得る。従って、本方法は、従来法に比較して、その後の遺伝子試験を可能にす る胎児有核赤血球の総数の統計学的に有意な増加をもたらした。さらに、その方 法はまた、胎児栄養芽細胞細胞を富化した。さらなる調査が、富化画分に存在す る分化の異なる段階の胎児細胞を明かにした。さらに、DACS法では、CD45⁺の所 望しない細胞集団の磁場涸渇を必要とする方法と、同等の結果を得た。 遠心分離における使用に適した任意のチューブが、本発明の実施のために使用 され得る。好ましい実施態様では、本発明は、胎児細胞の密度分離のための細胞 捕捉チューブに向けられる。本発明の目的に、細胞捕捉チューブは、その内部に 収縮部分または捕捉、および適切に調整された密度勾配物質を含有する遠心分離 チューブを指し、密度勾配物質は、一定の密度を有する細胞が、遠心分離の間に 、収縮部分の開口部を通って、収縮部分の下部のコンパートメント内に細胞ペレ ットを形成するように、収縮部分を超えるレベルまで満たされる。 前述の実験で、母体サンプルのDACS処理は、密度勾配界面から不必要な血液細 胞を涸渇するための薬剤として、抗CD45を使用した。種々の他の細胞型特異結合 薬剤が、血液中の特異細胞型を標的するため使用され得る。これらの薬剤は、Ｔ 細胞に特異的な抗CD3、抗CD4、抗CD5、および抗CD8；B細胞に特異的な抗CD12、 抗CD19、および抗CD20；単球に特異的な抗CD14；ナチュラルキラー細胞に特異的 な抗CD16および抗CD56；および、血小板に特異的な抗CD41のような抗体を包含す る。これらの抗体の多くは、すでに種々の型の粒子と結合された形態で市販され ている（AMAC、DYNAL）。あるいは、有核赤血球のポジティブ選択に、成熟赤血 球がサンプルから取り出され得、そしてキャリア粒子にコートされたグリコホリ ンAまたはCD71に指向する抗体が、残り全ての有核赤血球をペレット化するため に使用され得る。 上記の方法により富化された有核赤血球は、次に胎児細胞の存在について試験 された。雄胎児を有することが判明しているドナーから得た富化細胞調製物が、 FISH分析での使用に選択された。細胞を、緑蛍光色素に連結されたX染色体特異 プローブおよび赤蛍光色素に連結されたY染色体特異プローブとともにインキュ ベートした。胎児有核赤血球を、蛍光顕微鏡下で赤スポットおよび緑スポットを 含有する核を有する細胞（その他の細胞は、母起源の細胞である）として、同定 した。表２の最も右の欄は、従来法によるものより、本発明の１つの方法によっ て調製された細胞集団中におけるXY（胎児）染色体数が８倍増加したことを示す 。さらに興味深いことは、細胞捕捉および「FICOLL」を使用する方法はまた、細 胞捕捉チューブを使用せずに実施された同じ勾配を超えた検出閾値に対する胎児 有核赤血球数を増加させたことは注目される。このことは、細胞捕捉自身が、細 胞収量の増加に有用であったことを示す。 FISHのような技術に関連する確実な診断結果を得るために、一般的に、富化方 法が日常的な手順として使用されるために、胎児細胞を少なくとも0.1%の最終細 胞調製物に富化することが必要とされることは留意するべきである。本発明の方 法は、胎児細胞を、分析される総細胞10,000あたり41細胞のレベルまで富化する ことによって、この限界を明かに超えたことを本明細書中に示す。 ５.３.Ｂ 造血前駆細胞CD34⁺細胞の単離 骨髄および末梢血の移植は、ガンおよび造血異常の処置のために臨床で実施さ れる。造血前駆細胞は、輸注後に骨髄微環境に移動してこれを再構成する。分化 の程度に応じて、これらの前駆細胞は、骨髄微環境の短期間移植化または長期間 移植化のいずれかに寄与する。 一般的に、良好な移植および移植化に必要と考えられる２つの主要な細胞型が 存在する：放射線療法および化学療法直後の時間に患者の感染を防ぐ短期骨髄移 植化を提供する、コロニー形成ユニット細胞（CFU）；および、患者の長期永続 し、自己再生する骨髄系およびリンパ系を確立する、長期培養開始細胞（LTC-IC ）。CD34表面抗原を発現する造血前駆細胞集団は、CFUおよびLTC-ICの両方を含 有する。よって、本発明は、全CD34⁺細胞を富化する方法に関する。 さらに、骨髄細胞またはその他の前駆細胞供給源が、自己定植での再注入の前 に浄化されなければならない夾雑腫瘍細胞を含有するときは、低比率のCD34⁺細 胞を有する多量の全細胞が、腫瘍細胞の十分な浄化を行うことを、技術的に困難 にする。従って、後続の移植での使用のために残存腫瘍細胞の有効な浄化を受け るべきである、これらの細胞をより多量に含有する細胞混合物からCD34⁺前駆細 胞を富化する簡単な方法の必要性が残されている。 これらの問題に的を絞る取り組みで、研究者は、抗CD34抗体の使用に焦点を定 めた。このような手順は、抗CD34抗体を含有するカラムへの白血球の通過、ある いは磁気ビーズ連結抗CD34抗体への、または抗CD34コートプレート上でのパンニ ングによる細胞の結合、および結合細胞の回収のようなポジティブ選択を包含す る。しかし、親和性に基づく方法は、経費および時間を浪費する点において実用 的利用に関して制限を有する。 種々の型の密度勾配遠心分離を利用する造血前駆細胞の富化のための別の方法 が報告された（Olofssonら、1980，Scan．J．Haematol．24:254; Ellisら、1984 ，J．Immunol．Meth．66:9; LaskyおよびZanjani，1985，Exp．Hematol．13:680 ; Martinら、1986，Brit．J．Haematol．63:187）。しかし、全ての報告された 方法は、富化後に造血前駆細胞を同定するために、寒天コロニーアッセイを使用 す る。前駆体アッセイは、CD34⁺集団の１％未満を占める、決定付けられた前駆細 胞を検出するだけであることが、知られている。従って、これらの方法が、リン パ造血系を永続的に移植化および再構成し得る初期前駆細胞または幹細胞を、実 際に富化し得るかどうかは、それらが臨床的にテストされなかったので、明確で はない。さらに、発表された報告からは、これらのいずれの手順もが、臨床使用 に十分な量の細胞を得ることができる暗示は存在しない。 本発明は、密度勾配遠心分離に基づく、迅速かつ高収量の前駆細胞富化の方法 を提供する。さらに詳細には、本発明は、好ましくは、細胞収量を最大にするた めに、特別に設計された細胞捕捉遠心分離チューブ内に含有される密度勾配溶液 の厳密に決定された密度を利用する。 本明細書に記載されている本発明の方法の主要な利点は、多量のアフェレーシ スされた血液が、直接密度勾配上に設置され得ることである。末梢血は、抗凝集 剤含有チューブ内に回収される得るか、またはアフェレーシスまたはリューコフ ェレーシスによって回収され得る。さらに、単一工程プロセスが、注入物の総容 積を70-90％まで減少させ、それによって、必要な冷却貯蔵量を減少させる。富 化後に、最終細胞調製物は、開始細胞数の10％から30％の間を示すが、開始CD34⁺ 細胞数およびコロニー形成CFU数の70％と100％との間を含有する。