WO2003050532A1 - Systeme de separation de cellules sanguines - Google Patents

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WO2003050532A1
WO2003050532A1 PCT/JP2002/012839 JP0212839W WO03050532A1 WO 2003050532 A1 WO2003050532 A1 WO 2003050532A1 JP 0212839 W JP0212839 W JP 0212839W WO 03050532 A1 WO03050532 A1 WO 03050532A1
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separation
sample
blood
blood cell
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PCT/JP2002/012839
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Hirofumi Yura
Yoshio Saito
Michihiro Kitagawa
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Netech Inc.
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    • G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour

Definitions

  • the present invention relates to a blood cell separation system using a lectin, and more particularly, to a sample containing nucleated erythroblasts, which are fetal nucleated cells contained in maternal peripheral blood, umbilical cord blood, and the like of a pregnant woman, from annuclear erythrocytes And a system for efficiently removing mature and white blood cells, separating and enriching fetal nucleated erythroblasts, and examining their chromosomes and genes.
  • nucleated erythroblasts which are fetal nucleated cells contained in maternal peripheral blood, umbilical cord blood, and the like of a pregnant woman, from annuclear erythrocytes
  • a system for efficiently removing mature and white blood cells separating and enriching fetal nucleated erythroblasts, and examining their chromosomes and genes.
  • Conventional technology Conventional technology
  • AFP a-fetoprotein; fetal serum protein
  • the method of predicting fetal abnormalities based on the changes in (1) is superior in that it is noninvasive, but it is a screening method that suggests the need for amniocentesis and cannot be a definitive diagnosis.
  • nucleated erythroblasts which have a short life cycle and are almost absent from normal maternal cells, have been attracting attention as fetal nucleated cells present in maternal blood, making them possible cells to be diagnosed.
  • the research to investigate is becoming active.
  • the abundance ratio of the maternal blood for the entire nucleated cells low as 1/10 5-1 / 10 7, similarly to the fetus cytology that by the lymphocytes, maternal nucleated cells and fetal as leukocytes.
  • the inventors of the present invention have focused on the specific interactions of sugar chains and have been conducting research on them, and have coated sugar chain polymers having various sugar chains on their side chains on the surface of a substrate such as a petri dish.
  • a patent has been obtained for a cell culture substrate in which a lectin having an affinity for the sugar chain is selectively immobilized by covering the substrate (Japanese Patent No. 3139957).
  • Japanese Patent No. 3139957 Japanese Patent No. 3139957
  • the present invention is based on the precise separation and recovery of nucleated erythroblasts (NRBC) using lectins to solve all of the above problems, and is a new blood cell separation system that can be used clinically. It was made with the intention of building.
  • Ryoaki Motomoto used a lectin to precisely separate rare fetal nucleated cells from maternal cells in a limited amount of maternal blood sample, using red in the pretreatment process.
  • the objective is to provide a method for producing test specimens containing cells. Summary of the Invention
  • the blood separation system of the present invention comprises:
  • a primary (coarse) separation means for obtaining a primary (coarse) separation sample by removing mainly anucleated red blood cells, white blood cells and platelets from a blood sample collected from a pregnant woman, and the primary separation means is a maternal blood sample Among the various blood cells contained in, the nucleated cells, such as leukocytes and non-nucleated erythrocytes and platelets, are separated and removed under conditions that minimize the loss of fetal nucleated cells.
  • the secondary separation means wherein the primary separation sample is incubated with a predetermined concentration of lectin on a substrate having a sugar chain polymer immobilized on its surface under conditions for inactivating cells. Then, fetal nucleated cells contained in the primary separation sample are selectively bound to the lectin, and are concentrated and immobilized on the substrate by the interaction of lectin monosaccharide to form a secondary separation sample.
  • sampling means for sampling the secondary separation sample obtained from the secondary separation means is provided, and the sampling means centrifuges the substrate on which the fetal nucleated cells are concentrated and fixed under predetermined conditions. After processing, a test specimen in which fetal nucleated cells derived from maternal blood are present on a substrate at a level that allows for a definitive diagnosis in a state that is advantageous for gene / chromosome testing such as FISH, etc. provide.
  • the blood separation system of the present invention is further provided with a testing means for testing chromosomes and / or genes of fetal nucleated cells contained in the test specimen using the test specimen obtained from the sampling means. preferable.
  • the present invention provides a method for producing a test specimen for prenatal diagnosis of a fetus using the blood cell separation system described above, and an immature cell of the fetus produced by the production method, which is advantageous for gene / chromosome tests such as FISH. It also provides test specimens that are present in a number of levels that allow for a definitive diagnosis in a stable condition.
  • FIG. 1 is a block diagram illustrating the blood cell separation system of the present invention.
  • FIG. 2 is a photomicrograph ( ⁇ 200) showing blood cells immobilized on a sugar chain high molecular weight coated substrate using 300 ⁇ g Zm1 lectin (SBA) from maternal blood.
  • FIG. 3 is a photomicrograph ( ⁇ 200) showing blood cells immobilized on a glycan polymer-coated substrate using 8 ⁇ g / ml lectin (SBA) from maternal blood.
  • FIG. 4 is an enlarged photograph (1,000 times) of the immobilized cells shown in FIG.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view showing an example of a substrate that can be used in the blood cell separation system of the present invention. Description of the preferred embodiment
  • a blood sample used in the system and method of the present invention is obtained from a pregnant woman.
  • a blood collection means a commonly used blood collection device including a syringe, a vacuum blood collection tube, or a blood bag is used.
  • the collected blood may be any blood including venous blood, umbilical cord blood, placental intervillous blood, bone marrow fluid, etc., but peripheral venous blood is preferred from the viewpoint of minimizing invasion of the mother.
  • the blood collection volume is not particularly limited, but is generally about 1 to 1 Oml because of the problem of invasion of the mother.
  • the collected blood sample is preferably added with EDTA, heparin, CPDZACD, etc. in order to prevent coagulation.
  • a blood night sample is preferably used within 24 hours after blood collection, more preferably within 6 hours after blood collection.
  • the blood cell separation system of the present invention includes a primary separation means for mainly removing most of the non-nucleated red blood cells and maternal white blood cells, which are the cell fractions to be removed in the blood sample.
  • a specific gravity centrifugal separation means using a liquid having a specific specific gravity or a filter one separation means is preferably used.
  • the first embodiment of the primary separation means constituting the blood cell separation system of the present invention is a specific gravity centrifugal separation means, wherein sucrose, modified sucrose, glycerol or The specific gravity of liquid defined in a predetermined specific gravity using an existing weighting agent such as colloidal silica having a coating of poly Bulle pyrrolidone, e.g. Pharmacia (Pharmacia) manufactured by Fuikonore 'Nono 0 click (Ficol - Paque) , Fuikoru 'high pack (Ficoll- Hypaque) s Percoll (percall), is needed use, etc. histopaque of Asuka-sigma.
  • an existing weighting agent such as colloidal silica having a coating of poly Bulle pyrrolidone, e.g. Pharmacia (Pharmacia) manufactured by Fuikonore 'Nono 0 click (Ficol - Paque) , Fuikoru 'high pack (Ficoll- Hypaque
  • the specific gravity solution conventionally used for separating blood components from whole blood is set to a specific gravity of 1.077 (Ficoll 'Pack, Histopack 1077, etc.).
  • a specific gravity solution having a specific gravity of 1.077 is used, a part of the fetal nucleated cells such as NRBC is dispersed in the specific gravity solution after centrifugation, and a mononuclear cell is conventionally used.
  • a specific gravity liquid having a specific gravity higher than 1.077 is preferably used as the primary separation means, whereby loss of fetal nucleated cells can be suppressed.
  • the specific gravity centrifugation means of the present invention comprises a centrifuge tube, a specific gravity of 1.077 to 1.105, more preferably 1.080 to 1.095, and still more preferably 1.090 to 1.095 g. m 3 specific gravity solution, and a centrifugal separator.
  • a blood sample collected from a pregnant woman is added to the centrifuge tube containing the specific gravity solution, and the centrifugal separator is preferably used at a rotational speed of 500 to 200 rpm (50 to 800 G). By centrifuging for ⁇ 40 minutes, a primary separation sample can be obtained as a fraction containing a large number of fetal nucleated cells in the upper layer of the specific gravity solution.
  • the primary separation means in this effort may include a Panjung means for further removing mixed leukocytes and the like.
  • This panning method is an example
  • a plate such as a polystyrene dish surface-treated with fetal calf serum (FCS) is used to separate and remove leukocyte components such as monocytes and granulocytes by using non-specific adhesion to the plate. .
  • FCS fetal calf serum
  • a sample may be added to a dish, and after incubation for a predetermined time, cells that do not adhere to the plate may be collected as a suspension. I just need.
  • the dish is preferably made of disposable pull-type plastic, for example, any product including commercially available plastic plate products such as polystyrene dishes manufactured by Nunc, Falcon, Iwaki Pharmaceutical, or Sumitomo Becrite can do.
  • FCS is added to this plate, and left at, for example, 4 ° C. for about 2 hours to cover the surface with the protein in FCS.
  • it is also effective to use a saccharide as a coating agent.
  • PV-Sugars manufactured by Netec Co., Ltd., sales agency: Seikagaku Kogyo
  • a solution of PV-Sugar powder in distilled water of about 10 ⁇ g / m1 to 1000 ⁇ g / m1, more preferably about 50 zg / m1 to 500 ⁇ g / m1 Solutions can be used.
