KR100966779B1 - 혈액 세포 분리 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 임산부의 혈액에 함유된 희소한 배아 유래 유핵 세포를 정밀하게 분리 및 농축하여, 출산전 염색체/유전자 진단에 사용가능한 검사 표본을 편리하게 제공할 수 있는 혈액 세포 분리 시스템을 제공하는 것에 관한 것이다. 즉, 상기 혈액 세포 분리 시스템은 (1) 임산부로부터 채집한 혈액 시료로부터 주로 무핵 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 제거하여 1차 분리된 시료를 제공하는 분리 단위; (2) 상기한 단위에 의해 수득된 1차 분리된 시료에 잔존하는 무핵 적혈구 및 백혈구를 당 사슬-렉틴 기법을 사용하여 제거함으로써, 농축된 배아 유핵 세포를 갖는 2차 분리된 시료를 제공하는 2차 분리 단위; 및 (3) 상기 2차 분리 단위에 의해 수득된 2차 분리된 시료로 표본화하는 표본화 단위를 포함한다.
혈액 세포 분리, 태아 유핵 세포, 출산전 검사

Description

혈액 세포 분리 시스템 {BLOOD CELL SEPARATION SYSTEM}
본 발명은 렉틴을 사용하는 혈액 세포 분리용 시스템, 특히 임산부의 모체 말초혈 또는 제대혈에서 발견되는 태아 유핵 세포인 유핵 적아세포(erythroblast)를 함유하는 샘플로부터 태아 유핵 적아세포를 분리하고 농축하기 위해 무핵 적혈구 및 성숙 백혈구를 효율적으로 제거하기 위한 시스템, 및 또한 이들의 염색체 및 유전자를 검사하기 위한 시스템에 관한 것이다.
유전자 진단 분야에서는, 배아, 즉 태아에 위협을 가하지 않는 출산전 진단법의 개발이 오랫동안 기대되어 왔다. 현재 임상학적으로 실행되고 있는 유전자 진단법은 양수천자(amniocentesis), 융모 샘플링 및 태아 채혈과 같은 침습적 절차, 특히 양수천자에 의한 태아 세포의 샘플링이 확정적인 진단 (positive diagnosis)을 가능하게 하나, 약 1/300으로 높은 유산의 위험을 안고 있다.
또한, AFP (α-페토프로테인), hCG (융모 생식샘자극 호르몬), uE3 (요산 에스트리올 3, 임신기간 중에 태아 부신으로부터 분비되고 태아-태반 기능 검사에 사용되는 에스트로겐의 일종) 및 인히빈 A (inhibin A) (생식샘자극 호르몬의 일종)와 같은 모체 말초혈에 존재하는 모체 혈청 생화학적 표지자에서의 변화로부터 태아의 이상을 예측하는 방법은 비침습적인 것이 바람직하나, 이들 방법은 양수천자 를 수행해야될 필요에 대해 검사하는 방법일 뿐이며, 어떤 확정적인 진단을 하기 위해 의존할 수는 없는 것들이다.
반면, 모자간의 혈액형 부적합에 대한 임상적 연구에서는, 태아 세포가 모체 순환계 내로 침투할 수 있음이 분명해졌다. 따라서, 모체 혈액으로부터 혼입된 태아 세포가 분리될 수 있고, 이들이 유핵 세포라면, 그의 DNA 및 염색체를 사용하여 안전하게 확정적인 태아 진단을 수행할 수 있다. 1969 년에는, Walknowska 등이 남자아이를 임신한 30 명의 여성 중 21 명으로부터 모체 말초 림프구를 배양하여 46XY 핵형을 발견하였음을 보고하였다. 그러나, 유사한 림프구의 집단 전체에서 Y 염색체를 가진 림프구를 추출하는 작업은 극히 어려우며, 나일론 울 칼럼 또는 밀도 원심분리를 사용하여 이들을 분리하고 농축하려는 노력은 현실적인 해결책을 얻는 데 성공하지 못했다. 또한, 과거의 임신으로부터 잔존하는 태아 세포의 존재 또한 문제가 되는 것으로 여겨지므로, 목적하는 신생 태아의 검사를 가능하게 하는 안전한 확정적 태아 진단법의 개발이 더 이상 진행되지 못하였다.
최근, 수명이 짧고 모체에는 보통 거의 존재하지 않는 세포인 유핵 적아세포가 모체 혈액에 존재하는 태아 유핵 세포로서 주목받기 시작했으며, 이들을 진단에 사용되는 세포로서 사용하는 가능성에 대한 연구가 매우 활성화되었다. 그러나, 모체 혈액 중의 이들의 존재 비율이 모든 유핵 세포의 1/105 내지 1/107 로 매우 낮고, 림프구에 의한 태아 세포 진단에서와 마찬가지로, 백혈구와 같은 모체 유핵 세포로부터 충분한 수의 태아 유핵 적아세포를 분리 검출하는 과정을 달성하는 데에 는 기술적인 장애가 있다.
트랜스퍼린 수용체 항체 또는 자석 비드를 사용한 유세포분석기법 (flow cytometry)을 사용하여 적아세포를 분리하려는 노력이 있어왔으나, 항체의 특이성 문제로 인해 Y 염색체를 갖는 적아세포의 효율적인 검출은 불가능하게 되었다.
반면, 세포 분리를 수행하는 대신, 적아세포를 형태적으로 확인하고 미세조작에 의해 한 번에 하나씩 집어내는 채집 방법이 있으나, 모체 유핵 세포의 덩어리 중에서 적아세포를 구별하는 과정은 상당한 기술적 전문성을 요하고, 시간이 지극히 오래 걸린다. 따라서, 상기 방법은 특수한 장비를 필요로 하며, 예를 들면 단일 시료에 대해 작업하는 데 며칠이 걸릴 수도 있다. 현재에는, 1 cc의 모체 말초혈로부터 아마도 단 하나의 적아세포가 검출될 것이다. 그러나, 통계학적으로 확정적인 방식으로 유전자 및 염색체를 검사하기 위한 일반적이고 현실적인 태아 검사 방법을 구축하기 위해서는 적어도 30 개의 태아 세포가 필요할 것으로 생각되며, 이는 임산부로부터 안전하게 채집될 수 있는 혈액의 양이 최대한 10 cc임을 감안할 때 상기 샘플링 방법은 비현실적이므로, 현재까지도 높은 수율로 적아세포를 신속하고 편리하게 분리하고 농축하는 방법에 대한 강한 요구가 있다.
본 발명자들은 탄수화물 사슬의 특이적 상호작용에 중점을 둔 연구를 수행하여, 측쇄로서 다양한 탄수화물을 갖는 당접합(glycoconjugate) 고분자로써 코팅된 디쉬 등의 매트릭스 표면을 가짐으로써, 상기 탄수화물 사슬에 대한 친화성이 있는 렉틴(lectin)이 선택적으로 결합되는 세포 배양 매트릭스에 관한 특허 (일본특허 제 3139957 호)를 획득하였다. 또한, 상기 발명자들은, 렉틴을 사용한 분리법이 적아세포뿐만 아니라 미숙 조혈세포를 또한 분리 및 농축하는 데 사용될 수 있으므로, 10-30 개의 태아 유핵 세포를 검출할 수 있게 한다는 것을 발견하였다 (국제출원공보 WO 00/58443).
적아세포와 같은 혈액 세포를 분리 및 회수할 때, 말초혈은 일반적으로 먼저 밀도 원심분리를 사용하여 전처리되는데, 적아세포는 상기 밀도 원심분리에 의한 전처리 단계 중에 손상되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 유핵 적아세포의 비중은 약 1.077 내지 1.095 사이에서 변하며, 특정 비중을 갖는 고밀도 유체 (예컨대, 피콜(Ficoll) 등)가 사용되는 경우, 적아세포는 때때로 피콜층 아래 및 피콜층 위의 적혈구 층 모두에서 검출되어, 밀도 원심분리에 의한 단순 분리는 적아세포의 일부가 손실되게 할 수 있다. 이는 태아 헤모글로빈을 함유하고 핵제거 (denucleate)가 시작되려는 태아 적아세포의 비중이 불확실하기 때문인 것으로 생각된다.