CD34⁺細胞の この高収量（70％から100％）によって、単回の末梢血回収が、除法的(ablative )化学療法を受けている患者の造血系および免疫系を再構成するのに十分なCD34⁺ 細胞を与え得る。この細胞集団はまた、減少したT細胞数を有するが、相当数の ナチュラルキラー細胞およびナチュラルサプレッサー細胞を有する。さらに、こ の手順は、迅速、便利、かつ経費的に有効である。全サンプルの処理は、特別な 機器を必要とせず、１時間の時間枠で１人によって実施され得る。 本発明はまた、後続の移植での使用のために自己定植中の前駆細胞を再注入す る前に、腫瘍細胞が夾雑する骨髄細胞またはその他の前駆細胞供給源からの浄化 を提供する。 浄化目的に、所定の腫瘍細胞密度が、1.0490から1.0640 gr/mlの範囲の不連続 密度勾配上で、腫瘍含有サンプルを遠心分離することによって決定される。大部 分の所望されない非腫瘍細胞が、免疫系および造血系の細胞を代表し、1.0610か ら1.0770の範囲の密度を有する。腫瘍細胞の密度は、一般的に1.0490から1.0580 gr/mlの密度範囲になる。細胞分離培地の密度は、所望の前駆細胞の比重の±0. 0005 gr/ml、好ましくは±0.0002 gr/mlの精度まで決定される。従って、腫瘍浄 化は、二工程プロセスによって達成され得、そこで、前駆細胞が最初に、腫瘍細 胞を保持し得る細胞分離培地を通して、ペレット化される。あるいは、本明細書 に記載の方法に従って、DACS技法が、一工程プロセスで腫瘍細胞を除去するため に使用され得る。 CD34⁺細胞の富化には、細胞分離培地は、密度1.0605±0.0005 gr/ml、生理学 的浸透圧270-290 mOsm/kg H₂O、および生理学的pH 6.8-7.8に調整されるべきで る。より好ましくは、pH 7.4にて、密度は、1.0605±0.0002 gr/mlであり、そし て生理学的浸透圧は、280 mOsm/kg H₂Oである。 例示的な実施例では、G-CSF処置を受けているガン患者からのアフェレーシス された血液は、収縮より上のレベルまで満たされた「PERCOLL」溶液（好ましい 密度1.0605±0.0005 gr/ml、浸透圧280 mOsm/kg H₂O、およびpH 7.4に調整され ている）を含有する、細胞捕捉遠心分離チューブに、直接のせられる。「PERCOL L」溶液の密度は、少なくとも小数第４位までその精度を正確に決定できる密度 計で調整され得る。種々のその他の勾配物質が、前駆細胞富化に使用され得、そ してそれは、限定されないが、「FICOLL」、「FICOLL-HYPAQUE」、塩化セシウム 、アルブミンのような任意のタンパク質溶液、またはスクロースおよびデキスト ランのような任意の糖溶液を包含することに、留意されるべきである。しかし、 密度勾配溶液は、その使用の前に、本明細書の開示に従って、適切な密度、浸透 圧、およびpHに調製および調整されるべきである。勾配溶液は、より高い密度を 有する全細胞が、遠心分離の間に勾配を通って通過し得るのに十分な容積で、遠 心分離チューブに添加されるべきである。例えば、約20-25 mlの溶液の容積は、 一般的に、20 mlのアフェレーシスされた血液サンプル中の細胞を分離するのに 十分である。 遠心分離での使用に適した任意のチューブが、本発明の実施に使用され得る。 本発明の好ましい実施態様では、５.１.Ａ.節に記載されている細胞捕捉遠心分 離装置が、CD34⁺細胞の密度分離に使用される。 表３は、「PERCOLL」が、密度勾配物質として使用された研究での結果を示す 。「PERCOLL」は、生理学的浸透圧280±10 mOsm/kg H₂O、および生理学的pH 7.4 に調製および調整された。この研究には、開始細胞混合物は、G-CSFで処置され た非ホジキンリンパ腫患者からアフェレーシスされた血液のサンプルであった。 勾配が異なる密度に調整された場合、結果は、その密度が1.0600 gr/mlまたはそ れを超えると、より低密度に調整された勾配を超えて、界面画分にCD34⁺細胞の 約60-90％増加が存在したことを示した。さらに、全細胞収量の割合も、1.0600 gr/mlまたはそれを超えるとわずかに増加した。従って、開始細胞混合物から全C D34⁺細胞を高い割合で回収するために、密度1.0605 gr/mlが選択された。CD34⁺ 細胞の高収量富化を確実にするのに、±0.0005 gr/ml内の精度が好ましいことが 、さらに決定された。 本発明の支持において実施されるさらなる実験で、「PERCOLL」を、密度1.060 5 gr/mlおよび浸透圧280 mOsm/kg H₂Oに調整し、密度1.077±0.001 gr/mlおよび 320 mOsm/kg H₂Oを有するストック「FICOLL」と比較した。表４は、遠心分離の 重力が増加されたときに、より多くのCD34⁺細胞が、ストック「FICOLL」勾配中 でペレット化されたことを示す。非調整「FICOLL」の使用は、細胞混合物からの CD34⁺細胞の密度勾配分離に使用される標準的な物質であったので、これらの結 果は、正確に決定された密度範囲が、細胞混合物からのCD34⁺細胞の高収量富化 を実質的に増強し得たことを示す。表４に示されているように、1500×gでの遠 心分離後のCD34⁺細胞収量の割合は、従来法によって達成されたものより約２倍 増加した。 絶対細胞数および細胞回収率は、非ホジキンリンパ腫患者からのアフェレーシ スされた血液サンプルを使用して決定された。５つのサンプルからの平均細胞回 収率は変化したが、常に90％の範囲にあった。洗浄工程後に、細胞計数を実施し たので、このことは10％までの細胞損失を説明し得る。CD34⁺細胞回収率は、５ つの異なる血液サンプルから決定され、90％の範囲にあった。この結果は、上記 に示されている非特異的細胞損失と同様であり、従って、それは、CD34⁺細胞の 総数の特異的枯渇または造血前駆細胞によるCD34発現の変化に起因しなかった。 CFUの定量的回収率を決定すると、CFU回収率もまた90％の範囲にあった。従って 、1.0605 gr/ml密度勾配による細胞分離手順は、コロニーを形成する造血前駆細 胞の機能的潜在性を変化させなかった。 さらに、勾配にわたるCFUの定量的分布が決定された。図１０に示されている 結果は、ごくわずかな数のCFUのみが、ペレット画分に認められ、CFUの約90-100 ％が1.0605 gr/ml「PERCOLL」の界面に存在したことを示す。さらに、CFU-GEMM の100％が、界面に存在したことが認められた（図１１）。LTC-ICアッセイは、 決定付けられていない造血幹細胞の90から100％の間が、界面に存在することを 示した（図１２）。 従って、これらのデータは、1.0605±0.0005 gr/mlに調整された単層勾配上で のアフェレーシスされた血液の遠心分離が、全細胞産物のわずかの非特異的損失 （10％以下）をもたらしたことを実証する。しかし、界面は総細胞数の30％を示 したが、この細胞集団は、70-90％のCD34⁺細胞および90％を超えるCFUを含有し た。