  • this PV-Sugar solution By adding this PV-Sugar solution to the dish and leaving it at room temperature for 30 minutes or more, the PV-Sugar is adsorbed and the dish surface becomes hydrophilic.
  • the sugars that make up PV-Sugar include, as darcos, PV-G (Gnorecose), PV-MA (Maltose), PV-GA (Dalconic acid), PV-CA (Cellobiose), PV-Lam ( Laminaribiose), galactose-based PV-LA (latatose), PV-LAC00H (carboxylated ratatose), PV-MeA (melibiose), others, PV_Man (mannobiose), PV_GlcNAc
  • N-Acetylchitobiose and the like are preferably used, but any carbohydrate, such as a natural polysaccharide, can be used as long as it can efficiently coat the dish surface. These are preferably used because they can be easily coated on a polystyrene dish and have little loss or damage of fetal cells.
  • the carbohydrates that make up the sugar chain-containing polymer material are dalconic acid (PV_GA), melibiose (PV-MeA), and mannose (PV-Man). High leukocytes with reduced fetal cell loss This is advantageous in that the adsorption and removal of water can be realized.
  • PV-Sugar as a coating agent is a synthetic polymer having a separation performance equal to or higher than that of FCS, and is also preferable in that a stable lot is more readily available and easier to store than FCS.
  • panjung is not limited to a plastic plate, and a glass plate or the like may be covered with FCS or PV-Sugar as described above.
  • Panjung can efficiently adsorb and remove platelets contaminating in the process of preparing a blood sample in this manner. In other words, Panjung is effective in pre-removing excess granulocytes, monocytes, and platelets, and thus can be said to be a means contributing to higher precision erythroid separation.
  • a second aspect of the primary separation means constituting the blood cell separation system of the present invention is a filter separation means.
  • This filter separation means is used for general blood component separation.
  • the non-nucleated erythrocyte component having deformability is normally removed through the pores, and the leukocyte component and the fetus-containing component are removed.
  • Components containing erythroblasts, which are nuclear cells, are retained inside or on the top of the filter material.
  • a primary separated sample containing fetal nucleated cells, leukocytes, and the like can be obtained by recovering components retained in the filter with a washing solution or the like. .
  • the filter used here allows the passage of non-nucleated red blood cell components (mean particle size; 7 to 8.5 ⁇ m), but allows the passage of leukocytes (mean particle size 7 to 30 (11) and fetal nucleated cells (mean particle size; 8 to 19 urn) are not particularly limited as long as they are physically or chemically captured and not allowed to pass through.
  • leukocytes mean particle size 7 to 30 (11)
  • fetal nucleated cells mean particle size; 8 to 19 urn
  • Any material can be used, including non-woven fabrics controlled by the fiber diameter / accumulation mode, porous membranes whose pore size is controlled by stretching polymers, beads or sponge-like materials, etc.
  • fluorine-based polymers polysulfone, Ester, Polyvinyl acetal, Polyvinyl alcohol, Polyamide, Polyimide, Polyurethane, Polyacryl, Polystyrene, Polyketone, Silicone, Polylactic acid, Cellulose, Chitosan, Cellulose, Silk
  • An inorganic material such as synthetic or natural polymers such as hemp, hydroxyapatite, glass, alumina, titanium, and metals such as stainless steel, titanium aluminum, etc. to maintain the retention of leukocytes.
  • the pore size of the filter is preferably from 1.0 to 40 xm, more preferably from 2.0 to 20 ⁇ , and even more preferably from about 3.0 to 10 / m.
  • the filter is made of fiber In this case, the fiber diameter is from 1.0 to 30 ⁇ , more preferably from 1.0 to 20 and still more preferably from 1.5 to about L 0 / zm.
  • the material constituting the filter may be a material whose surface is modified, and a material in which the retention of leukocytes is improved without inhibiting the passage of non-nucleated red blood cells can be suitably used.
  • the fetal nucleated cells and leukocytes retained in the filter can be collected by washing the filter.
  • immature nucleated erythroblasts which are fetal nucleated cells, have a tendency to be more easily detached than leukocyte components. Fetal nucleated cells can be recovered preferentially.
  • any of physiological buffers, physiological saline containing infusions and the like, and culture media may be used as long as fetal nucleated cells can be detached.
  • the filter separating means in the separation system of the present invention includes, in addition to the above-mentioned filter and washing liquid, a reservoir for storing the nucleated red blood cell component flowing out of the filter, and a supply pump such as a syringe pump for supplying the washing liquid to the filter. Liquid means or the like may be provided.
  • the sample containing fetal nucleated cells obtained in this way is the primary separated sample in the present invention.
  • the primary separation sample obtained by the filter separation may be subjected to the above-mentioned panning treatment to further reduce the white blood cell count, and may be used as the primary separation sample.
  • the secondary separation means for removing the remaining non-nucleated red blood cells and white blood cells from the primary separation sample obtained as described above and obtaining a secondary separation sample enriched in fetal nucleated cells Is provided.
  • the primary separation sample is incubated with a lectin at a predetermined concentration under conditions for inactivating cells on a substrate having a sugar chain polymer immobilized on a surface thereof, whereby the primary separation sample is obtained.
  • a method in which fetal nucleated cells contained in a separated sample are selectively bound to the lectin and concentrated and immobilized on the substrate by the interaction of lectin monosaccharide (hereinafter referred to as “sugar chain-lectin method”). Is performed.
  • sugar chain-lectin method The details of the sugar chain-lectin method are described in International Publication WO 00/5843.
  • sugar chain polymer used here include polystyrene and the like.
  • a structure in which a sugar chain structure is introduced into a hydrophobic polymer main chain is used.
  • PVLA, PVMA, PVMan PVMeA, PVLAC00H, PVG, PVGlcNac, PVLam and the like described in WO 00/58443 are particularly preferred. Among them, it is preferable to select one having a sugar chain structure recognized by the lectin to be used.
  • the primary separated sample and lectin are incubated under conditions that inactivate the cells, thereby forming a fetal nucleated cell-lectin complex.
  • a complex is formed, and the complex is concentrated and immobilized on the substrate by the interaction between sugar chain and lectin.
  • the lectin to be used is preferably a lectin that recognizes a sugar chain expressed by fetal nucleated cells, for example, a galactose-recognizing lectin such as SBA, PNA, EC Re AlloA, VM, Con A, LcH, PSA, etc.
  • Glucose-recognizing lectins, and mannose-recognizing lectins such as LCA, GNA, and CPA, but are not limited thereto.
  • fetal nucleated cells can be preferentially immobilized, and contaminated maternal leukocytes can be selectively immobilized and not immobilized.
  • the amount of lectin to be added to the primary separation sample containing about 2 ⁇ 10 6 cells is preferably 8 to 35 ⁇ g, more preferably 8 to 32 / ig, Preferably, it is about 10 to 30 Aig.
  • the amount of lectin to be added to the primary separation sample containing about 2 ⁇ 10 6 cells is preferably 10 to 200 ⁇ , more preferably 20 to: L 00 / zg, and still more preferably. Is 30 to 75 ⁇ g.
  • the optimum range of the lectin concentration used varies slightly depending on the substrate material to be used and the type of lectin, but such an optimum concentration may be appropriately determined by those skilled in the art without undue experimentation. It is a choice. '
  • the incubation of the lectin with the cells is carried out under conditions that inactivate the cells, and under these conditions, the above selectivity is obtained.
  • “Conditions for inactivating cells” refers to conditions that reduce the fluidity and spontaneous adhesion of cell membranes, typically at temperatures from 0 ° C or more to less than 37 ° C, preferably It is achieved by adjusting the temperature to 0 to 36 ° C, more preferably 4 to 30 ° C, and still more preferably: to 22 ° C. This condition is not limited to the low-temperature control described above, but can also be achieved by adding a reagent for stopping cell respiration, such as sodium azide, at 37 ° C.
  • the incubation time is not particularly limited, and it is sufficient that at least the cell and the lectin form a cell-lectin complex, but it is typically 0 to 120 minutes, preferably 0 to 90 minutes, and Preferably, it is 0 to 60 minutes.
  • it is typically 0 to 120 minutes, preferably 0 to 90 minutes, and Preferably, it is 0 to 60 minutes.
  • cells are separated by discarding cells adherent to the substrate (fetal nucleated cells that may contain some anucleated red blood cells) ⁇ non-adherent cells (such as leukocytes) as a cell suspension after incubation.
  • fetal nucleated cells that may contain some anucleated red blood cells
  • non-adherent cells such as leukocytes
  • the secondary separation means in the present invention comprises a substrate surface-modified with a sugar chain polymer, and a means for inactivating cells containing a lectin and a reagent such as a cooling device or sodium azide. Then, a fetal nucleated cell is fixed at a high density, and a secondary separation sample from which unnecessary components such as leukocytes are effectively removed is obtained.
  • the substrate in the secondary separation means is a slide plate used in the FISH method or the like, the process from secondary separation to inspection can be performed using one substrate, which is practical. Therefore, when the slide plate used here is subjected to inspection with a microscope, observation with a microscope is impaired. Flasks, dishes, cuvettes, and finolem-shaped materials having a low degree of permeability can be used.However, considering the versatility of microscopes, etc., when performing secondary separation using lectins, the cover shell should be used.
  • a chamber slide which is attached and detaches the cover shell after the secondary separation to dry and fix the attached fetal nucleated cells and facilitates the direct FISH treatment, can be particularly preferably used.