또한, 상기 방식으로 분리 및 정제된 유핵 적아세포에서의 염색체 이상 등을 알기 위해서는, 상기 세포를 FISH 기법 (Fluorescence In Situ Hybridization; 형광제자리교잡법) 등으로 검사해야 하나, 이는 상기 검사에 적절한 시료의 제조 과정 중에 극복되어야 할 현실적 문제를 유발한다.
따라서, 상술한 문제점을 완전히 해결하기 위해, 본 발명은 렉틴을 이용한 유핵 적혈구 (NRBC)의 정밀 분리 및 회수를 기초로 하는, 임상적 실시를 위해 제공될 수 있는 신규한 혈액 세포 분리 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다. 즉, 본 발명은, 렉틴을 사용하여 한정된 양의 모체 혈액 샘플 내 모체 세포로부터 희소 태아 유핵 세포를 정밀하게 분리하면서, 전처리 단계 중에 적아세포의 손실을 상당히 방지함으로써, 목적하는 미숙 태아 세포 또는 NRBC를 선택적으로 높은 수율로 분리, 농축 및 회수하는 시스템을 제공하고, 상기와 같은 시스템을 사용하여 분리 및 회수된 태아 세포를 포함하는 검사용 표본을 제조하는 방법을 제공한다.
발명의 개요
본 발명의 혈액 분리 시스템은:
(1) 임산부로부터 채취한 혈액 샘플로부터 주로 무핵 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 제거하여 1차 (조) 분리된 샘플을 수득하는 1차 (조) 분리 장치를 포함하는데, 상기 1차 분리 장치는 모체 혈액 샘플에 포함된 각종 혈액 세포 중에서 태아 유핵 세포의 손실을 상당히 방지하는 조건 하에서 주로 유핵 세포인 백혈구, 무핵 적혈구, 혈소판 등을 분리 제거하며;
(2) 상기 1차 분리 장치로부터 수득한 1차 분리된 샘플로부터 잔존하는 무핵 적혈구 및 백혈구를 제거하여, 태아 유핵 세포가 농축된 2차 (정밀) 분리된 샘플을 수득하는 2차 (정밀) 분리 장치를 포함하는데, 상기 2차 분리 장치는, 세포를 불활성화시키는 조건 하에서 소정 농도의 렉틴과 함께 상기 1차 분리된 샘플을 표면에 당접합 고분자가 고정된 기판 상에서 배양함으로써, 상기 1차 분리된 샘플에 함유된 태아 유핵 세포를 상기 렉틴과 선택적으로 결합시켜, 이들을 렉틴-탄수화물 상호작용에 의해 상기 기판에 농축 결합시켜서 2차 분리된 샘플을 형성시키는 것에 관련되며; 그리고
(3) 상기 2차 분리 장치로부터 수득한 2차 분리된 샘플의 표본화를 위한 표 본화 장치를 포함하는데, 상기 표본화 장치는 소정의 조건 하에서 상기 태아 유핵 세포가 농축되고 결합된 상기 기판을 원심분리하여, 모체 혈액으로부터의 태아 유핵 세포가 FISH 기법 등에 의한 유전자/염색체 검사에 유리한 상태로, 확정적 진단을 가능하게 하는 수준으로 존재하는 검사용 표본을 수득하는 것에 관련된다.
본 발명의 혈액 분리 시스템은 바람직하게는, 검사용 표본에 함유된 태아 유핵 세포 내 염색체 및/또는 유전자를 검사하기 위한 상술한 표본화 장치로부터 수득된 검사용 표본을 사용하기 위한 검사 장치를 추가 포함해야 한다.
또한, 본 발명은 상술한 혈액 세포 분리 시스템을 사용하는 출산전 태아 진단용 검사용 표본의 제조 방법, 및 미숙 태아 세포가 FISH 기법 등에 의한 유전자/염색체 검사에 유리한 상태로, 확정적 진단을 가능하게 하는 수준으로 존재하는, 상기 제조 방법에 의해 제조된 검사용 표본을 또한 제공한다.
도 1 은 본 발명의 혈액 세포 분리 시스템의 예를 나타내는 블록 도면이다.
도 2 는 300 ㎍/㎖의 렉틴 (SBA)을 사용하여 모체 혈액으로부터 당접합 고분자로 코팅된 기판 상에 고정된 혈액 세포를 나타내는 현미경 사진 (×200)이다.
도 3 은 8 ㎍/㎖의 렉틴 (SBA)을 사용하여 모체 혈액으로부터 당접합 고분자로 코팅된 기판 상에 고정된 혈액 세포를 나타내는 현미경 사진 (×200)이다.
도 4 는 도 3 에 나타난 고정된 세포를 나타내는 현미경 사진 (×1000)이다.
도 5 는 본 발명의 혈액 세포 분리 시스템에 사용가능한 기판의 예를 나타내는 단면도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
먼저, 본 발명의 시스템 및 방법에 사용될 혈액 샘플을 임산부로부터 취한다. 혈액 채집 수단으로는, 주사기, 진공 혈액 채집관 또는 혈액 봉지와 같이 일반적으로 사용되는 혈액 채집 도구를 사용할 수 있다. 채취될 혈액은 정맥혈, 제대혈, 태반으로부터의 융모간 혈액 또는 골수액을 포함하는 임의 유형의 혈액일 수 있으나, 모체로의 침습을 가능한 한 많이 제한하기 위해서는 말초 정맥혈이 가장 바람직하다. 혈액 샘플의 양에는 특별한 제한이 없으나, 일반적으로 모체의 침습으로 인한 문제의 관점에서 약 1-10 ㎖이어야 한다. 채취된 혈액 샘플이 응고하는 것을 방지하기 위해, EDTA, 헤파린, CPD/ACC 등이 바람직하게 첨가되어야 한다. 의미있는 결과를 수득하기 위해서는, 임산부로부터 사용 전 24 시간 내에, 더욱 바람직하게는 사용 전 6 시간 내에 채취된 신선한 혈액 샘플을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 혈액 세포 분리 시스템은, 상술한 혈액 샘플로부터 제거될 세포 분획인 무핵 적혈구 및 모체 백혈구의 대부분을 주로 제거하기 위한 1차 분리 장치를 포함한다. 구체적으로, 1차 분리 장치는 바람직하게는 특정 밀도를 갖는 액체를 사용하는 밀도 원심분리 장치 또는 여과 분리 장치이어야 한다.
본 발명의 혈액 세포 분리 시스템을 형성하는 1차 분리 장치의 제 1 구현예는 밀도 원심분리 장치로서, 여기서는 수크로스 및 개질 수크로스, 글리세롤 또는 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드성 실리카와 같은 기존의 밀도 조정제를 사 용하여 소정의 밀도로 설정된 밀도구배액 (density gradient fluid)이 사용된다. 예로는, Pharmacia 사로부터 입수가능한 Ficoll-Paque, Ficoll-Hypaque 및 Percoll, 또는 Asuka-Sigma 사로부터 입수가능한 Histopaque 가 포함된다. 전혈(whole blood)로부터의 혈액 성분의 분리를 위해 과거에 일반적으로 사용된 밀도구배액은 1.077의 비중으로 설정되어 있다 (예컨대 Ficoll-Paque 및 Histopaque-1077). 이 경우, 원심분리를 하면, 비중이 높은 과립구 및 적혈구는 밀도구배액의 밑으로 가는 반면, 단핵구 및 백혈구와 같은 림프구는 밀도구배액 위로 떠오른다. 그러나, 본 발명자들은, 비중이 1.077인 밀도구배액을 사용하면, NRBC와 같은 태아 유핵 세포가 원심분리 후에 밀도구배액 내로 분산되어, 종래와 같이 단핵구를 함유하는 층만을 취하는 경우 희소 태아 유핵 세포를 많이 손실할 수 있다. 따라서, 본 발명의 분리 시스템에서는, 비중이 1.077 초과인 밀도구배액이 1차 분리 장치로서 바람직하게 사용되며, 이는 태아 유핵 세포의 손실을 방지하도록 사용될 수 있다.