界面は100％のCFU-GEMMを含有し、そしてCFU-GEMMは、低い程度の造血決定 付けおよび限られた程度の自己再生を有する前駆細胞を示したので、界面はまた 、決定付けられていない造血幹細胞を含有した。LTC-ICアッセイによって得られ た結果は、さらにこの結論を支持する。この単純化された手順は、完全閉鎖系で のCD34⁺細胞富化の自動化を可能にし得る。さらに、細胞捕捉チューブで実施さ れた実験は、より高い程度の整合性さえ有する同様の結果を与えた。 CD34⁺ 細胞のさらなる指標：対宿主性移植片病（GvHD）は、ドナーの同種移植 片に存在するT細胞によって誘導される。その結果、いくつかの移植プロトコル は、移植前の移植片からの全T細胞除去を包含した。これらの方法はうまくGvHD を軽減したが、それらはまた、移植片の不全および腫瘍再発の発生を増加した。 言い替えると、限られた数のT細胞の存在が、同種移植患者の生存見込みに有益 であり得る。これに関して、「PERCOLL」勾配は、T細胞を除去するその能力につ いてテストするために、密度1.0605±0.0005gr/mlに調整された。G-CSF処置正常 個人からの正常骨髄およびアフェレーシスされた血液サンプルを、密度勾配上で 処理した。界面およびペレット画分からの細胞を、T細胞特異的抗CD3抗体で染色 した。図１３は、両方の組織供給源について、界面が、非処理物質中に存在した 全T細胞数の10％と20％との間を含有したことを示す。 インビトロでの研究は、ヒト骨髄が、混合リンパ球反応（MLR）でのインビト ロにおける同種応答をブロックする低密度の細胞を含有することを示した。この 抑制活性が、HLA非拘束性であったという事実に基づいて、それは、文献ではナ チュラルサプレッサー（NS）活性と呼ばれた。「PERCOLL」密度勾配は、NS活性 を有する細胞を富化するその能力についてテストするために、密度1.0605±0.00 05 gr/mlに調整した。G-CSF処置を受けたリンパ腫患者および正常個人からのア フェレーシスされた血液サンプルを、不連続５層勾配で遠心分離し、界面および ペレットを、混合リンパ球培養物を抑制するその能力についてスクリーニングし た。図１４は、NS活性を有する細胞が1.0605 gr/mlと等しいか、またはより軽い 密度を有したことを示す。その結果、90％を超えるNS活性が、1.0605 gr/ml勾配 上の遠心分離後の最終調製物中に存在した。 NK細胞は、自己腫瘍細胞を傷害することが示された。臨床観点から、腫瘍再発 を減少するために移植物中に増加したNK細胞数を有することが有益であり得る。 これに関連して、NK細胞密度は、不連続５層「PERCOLL」勾配上で決定された。N K細胞はまた、1.0605 gr/mlと等しいか、またはより軽い密度を示した。結果と して、90％を超えるNK細胞が、図１５に示されるように、1.0605 gr/ml勾配での 遠心分離後の最終細胞調製物中に存在した。 図１６（A-F）は、重いキャリア（磁気ビーズまたはアミノプロピルガラスビ ーズのような）に結合された抗CD45 mAbによって夾雑細胞を除去することによっ て、CD34⁺細胞が、本発明の密度法と組み合わせたDACS手順を用いて富化された 代表的な実験の結果を示す。この特定の実験で、全細胞数は82％減少され、CD34 収量は約40％であった。CD34純度は、２％から約20％に増加した。抗CD45抗体は またいくらかのCD34⁺細胞を除去したので、この方法は、非幹細胞を枯渇させる ために、その他の抗体の混合物を使用することによって改良され得る。 ５.３.Ｃ．乳腫瘍細胞の富化 乳腫瘍細胞および腫瘍塞栓が、血流に直接広がることは認められており、これ は診断目的のための乳腫瘍細胞の別のそして望ましい供給源を提供する（Cecil Textbook of Medicine,前出）。しかし、乳ガン診断に循環体液をうまく利用す るために、少量の循環乳腫瘍細胞が最初に富化されなければならず、そして乳腫 瘍細胞を検出するために高感度かつ特異的な技術が使用されなければならない。 現在、循環体液から乳腫瘍細胞を高収量かつ特異的な富化をなす、多量の全血 の処理に適した、迅速かつ再現性のある手順の必要性が存在する。これは、本発 明の方法を、このような液体からの転移乳腫瘍細胞の検出に適用することによっ て、達成され得る。 本発明は、密度勾配遠心分離に基づいた、細胞供給源または細胞混合物から乳 腫瘍細胞集団を、迅速かつ高収量で単離または富化する方法に関する。より詳細 には、本発明は、正確に決定された密度の密度勾配溶液を含有する、特別に設計 された細胞捕捉遠心分離チューブの使用、および収量を最大にする所望の細胞集 団を回収する方法に関する。本発明の方法は、分子または細胞検出技法の使用の 前に、細胞供給源（例えば全血）から、腫瘍細胞を富化することによって、乳腫 瘍の検出感度を増大するために使用され得る。腫瘍特異抗体と密度調整細胞分離 とを組み合わせて、この方法は、骨髄または末梢血幹細胞移植片からの、腫瘍細 胞の浄化を可能にする。 本発明は、勾配物質の特異的な密度、浸透圧、およびpHへの適切な調整が、大 いに細胞分離を増大させることを実証する。乳腫瘍細胞の富化については、勾配 は、密度1.0490から1.0580±0.0005 gr/ml（乳腫瘍細胞の特定の型に依存して） 、 生理学的浸透圧270-290 mOsm/kg H₂O、および生理学的pH 6.8-7.8に調整される べきである。実施例としての特定の実施態様では、乳腫瘍細胞は、収縮の上のレ ベルまで満たされた「PERCOLL」溶液のような適切な細胞分離培地を含む、細胞 捕捉遠心分離チューブに直接のせられる。本明細書に記載されている特定の実施 例では、腫瘍細胞の良好な富化が、1.0490と1.0580±0.0002 gr/mlとの間の特異 的な密度（乳腫瘍細胞の特定の型に依存して）、浸透圧280 mOsm/kg H₂O、およ びpH 7.4に調整された「PERCOLL」密度勾配物質で実施された。「PERCOLL」溶液 の密度は、５.１.Ｂ.節に記載されているように、密度計でその精度を正確に定 めるために調整され得る。 実施例３に記載されている方法によって富化された細胞は、次に、乳腫瘍細胞 の存在について調査され得る。本発明の細胞分離法から単離または富化された細 胞の得られた収量は、診断目的（例えば、形態学的、分子的、生化学的、または 免疫表現型のアッセイ）のために使用され得る。例えば、DNAは回収細胞から調 製され得、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に供せられるか、または、回収細胞は 形態学的に評価され、その結果、このような決定によって、以前は依存していた 健康な組織を冒し高額である手術手順の使用をさけ得る。 種々の乳腫瘍抗原および乳腫瘍マーカーは、当業者に公知であり、または商業 的に入手可能である。それらは、限定されないが、カテプシンD（Westleyら、19 80）、EGF-R（Osborneら、1980）、エストロゲンレセプター（Gorskiら、1966） 、Ki-67（Gerdesら、1983）、プロゲステロンレセプター（Horowitzら、1983） 、および乳ガンに関連するTGF-αを包含する。