  • the slide portion of the chamber slide contains, for example, an organic material such as polystyrene, polycarbonate, polysulfone, polyurethane, or a vinyl copolymer, and an inorganic material such as glass containing quartz, and is used in the sugar chain-lectin method. Any material which can be coated with the sugar chain-containing polymer to be observed and which can be observed with a microscope can be used.
  • a glass material that is not easily deformed can be more preferably used because an organic solvent treatment is performed at a high temperature in order to naked nuclei the cells fixed on the slide.
  • FIG. 5 shows an example of a substrate used after the secondary separation in the blood cell separation system of the present invention.
  • a chamber is composed of a slide portion (1) forming a bottom surface and a side plate (2) standing upright on the slide portion.
  • a layer (10) of a sugar chain polymer used for secondary separation is provided on the bottom surface of the chamber.
  • the opening of one chamber is closed by a lid (3).
  • the blood cell separation system of the present invention includes a sampling unit that samples the secondary separation sample by centrifugation under predetermined conditions.
  • the sampling means of the present invention comprises a centrifugal processing device for centrifuging the secondary separation sample, and centrifuging the secondary separation sample under a predetermined condition while keeping the substrate. This condition depends on the material of the substrate (slide) used.
  • the substrate is a plastic chamber slide, remove the cell suspension and remove the cover shell.
  • a physiological buffer containing albumin close to a physiological concentration rich in protein is used to prevent the slide surface from drying out immediately. It is preferable to wash with a liquid or FCS and then centrifuge.
  • FCS preferably diluted to 1/2, more preferably 3/5 with distilled water, can be used particularly preferably, because it spreads the adherent cells larger on the plate and facilitates visualization under the microscope. . Any dilution range can be used as long as it does not degrade the cells.
  • 1 ° C to 150 ° G is suitable for pressing the cells onto the plate, and more preferably, 400 ° C to 700 ° G is effective in shortening the centrifugation time.
  • the centrifugation time varies depending on the centrifugal force, but is generally about 1 to 15 minutes. If air-dried directly without centrifugation, the cells often shrink and a beautiful cell image cannot be obtained.
  • a two-stage centrifugation process is performed during the above centrifugation operation: a primary centrifugation with a gentle and gentle centrifugal force and a secondary centrifugation with a strong centrifugal force equal to or more than that.
  • a primary centrifugation with a gentle and gentle centrifugal force and a secondary centrifugation with a strong centrifugal force equal to or more than that.
  • the cell suspension containing non-adherent cells with preferably 1/2, more preferably 3/5 diluted FCS, and to perform primary centrifugation as it is.
  • moderate centrifugation at 10 to 300 G, preferably about 10 to 150 G is suitable, and more preferably at 10 to 50 G, the adherent cells may be detached.
  • the blood cell separation system of the present invention comprises a chromosome and / or a gene of fetal nucleated cells immobilized using a test specimen in which fetal nucleated cells are concentrated and fixed on a substrate (slide) as described above. May be further provided.
  • the inspection means may be, for example, a means for direct fluorescence labeling of nuclear chromosomes by the FISH method and microscopic observation, and aneuploidy depending on the type of probe selected.
  • Chromosomal abnormalities such as (aneuploidy), isochromosome, locus (translocation), deletion (deletion), and reciprocal translocation can be detected.
  • it may be a means for performing a PCR method in which the adhered cells are removed under a microscope by microscopic manipulation or laser dissection to amplify the gene.
  • the amplified gene can be further screened on a gene chip, and the system of the present invention can be applied to various chromosome / gene diagnostic methods.
  • the blood cell separation system of the present invention it is possible to identify rare fetal nucleated cells in maternal blood, which have been difficult to separate and concentrate by specific gravity, identification of surface markers by antibodies, etc. It combines high-precision and high-density separation and concentration by combining primary separation by specific gravity centrifugation under conditions or filter separation with secondary separation based on lectin sugar chain recognition under specific conditions.
  • the rare fetal nucleated cells are directly separated and concentrated on a substrate that can be used for detection of chromosomes and genes in the nucleus, and fixed on the substrate. These cells maintain good cell morphology suitable for gene / chromosome testing.
  • the present invention also provides a method for producing a test sample of fetal nucleated cells that can be directly used for various chromosomal and / or genetic diagnosis tests by using the above-described system, and a test sample produced by the method. Things.
  • the method using the system of the present invention comprises a primary separation step of removing a large amount of unnecessary cell components from rare cells contained in a sample, and a coarsely separated primary cell. And a secondary separation step of separating and concentrating the target rare cells by further removing unnecessary cell components from the separated sample.
  • the secondary separation by the sugar chain-lectin method described above is performed.
  • the method is replaced with a separation method using an antibody specific to a rare cell, such a separation method and system are within the scope of the present invention.
  • the rare cells of interest include fetal nucleated cells (fetal nucleated erythroblasts) contaminated in maternal blood, which can diagnose their condition and abnormalities by chromosome / gene analysis after isolation and enrichment, and after remission. Residual leukemia cells, immature cells in cord blood, and the like may be used.
  • the primary cell separation system provided by the present invention can be concentrated on a slide substrate by selecting a lectin or an antibody used in the secondary separation system. Such cells may be used.
  • the term “fetal nucleated cells” is intended to include all of these rare cells of interest.
  • Example 1 Primary separation by specific gravity centrifugation
  • Histopaque (Sigma) was purchased as a specific gravity centrifugation reagent, and sodium ditrizoate was added thereto to prepare six types of specific gravity liquids whose specific gravity was adjusted to 1.077 to 1.105. Seven cc of venous blood was collected from a pregnant woman at 10 to 20 weeks of gestation and centrifuged (20 ° C, 1500 rpra) on each specific gravity solution for 30 minutes. The cells collected near the interface between the specific gravity solution and the plasma component (upper layer) are collected and washed by centrifugation with a physiological buffer to obtain a primary separated sample from which most of the anucleated red blood cells and platelets have been removed. Was.
  • Samples that had been subjected to primary separation under each specific gravity condition were subjected to secondary separation by the sugar chain-lectin method.
  • a plastic chamber slide (2-well, made by Nargennuk) was used.
  • Sugar polymer coating to the substrate is a PVMeA
  • SBA lectin
  • the cells that were not fixed were discarded as a suspension, the cells fixed on the chamber slide were dried, and Pappenheim staining was performed.
  • the stained cells were observed under a microscope, and the number of fixed and fixed erythroblasts (fetal nucleated cells) isolated on a slide was counted. The results are shown in Table 1.
  • Plastics chamber slides (4 ⁇ L, manufactured by Nargenunc) were treated with FCS or an aqueous solution of 0.01 t% sugar-chain polymer (PV-Sugar) (manufactured by Netec).
  • Sugar chain polymers include gnorecose, maltose, gnoreconic acid, N-acetyl Those having the structure of rudarcosamine, mannose, ratatoose, or melibiose were used.
  • Umbilical cord blood collected after childbirth was subjected to specific gravity centrifugation using a Histopack (d; 1.095) according to a standard method, and cells accumulated near the interface between the Histopack and plasma were collected ( 10 wt
  • the cells were resuspended in RPMI1640 supplemented with% FCS and seeded in the above-mentioned wells whose surface was coated with FCS or a sugar chain polymer, incubated at 37 ° C for 30 minutes, and non-adherent cells were collected as a cell suspension.
  • the cells attached to the wells were identified by the above-mentioned Pappenheim staining to identify their types, and the results are shown in Table 2.
  • Table 2 shows the fraction of red blood cells attached to the surface of the wells coated with various coatings.
  • FCS was selected as a processing agent for reducing the red blood cell fraction loss and for appropriately removing white blood cells, and the processing effect of maternal blood was examined.
  • Specific gravity using a specific gravity solution having a specific gravity of 1.095 The primary separation sample obtained by centrifugation was divided into two parts, And the other was not subjected to any treatment, and subjected to secondary separation by the sugar chain-lectin method under the same conditions as in Example 1. Table 3 shows the results. Table 3
  • the ratio of red blood cells / white blood cells per slide in Table 3 indicates the leukocyte removal rate in the secondary separation, and the number of erythroblasts detected on the slide indicates the efficiency of erythroblast recovery in the secondary separation. Show. Specifically, the results of counting the adherent cells under a microscope were shown as the relative ratio (multiple) between the case without panjung and the case with panjung. From Table 3, it is clear that Panjung improves the selective separation and enrichment effect of erythroblasts in the sugar chain-lectin method. This is because panning removes excess leukocytes, allowing cells to adhere via lectin (erythroblasts) to efficiently interact with lectin and reduce adhesion errors. This is presumed to be due to a synergistic effect of a decrease in erythroid miscount due to a decrease in nucleated cells other than blasts.
  • Example 2 coarse separation was performed using a filter provided with a polyester nonwoven fabric having an average pore size of about 8 ⁇ m. Collected maternal blood with lwt% BSA The mixture was diluted with a physiological buffer solution and passed through a filter by gravity. Next, the buffer alone was similarly passed through the filter to rinse the remaining red blood cells in the filter. Thereafter, the buffer solution was back-flushed with a syringe pump, and non-adherent cells not passing through the filter were collected. The cell fraction that did not pass through the filter but did not adhere strongly to the filter was used as the primary separation sample, and the secondary separation was performed by the sugar chain-lectin method. Table 4 shows the results of the primary separation samples obtained from the above filters as relative ratios (multiples) to the results obtained when the cell fraction recovered by FCS Panjung was subjected to the secondary separation by the sugar chain-lectin method. Table 4
  • the erythrocyte / leukocyte ratio per slide visual field (removal rate of leukocytes in the secondary separation), and the number of erythroblasts detected on the slide (erythroblasts in the secondary separation)
  • the efficiency of selective separation and enrichment of erythroblasts by the sugar chain-lectin method is clearly improved by the filter treatment. It is presumed that the primary separation by the filter was based on the fact that the non-nucleated red blood cells having deformability were filtered by the filter, and the cells not passed or trapped by the filter were collected by washing the filter. As a result, it was shown that the erythroblast loss was further suppressed by the filter method as a primary separation method than by the specific gravity centrifugation method. Erythrocyte / leukocyte selectivity was only slightly improved, but this was due to the removal of non-nucleated erythrocytes remaining in the filter by washing.