하기에 기술되는 실시예에서 나타나듯이, 밀도구배액의 비중이 증가하면, 태아 유핵 세포의 회수율도 증가하나, 동시에 원치 않는 백혈구의 혼입이 증가할 것이다. 그러나, 본 발명은 하기에 기술되는 바와 같은 패닝(panning) 장치뿐만 아니라 탄화수소-렉틴 상호작용을 이용하는 2차 분리 장치를 가질 수 있으므로, 혼입된 백혈구를 분리 및 제거하여 더 많은 태아 유핵 세포를 회수할 수 있다. 따라서, 본 발명의 밀도 원심분리 장치는 원심분리관, 상기 원심분리관 내에 위치한, 비중이 1.077-1.105, 바람직하게는 1.080-1.095, 더욱 바람직하게는 1.090-1.095 g/㎤ 인 밀도구배액, 및 원심분리기를 포함한다. 임산부로부터 채취한 혈액 샘플을 밀도구배액이 담긴 원심분리관에 넣고, 이를 원심분리기에 넣어 500-2000 rpm (50-800 G)로 20-40 분간 원심분리시킴으로써, 다량의 태아 유핵 세포를 함유하는 밀도구배액 위에 위치한 층의 분획으로서 1차 분리된 샘플을 수득한다.
일부 경우, 본 발명의 1차 분리 장치는 혼입된 백혈구 등을 추가 제거하기 위한 패닝 장치를 또한 가질 수 있다. 상기 패닝 장치는 상기 플레이트에 대한 비특이적 부착을 이용하여 단핵구 및 과립구와 같은 백혈구 성분을 분리 제거하기 위해, 예를 들면 우태아 혈청 (FCS)으로써 표면-처리된 폴리스티렌 디쉬와 같은 플레이트 등을 포함한다.
구체적인 패닝 공정은 당해 분야에서 통상적으로 사용되어 온 바와 같다. 예를 들면, 샘플을 디쉬 상에 제공하고 소정 기간 동안 인큐베이션할 수 있고, 이어서 플레이트에 부착되지 않은 세포는 현탁액으로서 회수할 수 있다.
상기 디쉬는 바람직하게는 1회용 플라스틱 종류이어야 하고, 이 중 Nunc, Falcon, Iwaki Seiyaku 또는 Sumitomo Bakelite 사에서 입수가능한 폴리스티렌 디쉬와 같은 상업적으로 입수가능한 플라스틱 플레이트 제품을 사용할 수 있다. FCS를 상기 플레이트에 첨가한 후, 예를 들면 4℃에서 2 시간 동안 방치하여 FCS 중 단백질로써 표면을 코팅한다. 그 결과, 소수성 플라스틱 표면이 친수성이 되지만, FCS 중 단백질 성분이 변하기 시작하는 37℃ 초과의 온도, 또는 빙점 미만의 온도가 사용되지 않는 한, 임의의 조건이 사용될 수 있다. 이와는 별도로, 탄수화물을 코팅제로서 사용하는 것이 또한 효과적인데, 이 중 플라스틱 표면 상에 쉽 게 코팅되는 PV-슈거 (Netech 사 제품, Seikagaku Kogyo 사 판매)이 사용하기에 적당하다. 코팅은, PV-슈거 분말을 증류수에 용해시켜 10-1000 ㎍/㎖ 용액을 수득함으로써 수득하는데, 이 중 50-500 ㎍/㎖ 의 것이 바람직하게 사용된다. 상기 PV-슈거 용액을 디쉬에 넣고 실온에서 30 분 이상 방치하면, PV-슈거가 흡착되어 디쉬 표면이 친수성화된다. PV-슈거를 형성할 수 있는 탄수화물의 예에는, 글루코스 유형으로서 PV-G (글루코스), PV-MA (말토스), PV-GA (글루콘산), PV-CA (셀로바이오스) 및 PV-Lam (라미나리바이오스); 갈락토스 유형으로는, PV-LA (락토오스), PV-LACOOH (카르복실화 락토스) 및 PV-MeA (멜리바이오스); 및 PV-Man (만노바이오스) 및 PV-GlcNAc (N-아세틸키토바이오스)가 포함되나, 디쉬 표면을 효율적으로 코팅할 수 있는 탄수화물이라면 천연 다당류를 포함한 어떤 유형도 사용할 수 있다. 이들은, 폴리스티렌 디쉬를 용이하게 코팅할 수 있고 태아 세포를 많이 손실하거나 손상시키지 않기 때문에 바람직하게 사용된다. 구체적으로, 당접합 고분자 물질을 형성하는 탄수화물이 글루콘산 (PV-GA), 멜리바이오스 (PV-MeA) 또는 만노스 (PV-Man)인 것들이 높은 백혈구 흡착률 및 태아 세포의 손실이 낮게 유지되는 제거 공정을 달성할 수 있으므로 특히 유리하다. 코팅제로는, FCS의 분리 성능과 대등하거나 월등한 분리 성능을 갖는 합성 고분자이고, 안정한 롯트로 수득될 수 있고 FCS 보다 더 용이하게 저장할 수 있으므로, PV-슈거가 또한 바람직하다.
원심분리 후, 1차 분리된 샘플을 친수성화된 디쉬에 넣고, 5 분 이상 방치함으로써 백혈구 성분이 디쉬 표면에 더 높은 비율로 점착될 수 있게 하지만, 이들은 적절한 비율의 백혈구 점착 및 제거를 달성하기 위해서는 바람직하게는 15 분 내지 2 시간 동안 방치되어야 한다. 상기 기간 동안, 1차 분리된 샘플에 함유된 세포가 죽지 않는 임의의 온도가 사용될 수 있으나, 백혈구가 활성적으로 점착될 수 있는 18-37℃의 온도가 바람직하게 사용된다.
패닝 공정 (panning process)은 플라스틱 플레이트를 사용하는 것에 한정되지 않으며, 유리 플레이트 등도 상술한 바와 같이 FCS 또는 PV-슈거로 코팅함으로써 사용할 수 있다.
일반적으로, 2차 분리에서 사용되는 렉틴에 결합할 수 있는 혈소판이 많은 혈액 샘플의 오염이 원심분리 후에 발생할 수 있으며, 이는 적아세포 분석의 정밀성에 좋지 못한 영향을 미칠 것이다. 그러나, 패닝 처리는 혈액 샘플 제조 중에 오염된 혈소판을 점착시킴으로써 효과적으로 제거할 수 있다. 따라서, 패닝 과정은 과량의 과립구, 단핵구 및 혈소판을 예비-제거하기에 효과적인 공정이며, 매우 정밀한 적혈구 분리를 제공한다.
이러한 패닝 처리로 인해, 비중 및 입자 크기가 극히 적으나 점착성이 매우 강한 혈소판마저도 상술한 원심분리 장치에 의해 수득된 1차 분리된 샘플로부터 자동적으로 제거하여, 검출가능한 한계 미만으로 감소시키므로, 샘플에 몇 개의 무핵 적혈구 및 림프구와 같은 백혈구만이 잔존한 채 태아 유핵 세포가 풍부하게 하며, 상기 샘플은 본 발명의 분리 시스템을 위한 1차 분리된 샘플로 만들어질 수 있다.
본 발명의 혈액 세포 분리 시스템을 형성하는 1차 분리 장치의 제 2 구현예는 필터 분리 장치이다. 상기 필터 분리 장치는 혈액 성분의 분리에 일반적으로 사용되는, 소정의 공극 직경을 갖는 다공성 필터를 가져서, 혈액 샘플을 상기 필터 에 통과시킴으로써, 변형가능한 무핵 적혈구 성분은 보통 통과하여 제거되는 반면, 백혈구 성분 및 태아 유핵 세포인 적아세포를 포함한 성분은 필터 물질 내부 또는 상부에 잔류하게 된다. 세제액 등을 사용하여 필터 내에 잔류하는 성분을 회수함으로써, 태아 유핵 세포 및 백혈구를 함유하는 1차 분리된 샘플을 수득할 수 있다.