これらの抗原またはマーカーに対 する抗体は、回収細胞の腫瘍型を評価するために使用され得る。 本明細書に記載の方法の主な利点は、多量の全血が、密度勾配に直接置かれ得 ることである。末梢血は、抗凝集剤を含有するチューブに集められ得るか、また はアフェレーシスまたはリューコフェレーシスにより集められ得る。全血は、遠 心分離される前に処置または希釈される必要はない。しかし、この方法は乳腫瘍 細胞の特異的な浮遊密度に基づいてこれらの細胞を富化するので、インビボ供給 源からの回収後に比較的短時間内に分離に供せられることが重要である。なぜな ら細胞密度は培養または貯蔵条件に従って変化するからである。従って、乳腫瘍 細胞の血液からの最適の富化を得るために、血液サンプルは、回収後48時間以内 に使用されることか望ましい。最も好ましくは、血液サンプルは、回収の数時間 内に密後勾配遠心分離に供さられるべきである。 腫瘍細胞株由来の、４つの乳腫瘍細胞型の密度が、「PERCOLL」不連続密度勾 配システムを使用して決定された（図17A-17D）。細胞は、各界面から回収され て、血球計で計数された。結果は、腫瘍細胞の30-60％が、1.0580 g/mlと同じか より大きな密度を有することを示した（図18A-18D）。このことは、腫瘍細胞を 含有する画分が、10％と80％との間の純度であったことを暗示する。特異的密度 1.0580で回収された細胞のうち、全細胞の約75％から85％が腫瘍細胞であったが 、一方、全細胞容量の約10％は夾雑物であった。このことは、アッセイの検出限 界が、約1/10⁶から1/10⁵まで約10倍改良されることを暗示する。 放射標識乳腫瘍細胞が、末梢血バフィコートと混合されたとき、それらの80％ までが、1.0580 gr/ml、280 mOsm勾配上での混合物の遠心分離によって保持され 得た。さらに、非腫瘍細胞の少量画分のみが（最初の細胞数の10％未満）、回収 腫瘍画分に夾雑した。 培養乳腫瘍細胞を使用して得られた、図17A-17Dおよび図18A-18Dに示されてい る密度範囲は、インビボ供給源から得られた乳腫瘍細胞に適応され得るようであ る。インビボ供給源からの種々の乳腫瘍細胞の密度におけるわずかな変化が、最 適富化を達成するために必要な正確な密度の改良を必要とし得ることは、当業者 には明白である。±0.0002 gr/mlの精度を有する特異的な密度を決定する方法が 、本明細書に記載されている。 前述の方法はまた、本明細書に記載のDACS手順と組合せて使用され得る。例え ば、全血は、ほとんどの白血球と反応する抗CD45抗体でコートされたキャリア粒 子と、直接インキュベートされ得る。乳腫瘍細胞は、抗CD45とは有意な程度に反 応しないので、大部分の非赤血球、白血球、およびその他の細胞は、密度物質よ り重くされ、遠心分離の間にペレット化されるが、一方、乳腫瘍細胞は、上方コ ンパートメントにとどまる。前記の節で考察されたように、種々のその他の細胞 型特異的結合因子が、血液中の特異的細胞型を標的化するために使用され得る。 あるいは、ポジティブ選択DACS手順が、乳腫瘍細胞を、それらが遠心分離の間 にペレット化されるように、それらの通常密度より重くするために使用され得る 。ポジティブ選択手順に有用な細胞型特異的結合因子は、限定されないが、乳腫 瘍抗原に対する抗体および乳腫瘍マーカーに対する抗体、例えば、CA 15-3（Kuf eら、1984）、CA 549（Brayら、1987）、カテプシンD（Westleyら、1980）、EGF -R（Osborneら、1980）、エストロゲンレセプター（Gorskiら、1966）、Ki-67（ Gerdesら、1983）、プロゲステロンレセプター（Horowitzら、1983）、および乳 ガン関連TGF-αを包含する。これらの抗体の多くは、商業的に入手可能である。 本明細書に記載の方法によって富化された細胞は次に、乳腫瘍細胞の存在につ いて調査され得る。本発明の細胞分離法から単離または富化された得られた収量 の細胞は、診断目的（例えば、形態学的、分子的、生化学的、または免疫表現型 のアッセイ）に用いられ得る。例えば、DNAは回収細胞から調製され得、そして ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に供せられるか、または、回収細胞は形態学的に 評価され、その結果、このような決定によって、以前は依存していた健康な組織 を冒しかつ高額である手術手順の使用をさけ得る。あるいは、腫瘍細胞は、当業 者に公知の腫瘍細胞マーカーの存在によって同定され得、それらは限定されない が、カテプシンD（Westleyら、1980）、EGF-R（Osborneら、1980）、エストロゲ ンレセプター（Gorskiら、1966）、Ki-67（Gerdesら、1983）、プロゲステロン レセプター（Horowitzら、1983）、および乳ガンに関連するTGF-αを包含する。 これらの抗原にまたはマーカーに対する抗体は、回収細胞の腫瘍型を評価するた めに使用され得る。 ６．実施例 実施例１ 母血液からの有核赤血球の単離 Ａ．密度勾配の調製 「PERCOLL」溶液をPharmacia Biotech（Uppsala，Sweden）から購入し、納入 業者の薦めに従って4℃で保存した。貯蔵溶液を、12部の「PERCOLL」溶液を1部 の10×のカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS ）と混合して調製した。溶液のpHを7.4に調整し、浸透圧を280±10 mOsm/kg H₂O に調整した。血液サンプル中の胎児有核赤血球の分離に用いるために、貯蔵溶液 をさらに、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで希釈して密度1.0720 ±0.0005 gr/mlにし、室温で使用した。勾配の密度を、細胞分離の再現性および 精度を確実にするために、1.0720 gr/mlの±0.0005 gr/ml、好ましくは0.0002 g r/ml以内の精度に調整することが重要であった。これは、DMA 48（Anton PAAR U SA，Ashland，VA）のような高精度デジタル密度計によって行った。全手順を、 滅菌条件下で室温において行った。 Ｂ．血液サンプルの回収および処理 末梢血を、妊婦から抗凝固剤を含有するチューブに採取した。母血液中に循環 する胎児細胞数は、一般に妊娠17週後に減少し始めるので、採取は妊娠20週より 前に実施した。最適採取時期は、13週である。採取後、血液サンプルを48時間以 内に処理した。 Ｃ.１．末梢血の密度勾配遠心分離 全血（complete blood）サンプルを、50 mlコニカル細胞捕捉チューブ中に、 密度1.0720±0.0002 gr/ml、浸透圧280 mOsm/kg H₂O、およびpH 7.4に予め調整 した「PERCOLL」細胞分離培地上に重層した。チューブは、約15 mlの「PERCOLL 」が下部コンパートメントに存在し、5 mlの「PERCOLL」が収縮部分の上方に存 在するような配置に、収縮部分を有する。一般的には、20 mlの血液サンプルを 、この勾配の頂部に重層した。