  • Example 4 Centrifugation in sampling
  • FCS was used as a stock solution (1/1) and a solution diluted 1/2 with distilled water. After secondary centrifugation, the slide was air-dried at room temperature. The cells on the slide were stained with Pappenheim, and the respective staining attitudes were compared. Table 5 shows the results. Table 5
  • nucleated erythroid cells which are fetal nucleated cells that are contained in only a very small amount in maternal blood
  • processing can be performed on one substrate from the secondary separation step to the sampling step, and a test sample suitable for chromosomal gene diagnosis can be obtained.
  • Specimens can be applied directly to testing methods such as the FISH method. Therefore, birth without invading the mother A test specimen of fetal nucleated cells having high clinical value in pre-diagnosis can be manufactured simply and at low cost.

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Description

明細書 血液細胞分離システム 発明の属する技術分野
本発明は、 レクチンを用いた血液細胞の分離システム、 特に、 妊婦の母体末 梢血、 臍帯血等に含まれる胎児の有核細胞である有核赤芽球を含有する試料か ら無核赤血球や成熟白血球を効率よく除去し、 胎児由来の有核赤芽球を分離濃 縮し、 さらには、 その染色体や遺伝子を検査するためのシステムに関する。 従来の技術
遺伝診断学の分野では、 胚、 すなわち胎児に危険を及ぼさない出生前診断法 の開発が長年待ち望まれてきた。 現在、 臨床応用されている遺伝診断法は、 羊 水穿刺、 絨毛採取、 胎児採血といった侵襲的方法であり、 特に羊水穿刺による 胎児細胞の採取は、 確定診断が可能であるものの、 約 1/300という高い確率で の流産のリスクを伴う。
また、 母体末梢血中に存在する A F P ( a -fetoprotein；胎児性血清タンパ ク質） 、 h C G (コリォゴナドトロピン（chorionic gonadotropin；絨毛' I"生'『生 腺刺激ホルモン）、 u E 3 (uric Estriol 3；卵胞ホルモンで胎児-胎盤機能検 査で使用される、 妊娠時は胎児副腎から分泌される） 、 インヒビン A (性腺ホ ルモンの一種） などの母体血清生化学マーカー（Maternal Serum Biochemical Markers)の変動から胎児異常を予測する方法は、 非侵襲的であるという点で優 れているが、 羊水穿刺の必要性を示唆するスクリーニング法であり確定診断と はなり得ない。
一方、 母児間血液型不適合の臨床研究から、 胎児由来細胞が母体循環系に混 入することが明らかとなった。 よって、 母体血中に混入した胎児細胞を単離す ることができ、 かつ、 それらが有核細胞であれば、 安全で確定的な胎児診断と して、 その D N Aや染色体を利用することができる。 1969年、 ¾lknowskaら は、 母体末梢血リンパ球の培養を行ったところ、 男児妊娠 30人中 21人に 46XY の核型を見いだしたと報告した。 しカゝし、 同じリンパ球の集団から Y染色体を 有するリンパ球を見いだすのは極めて困難な作業であり、 それらを分離 ·濃縮 するためにナイロンウールカラム法、 比重遠心分離法などが試みられたが実用 性を見いだすことはできなかった。 また、 過去の妊娠時から残留する胎児細胞 などの存在も問題視され、 目的とする新生胎児の検査を可能とする安全な確定 的胎児診断の開発は進まなかった。
近年、 ライフサイクルが短く正常な母体には殆ど存在しない細胞である有核 赤芽球が、 母体血液中に存在する胎児有核細胞として注目され、 診断対象の細 胞としての可能 1·生を調べる研究が活発化してきた。 しかしながら、 母体血中の 存在比が有核細胞全体に対し 1/10 5〜1/107と極めて低いので、 リンパ球によ る胎児細胞診断と同様に、 白血球等の母体有核細胞と胎児の有核赤芽球とを分 離して多くの赤芽球を検出する点に技術上の困難性が存在する。
これまでに、 トランスフェリンレセプター抗体などを利用したフローサイト メトリーや磁気ビーズによる赤芽球分離が試みられたが、 抗体の特異性などの 問題により Y染色体を有する赤芽球を効率よく検出するには至っていない。 これに対し、 細胞分離を行わず、 この赤芽球を形態学的に判別してマイクロ マニピュレーションで 1個ずつ拾い上げる採取方法がある力 圧倒的多数の母 体有核細胞の中から赤芽球を識別するために技術的な習熟と極めて長 、採取時 間を要する。 即ち、 この方法には特殊な装置が必要で、 例えば 1検体を処理す るために数 Sを要することとなる。 現状では、 l ccの母体末梢血からせいぜい 約 1個の赤芽球が検出される程度である。 しかしながら、 統計的に確定的な遺 伝子 ·染色体検査を行うための汎用的かつ実用的な胎児検査法とするためには 最低でも 30個の胎児細胞が必要であるとされており、 妊婦からの採血量が 高々 10 ccであることに鑑みるとこの採取方法は現実的ではなく、 回収率が高 く簡便で迅速な赤芽球の分離■濃縮法が今も強く望まれている。
本発明者らは、 従来から糖鎖が有する特異的相互作用に着目し研究を行って きており、 種々の糖鎖を側鎖に有する糖鎖高分子をシャーレ等の基材表面に被 覆することにより、 その糖鎖に親和性を有するレクチンを選択的に固定ィ匕した 細胞培養基材について特許を取得している （特許第 3 1 3 9 9 5 7号） 。 さら にレクチンを利用した分離方法によれば、 赤芽球以外に幼弱な造血細胞の分離 濃縮が可能となり、 特に胎児有核細胞の検出が 10-30個程度まで可能になるこ とを見出した （国際公開 WO O O Z 5 8 4 4 3公報） 。
一方、 赤芽球等の血液細胞の分離回収に際しては、 まず始めに比重遠心法を 用いた末梢血の前処理が一般的に行われているが、 この比重遠心法による前処 理の段階で赤芽球の損失が生じていることがわかった。 例えば、 有核赤芽球の 比重は 1. 077〜1. 095程度で変化し、 一定比重の高比重液 （フイコール等） を 使用した場合に赤芽球がフイコール上層又はフイコール下層の赤血球層からも 検出される場合があり、 比重遠心法で単純に分離すると貴重な赤芽球を失うこ とにもなつていた。 これは、 胎児性へモグロビンを有し本来脱核しようとして V、る胎児赤芽球の比重が曖昧であるためと推測される。
さらに、 そのようにして分離精製した有核赤芽球の染色体異常等を知るため には F I S H (Fluorescence in situ Hybridization)法等による検査に供する 必要があるが、 当該検査に適した標本試料を作製する工程において克服しなけ ればならな 、実用上の問題も生じていた。
よって本発明は、 上記の諸問題を悉く解消すべく、 レクチンを利用した有核 赤芽球 （N R B C ) の精密な分離回収を基本とし、 臨床的に実用に供しうる新 たな血液細胞分離システムを構築することを意図してなされたものである。 即 ち本亮明は、 制限された量の母体血液試料中の希少な胎児由来の有核細胞を母 体由来の細胞からレクチンを利用して精密に分離するに当たり、 その前処理工 程における赤芽球損失を極力抑制し、 対象とする胎児の幼若細胞や N R B Cを 選択的かつ高収率で分離、 濃縮及ぴ回収するシステムを提供すること、 並びに そのシステムを利用して分離回収した胎児細胞を含む検査標本の製造方法を提 供することを目的とする。 発明の概要
本発明の血液分離システムは、
( 1 ) 妊婦から採取した血液試料から、 主に無核赤血球、 白血球及び血小板 を除去して一次 （粗） 分離試料を得る一次 （粗） 分離手段を備え、 当該一 次分離手段は母体血液試料に含まれる種々の血液細胞の内、 胎児有核細胞 を極力損失しない条件で、 主に有核細胞である白血球と無核赤血球及び血 小板等の細胞を分離■除去し、
( 2 ) 前記一次分離手段で得られた一次分离! ^料から、 残存する白血球を優 先的に除去し、 胎児有核細胞を濃縮した二次 （精密） 分離試料を得る二次 (精密） 分離手段を具備し、 当該二次分離手段は、 前記一次分離試料を、 表面に糖鎖高分子を固定化した基板上で、 細胞を不活性化する条件下にお いて所定濃度のレクチンと共にインキュベートすることにより、 前記一次 分離試料に含まれる胎児有核細胞を、 前記レクチンと選択的に結合させ、 レクチン一糖鎖の相互作用によって前記基板上に濃縮固定化して二次分離 試料とし、 及ぴ
( 3 ) 前記二次分離手段から得た二次分離試料を標本化する標本化手段を具 備し、 当該標本化手段は、 前記胎児有核細胞を濃縮固定化した基板を所定 の条件で遠心処理し、 母体血由来の胎児有核細胞が基板上に、 F I S H等 の遺伝子/染色体検査にとって有利な状態で、 力、つ、 確定的な診断が可能な レベルの数で存在する検查標本を提供する。
本宪明の血液分離システムは、 上記標本化手段から得られた検査標本を使用 して当該標本に含まれる胎児有核細胞の染色体及び/又は遺伝子を検査する検 查手段を更に具備するのが好ましい。