본원에서 사용되는 필터는, 무핵 적혈구 성분 (평균 크기 7-8.5 ㎛)을 통과시키나 백혈구 (평균 크기 7-30 ㎛) 및 태아 유핵 세포 (평균 입자 크기 8-19 ㎛)의 통과를 차단하도록 물리적 또는 화학적으로 포집할 수 있는 것인 한 특별히 제한되지는 않으므로, 회수 대상인 유핵 적아세포의 군에 속하는 것이 확실한, 최소 크기가 약 8 ㎛인 정색성 적아세포 (orthochromatic erythroblast)는 포집하나, 무핵 적혈구는 변형에 의해 통과시키는 바와 같은 범위 내의 공극 크기를 갖는 한, 예를 들면 필터를 형성하는 섬유의 응집물의 형태 또는 크기에 의해 포집하는 역할을 하는 부직포, 고분자를 연신함으로써 조절된 공극 직경을 갖는 다공성 필름, 비드 또는 스폰지 물질 등 어느 것이나 사용될 수 있다. 필터의 재료는 특별히 한정되어 있지 않으며, 백혈구를 채집할 수 있는 능력을 유지하기 위해 백혈구에 대한 일정 수준의 부착성을 유지하는 플루오로중합체, 폴리설폰, 폴리에스테르, 폴리비닐아세탈, 폴리비닐알코올, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리우레탄, 폴리아크릴, 폴리스티렌, 폴리케톤, 실리콘, 폴리락테이트, 셀룰로스, 키토산, 셀룰로스, 견 또는 마와 같은 합성 또는 천연 고분자, 또는 히드록시애퍼타이트, 유리, 알루미나, 티타니아 또는 스테인리스 강철 또는 티탄 알루미늄과 같은 금속을 포함하는 무기 물질일 수 있다. 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 아크릴, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 셀룰로스 및 히드록시애퍼타이트와 같은 폴리아미드가 가격 및 생산 면에서 바람직하다. 필터의 공극 크기는 1.0-40 ㎛, 바람직하게는 2.0-20 ㎛, 더욱 바람직하게는 3.0-10 ㎛이며, 필터가 섬유로 구성된 경우, 섬유 직경은 1.0-30 ㎛, 바람직하게는 1.0-20 ㎛, 더욱 바람직하게는 1.5-10 ㎛이다.
또한, 상술한 필터 형성 물질은 표면 상에서 개질될 수 있으며, 무핵 적혈구의 통과를 저지하지 않고 백혈구의 보유를 향상시키는 종류가 바람직하게 사용된다. 필터 내에 유지되는 태아 유핵 세포 및 백혈구는 필터를 세정함으로써 회수할 수 있다. 예를 들면, 미숙 유핵 적아세포는 백혈구 성분에 비해 탈착하려는 경향이 더 강하므로, 목적하는 태아 유핵 세포는, 혈액 샘플을 여과할 때 사용한 방향과는 반대 방향으로 필터에 세제액을 통과시킴으로써 선택적으로 회수할 수 있다. 본원에서 사용되는 세제액으로는, 태아 유핵 세포를 탈착시킬 수 있는 한, 임의의 생물학적 완충액 또는 생물학적 식염수, 예컨대 수혈액 또는 배양액을 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 분리 시스템 내 필터 분리 장치는 상기한 필터 및 세제액 외에도, 주사기 또는 펌프와 같은, 필터에 세제액을 공급하기 위한 유체 공급 장치, 또는 필터로부터 플러쉬된 무핵 적혈구 성분을 채집하기 위한 유체 저장소를 포함한다. 이러한 방식으로 수득된 태아 무핵 세포를 함유하는 샘플을 본 발명에 따라 1차 분리된 샘플로 한다.
필터에 의해 분리된 1차 분리된 샘플은 이어서 상술한 패닝 공정을 거쳐, 백 혈구의 수를 추가로 감소시키고, 이 또한 1차 분리된 샘플로서 사용할 수 있다.
본 발명의 혈액 세포 분리 시스템 내에서, 2차 분리 장치는 상기한 방식으로 수득된 1차 분리된 물질로부터 잔류 무핵 적혈구 및 백혈구를 제거하여, 태아 유핵 세포가 농축된 2차 분리된 샘플을 수득하기 위해 제공된다. 상기 2차 분리 장치에서, 1차 분리된 샘플은 표면에 당접합 고분자가 고정된 기판 상에서, 세포가 불활성화되는 조건 하에서 소정 농도의 렉틴과 함께 인큐베이션됨으로써, 렉틴-탄수화물 상호작용으로 인한 렉틴과의 선택적 결합에 의해 1차 분리된 샘플에 함유된 태아 유핵 세포를 상기 기판에 농축 및 부착시키는 방법을 수행한다 (이하, "탄수화물-렉틴 방법"이라 한다).
탄수화물-렉틴 방법의 상세 내용은 WO 00/58443 호에 기술되어 있다. 본원에서 사용되는 당접합 고분자로는, 탄수화물 사슬 구조가 폴리스티렌과 같은 소수성 고분자 주쇄에 도입된 것을 사용한다. 예를 들면, WO 00/58443 호에 기술된 바와 같은 PVLA, PVMA, PVMan, PVMeA, PVLACOOH, PVG, PVGlcNac 및 PVLam이 특히 바람직하다. 이들 중, 사용되는 렉틴에 의해 인식되는 탄수화물 사슬 구조를 갖는 것들을 선택하는 것이 바람직하다.
이들 당접합 고분자에 의해 표면-개질된 기판 상에서, 1차 분리된 샘플 및 렉틴을 세포가 불활성화되는 조건 하에서 인큐베이션하여, 태아 유핵 세포-렉틴 복합체를 형성시키는데, 이는 탄수화물-렉틴 상호작용에 의해 기판에 농축 및 부착된다.
사용되는 렉틴은 태아 유핵 세포에 의해 발현되는 탄수화물 사슬을 인식하는 것들이 바람직하며, 예로는 SBA, PNA, ECL, AlloA 및 VAA와 같은 갈락토스-인식 렉틴, Con A, LcH 및 PSA와 같은 글루코스-인식 렉틴, 및 LCA, GNA 및 CPA와 같은 만노스-인식 렉틴이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 여기서, 첨가된 렉틴의 양을 조정함으로써, 태아 유핵 세포가 더 높은 비율로 부착될 수 있게 하여, 모체로부터 혼입된 백혈구는 부착되지 않는 선택적 정밀 분리를 가능하게 한다. 구체적으로, 플라스틱 기판을 사용하면, 약 2×106 개의 세포를 함유하는 1차 분리된 샘플에 대한 첨가된 렉틴의 양은 바람직하게는 8-35 ㎍, 바람직하게는 8-32 ㎍, 더욱 바람직하게는 10-30 ㎍이다. 또한, 유리 기판을 사용하면, 약 2×106 개의 세포를 함유하는 1차 분리된 샘플에 대한 첨가된 렉틴의 양은 바람직하게는 10-200 ㎍, 바람직하게는 20-100 ㎍, 더욱 바람직하게는 30-75 ㎍이다. 따라서, 사용되는 렉틴 농도의 최적의 범위는 채택된 기판의 물질 및 렉틴의 종류에 따라 얼마간 변하는 반면, 최적 농도는 당업자에 의해 과도한 실험 없이도 선택될 수 있다.
모체 혈액 샘플로부터의 혈액 세포를 당접합 고분자 (PV-LA)로 코팅된 기판 상에 고정시킬 때, 300 ㎍/㎖의 렉틴을 사용하는 경우, 도 2의 현미경 사진에 나타나는 바와 같이 많은 백혈구 등 (강하게 염색되는 세포)이 오염된 반면, 8 ㎍/㎖의 렉틴을 사용하는 경우에는 도 3 및 4의 현미경 사진에 나타나는 바와 같이 백혈구와 같은 몇 개의 불필요한 세포가 존재하였고, 적혈구는 선택적으로 부착되었다.
렉틴과 세포의 인큐베이션을, 세포를 불활성화시키는 조건 하에서 수행하고, 그러한 조건 하에 상기한 선택성을 수득할 수 있다. "세포가 불활성화되는 조건" 은 세포막의 유동성 및 자발적 점착성이 저하되는 조건을 말하며, 통상적으로는 온도가 적어도 0℃ 내지 37℃, 바람직하게는 0-36℃, 보다 바람직하게는 4-30℃, 가장 바람직하게는 4-22℃로 조정되는 것이다. 그러나, 이러한 조건은 상기한 저온 조정으로 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 세포 호흡을 정지시키는 시약, 예컨대 나트륨 아자이드를 37℃에서 첨가함으로써 달성될 수 있다.