チューブは、850×gで30分間室温にて遠心分離し た。勾配の界面、すなわち「PERCOLL」の頂部にとどまった細胞を、チューブの 上部コンパートメントの全内容物を、もう１つの50 mlチューブに注いで回収し た。収縮部分の下方の領域の細胞ペレットおよび関連液体は、そのチューブを倒 置させたとき、その領域にとどまった。650×gで10分間の室温での遠心分離後に 、ペレットの頂部の液体をピペットで除去し、ペレット中の細胞をPBSに再懸濁 させ た。この低速遠心分離工程は、目的細胞をペレットに濃縮するために主に使用さ れたので、上部領域の細胞破片および血小板を取り除く一方で、細胞捕捉もまた 、この工程を促進するために使用され得た。この代替的な実施態様では、改変50 ml細胞捕捉チューブを用いた。この改変チューブは、その下方に約0.5 mlの小 容積が存在するように収縮部分がチューブの底部近くに配置された。この設計は 、ペレットを保護し、遠心分離後のペレットの上方の液体の除去の間における細 胞損失を減少する。この特徴は、本発明の方法を、続いて細胞選別工程（これは 、夾雑細胞（特に血小板）を減少するために実施される）を行う必要がなく、自 動化様式で使用されることを可能にした。 上記の細胞分離法を従来法と比較し、そして以下の手順をまたコントロールと して実施した。この手順は、当該分野で公知の以前に発表された方法に類似した （Bianchiら、1990，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 87:3279）。 血液サンプルを上記のように採取し、PBSで1:4に希釈した。希釈血液を、４つ の個々の15 mlチューブ中で「FICOLL-HYPAQUE」（Pharmacia）に重層した。Phar maciaによって示されているように、貯蔵「FICOLL」溶液の密度は1.077±0.001 gr/mlであり、そして浸透圧は320 mOsm/kg H₂Oであった。チューブを、850×gで 20分間、室温にて遠心分離した。「FICOLL」上方の界面の細胞をピペットで回収 し、２つの15 mlチューブに移した。チューブを頂部までPBSで満たし、650×gで 10分間、室温にて遠心分離した。ペレットの頂部の液体をピペットで吸引し、ペ レットをPBSに再懸濁させた。さらに、実験はまた、細胞収量を増加するために 、「FICOLL」溶液を入れた細胞捕捉チューブを使用して実施した。 Ｃ.２．磁場による親和性分離 上記の密度勾配遠心分離後に、PBSに再懸濁された胎児有核赤血球は、細胞を 抗CD45モノクローナル抗体（クローンALB-12）（Biodesign International，Ken nebunk，ME）と4℃で30分間インキュベートすることによりCD45⁺白血球を除去し て、さらに濃縮した。非結合抗体を、細胞をPBSで洗浄することによって除去し た。磁気粒子に結合させたヤギ抗マウス抗体（Immunocon）を、4℃で30分間、細 胞に加えた。細胞をPBS中で洗浄し、磁気粒子コートCD45⁺白血球を引き付ける磁 場に曝し、一方、胎児有核赤血球および栄養芽細胞は溶液中にとどまった。胎児 細胞をピペットで回収し、PBS中で一度洗浄した。次に、細胞を抗体染色および フローサイトメトリー分析によってテストし、有核赤血球数を決定した。 Ｄ.１．密度調整細胞選別 妊婦から採取した全血を、抗CD45抗体(ALB-12)でコートされたグルタルアルデ ヒドである1.4μアミノプロピルガラスビーズ（Bangs Laboratories Inc.，Carm el，IN）と、室温にて45分間インキュベートした。全血液細胞混合物を、50 ml 細胞捕捉チューブ中で「PERCOLL」（1.0720±0.0002 gr/ml、280 mOsm/kg H₂O、 pH 7.4）に重層した。チューブは、収縮部分の下方に約15 mlの「PERCOLL」、そ してその上方に5 mlの「PERCOLL」を含有した。気泡形成を防ぐために、収縮部 分の下方の容積を完全に「PERCOLL」で満たすことが重要であった。チューブを 室温で850×gにて30分間遠心分離した。白血球を涸渇させた細胞集団を、チュー ブの全上部領域を50 mlチューブに完全に注ぎ出して、「PERCOLL」の上方の界面 から回収した。細胞を、650×gにて10分間室温にて遠心分離し、そしてペレット の頂部の液体をピペットで除去した。ペレット中の細胞を、PBSに再懸濁させた 。 あるいは、第二回目の遠心分離工程は、前述のセクション５.２に記載のよう に、改変細胞捕捉チューブ中で実施され得る。さらに、第二密度調整細胞選別も また、血小板を特異的に除去するための抗CD41のような抗体を使用して実施され 得た。 Ｄ.２．抗体染色およびフローサイトメトリー分析 PBS中の白血球涸渇細胞集団を、DNA染料LDS 751（Exciton，Inc.，Dayton，OH ）で処理し、抗グリコホリンAおよび抗CD71（Becton Dickinson，Inc.，San Jos e，CA）のような、赤血球系統特異FITC結合モノクローナル抗体で処理した。LDS 751染料は、有核細胞と無核細胞とを識別した。100万個の細胞を、5%ウサギ血 清およびLDS 751の存在下に4℃にて30分間、10μl抗体とインキュベートした。 細胞をPBSで２回洗浄し、1%パラホルムアルデヒド中に固定した。抗体結合細胞 をフローサイトメトリーによって分析し、LYSYS IIプログラムを装備したFACSSc anシステムを使用して、統計学的分析を10⁴フロー事象で実施した。 実施例２ 血液細胞混合物由来のCD34⁺細胞の富化 Ａ．密度勾配の調製 「PERCOLL」溶液をPharmacia Biotech（Uppsala，Sweden）から購入し、納入 業者の薦めに従って4℃で保存した。貯蔵溶液を、12部の「PERCOLL」溶液を1部 の10×のカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS ）と混合して調製した。溶液のpHを7.4に調整し、浸透圧を280 mOsm/kg H₂Oに調 整した。細胞混合物中のCD34⁺細胞の分離で用いるために、貯蔵溶液をさらに、 カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで希釈して密度1.0605±0.0005 gr /mlにし、室温で使用した。勾配の密度を、細胞分離の再現性および精度を確実 にするために、1.0605 gr/mlの±0.0005 gr/ml以内の精度に調整することが重要 であった。これは、DMA 48（Anton PAAR USA，Ashland，VA）のような高精度デ ジタル密度計によって行った。全手順を、減菌条件下で室温において行った。 Ｂ．末梢血および骨髄の採取 患者に水分補給(hydrated)し、中央静脈カテーテルを通して２時間にわたる静 脈内(IV)注入によって投与されるシクロホスファミド（４gm/m²）で処置した。 シクロホスファミドの注入完了の24時間後に、患者を、約10μg/kg/日用量での 皮下（SC）注射によって投与されたG-CSF（Neupogen Amgen，Thousand Oaks，CA ）によって処置する。