さらに本発明は、 上記の血液細胞分離システムを用いた胎児の出生前診断用 検査標本の製造方法並びに当該製造方法で製造され、 胎児の未成熟細胞が F I S H等の遺伝子/染色体検査にとつて有利な状態で、 確定的な診断が可能なレ ベルの数で存在する検査標本も提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 本 明の血液細胞分離システムを例示するプロック図である。
図 2は、 母体血から 3 0 0 μ g Zm 1のレクチン （S B A) を用いて糖鎖高 分子被覆基板上に固定ィヒされた血液細胞を示す顕微鏡写真 （200倍） である。 図 3は、 母体血から 8 μ g /m 1のレクチン （S B A) を用いて糖鎖高分子 被覆基板上に固定化された血液細胞を示す顕微鏡写真 （200倍） である。
図 4は、 図 3に示した固定化細胞の拡大写真 （1, 000倍） である。
図 5は、 本発明の血液細胞分離システムで使用できる基板の一例を示す断面 図である。 好ましい実施態様の説明
以下、 本発明について詳細に説明する。
まず本発明のシステム及び方法に使用される血液試料は妊婦から採取される。 採血手段としては、 シリンジ、 真空採血管、 又は血液バッグ等を含む通常使用 されている採血器具が用いられる。 採取される血液は、 静脈血、 臍帯血、 胎盤 の絨毛間血液、 骨髄液等を含む如何なる血液でもよいが、 母体への侵襲を可能 な限り少なくするという観点から末梢静脈血が好ましい。 採血量は特に制限は 無いが、 やはり母体への侵襲の問題から一般的には 1〜1 O m l程度とする。 採取した血液試料は、 凝固を防止するために E D T A、 へパリン、 C P DZA C D等を添加しておくのが好ましい。 なお、 良好な結果を得るためには、 血夜 試料は、 好ましくは採血後 24時間以内、 より好ましくは採血後 6時間以内の ものを使用する。
本発明の血液細胞分離システムは、 上記の血液試料中の除去対象の細胞分画 である、 大部分の無核赤血球と母体白血球を主に除去する一次分離手段を具備 する。 具体的には、 この一次分離手段としては、 特定の比重を有する液体を用 いた比重遠心分離手段あるいはフィルタ一分離手段が好ましく用いられる。
本発明の血液細胞分離システムを構成する一次分離手段の第 1の態様は比重 遠心分離手段であり、 ここでは、 ショ糖及び修飾ショ糖、 グリセロールあるい はポリビュルピロリ ドンの被膜をもつコロイド状シリカ等の既存の比重調整剤 を用いて所定の比重に規定した比重液、 例えばフアルマシア（Pharmacia)社製 のフイコーノレ 'ノヽ0ック （Ficol - Paque) 、 フイコール 'ハイパック（Ficoll— Hypaque) s パーコール (percall)、 ァスカ ·シグマ社製のヒストパック等が用 いられる。 全血からの血液成分分離に従来から一般的に使用されている比重液 は、 比重 1. 077に設定されている （フイコール 'パック、 ヒストパック 1077 等） 。 この場合、 遠心処理した後に、 比重の高い顆粒球及び赤血球が比重液の 下層に、 白血球等のリンパ球及ぴ単球が比重液の上層に分離される。 しかしな がら、 本発明者等は、 この比重 1. 077の比重液を使用した場合、 遠心後に N R B C等の胎児有核細胞の一部が比重液中に分散し、 従来のように単核球を含む 層のみを採用するのでは希少な胎児有核細胞がかなり損失されることを見出し た。 よって、 本発明の分離システムでは、 一次分離手段として、 好ましくは 1. 077より高い比重を持つ比重液を使用することとし、 それにより胎児有核細 胞の損失を抑制することができる。
後述の実施例で示すように、 比重液の比重を高くするのに伴い胎児有核細胞 の回収率は向上するが、 それと同時に不要な白血球の混入も増加する。 しかし ながら本発明では、 次に述べる任意のパンニング手段、 さらに糖鎖ーレクチン 相互作用を利用した二次分離手段を備えているため、 混入した白血球を分離除 去して、 より多くの胎児有核細胞を回収することができる。 従って、 本発明の 比重遠心手段は、 遠心チューブ、 当該遠心チューブに入れられる比重 1. 077〜 1. 105、 より好ましくは 1. 080〜1. 095、 更に好ましくは 1. 090〜1. 095gん m3の 比重液、 並びに遠心分離装置を備えている。 前記比重液を入れた遠心チューブ に妊婦から採取した血液試料を添加して、 遠心分離装置で好ましくは 5 0 0〜 2 0 0 O rpm ( 5 0〜8 0 0 G) の回転数で 2 0〜 4 0分間遠心処理すること により、 比重液の上層に多数の胎児有核細胞を含む画分として一次分離試料を 得ることができる。
本努明における一次分離手段は、 場合によっては、 混入した白血球等をさら に除去するパンユング手段を具備していてもよい。 このパンニング手段は、 例 えばゥシ胎児血清 （F C S ) で表面処理されたポリスチレンディッシュ等のプ レート等を備え、 当該プレートに対する非特異接着を利用して単球、 顆粒球等 の白血球成分を分離■除去するものである。
パンニングの具体的手法は当該分野で従来から用いられているものでよく、 例えば、 ディッシュ上に試料を添カ卩し、 所定時間インキュベートした後にプレ ートに接着されない細胞を懸濁液として回収すればよい。
ディッシュはデイスポーザプルタイプのプラスティック製が好ましく、 例え ば、 ヌンク社、 ファルコン社、 岩城製薬社、 又は住友べ一クライト社製のポリ スチレンディッシュ等の市販プラスティックプレ一ト製品を含む如何なるもの でも使用することができる。 このプレートに F C Sを添加し、 例えば 4°C下、 2時間程度放置し表面を F C S中のタンパク質で被覆する。 このことによって、 疎水的なプラスティック表面が親水的になるが、 F C S中のタンパク質成分が 変成する 37°C以上や凍結温度などを使用しなければ、 いかなる条件を用いても かまわない。 この他、 被覆剤として糖質を用いることも有効で、 特にプラステ イツク表面へのコーティングが容易な PV- Sugar類 （ネーテック社製、 販売 元：生化学工業） が好適に用いられる。 コーティングには、 PV- Sugar粉体を蒸 留水に溶かした 10 μ g /m 1〜1000 μ g /m 1程度の溶液、 より好ましくは 50 z g /m 1〜500 μ g /m 1程度の溶液が用いられ得る。 この PV- Sugar溶液 をディッシュに添加し、 室温で 30分以上放置することで、 PV - Sugarが吸着し てディッシュ表面が親水化する。 PV- Sugarを構成する糖質としては、 ダルコ一 ス系として、 PV-G (グノレコース） 、 PV-MA (マルトース) 、 PV-GA (ダルコン 酸） 、 PV-CA (セロビオース） 、 PV - Lam (ラミナリビオース） 、 ガラクトース 系として PV-LA (ラタトース） 、 PV-LAC00H (カルボキシル化ラタトース） 、 PV-MeA (メリビオース） 、 その他、 PV_Man (マンノビオース） 、 PV_GlcNAc
(N -ァセチルキトビオース） などが好適に用いられるが、 効率よくディッシュ 表面を被覆することができる糖質であれば、 天然の多糖類などいかなるもので あってもかまわない。 これらはポリスチレンディッシュに対するコーティング が容易で、 胎児細胞の損失やダメージが少ないことから好適に使用される。 特 に、 糖鎖含有高分子材料を構成する糖質が、 ダルコン酸 (PV_GA)、 メリビオー ス（PV- MeA)やマンノース（PV- Man)であるものが、 胎児細胞の損失が抑制され高 い白血球の吸着除去が実現されるという点で有利である。 被覆剤としての PV - Sugarは F C Sと同等以上の分離性能を持つ合成高分子であると共に、 F C S に比べ安定なロットが入手しやすく、 保存が容易であるなどの点でも好ましい。 この親水化されたディッシュに比重遠心後の一次分離試料を添加し、 5分以 上放置することによって白血球成分を優先的にディッシュ表面に付着させるこ とができるが、 好ましくは 15分から 2時間程度放置することで好適な白血球 付着除去を達成することができる。 放置する場合、 一次分離試料に含まれる細 胞が死滅しない如何なる温度も使用することができるが、 白血球の能動的な付 着を誘導しやすい 18°C〜37°Cが好適に用いられ得る。
なお、 パンユングに使用されるのはプラスティックプレートに限られず、 ガ ラスプレート等を上述のように F C S又は PV- Sugar等で被覆して使用するこ ともできる。
概して、 妊婦検体によっては比重遠心分離後の血液試料に多量の血小板が混 入する場合があり、 このような多量の血小板は、 後述の二次分離において多量 のレクチンを結合させ、 赤芽球の分離精度に影響する可能性がある。 し力 しな がら、 パンユングは、 このように血液試料の調製過程で混入する血小板も効率 よく吸着 '除去することができる。 即ち、 パンユングは余剰の顆粒球■単球及 び血小板のプレ除去に有効であることから、 より高い精度の赤芽球分離に寄与 する手段であるといえる。
このパンユング手段により、 上記の比重遠心手段で得られた一次分離試料か ら、 接着性が極めて高く比重や粒径が極端に小さい血小板も自動的に検出限界 以下に除去され、 一部の無核赤血球とリンパ球等の白血球が僅かに残存する胎 児有核細胞リツチな試料とすることができ、 これを本発明の分離システムにお ける一次分離試料としてもよい。
本発明の血液細胞分離システムを構成する一次分離手段の第 2の態様はフィ ルター分離手段である。 このフィルター分離手段は、 一般の血液成分分離に使 用される所定の孔径を持つ多孔性フィルターを備え、 当該フィルターに血液試 料を通すことにより、 通常は、 変形能を有する無核赤血球成分は孔を通過して 除去され、 白血球成分及び胎児有核細胞である赤芽球を含む成分はフィルタ一 素材内部あるいは上部に滞留されるものである。 ここで、 フィルター内に滞留 した成分を洗浄液等によって回収することにより、 胎児有核細胞及び白血球な どを含む一次分離試料が得られる。 .