또한, 인큐베이션 시간은 세포와 렉틴이 세포-렉틴 복합체를 형성하기에 충분한 한 특히 한정되지는 않으나, 전형적으로는 0-120 분, 바람직하게는 0-90 분, 보다 바람직하게는 0-60 분이다. 여기서, "0 분"이란 1차 분리된 샘플 및 렉틴을 혼합한 후 즉시 후속 단계가 시작되는 것을 의미한다.
상기 2차 분리에 있어서, 인큐베이션 후에 기판에 점착되는 세포 (일부 무핵 적혈구를 포함할 수 있는 태아 유핵 세포)는 부착되지 않은 세포 (백혈구 등)를 세포 현탁액의 형태로 폐기하여 분리한다.
따라서, 본 발명에 따른 2차 분리 장치는 당접합 중합체로써 표면-개질된 기판, 렉틴, 및 냉각 장치 또는 나트륨 아자이드를 함유하는 시약과 같이 세포를 불활성화시키는 도구를 포함하며, 태아 유핵 세포가 기판에 고밀도로 부착되고, 백혈구와 같은 원치 않는 성분이 효과적으로 제거된 2차 분리된 샘플을 수득하게 한다.
본 발명에 따른 혈액 세포 분리 시스템에서는, 2차 분리된 샘플을 하기에 설명할 제조 장치에 의해 제조한 후, 최종적으로 FISH 기법 등을 사용하는 유전자/염색체 검사에 적합하게 된다. 따라서, 2차 분리 장치 내 기판을 FISH 기법 등에서 슬라이드 플레이트로서 사용함으로써, 단일 기판이 2차 분리에서부터 검사에 이르 는 전 과정에서 사용될 수 있으며, 이는 매우 실용적이다. 따라서, 본원에서 사용되는 슬라이드 플레이트가 현미경적 검사를 위해 유지되어야 하는 경우, 현미경의 시야를 방해하지 않도록 충분한 투명도를 갖는 플라스크, 디쉬, 큐벳 또는 필름을 사용할 수 있으나, 현미경과의 일반적인 상용성을 고려하면, 챔버 슬라이드를 사용하는 것이 특히 바람직하며, 여기에는 렉틴에 의한 2차 분리 중에 커버 쉘 (cover shell)이 부착되고, 상기 커버 쉘은 2차 분리 후에는 제거되며, 부착된 태아 유핵 세포는 건조 및 고정되어, 이는 용이하게 FISH 기법에서 직접 사용될 수 있다.
챔버 슬라이드의 슬라이드 부분은, 상술한 탄수화물-렉틴 공정에서 사용된 당접합 고분자로써 코팅되고 현미경을 통해 볼 수 있는, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 폴리우레탄 및 비닐 공중합체 등과 같은 유기 물질뿐만 아니라 실리카를 포함한 유리와 같은 무기 물질을 포함하는 임의의 물질로 만들어질 수 있다. 또한, FISH 기법에서 사용되는 경우에는, 슬라이드에 부착된 세포의 핵을 드러내지 않도록 고온에서의 유기 용매 공정을 사용해야 하므로, 변형에 민감하지 않은 유리 물질이 바람직하게 사용된다.
도 5 는 본 발명의 혈액 세포 분리 시스템 중 2차 분리 및 후속 공정에서 사용가능한 기판의 예를 나타낸다. 도 5에 묘사된 기판은 챔버의 바닥을 구성하는 슬라이드 부분 (1) 및 상기 슬라이드 부분 (1)에 수직으로 위치한 측벽 (2)를 포함한다. 당접합 고분자 층 (10)이 상기 챔버의 바닥의 상부 표면 상에 형성된다. 챔버의 개방 부분은 덮개 (3)에 의해 밀폐될 수 있다.
본 발명의 혈액 세포 분리 시스템은 표본의 제조를 위한 소정의 조건 하에서 2차 분리된 샘플을 원심분리하기 위한 표본화 장치를 포함한다.
일반적으로, 염색체 검사 등을 위한 유리 슬라이드 상에 세포 표본을 제조할 때, 세포 현탁액을 피펫으로 취하고, 슬라이드 상에 적하하고, 공기 중에서 건조하거나, 세포를 함유하는 샘플을 슬라이드 상에 분산시키고, 이어서 이를 건조하여 스미어 샘플 (smear sample)을 형성시킨다 (예를 들면 JP-A-H7-27682 호 참조). 그러나, 본 발명자들은, 2차 분리된 샘플로부터 세포를 검사에 적합한 형태로 슬라이드에 부착시키기 위해서는, 특별한 원심분리 조건이 사용되어야 함을 처음으로 발견하였다.
따라서, 본 발명의 표본화 장치는, 소정의 조건 하에서 2차 분리된 샘플을 기판 상에 여전히 유지되는 상태로 원심분리할 수 있는, 2차 분리된 샘플의 원심분리용 원심분리 장치를 포함한다. 상기 조건은 사용되는 기판 (슬라이드)에 따라 달라진다.
기판이 플라스틱 챔버 슬라이드인 경우에는, 세포 현탁액이 제거된 후에 커버 쉘이 제거되지만, 슬라이드 표면이 건조되는 것을 방지하기 위해서는, 바람직하게는 단백질이 풍부한 생물학적 농도에 가깝게 알부민을 함유하는 생물학적 완충액 또는 FCS로써 세정한 후 원심분리해야 한다. 또한, 증류수로써 바람직하게는 1/2로, 더욱 바람직하게는 3/5으로 희석된 FCS는 부착된 세포를 플레이트 상에 넓게 분산시키는 데 사용할 수 있으므로, 현미경을 통해 이들을 용이하게 관찰할 수 있게 하며, 따라서 사용하기에 특히 바람직하다. 희석 범위는 세포를 분해하지 않 는 정도인 한 임의의 범위일 수 있다.
원심분리력에 있어서는, 세포를 플레이트에 부착시키기에는 100-1500 G가 바람직하며, 원심분리 시간을 짧게 하는 데 효과적이므로 400-700 G가 보다 바람직하다. 원심분리 시간은 원심분리력에 따라 변하나, 일반적으로는 약 1-15 분이어야 한다. 원심분리 없이 직접 공기 건조되는 경우에는, 세포가 종종 위축되어 좋은 세포 영상을 얻지 못하게 할 수 있다.
반면, 유리 챔버 슬라이드가 사용되는 경우에는, 상기한 원심분리 공정에서, 첫 번째 원심분리는 낮은 원심분리력으로 수행하고, 두 번째 원심분리는 더 높은 원심분리력으로 수행하는 두 단계 절차를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 부착되지 않은 세포를 함유하는 세포 현탁액을 FCS로써 바람직하게는 1/2, 더욱 바람직하게는 3/5의 희석물로써 대체하고, 커버 쉘을 제거하기 전에 첫 번째 원심분리를 수행하는 것이 바람직하다. 첫 번째 원심분리는 10-300 G, 바람직하게는 10-150 G, 보다 바람직하게는 10-50 G에서 가볍게 수행하여, 부착된 세포가 탈착되거나 압착 시 변형되는 것을 추가 방지할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 다음에는, 커버 쉘을 제거하고 두 번째 원심분리를 수행하여, 검사에 적합한 고정된 세포 영상을 수득한다. 두 번째 원심분리는 25-300 G, 바람직하게는 30-200 G, 보다 바람직하게는 35-130 G의 원심분리력으로 수행하여, 변형 없는 고정된 세포 영상의 재현성이 더욱 증가되게 해야 한다.
상기한 바와 같이, 슬라이드 기판의 물질에 따라 달라지는 구체적 조건에 따라 원심분리 공정을 수행함으로써, 태아 유핵 세포가 유리한 상태로 고정된 슬라이 드 기판으로 구성된 검사 표본을 수득할 수 있다.
본 발명의 혈액 세포 분리 시스템은, 태아 유핵 세포가 부착된 태아 유핵 세포의 염색체 및/또는 유전자 검사를 위해 상기한 바와 같이 기판 (슬라이드)에 농축 및 고정된 검사 표본을 사용하기 위한 검사 장치를 포함한다.