アフェレーシスを、１×10⁹/Lに等しいかまたはそれを超 える白血球計数（WBC）の回収で開始した。アフェレーシスは、速度80 ml/分で2 00分間（総容量16L）、Cobe Spectra Cell Separator（Lakewood，Colorado）を 使用して実施した。 Ｃ．アフェレーシス血液および骨髄バフィコートの密度勾配遠心分離 アフェレーシス末梢血を、密度勾配に直接かけた。しかし、全血および骨髄吸 引物は、密度勾配にかける前にバフィコートにした（赤血球を除いた）。 アフェレーシス血液または骨髄バフィコートサンプルを、50 mlコニカル細胞 捕捉チューブまたは市販のチューブに、密度1.0605±0.0005 gr/ml、浸透圧280 mOsm/kg H₂O、およびpH 7.4に予め調整された「PERCOLL」に重層した。細胞捕捉 チューブは、約15 mlの「PERCOLL」が下部コンパートメントに存在し、5 mlの「 PERCOLL」が収縮部分の上方に存在するような配置に、収縮部分を有する。気泡 の形成を防ぐように、「PERCOLL」で収縮部分の下方の容積を完全に満たすこと が重要であった。一般的に、20 mlのアフェレーシス血液サンプルを、この勾配 の頂部に重層した。チューブを、室温にて850×g、30分間遠心分離した。密度の 界面、すなわち「PERCOLL」の頂部にとどまった細胞を、チューブの上方コンパ ートメントの全内容物をもう１つの50 mlチューブに注ぐことにより回収した。 収縮部分の下方の領域中の細胞ペレットを、チューブが倒置されたときに注ぎ出 されるのを防いだ。 前述の段落に記載の細胞分離法を従来法と比較するために、テストサンプルを また「FICOLL-HYPAQUE」（Pharmacia）にも重層した。貯蔵「FICOLL」溶液は、 納入業者によって発表されるように、密度1.077±0.001 gr/mlおよび浸透圧320 mOsm/kg H₂Oであった。 Ｄ．密度調整細胞分 アフェレーシス血液製品を、抗CD45抗体（クローンALB-12、Biodesign Intern ational，Kennebunk．ME）でコートされたグルタルアルデヒドである1.4μのア ミノプロピルガラスビース（Bangs Laboratories Inc.，Carmel，IN）と、室温 で45分間インキュベートした。全血液細胞混合物を、50 mlチューブ中で「PERCO LL」（1.0605±0.0005 gr/ml、280 mOsm/kg H₂O、pH 7.4）に重層した。 Ｅ．モノクローナル抗体のキャリア粒子への結合 フィコエリトリン（PE）結合抗CD34モノクローナル抗体（造血前駆細胞マーカ ー）およびフルオレセイン結合（FITC）抗CD45モノクローナル抗体（pan-白血球 マーカー）を、Becton Dickinson，Inc．（San Jose，CA）から入手した。CD45 、CD16（顆粒球、単球）、CD3（T細胞）、CD14（単球）に特異的である非結合抗 体を、当該分野で公知の方法に従って、実験室において調製した。 抗体を、ヤギ抗マウスコート磁気ビーズまたはヤギ抗マウスコートアミノプロ ピルガラスビーズのいずれかに、室温にて一晩インキュベーションを行って結合 させた。あるいは、抗体は、ヤギ抗マウス架橋なしにこれらのビーズに直接結合 され得たか、またはアビジン-ビオチン結合反応を介して結合され得た。さらに 、抗体は、細胞のFc部分を介してのビーズへの非特異結合を減少させるために、 Fab2フラグメントへ切断され得た。 Ｆ．抗体染色およびフローサイトメトリー分析 細胞を、5%ウサギ血清の存在下で、氷上にて30分間、10⁶細胞あたり10μLの抗 体およびDNA染料LDS 751（Eaciton Inc.，Dayton OH）とインキュベートした。 ウサギ血清を、細胞への非特異結合を減少させるために使用した。細胞を、PBS で２回洗浄し、次に、1%パラホルムアルデヒドで固定した。LYSYS IIプログラム を装備したFACSScanフローサイトメトリーシステムを使用して、統計学的分析を 10⁴フロー事象で実施した。 Ｇ．コロニー形成(CFU)アッセイ／決定付けられているCD34⁺細胞の機能決定 細胞サンプル中のCD34⁺細胞の機能特徴づけを、コロニー形成アッセイ（CFU） によって決定した。このアッセイは、細胞溶液中の決定付けられている造血前駆 細胞の数の定量を可能にした。10⁵細胞を、異なるコロニー刺激因子およびエリ トロポイエチン（Terry Fox Laboratories，Vancouver）を含有する2 mL半固体 メチルセルロース中に混合した。全混合物を、37℃で14日間インキュベートした 。エリトロイド（CFU-E、BFU-E）、顆粒球／マクロファージ（CFU-GM）、混合（ CFU-GEMM）コロニーの数を、倒立顕微鏡（40×）下で計数した。 Ｈ．長期培養開始細胞（LTC-IC）アッセイ／決定付けられていないCD34⁺細胞 の機能決定 細胞混合物中の決定付けられていない造血前駆細胞の数を、長期培養開始培養 によって決定した。細胞を、照射間質フィーダー層上に播種し、そしてCFU決定 を時間を関数として行った。造血幹細胞は自己再生し得、5週を超える期間の間 このシステム中てCFUを上昇させた。長期骨髄間質培養は、12.5%ウマ血清、12.5 %胎児ウシ血清、2 mM L-グルタミン、0.2 mM i-イノシトール、20μM葉酸、10-⁴ M 2-メルカプトエタノールを補充したα-MEM培地中で、96ウエルプレート（ウエ ルあたり200μl中10⁶細胞）中で開始し、加湿環境下で33℃に維持した。週間隔 で、培地の半分を除去して、等量の新鮮培地と取り替えた。培養の２週後に、周 密状態の間質層をγ照射（2000ラド）して、内因性造血細胞を殺傷した。分離後 の非分画サンプルおよび細胞調製物を、10^-6Mヒドロコルチゾンを補充した同じ 培地中で、照射間質層上に播種した。培養の５週後に、付着および非付着細胞を 回収して、上記のセクションＧと同様にCFUアッセイでスクリーニングした。 Ｉ．ナチュラルキラー（NK）細胞アッセイ K562標的細胞を、100μCi⁵¹Crで37℃で１時間標識し、次に４回洗浄して計数 した。標的細胞を、V底96ウエルの複数ウエルプレート中で4時間、細胞分離後の 別の画分からの非分画アフェレーシス血液および細胞と共培養した。エフェクタ ーおよび標的細胞を、異なる比率、100:1、50:1、25:1、および12:1に混合した 。例えば、100:1比率は、5×10⁵エフェクター細胞および5×10³標的細胞を含有 した。インキュベーション期間後、100μl上清を回収して、シンチレーションカ ウンター中で計数した。最大および自発⁵¹Cr放出を、それぞれに、50μl貯蔵標 的溶液およびエフェクター自身からの上清について計数して測定した。細胞傷害 性％を、下記の式に従って決定した： Ｊ．混合リンパ球培養およびナチュラルサプレッサー細胞活性 ２つの異なるバフィコートからの細胞を、平底96ウエル複数プレート中に、各 々10⁵細胞で混合した。