ここで使用されるフィルターは、 無核赤血球成分 （平均粒径； 7〜8. 5 μ m) は通すが、 白血球 （平均粒径 7〜30 (11) 及び胎児有核細胞 （平均粒径； 8~ 19 u rn) は物理的又は化学的に捕捉して通過させないものであれば、 特に限定 されるものではないが、 例えば、 回収対象である有核赤芽球のグループの中で も最も可能性が高い約 8 μ πιの最小粒径を持つ正染性赤芽球が捕捉され、 変形 能によつて無核赤血球が通過できる範囲の孔径を持つものであれば、 フィルタ 一を構成する繊維の径ゃ集積様式によつて制御された不織布、 高分子を延伸す ることによって孔径を制御された多孔膜、 ビーズ又はスポンジ状材料等を含む 如何なるものも使用されうる。 フィルターの素材は特に限定されず、 フッ素系 ポリマー類、 ポリスルホン系、 ポリエステル系、 ポリビニルァセタール系、 ポ リビエルアルコール系、 ポリアミド系、 ポリイミ ド、 ポリウレタン系、 ポリア クリル系、 ポリスチレン系、 ポリケトン系、 シリコーン系、 ポリ乳酸系、 セル ロース系、 キトサン系、 セルロース系、 絹、 麻などの合成又は天然高分子ある いはヒドロキシァパタイト、 ガラス、 アルミナ、 チタエア、 及びステンレス、 チタンアルミ二ゥム等の金属といった無機材料で、 白血球の滞留性を保持させ るため白血球に対する接着性がある程度維持されているものであればよい。 特 に、 ナイロン等のポリアミ ド、 ポリエステ^^、 ポリウレタン、 ポリエチレン、 ポリプロピレン、 アタリノレ、 ポリスチレン、 ポリカーボネート、 セルロース、 ヒドロキシァパタイトなどがコスト及び製造面の点で好ましい。 フィルターの 孔径は、 好ましくは 1 . 0〜4 0 x m、 より好ましくは 2 . 0〜2 0 μ ΐη、 さ らに好ましくは 3 . 0 ~ 1 0 / m程度であり、 フィルタ一が繊維で構成される 場合の繊維径は 1 . 0〜3 0 μ πι、 より好ましくは 1 . 0〜2 0さらに好まし くは 1 . 5〜： L 0 /z m程度とする。
また、 フィルターを構成する上記の素材は、 その表面を修飾したものでもよ く、 無核赤血球の通過性を阻害せず白血球の滞留性を向上させたものが好適に 使用できる。 フィルター内に滞留した胎児有核細胞及ぴ白血球は、 フィルター を洗浄することにより回収することができる。 例えば、 胎児有核細胞である未 成熟な有核赤芽球は白血球成分より脱着されやすい傾向を有するため、 例えば フィルターに血液試料濾過時と逆方向から洗浄液を通液することにより、 目的 とする胎児有核細胞を優先的に回収することができる。 ここで使用される洗浄 液としては、 胎児有核細胞を脱着できれば生理的緩衝液類、 輸液などを含む生 理食塩水類、 培地類などの何れを用いてもよい。
従って、 本発明の分離システムにおけるフィルター分離手段は、 上記のフィ ルター及び洗浄液に加えて、 フィルターから流出した無核赤血球成分を貯蔵す る液溜め、 フィルターに洗浄液を供給するシリンジゃポンプ等の給液手段など を備えていてもよい。 このようにして得られた胎児有核細胞を含む試料を本発 明における一次分離試料とする。
なお、 フィルタ一分離された一次分離試料に対して上述のパンニング処理を 施して白血球数を更に減少させ、 それを一次分離試料としてもよい。
本発明の血液細胞分離システムでは、 上記のようにして得られた一次分離試 料から残存する無核赤血球及び白血球を除去し、 胎児有核細胞を濃縮した二次 分離試料を得る二次分離手段を具備する。 この二次分離手段では、 前記一次分 離試料を、 表面に糖鎖高分子を固定化した基板上で、 細胞を不活性化する条件 下において所定濃度のレクチンと共にィンキュベートすることにより、 前記一 次分離試料に含まれる胎児有核細胞を、 前記レクチンと選択的に結合させ、 レ クチン一糖鎖の相互作用によって前記基板上に濃縮固定ィ匕する方法 （以下 「糖 鎖ーレクチン法」 と称する） が実施される。
糖鎖ーレクチン法の詳細については、 国際公開 WO O 0 / 5 8 4 4 3号公報 に記載されている。 ここで使用される糖鎖高分子としては、 ポリスチレン等の 疎水性高分子主鎖に糖鎖の構造を導入したものが用いられ、 例えば、 国際公開
WO 00/58443号公報に記載されている PVLA、 PVMA、 PVMan PVMeA、 PVLAC00H、 PVG、 PVGlcNac、 PVLam等が特に好ましい。 中でも、 使用するレクチ ンに認識される糖鎖構造を有するものを選択するのが好ましい。
■ これらの糖鎖高分子で表面修飾された基板上において、 前記一次分離試料と レクチンとを、 細胞を不活性ィヒする条件下においてィンキュベーシヨンして胎 児有核細胞ーレクチンの複合体を形成し、 当該複合体を糖鎖一レクチンの相互 作用によつて基板上に濃縮固定化する。
使用されるレクチンとしては、 好ましくは胎児有核細胞が表現している糖鎮 を認識するもの、 例えば、 SBA、 PNA、 ECレ AlloA、 VM等のガラクトース認識 性レクチン、 Con A、 LcH、 PSA等のグルコース認識性レクチン、 LCA、 GNA、 CPA 等のマンノース認識性レクチンが挙げられるが、 これらに限られるものではな い。 ここで、 レクチンの添加量を調節することにより、 胎児有核細胞を優先的 に固定化し、 混入した母体由来の白血球は固定化しないという選択的な精密分 離が可能となる。 具体的には、 プラスティック基板を用いた場合、 細胞 2 x 1 06個程度を含む一次分離試料に対するレクチンの添加量は、 好ましくは 8〜 35 μ g、 より好ましくは 8〜32/i g、 さらに好ましくは 10〜3 0 Ai g程 度とする。 また、 ガラス基板を用いた場合は、 細胞 2 X 106個程度を含む一 次分離試料に対するレクチンの添加量は、 好ましくは 10〜200 §、 より 好ましくは 20〜： L 00 /z g、 さらに好ましくは 30〜 75 μ gとする。 この ように、 採用する基板の素材ゃレクチンの種類に応じて、 使用されるレクチン 濃度の至適範囲は若干変化するが、 そのような至適濃度は当業者が過度の実験 をすることなく適宜選択しうるものである。 '
ちなみに、 母体血からレクチン （SBA) を使用して糖鎖高分子 （PV-L A) 被覆した基板上に血液細胞を固定ィヒするに当たり、 300 x g/m lのレ クチンを使用した場合には、 図 2の顕微鏡写真に示されるように、 母体血に含 まれる白血球など （濃く染色された細胞） が多数混入しているが、 8/x gZm 1のレクチンを使用した場合には、 図 3及び図 4の顕微鏡写真に示されるよう に、 白血球などの不要細胞は殆ど存在せず、 赤血球細胞のみが選択的に固定化 された。
なお、 レクチンと細胞とのインキュベーションは、 細胞を不活性化する条件 下において実施され、 この条件下で上記の選択性が得られるのである。 「細胞 を不活性化する条件」 とは、 細胞膜の流動性及び自発的粘着力を低下させる条 件を意味し、 典型的には、 温度を 0 °C以上〜 3 7 °C未満、 好ましくは 0〜 3 6 °C、 より好ましくは 4〜3 0 °C、 さらに好ましくは ：〜 2 2 °Cに調節するこ とによって達成される。 し力、し、 この条件は、 前記低温調節に限られるもので はなく、 例えば、 3 7 °Cにおいてアジ化ナトリゥムなどの細胞呼吸を停止させ る試薬を添加させることによつても達成できる。
また、 このインキュベーション時間は特に限定されず、 少なくとも細胞とレ クチンとが細胞-レクチン複合体を形成すれば良いが、 典型的には 0〜1 2 0 分間、 好ましくは 0〜9 0分、 さらに好ましくは 0〜6 0分とする。 ただし、
「 0分」 とは、 一次分離試料とレクチンとを混合した直後に次の工程に移行す ることを意味する。
この二次分離では、 インキュベーションの後に基板に対する付着細胞 （一部 の無核赤血球を含み得る胎児有核細胞） ヽ 非付着細胞 （白血球など） を細胞 浮遊液として廃棄することにより分離される。
従って、 本 明における二次分離手段は、 糖鎖高分子で表面修飾された基板 及びレクチン並びに冷却装置やアジ化ナトリゥムといった試薬を含む細胞を不 活性化する手段とを備え、 その結果、 基板上に胎児有核細胞が高密度で固定ィ匕 され、 白血球等の不要成分が有効に除去された二次分離試料が得られる。