상기 검사 장치는, 예를 들면 FISH 기법을 사용하여 핵내 염색체를 직접 형광 라벨링하고 현미경으로 관찰하기 위한 장치일 수 있으며, 이는 선택된 프로브(probe)의 종류에 따라 이수성(aneuploidy), 등완염색체(isochromosome), 전좌(translocation), 소실(deletion), 및 상호전좌(reciprocal translocation)와 같은 염색체 이상을 검출할 수 있다. 대안적으로 상기 장치는, 부착된 세포를 현미경 하에서 미세조작 또는 레이저 절제에 의해 박리함으로써 회수하고, 유전자를 증폭시키는 PCR 기법을 사용할 수 있다. 증폭된 유전자는 유전자 칩 상에서 스크리닝될 수 있고, 본 발명의 시스템은 다양한 유형의 염색체/유전자 진단에 대해 조정될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 혈액 세포 분리 시스템을 사용함으로써, 비중 또는 항체에 의한 표면 표지자 동정을 사용하여 분리 및 농축하기가 어려운 모체 혈액 내 희소 태아 유핵 세포를, 특정 조건 하의 밀도 원심분리 또는 필터 분리에 의한 1차 분리와, 특정 조건 하의 렉틴에 의한 탄수화물 사슬 인식을 기초로 한 2차 분리의 조합에 의해, 고정밀 및 고밀도로 분리 및 농축한다. 구체적으로, 본 발명에 따르면, 이러한 희귀 태아 유핵 세포는 핵내 염색체 및 유전자의 검사에 사용될 수 있는 기판 상에 직접 부착, 분리 및 농축되고, 상기 기판에 부착된 세포는 유전자/염색체 검사에 대해 조정가능한 양호한 세포 형태를 유지한다. 따라서, 본 발명은, 상기한 시스템을 사용함으로써 다양한 염색체 및/또는 유전자 진단에서의 검사에 직접 사용될 수 있는 태아 유핵 세포의 검사표본을 제조하는 방법, 및 상기 방법에 의해 제조되는 검사 표본을 제공한다.
본 발명의 시스템을 사용하는 방법은, 샘플에 함유된 희소 세포로부터 다량의 원치 않는 세포 성분을 제거하는 1차 분리 단계, 및 1차 분리된 샘플로부터 원치 않는 세포 성분을 제거하는 목적으로 희소 세포를 분리 및 농축하는 2차 분리 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며, 예를 들면 상술한 탄수화물-렉틴 방법에 의한 2차 분리를 희소 세포에 특이적인 항체를 사용하는 분리 기법으로 대체할 경우에도, 상기와 같은 분리 방법 및 시스템은 본 발명의 범위 내로 유지될 것이다. 또한, 목표로 하는 희소 세포는, 분리 및 농축 후 검사에 의해 염색체 및 유전자의 상태 및 이상을 진단할 수 있는, 모체 혈액에 혼입된 태아 유핵 세포 (태아 유핵 적아세포)인 것 외에도, 관해(remission) 후에도 잔존하는 백혈병 세포, 또는 제대혈 내의 미숙 세포일 수 있으며, 본 발명에 의해 제공되는 조 세포 분리 시스템 또는 정밀 분리 시스템에서 사용되는 것과 같은 렉틴 또는 항체에 의한 선택에 의해 슬라이드 기판상에 농축될 수 있는 임의 종류의 세포일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "태아 유핵 세포"는 이러한 방식으로 목표되는 모든 희소 세포를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명의 혈액 세포 분리 시스템을, 1차 분리, 탄수화물-렉틴 방법을 사용하는 2차 분리, 및 양호한 세포 형태를 유지하는 표본화를 위한 조건의 설정에 중점을 두어 상세히 설명할 것이다.
실시예 1: 밀도 원심분리에 의한 1차 분리
Histopaque (Sigma 제품)를 밀도 원심분리 시약으로 사용하기 위해 수득하고, 이에 나트륨 디아트리조에이트를 첨가하여, 비중이 1.077-1.105로 조정된 6 종류의 밀도구배액을 제조하였다. 10-20 주 째의 임산부로부터 7 cc의 정맥혈을 채취한 후, 이를 각각의 밀도구배액 중에서 30 분간 원심분리하였다 (20℃, 1500 rpm). 밀도구배액과 혈장 성분 (상부층) 사이의 경계 근처에서 수집한 세포를 회수한 후, 생물학적 완충액으로 원심분리적으로 세정하여, 대부분의 무핵 적혈구 및 혈소판이 제거된 조 분리된 샘플을 수득하였다.
다양한 밀도 조건 하에서 일차적으로 정제한 샘플을 탄수화물-렉틴 방법에 의해 2차 분리하였다. 기판으로는, 플라스틱 챔버 슬라이드 (2 개의 웰, Nalgenunc 사 제품)를 사용하였다. 기판 상에 코팅된 당접합 중합체는 PVMeA 였고, 약 2×106 개의 세포에 대해 12 ㎍의 렉틴 (SBA)를 첨가한 후, 18℃에서 30 분간 인큐베이션하였다. 부착되지 않은 세포는 현탁액의 형태로 폐기한 반면, 챔버 슬라이드에 부착된 세포는 건조하고 Pappenheim 염료로 염색하였다. 염색된 세포를 현미경을 통해 관찰하며, 분리되고 슬라이드에 부착된 정색성 적아세포 (태아 유핵 세포)를 계수하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
각종 유체를 사용한 원심분리로써 1차 분리된 샘플에 대해 탄수화물-렉틴 방법을 사용한 2차 분리 후에 검출된 적아세포의 수 (평균 10 샘플)
밀도구배액의 밀도
1.077 1.080 1.090 1.095 1.100 1.105
슬라이드 상에서 검출된 정색성 적아세포의 수 10.7 13.1 14.3 15.7 16.0 22.9
비중 1.077에 대한 값과 비교한 적아세포 검출 비율 1.0 1.2 1.3 1.5 1.5 2.1
표 1에 나타난 바와 같이, 밀도구배액 (Histopaque)의 밀도를 증가시키면, 탄수화물-렉틴 정밀 분리 후에 검출된 적아세포의 수가 명백히 증가되었다. 이는, 비중이 1.077인 밀도구배액을 사용하는 밀도 원심분리에 의한 통상적인 혈액 세포 분리에서는 비중이 높은 적혈구가 손실되었음을 명백히 한다. 반면, 정색성 적아세포의 수는 비중이 1.095를 초과할 때 증가하는 한편, 혼입된 백혈구의 수가 상당히 증가하는 것이 또한 관찰되는데, 그 결과, 현미경에 의한 적아세포의 검출이 탄수화물-렉틴 방법으로 인한 정밀 분리 효율의 감소에 의해 저하되는 경우가 있었다.
실시예 2: 패닝(panning)에 의한 부가적 분리
플라스틱 챔버 슬라이드 (4 개의 웰, Nalgenunc 제품)를 FCS 또는 당접합 중합체 (PV-슈거) (Netech 제품)의 0.01 중량% 수용액으로 처리하였다. 당접합 중합체로는, 글루코스, 말토스, 글루콘산, N-아세틸글루코사민, 만노스, 락토스 또는 멜리바이오스의 구조를 갖는 것을 사용하였다.
Histopaque (d, 1.095)를 사용한 표준 방법에 따라 출산 후 회수된 제대혈에 대해 밀도구배 원심분리를 수행하였고, Histopaque와 혈장 사이의 경계 근처에 응집된 세포를 수집하였다. 샘플을 10 중량% FCS가 첨가된 RPMI1640에 재현탁시키 고, 표면이 FCS 또는 당접합 고분자로써 코팅된 상술한 웰 상에 접종하였다. 37℃에서 30 분간 인큐베이션한 후, 부착되지 않은 세포를 세포 현탁액 형태로 회수하고, 웰에 부착된 세포는 Pappenheim 염료로 염색하여 이들의 종류를 동정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2는, 코팅물 종류에 대한 적혈구 분획 (적아세포 포함)과 웰 표면에 부착된 백혈구 분획 사이의 비율, 및 모든 접종된 세포의 점착률을 나타낸다.