１つのバフィコートは3000ラド照射を受け、「スティム レーター」と称した。もう一方のバフィコートは、処理せず、「レスポンダー」 と称した。非分画アフェレーシス末梢血製品（APBL）または異なる密度画分から の細胞を、ウエルあたり10⁵細胞でこれらの共培養物に添加した。これらの細胞 は、「サプレッサー」と称され、MLRに添加される前に1500ラド照射を受けた。 細胞を５日間培養して、次に[³H]-チミジンでパルスした（１μCi/ウエル）。18 時間後に、細胞を回収して、シンチレーションカウンターで取り込まれたチミジ ン量を測定した。サプレッサー細胞によって誘導された抑制％を、下記の式で決 定した： 実施例３ 乳ガン細胞密度の密度決定および 密度勾配遠心分離によるそれらの富化 細胞を、当該分野で公知の方法に従って、標準的な培養条件下で24時間、³Hチ ミジンとインキュベートした。細胞を末梢血からのバフィコートと混合した。 Ａ．密度勾配の調製 「PERCOLL」溶液をPharmacia Biotech（Uppsala，Sweden）から購入し、納入 業者の薦めに従って4℃で保存した。貯蔵溶液を、12部の「PERCOLL」溶液を1部 の10×のカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS ）と混合して調製した。溶液のpHを7.4に調整し、そして浸透圧を280 mOsm/kg H₂ Oに調整した。細胞混合物中でインビトロ細胞系から得た乳ガン細胞を富化する のに用いるために、貯蔵溶液をさらに、カルシウムおよびマグネシウムを含まな いPBSで希釈して、各々1.0490、1.0520、1.0550、1.0580、および1.0610の密 度を有する５つの個別画分にして、室温にて使用した。勾配の密度を、細胞分離 の再現性および精度を確実にするために、±0.0002 gr/ml点の精度で調整するこ とが重要であった。これは、DMA 48（Anton PAAR USA，Ashland，VA）のような 高精度デジタル密度計によって行った。全手順を、滅菌条件下で室温において行 った。 Ｂ．密度勾配遠心分離 放射性標識乳ガン細胞を健常ドナーからのバフィコートと混合して、不連続密 度勾配上で遠心分離した。細胞系30 HTB、126 HTB、1500 CRL、および1504 CRL からの乳ガン細胞を含有する細胞混合物を、50 mlコニカル細胞捕捉チューブ中 に、密度1.0490〜1.0610±0.0002 gr/mlの範囲、浸透圧280 mOsm/kg H₂O、およ びpH 7.4に予め調整した「PERCOLL」勾配上に重層した。チューブは、約15 mlの 「PERCOLL」が下部コンパートメントに存在し、50 ml「PERCOLL」が収縮部分の 上方に存在するような配置に、収縮部分を有する。気泡形成を防ぐように、収縮 部分の下方の容積を「PERCOLL」で完全に満たすことが重要であった。一般的に は、20 mlの細胞サンプルが、この勾配の頂部に重層した。チューブは、850×g で30分間室温にて遠心分離した。勾配の界面、すなわち「PERCOLL」の頂部にと どまった細胞を、チューブの上部コンパートメントの全内容物を、もう１つの50 mlチューブに注ぐことにより回収した。収縮部分の下方のコンパートメントの 細胞ペレットは、そのチューブを倒置させたときに注ぎ出されるのを防がれた。 650×g、10分間の室温での遠心分離後、ペレットの頂部の液体をピペットで取り 出し、ペレット中の細胞をPBSに再懸濁させた。この低速遠心分離工程は、目的 細胞をペレット中に濃縮するために主に使用されたので、液体中の細胞破片およ び血小板を除去する一方で、細胞捕捉もまた、この工程を促進するために使用さ れ得た。この代替的な実施態様では、改変50 ml細胞捕捉チューブを用いた。こ の改変チューブは、約0.5 mlの小容積がその下に存在するように、収縮部分はチ ューブの底部近くに配置された。この設計は、ペレットを保護し、遠心分離後の ペレットの上方の液体の除去の間の細胞損失を減少する。この特徴は、本発明の 方法を、細胞選別の必要がなく自動化されることを可能にした。 実施例４ キャリア粒子の調製 Ａ．ビーズの調製 Bangs Laboratories，Carmel，INから入手したシリカビーズ（1.4μm）を、濃 HClで２時間室温で洗浄し、15分ごとに激しく撹拌してビーズのかたまりを壊し た。洗浄後、ビーズを850 gで５分間遠心分離した。HClを含有する上清をデカン テーションによって取り除き、ビーズを激しく撹拌しながら脱イオンH₂Oで洗浄 してビーズのかたまりを壊した。 ビーズを、濃硝酸中で一晩、マグネチックスターラーを用いて一定速度で撹拌 しながら室温でインキュベートした。次に、ビーズを850 gで５分間遠心分離し 、各工程で50 mlの脱イオンH₂Oを使用して、３回脱イオン水で洗浄した。ビーズ を各洗浄の間で激しく撹拌して、ビーズが凝集するのを防いだ。微生物の夾雑を 防ぐために、ビーズをさらなる使用まで脱イオンH₂O中で0〜4℃で貯蔵した。 Ｂ．ビーズのシラン化 ビーズをシラン化するために、3-アミノプロピルトリエトキシシラン、(3-ヨ ードプロピル)トリメトキシシラン、または[1-9トリメトキシシリル)-2-(m-(ま たはp)クロロメチル)フェニル]エタンを使用した。40 mlのシラン溶液（95%エタ ノール／脱イオンH₂O中の10%溶液）をビーズ4grあたりについて添加した。ビー ズ混合物を、室温で１時間ひっくり返し回転させた。ビーズを850 gで５分間遠 心分離し、過剰のシランを、100 ml容量の95%エタノール／脱イオンH₂Oを使用し て洗浄除去した。ビーズを各洗浄工程の間で激しく撹拌して、ビーズが凝集する のを防いだ。洗浄工程後、ビーズを乾燥して貯蔵し得る。あるいは、ビーズは、 ビーズの凝集を防ぐ、冷却95%エタノール／脱イオンH₂O中に貯蔵され得る。 Ｃ．アミノプロリルガラスへの抗体結合 シラン化ビーズを、2.5%グルタルアルデヒド中で室温にて一晩インキュベート した。次の日、ビーズを850 gで5分間遠心分離して、ビーズ5gあたり100 mlの容 量の脱イオンH₂Oで、遊離グルタルアルデヒドを洗浄除去した。ビーズを各洗浄 工程の間で激しく撹拌して、ビーズが凝集するのを防いだ。 抗体を、少なくとも3 mg/m²全ビーズ表面に、アミノプロピルビーズに過剰に 加え、室温で一晩ひっくり返し回転させた。次の日、ビーズを850 gで５分間遠 心分離し、遊離タンパク質を、100 mlの脱イオンH₂Oで洗浄除去した。ビーズを 各洗浄工程の間で激しく撹拌して、ビーズが凝集するのを防いだ。ビーズを、0. 1アジ化ナトリウムを含有する脱イオンH₂O中に冷却して貯蔵した。最終ビーズ懸 濁液は、70〜90%の単一ビーズ、および10〜30%の主に二重および三重ビーズを含 有する。 抗体結合ビーズの結合効率（コートされるビーズ％によって）は、フローサイ トメトリー分析および結合抗体に対するフルオレセイン化抗体を使用して決定さ れ得る。あるいは、抗体は、グルタルアルデヒド結合なしに、直接シラン化ビー ズに添加され得る。 