本発明の血液細胞分離システムでは、 前記二次分離試料を下記の標本化手段 によって標本化した後に、 最終的に F I S H法等を用いた遺伝子/染色体検査 に供される。 従って、 前記二次分離手段における基板を F I S H法等で使用さ れるスライドプレートとすれば、 1枚の基板を使用して二次分離から検査まで の工程を実施することができ実用的である。 よって、 ここで用いられるスライ ドプレートとしては、 顕微鏡による検査に供する場合は、 顕微鏡観察を損なわ ない程度の透過度を有する、 フラスコ、 ディッシュ、 キュベット、 フイノレム状 のものを用いることができるが、 顕微鏡などに関して汎用性を考慮すると、 レ クチンを用いた二次分離を実施する時はカバーシェルが装着されていて、 二次 分離後はカバーシェルを脱着し付着した胎児有核細胞を乾燥'固定化し、 直接 F I S H処理を容易にするチャンバースライドが特に好適に使用されうる。 チャンバースライ ドのスライ ド部分は、 例えばポリスチレン、 ポリカーポネ ート、 ポリスルホン、 ポリウレタン、 ビニル系共重合体等の有機材料、 並びに 石英を含むガラス類といった無機材料を含み、 前記糖鎖一レクチン法で使用さ れる糖鎖含有高分子がコーティングされ得る如何なる顕微鏡観察が可能な素材 も使用することができる。 また、 F I S H処理に供する場合には、 スライド上 に固着した細胞を裸核するために高温で有機溶媒処理を施すので、 変形しにく いガラス素材がより好適に用いられ得る。
本発明の血液細胞分離システムにおける二次分離以降で使用される基板の一 例を図 5に示した。 図 5に示した基板は、 底面をなすスライド部分 （1 ) と、 当該スライド部分に垂直に立てられた側板 （2 ) とからチャンバ一が構成され ている。 チャンバ一底面には、 二次分離で使用される糖鎖高分子の層 （1 0 ) が設けられている。 チャンバ一の開口部は、 蓋 （3 ) により閉塞できるように されている。
本発明の血液細胞分離システムは、 前記二次分離試料を所定の条件で遠心処 理して標本化する標本化手段を具備する。
一般に、 染色体解析等のための細胞標本をスライドガラス上に作製する際に は、 細胞懸濁液をピペッティングし、 スライド上に滴下して風乾させる、 細胞 を含む試料をスラィド上に擦りつけて乾燥させ塗抹標本とするといった手法が 用いられている （例えば、 特開平 7 - 2 7 6 8 2号公報参照） 。 しかし本発明 者らは、 前記二次分離試料からスライド上に検査に適した良好な形状で細胞を 固着させるためには特殊な遠心処理条件を採用することが必要であることを初 めて見出した。 よって、 本発明の標本化手段は、 前記二次分離試料を遠心処理する遠心処理 装置を備え、 前記二次分離試料を、 その基板のまま所定条件で遠心処理する。 この条件は、 使用する基板 （スライド） の材質によって異なる。
基板がブラスティック製チャンバースライドの場合、 細胞浮遊液を廃棄した 後にカバーシェルを脱着するが、 スライド表面がすぐに乾燥しないようタンパ ク質を豊富に含む生理的濃度に近いアルプミンを含む生理的緩衝液や F C Sで 洗浄してから遠心することが好ましい。 さらに蒸留水で好ましくは 1/2、 より 好ましくは 3/5に希釈された F C Sは、 固着細胞をプレート上でより大きく広 げ、 顕微鏡上での視認を容易にするので特に好適に使用されうる。 この希釈範 囲は、 細胞を分解しない程度のものであれば、 如何なる範囲も使用され得る。 遠心力は、 1◦ 0〜 1 5 0 O Gが細胞をプレート上に圧着するのに好適で、 より好ましくは 4 0 0〜 7 0 0 Gが遠心時間を短縮する上で有効である。 遠心 時間は遠心力によって変化するが一般的には 1〜1 5分間程度とする。 遠心処 理を施さないで直接風乾させると、 細胞が萎縮して美しい細胞像が得られない ことが多い。
一方、 ガラス製のチャンバースライドを用いる場合は、 上記遠心操作に際し、 穏、やかな遠心力での一次遠心と、 それと同等以上の強い遠心力での二次遠心と いう 2段階の遠心処理を施すのが好ましい。 また、 カバーシェルを脱着させる 前に好ましくは 1/2、 より好ましくは 3/5希釈 F C Sで非付着細胞を含む細胞 懸濁液を置換し、 そのまま一次遠心処理を施すのが好ましい。 この一次遠心は 1 0〜3 0 0 G、 好ましくは 1 0〜 1 5 0 G程度の緩やかな遠心が好適であり、 より好ましくは 1 0〜5 0 Gとすることで付着細胞が脱着したり圧着の際に細 胞が変形することを更に抑制できる。 次いで、 カバーシェルを脱着して二次遠 心処理を施すと、 検査により適した固着細胞像を得ることができる。 二次遠心 としては 2 5〜 3 0 0 G、 好ましくは 3 0〜2 0 0 G、 より好ましくは 3 5〜 1 3 0 Gの遠心力とすることにより、 変形のない固着細胞像が得られる再現性 が更に向上する。 以上のように、 スライド基板の材質によって異なる特定の条件に従って遠心 処理することにより、 胎児有核細胞が良好な形態で固定化されたスライド基板 からなる検査標本が得られる。
本発明の血液細胞分離システムは、 上記のように基板 （スライド） 上に胎児 有核細胞が濃縮固定された検査標本を使用して固定化された胎児有核細胞の染 色体及び/又は遺伝子を検査する検査手段を更に具備していてもよい。
当該検査手段は、 例えば F I S H法で核内染色体を直接蛍光ラベルして顕微 鏡観察する手段であってよく、 選択するプロープの種類によつて異数性
(aneuploidy) 、 同腕染色体 (isochromosome) 、 座 (translocation) 、 欠 失（deletion)、 及び相互転座 (reciprocal translocation)等の染色体異常を検 出することができる。 あるいは、 固着した細胞を顕微鏡下ではがし取るマイク 口マニピュレーションやレーザーダイセクションによって回収して遺伝子増幅 する P C R法を実施する手段であってもよい。 増幅された遺伝子は、 さらに遺 伝子チップ上でスクリーニングすることもでき、 本発明のシステムは、 多彩な 染色体/遺伝子診断法に適応することができるものである。
以上のように、 本発明の血液細胞分離システムを用いれば、 比重や抗体によ る表面マーカー識別等によって分離 ·濃縮することが困難であった希少な母体 血中の胎児有核細胞を、 特定条件での比重遠心分離又はフィルタ一分離による 一次分離と特定条件下でのレクチンの糖鎖識別に基づく二次分離とを組み合わ せることによって、 高精度かつ高密度に分離■濃縮するものである。 特に、 本 発明によれば、 当該希少な胎児有核細胞が、 その核内の染色体や遺伝子の検查 に供するのに使用できる基板上に直接接着 '分離'濃縮され、 かつ、 基板上に 固着された細胞が、 遺伝子/染色体検査に適応できる良好な細胞形態を維持し ている。 よって本発明は、 上記のシステムを利用することによる種々の染色体 及び/又は遺伝子診断用の検査に直接供しうる胎児有核細胞の検査標本の製造 方法及び当該方法で製造された検査標本も提供するものである。
なお、 本発明のシステムを使用する方法は、 試料中に含まれる希少な細胞か ら多量に含まれる不要な細胞成分を除去する一次分離工程と、 粗分離した一次 分離試料から不要な細胞成分を更に除去して目的とする希少細胞を分離 ·濃縮 する二次分離工程とを具備することを特徴としており、 例えば、 上述した糖鎖 ーレクチン法による二次分離を、 例えば希少細胞に特異的な抗体等を使用した 分離法に置換したとしても、 そのような分離方法及びシステムは本発明の範囲 内にある。 さらに、 対象とする希少細胞は、 分離 ·濃縮後の染色体/遺伝子検 查でそれらの状態や異常を診断できる母体血液に混入する胎児有核細胞 （胎児 有核赤芽球） の他、 寛解後に残存する白血病細胞、 臍帯血中の未成熟な細胞等 でもよく、 本発明で提供される一次細胞分離システムゃ二次分離システムで用 いられるレクチン又は抗体などの選択によってスライド基板上に濃縮できるい かなる細胞であってもよい。 本明細書において使用する 「胎児有核細胞」 とい う用語は、 これらの対象とする希少細胞を全て包含するものとする。 実施例
以下に、 本発明の血液細胞分離システムについて、 一次分離、 糖鎖ーレクチ ン法を用いた二次分離、 さらには、 細胞形態を良好に維持する標本化における 条件設定等を中心にして具体的に説明する。 実施例 1 ：比重遠心法による一次分離
比重遠心分離試薬としてヒストパック（Histopaque) (シグマ社） を購入し、 ジ ァトリゾ酸ナトリゥムを加え、 比重を 1. 077〜1. 105に調整した 6種類の比重 液を作製した。 妊娠 10〜20週の妊婦から静脈血 7 ccを採取し、 各比重液上で 30分遠心処理 （20°C、 1500 rpra) した。 比重液と血漿成分 （上層） との界面付 近に集積された細胞を回収し、 生理的緩衝液で遠心洗浄し、 大部分の無核赤血 球と血小板が除去された一次分離試料を得た。