각각의 웰에 대한 혈액 세포의 점착 (평균 5 샘플) (%)
FCS 만노스 글루코스 말토스 글루콘산 글루코사민 락토스 멜리바이오스
백혈구/적혈구 비 99.2 99.1 98.9 99.5 99.1 97.4 98.9 98.9
전체 점착률 69.3 71.0 62.3 64.6 78.0 72.6 65.8 78.1
표 2에 나타난 바와 같이, 플라스틱 표면이 혈청 단백질 (FCS) 또는 당접합 고분자로써 코팅된 웰을 사용하여 거르는 경우, 부착되는 대부분의 혈구는 백혈구임이 분명하다. 적혈구 분획의 부착은 말토스, 글루콘산, FCS 및 만노스로 처리된 웰에서는 저하되는 반면, 글루콘산, 글루코사민 및 만노스는 백혈구의 제거가능성을 나타내는 전체 점착률에서 우월하다. 이 경우, 약 1 또는 2 개의 부착된 적아세포가 관찰된 글루코스 종류의 물질의 부분을 제외하고, 부착된 적혈구 분획에서는 적아세포가 포함되지 않았다.
다음으로, 적혈구 분획의 상당한 손실 없이 적당한 양의 백혈구를 제거하기 위한 처리제로서 FCS를 선택하여, 모체 혈액의 처리 효과를 연구하였다. 비중이 1.095인 밀도구배액을 사용한 밀도 원심분리에 의해 수득된 1차 분리된 샘플을 두 부분으로 나누고, 그 중 하나는 상술한 조건 하에서 걸러내고, 다른 하나는 처리하지 않은 채, 실시예 1과 동일한 조건 하에서 탄수화물-렉틴 2차 분리를 수행하였다.
렉틴 2차 분리에 대한 패닝의 효과 (평균 20 샘플) (패닝하지 않은 경우와 비교한 비)
슬라이드 시야 당 적혈구/백혈구 비 2.6 배
슬라이드 상에서 검출된 적혈구의 수 2.6 배
표 3의 슬라이드의 시야 당 적혈구/백혈구의 비율은 2차 분리에서의 백혈구의 제거율을 나타내고, 슬라이드 상에서 검출된 적혈구의 수는 적아세포 회수 효율을 나타낸다. 구체적으로, 현미경 하의 부착된 세포의 계수 결과는 패닝이 수행되지 않은 경우 및 패닝이 수행된 경우의 상대적 비율 (배수)로서 나타낸다. 표 3의 결과로부터, 패닝이 탄수화물-렉틴 방법에서의 적아세포의 선택적 분리 및 농축 효율을 향상시킴이 명백하다. 이는, 패닝이 과량의 백혈구를 제거하여, 렉틴에 의해 부착될 세포 (적아세포)가 렉틴과 효율적으로 상호작용하여 점착 실패율을 감소시킬 수 있다는 사실, 및 현미경 관찰 중에 적아세포 외의 유핵 세포 수의 감소로 인해 적아세포의 계수 오류가 감소되었다는 사실로 인한 공동상승적인 효과에 의한 것으로 여겨진다.
표 3의 결과는, 표 1의 비중이 1.095인 경우와 비교하더라도, 현미경 관찰을 저해하는 백혈구의 혼입이 패닝에 의해 억제되는 반면, 비중이 1.105인 경우 (걸러내지 않음)에서보다 더 많은 적아세포가 검출될 수 있게 한다는 것을 나타낸다. 또한, 모체 혈액에서 패닝으로 인한 적아세포의 손실이 거의 없었다.
실시예 3: 필터 분리에 의한 1차 분리
실시예 1의 밀도 원심분리법 대신에, 평균 공극 크기 8 ㎛의 폴리에스테르 부직포를 포함하는 필터를 사용하여 1차 분리를 수행하였다. 모체 혈액의 샘플을 1 중량% BSA를 함유하는 생물학적 완충액으로 희석한 후, 자연적 적하에 의해 필터에 통과시켰다. 다음으로, 완충액만을 필터에 통과시켜, 필터 내 잔류 적혈구를 세정 제거하였다. 이어서, 완충액을 주사기 펌프로써 반대 방향으로 통과시키고, 필터를 통과하지 못한 부착되지 않은 세포를 회수하였다. 필터를 통과하지 못했으나 필터에 강하게 점착되지 않은 세포 분획을 1차 분리된 샘플로 취하고, 이를 탄수화물-렉틴 방법으로 2차 분리하였다. 표 4 는 상기한 필터로부터 수득한 1차 분리된 샘플을 사용한 결과를, FCS 패닝에 의해 회수된 세포 분획을 탄수화물-렉틴 방법으로 2차 분리한 경우의 결과에 대한 상대적 비율 (배수)의 형태로 나타낸다.
렉틴 2차 분리에 대한 여과의 효과 (평균 20 샘플) (밀도 원심분리+패닝의 경우와 비교한 비)
슬라이드 시야 당 적혈구/백혈구 비 1.5 배
슬라이드 상에서 검출된 적혈구의 수 2.4 배
표 4에 따르면, 슬라이드의 시야 당 적혈구/백혈구의 비율 (2차 분리에서의 백혈구 제거율) 및 슬라이드 상에서 검출된 적아세포의 수 (2차 분리에서의 적아세포 회수율) 모두가 향상되어, 탄수화물-렉틴 방법을 사용한 적아세포의 선택적 분리 및 농축 효율이 필터 공정에 의해 향상될 수 있음을 명백히 나타낸다. 필터에 의한 1차 분리는, 변형할 수 있는 무핵 적혈구가 필터를 통과하고, 필터를 통과하지도 않고 필터에 포집되지도 않는 세포는 필터를 세정함으로서 회수함에 기인하는 것으로 여겨진다. 따라서, 적아세포의 손실이 여과법으로서 밀도 원심분리법보다는 1차 분리법을 사용함으로써 추가 억제됨이 입증된다. 적혈구/백혈구 선택성은 약간만 향상되는데, 이는 필터에 잔존하는 무핵 적혈구가 세정에 의해 회수되기 때문이다.
실시예 4: 표본화 단계에서의 원심분리
FISH 기법에 적당한 유리 챔버 슬라이드 (Nalgenunc 제품)를 사용하여, 탄수화물-렉틴 방법을 사용한 2차 분리를 수행하였다. 1차 분리 조건에서와 같이, 하기를 사용하였다 (실시예 2와 동일).
밀도 원심분리: d, 1.095
FCS 패닝
탄수화물-렉틴 방법에 의한 2차 분리 후에, 부착되지 않은 세포를 함유한 세포 현탁액을 폐기하고, 챔버를 FCS로 대체하고, 커버 쉘을 제거하고, 슬라이드를 원심분리한 경우 (실험 조건 1 및 2)와, 부착되지 않은 세포를 함유한 세포 현탁액을 폐기하고, 챔버를 FCS로 대체하고, 첫 번째 원심분리를 즉시 수행하고, 두 번째 원심분리를 커버 쉘을 제거한 후에 슬라이드 상에서 수행한 경우 (실험 조건 3-11)를 비교하였다.
FCS로는, 원액 (1/1)을 사용 전에 증류수로 1/2로 희석하고, 두 번째 원심분리 후에 표준 온도에서 슬라이드를 공기 건조하였다. 슬라이드 상의 세포를 Pappenheim 염료로 염색하고, 이들의 각각의 염색 외양을 비교하였다. 결과를 표 5에 나타낸다.
슬라이드 원심분리 조건 염색 외양
조건 제1원심분리
(G)		 시간 (분) 대체액 제2원심분리
(G)		 시간 (분)
1 1/2 FCS 1500 3 F
2 1/2 FCS 200 10 F
3 200 5 1/2 FCS 200 10 D
4 45 5 1/2 FCS 200 10 D
5 25 5 1/2 FCS 200 10 C
6 25 5 1/2 FCS 130 10 B
7 25 5 1/2 FCS 130 10 C
8 25 5 1/2 FCS 70 10 A
9 25 5 1/2 FCS 70 10 C
평가 염색 외양
세포의 형태 세포질, 핵 구조
F 점으로 수축 식별 가능
D 수축 식별 가능
C 적혈구는 수축, 백혈구는 변형 식별 가능성의 한계
B 약간의 변형 명확
A 양호 명확
정상 스미어 샘플과는 달리, 탄수화물-렉틴 방법에 의해 2차 분리된 슬라이드 상의 세포는 원심분리에 의해 부착된 세포가 압착될 필요가 있으나, 유리 슬라이드를 기판으로 사용한 경우에는, 첫 번째 원심분리가 저속으로 FCS 용액 중에서 이루어져야 한다. 커버 쉘을 제거한 후의 두 번째 원심분리에서도, 비교적 저속 조건이 양호한 염색 외양을 유지하였다. 또한, 고 단백질 농도로 FCS- 또는 BSA-첨가된 완충액이 대체액으로서 효과적인 반면, 생물학적 조건 하에 희석된 FCS는 부착된 세포가 팽윤하게 하여, 더 나은 염색 외양을 유지하였다. 예를 들면, 세포는 조건 8, 10 및 11 하에서 세포질 및 핵의 적절한 형태 및 분명한 구조를 나타내었다. 특히, 3/5로 희석된 FCS를 사용한 조건 11 하에서는, 보관 기간 또는 개체와 같은 샘플로부터의 변형 효과가 거의 관찰되지 않았다. 플라스틱 슬라이드 를 사용한 경우, 상기 주어진 조건 1 하에서 적절히 양호한 염색 외양을 수득하였다.