本明細書中に掲載されている全刊行物は、その全体が参考として援用されてい る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／２９９，４６９ (32)優先日 1994年８月31日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞分離装置であって、 側壁および閉底を有する遠心分離チューブ； チューブ内に配置された収縮部材であって、該収縮部材は、該チューブが倒置 されるときに、該収縮部材の下でチューブの底部分に液体が保持されるように配 置および構成された、収縮部材；および、 該チューブの遠心分離前に該チューブの底部分に含有される細胞分離培地であ って、該細胞分離培地と低密度培地との間の界面に捕捉される細胞が、遠心分離 後に、該チューブが倒置されるときに該低密度培地によって取り出されるように 、該収縮部材によって形成される開口部の上のレベルまで該収縮部材の上に拡張 する、細胞分離培地、 を包含する、細胞分離装置。 ２．前記収縮部材が、収縮開口部を定めるより低い縁領域を有する、１以上の下 方向傾斜表面を定める、請求項１に記載の装置。 ３．前記収縮部材が、中央収縮開口部を有する環である、請求項１に記載の装置 。 ４．前記環が、選択されるチューブのレベルで該チューブへ強制密着のために構 築されたエラストマー環である、請求項３に記載の装置。 ５．前記収縮部材が、複数の開口部を定める、請求項１に記載の装置。 ６．前記チューブが、閉じられた頂部、およびそれを通って液体物質がチューブ へ導入され得る該頂部中のポートを有する、請求項１に記載の装置。 ７．前記頂部中の第二のポート、および該第二のポートと収縮部材の下のチュー ブの底と連通する閉じられた液体チャンネルをさらに有する、請求項６に記載の 装置。 ８．CD34⁺造血前駆細胞の単離での使用のための請求項１に記載の装置であって 、前記細胞分離培地の特異的密度が、該CD34⁺造血前駆細胞の特異的密度の±0.0 005 gr/ml内である、装置。 ９．前記細胞分離培地が、浸透圧280±10 mOsm/kg H₂Oおよび特異的密度1.0605g r/mlを有する、請求項８に記載の装置。 １０．母性血液細胞もまた含有する細胞混合物からの有核胎児細胞の単離での使 用のための請求項１に記載の装置であって、前記細胞分離培地の特異的密度が、 該胎児細胞の特異的密度の±0.0005 gr/ml内である、装置。 １１．前記細胞分離培地が、浸透圧280±10 mOsm/kg H₂Oおよび特異的密度1.072 0 gr/mlを有する、請求項１０に記載の装置。 １２．細胞混合物から乳腫瘍細胞の単離での使用のための請求項１に記載の装置 であって、前記細胞分離培地が、浸透圧280±10 mOsm/kg H₂Oおよび特異的密度1 .0490から1.0580 gr/mlを有する、装置。 １３．選択細胞の型とは異なる密度を有する１以上のその他の細胞型を含有する 細胞混合物から該選択細胞を単離する方法であって、 請求項１から７のいずれかに記載され、かつ該選択細胞型の特異的密度の±0. 0005 gr/ml内である特異的密度を有する細胞分離培地を含有する遠心分離装置に 、該選択細胞型を含有する細胞混合物を添加する工程； 前記チューブ中で、密度勾配物質の特異的密度より大きな特異的密度を有する 細胞をペレット化するために十分な重力で該装置を遠心分離する工程；および、 該選択細胞を含有する細胞画分を、該装置のチューブの上方部分から回収する 工程、 を包含する、方法。 １４．前記回収工程が、前記装置の上方部分中に存在する培地のデバイスからの デカンテーションによる、請求項１３に記載の方法。 １５．請求項１３に記載の方法であって、遠心分離の前に、前記細胞混合物をキ ャリア粒子に結合された細胞型特異的結合因子とともにインキュベートする工程 をさらに包含し、該粒子が、前記細胞分離培地の特異的密度より少なくとも0.00 1 gr/ml大きな特異的密度を有する、方法。 １６．前記細胞型特異的結合因子が、単離されるべき前記選択細胞型に結合しな い、請求項１５に記載の方法。 １７．細胞混合物からCD34⁺細胞を富化するための請求項１３に記載の方法であ って、前記細胞分離培地が、浸透圧280±10 mOsm/kg H₂Oおよび特異的密度1.060 5±0.0002 gr/mlを有する、方法。 １８．母性血液細胞もまた含有する細胞混合物からの有核胎児細胞の単離での使 用のための、請求項１３に記載の方法であって、前記細胞分離培地が、浸透圧28 0±10 mOsm/kg H₂Oおよび特異的密度1.0720±0.0002 gr/mlを有する、方法。 １９．細胞混合物からの乳腫瘍細胞の単離での使用のための、請求項１３に記載 の方法であって、前記細胞分離培地が、浸透圧280±10 mOsm/kg H₂Oおよび1.049 0から1.0580 gr/mlの範囲から選択される特異的密度を有する、方法。 ２０．細胞混合物からCD34⁺細胞を単離する方法であって、 遠心分離チューブ中で細胞分離培地上に該細胞混合物を重層する工程であって 、該細胞分離培地が、特異的密度1.0605±0.0005 gr/mlおよび浸透圧280±10 mO sm/kg H₂Oを有する、工程； 該分離培地の特異的密度より大きな特異的密度を有する細胞をペレット化する ために十分な重力で該遠心分離チューブを遠心分離する工程：および、 該チューブの上方部分から該CD34⁺細胞を回収する工程； を包含する、方法。 ２１．細胞混合物から有核胎児細胞を単離する方法であって、 遠心分離チューブ中で細胞分離培地上に該細胞混合物を重層する工程であって 、該細胞分離培地が、特異的密度1.0720±0.0005 gr/mlおよび浸透圧280±10 mO sm/kg H₂Oを有する、工程； 該分離培地の特異的密度より大きな特異的密度を有する細胞をペレット化する ために十分な重力で該遠心分離チューブを遠心分離する工程：および、 該チューブの上方部分から該CD34⁺細胞を回収する工程； を包含する、方法。 ２２．細胞混合物から乳腫瘍細胞を単離する方法であって、 遠心分離チューブ中で細胞分離培地上に該細胞混合物を重層する工程であって 、該細胞分離培地が、1.0490から1.0580 gr/mlの範囲から選択される特異的密度 および浸透圧280±10 mOsm/kg H₂Oを有する、工程； 該分離培地の特異的密度より大きな特異的密度を有する細胞をペレット化する ために十分な重力で該遠心分離チューブを遠心分離する工程：および、 該チューブの上方部分から該CD34⁺細胞を回収する工程； を包含する、方法。 ２３．細胞混合物からナチュラルキラー細胞を単離する方法であって、 遠心分離チューブ中で細胞分離培地上に細胞混合物を重層する工程であって、 該細胞分離培地が、特異的密度1.0605±0.0005 gr/mlおよび浸透圧280±10 mOsm /kg H₂Oを有する、工程； 該分離培地の特異的密度より大きな特異的密度を有する細胞をペレット化する ために十分な重力で該遠心分離チューブを遠心分離する工程：および、 該チューブの上方部分から該CD34⁺細胞を回収する工程； を包含する、方法。