본 발명의 혈액 분리 시스템에 따르면, 매우 소량의 모체 혈액에 함유된 태아 유핵 세포인 유핵 적혈구가 선택적으로 분리, 농축되고, 기판에 부착된다. 또한, 사용된 기판을 적절하게 선택함으로써, 2차 분리 단계로부터 표본화 단계까지의 가공이 단일 기판 상에서 수행되어, 염색체/유전자 진단에 적합한 검사표본을 수득할 수 있으며, 상기 검사 표본은 FISH 기법과 같은 검사 수단에 직접 적용될 수 있다. 따라서, 출산전 진단에 있어 임상학적 가치가 높은 태아 유핵 세포 검사 샘플을, 모체를 침습하지 않고 편리하고 저렴하게 제조할 수 있다.

Claims (24)

  1. 하기를 포함하는 혈액 세포 분리 시스템:
    임산부로부터 채취한 혈액 샘플로부터 주로 무핵 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 제거하여 1차 분리된 샘플을 수득하기 위한 1차 분리 장치;
    상기 1차 분리 장치로부터 수득된 1차 분리된 샘플로부터 잔류 무핵 적혈구 및 백혈구를 제거하여, 농축된 태아 유핵 세포를 갖는 2차 분리된 샘플을 수득하기 위한 2차 분리 장치로서, 세포를 불활성화시키는 조건 하에서 렉틴과 함께 상기 1차 분리된 샘플을 당접합(glycoconjugate) 고분자가 표면에 고정된 기판 상에서 인큐베이션하고, 이로써 상기 1차 분리된 샘플에 함유된 태아 유핵 세포를 상기 렉틴과 선택적으로 결합시킴으로써, 이들을 렉틴-탄수화물 상호작용에 의해 상기 기판에 농축 및 부착시켜 2차 분리된 샘플을 형성시키는 것에 관련된 2차 분리 장치; 및
    상기 2차 분리 장치로부터 수득된 2차 분리된 샘플을 표본화하는 표본화 장치로서, 상기 태아 유핵 세포가 농축 및 부착된 상기 기판을 원심분리함으로써 검사 표본을 수득하는 것에 관련된 표본화 장치.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 1차 분리 장치는 밀도가 적어도 1.077 ㎎/㎤ 를 초과하는 밀도구배액을 사용하는 밀도 원심분리 장치인 혈액 세포 분리 시스템.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 밀도 원심분리 장치에 의해 수득된 태아 유핵 세포를 함유하는 샘플에 혼입된 백혈구를 제거하기 위한 패닝(panning) 장치를 추가 포함하는 혈액 세포 분리 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 1차 분리 장치가 필터를 사용하여 무핵 적혈구 및 백혈구를 분리하기 위한 장치인 혈액 세포 분리 시스템.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 2차 분리 장치에서 세포를 불활성화시키는 조건이 0℃ 이상 37℃ 미만의 저온 조건이거나, 세포 호흡을 정지시키는 조건인 혈액 세포 분리 시스템.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 표본화 장치 내 원심분리가, 플라스틱 기판을 사용할 경우에는 100-1500 G에서 1-15 분간의 원심분리이고, 유리 기판을 사용할 경우에는 10-300 G에서 1-10 분간의 첫 번째 원심분리 후 25-300 G에서 5-15 분간의 두 번째 원심분리인 혈액 세포 분리 시스템.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 표본화 장치에 사용되는 기판이 2차 분리된 샘플에 함유된 현탁액을 1/2로 희석된 FCS로써 치환하여 수득된 것인 혈액 세포 분리 시스템.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 표본화 장치로부터 수득된 검사 표본에 함유된 태아 유핵 세포 내 염색체, 유전자 또는 염색체 및 유전자 검사용 검사 장치를 추가 포함하는 혈액 세포 분리 시스템.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 검사 장치가 표본에 함유된 태아 유핵 세포의 핵 내 염색체를 염색하기 위한 염색 도구를 포함하는 것인 혈액 세포 분리 시스템.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 염색 수단 내 핵의 염색이 FISH 기법으로 인한 것인 혈액 세포 분리 시스템.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 검사 장치가 광학 현미경 또는 형광 현미경을 사용한 염색체 검사 장치를 포함하는 것인 혈액 세포 분리 시스템.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 검사 장치가 표본에 함유된 태아 유핵 세포의 염색체로부터 추출된 유전자를 증폭시키기 위한 도구를 포함하는 것인 혈액 세포 분리 시스템.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 증폭 도구가 PCR 기법을 수행하기 위한 물질에 연관된 것인 혈액 세포 분리 시스템.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 검사 장치가 증폭된 유전자를 스크리닝하기 위한 장치를 포함하는 것인 혈액 세포 분리 시스템.
  15. 하기 단계를 포함하는, 출산전 태아 염색체, 유전자 또는 염색체 및 유전자 진단을 위한 검사 표본의 제조 방법:
    임산부로부터 채취한 혈액 샘플로부터 주로 무핵 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 제거하여 1차 분리된 샘플을 수득하는 1차 분리 단계;
    상기 1차 분리된 샘플 내의 잔류 백혈구를 선택적으로 제거하여 목적하는 태아 유핵 세포를 농축된 형태로 갖는 2차 분리된 샘플을 수득하기 위해, 세포를 불활성화시키는 조건 하에서 상기 1차 분리된 샘플을 렉틴과 함께, 표면에 당접합 고분자가 고정된 기판 상에서 인큐베이션함으로써, 상기 1차 분리된 샘플에 함유된 태아 유핵 세포를 상기 렉틴과 선택적으로 결합시켜, 이들을 상기 렉틴-탄수화물 상호작용에 의해 상기 기판에 농축 및 부착시키는 2차 분리 단계; 및
    상기 태아 유핵 세포가 농축 및 부착된 2차 분리된 샘플의 원심분리를 수행하는 표본화 단계.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 1차 분리 단계가, 밀도가 적어도 1.077 ㎎/㎤를 초과하는 밀도구배액(density gradient fluid)을 사용하여 밀도 원심분리에 의해 수행되는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 혼입된 백혈구를 제거하기 위한 상기 밀도 원심분리 수단에 의해 수득된 태아 유핵 세포를 함유하는 샘플을 패닝(panning)하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 1차 분리 단계가 필터를 사용하여 무핵 적혈구 및 백혈구를 분리함으로써 수행되는 방법.
  19. 제 15 항에 있어서, 상기 정밀 분리 단계에서 세포를 불활성화시키는 조건이 0℃ 이상 37℃ 미만의 저온 조건이거나, 세포 호흡을 정지시키는 조건인 방법.
  20. 제 15 항에 있어서, 상기 표본화 단계에서의 원심분리가, 플라스틱 기판을 사용하는 경우에는 100-1500 G에서 1-15 분간이 원심분리이고, 유리 기판을 사용하는 경우에는 10-300 G에서 1-10 분간의 첫 번째 원심분리 후에 25-300 G에서 5-15 분간의 두 번째 원심분리인 방법.
  21. 제 15 항에 있어서, 2차 분리된 샘플에 함유된 현탁액이 1/2로 희석된 FCS로 치환된 기판이 상기 표본화 단계에 제공되는 방법.
  22. 제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 출산전 태아 염색체, 유전자 또는 염색체 및 유전자 진단용 검사 표본.
  23. 표면에 당접합 고분자가 고정된, 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 혈액 세포 분리 시스템용 기판.
  24. 삭제
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