各比重条件で一次分離をされた試料に、 糖鎖一レクチン法により二次分離を 施した。 基板としてプラスティック製チャンバースライド （2ゥェル、 ナルジ ェヌンク社製） を用いた。 基板にコーティングする糖鎖高分子は PVMeAとし、 細胞約 2 X 1 0 6個に対して 1 2 gのレクチン （S B A) を添加し、 18°Cで 30分間ィンキュベートした。 固定ィヒされなかった細胞を懸濁液として廃棄し、 チャンバースライドに固定された細胞を乾燥させ、 パッペンハイム染色を行つ た。 染色された細胞を顕微鏡下で観察し、 スライドに分離'固定された正染性 赤芽球 （胎児有核細胞） をカウントした。 その結果を、 表 1に示す。
Figure imgf000019_0001
表 1に示されるように、 比重液 （ヒス トノ ック） の比重を増加させることに より、 糖鎖ーレクチン法による二次分離の後で検出される赤芽球数が明らかに 増加した。 このことから、 従来の 1. 077の比重を持つ比重液を用いた比重遠心 法による血液細胞の従来の分離方法では、 比重の高い赤芽球を損失していたこ とが明らかになった。 一方、 比重が 1. 0%を越えると、 正染性赤芽球の数は増 加するが、 混入する白血球数の著しい増加も観察され、 その結果糖鎖一レクチ ン法による二次分離の効率を低下させて顕微鏡による赤芽球検出が妨げられる 場合があった。 実施例 2 ：パンニングによる付加的分離
プラスティックス製チャンバースライド (4ゥエル、 ナルジェヌンク社製） を F C Sあるいは 0. 01 t%糖鎖高分子 (PV- Sugar) (ネーテック社製） 水溶液 で処理した。 糖鎖高分子は、 グノレコース、 マルトース、 グノレコン酸、 N-ァセチ ルダルコサミン、 マンノース、 ラタ トース、 又はメリビオースの構造を有する ものを用いた。
出産後回収した臍帯血に、 ヒストパック（d; 1. 095)を用いて定法に従う比重 遠心分離を行い、 ヒストパックと血漿の界面付近に集積された細胞を採取した ( 当該試料を、 10 wt% F C Sを添加した RPMI1640に再浮遊させ、 表面を F C S あるいは糖鎖高分子でコートした上記ゥエルに播種した。 37°Cで 30分間ィン キュベーシヨンし、 非付着細胞を細胞浮遊液として回収し、 ゥェル上に付着し た細胞を前記パッペンハイム染色してその種類を同定した。 その結果を表2に 示す。 表 2は、 各種コーティングを施したゥエル表面に付着した赤血球分画
(赤芽球を含む） と白血球分画の比率と、 播種した細胞全体の接着率を表す。 表 2
Figure imgf000020_0001
表 2に示したごとく、 ブラスティック表面を血清タンパク質 （F C S ) や糖 鎖高分子でコートしたゥエルによるパンニングでは、 接着する血球のほとんど の細胞が白血球であることは明らかである。 赤血球分画の付着は、 マルトース、 ダルコン酸、 F C S、 マンノース処理ゥエルで抑制されており、 白血球の除去 性を示す総接着率では、 ダルコン酸、 ダルコサミン、 マンノースが優れていた。 この際、 1ないしは 2個程度の付着赤芽球を観察した一部のグルコース系素材 を除き、 付着した赤血球分画の中に赤芽球は含まれていなかった。
次 、で、 赤血球分画の損失が少なく適度に白血球を除去する処理剤として F C Sを選択し、 母体血の処理効果を調べた。 比重 1. 095の比重液を用いた比重 遠心で得られた一次分離試料を 2つに分割し、 一方には上記の条件でパンニン グを施し、 他方は何も処理せずに、 実施例 1と同条件の糖鎖ーレクチン法によ る二次分離を施した。 結果を表 3に示す。 表 3
Figure imgf000021_0001
表 3におけるスライド 1視野当たりの赤血球/白血球比は二次分離における 白血球の除去率を、 また、 スライ ド上で検出された赤芽球数は二次分離におけ る赤芽球の回収効率を示す。 具体的には、 顕微鏡下で付着細胞を計数した結果 を、 パンユングしない場合とパンユングした場合の相対比 (倍数) として示し た。 表 3から、 パンユングによって糖鎖ーレクチン法における赤芽球の選択的 分離■濃縮効果が向上することは明らかである。 これは、 パンニングによって 余剰の白血球が除かれることにより、 レクチンを介して付着すべき細胞 （赤芽 球） が効率よくレクチンと相互作用できて接着ミスが減少したこと、 及び顕微 鏡観察上、 赤芽球以外の有核細胞が減少することによつて赤芽球のミスカウン トが減少したことの相乗効果によると推察される。
表 3の結果は、 表 1の比重 1. 095の場合との比較においても、 パンエングを 行うことで顕微鏡観察を妨げる白血球の混入を抑制しながら比重 1. 105の場合
(パンニング無し） 以上の赤芽球検出を可能にしたことを示している。 また、 母体血では、 パンニングによる赤芽球の損失は殆ど皆無であつた。 実施例 3 ： フィルター分離による一次分離
実施例 1の比重遠心法に代えて、 平均孔径約 8 μ mのポリエステル不織布を 備えたフィルターを用いて粗分離を行った。 採血された母体血を lwt%B S Aを 含む生理的緩衝液で希釈し、 自然落下でフィルターを通した。 次いで、 緩衝液 のみを同様にフィルターを通してフィルター内の残存赤血球をリンスした。 こ の後、 シリンジポンプで緩衝液を逆流させ、 フィルターを通過しない非接着細 胞を回収した。 このフィルターを通過しないがフィルター内に強固に接着して いない細胞分画を一次分離試料とし、 糖鎖一レクチン法による二次分離を実施 した。 表 4は、 上記フィルターから得られた一次分離試料での結果を、 F C S パンユングによって回収された細胞分画を糖鎖ーレクチン法で二次分離をした 場合の結果に対する相対比 （倍数） で示す。 表 4
Figure imgf000022_0001
表 4によれば、 スライ ド 1視野当たりの赤血球/白血球比 （二次分離におけ る白血球の除去率） 、 及びスライ ド上で検出された赤芽球数 （二次分離におけ る赤芽球の回収効率） ともに向上しており、 フィルター処理によって糖鎖ーレ クチン法での赤芽球の選択的分離■濃縮効率が向上したことが明らかである。 フィルターによる一次分離は、 変形能を有する無核赤血球がフィルターによつ て濾過され、 フィルターを通過も トラップもされない細胞がフィルターの洗浄 によって回収されたことに基づくものと推察される。 結果的に、 フィルタ一法 は比重遠心法よりも一次分離法として赤芽球の損失が更に抑制されることが示 された。 赤血球/白血球選択性は若干向上する程度に止まったが、 これは、 フ ィルター内に残留した無核赤血球が洗浄によって回収されたことによるもので めった。 実施例 4 ：標本化における遠心処理
F I S H処理に有利なガラス製チャンバースライド （ナルジェヌンク製） を用 い、 糖鎖一レクチン法による二次分離を行った。 それに先立つ一次分離条件は 以下を採用した （実施例 2と同じ） 。
比重遠心法： d; 1. 095
F C Sノ、。ンユング
糖鎖一レクチン法での二次分離後、 非付着細胞を含む細胞浮遊液を廃棄し、 F C Sでチャンバ一内を置換してカバーシェルを脱着し、 スライドを遠心処理 した場合 （実験条件 1及び 2 ) 、 並びに非付着細胞を含む細胞浮遊液を廃棄し F C Sでチャンバ一内を置換し、 そのまま一次遠心を行ってからカバーシェル を脱着してスライドを二次遠心処理した場合 （実験条件 3〜1 1 ) を比較した
F C Sは原液（1/1)と蒸留水で 1/2に希釈したものとを用い、 二次遠心後ス ライドは常温で風乾された。 スライド上の細胞はパッペンハイム染色され、 そ れぞれの染色態度を比較した。 表 5に結果を示す。 表 5
Figure imgf000023_0001
表 5 (続き）
Figure imgf000024_0001
通常の塗末標本とは異なり、 糖鎖一レクチン法での二次分離を施されたスラ イド上の細胞は、 遠心処理による付着細胞の圧着が必要となるが、 ガラススラ ィドを基板とした場合では、 F C S溶液下での低速による一次遠心が必要であ つた。 カバーシェルを脱着した後の二次遠心でも、 比較的低速の条件が良好な 染色態度を維持した。 カロえて、 置換液はタンパク濃度が高い F C Sや B S A添 加緩衝液が有効であるが、 生理的条件以下の希釈 F C Sなどが付着細胞の膨潤 を誘導し、 より良好な染色態度を維持した。 例えば、 上記条件 8、 1 0及び 1 1は、 細胞の形態が良好であり、 なおかつ細胞質及び核の構造が明瞭であった 力 中でも 3/5希釈の F C Sを使用した条件 1 1は、 保存時間や個体差などの 検体の状態による影響を最も受けにくい条件であった。 なお、 ブラスティック 製スライドを用いた場合では、 上記条件 1で十分良好な染色態度が得られた。 発明の効果
本発明の血液分離システムによれば、 特に母体血に極めて少量しか含まれな い胎児有核細胞である有核赤芽球などを基板上に選択的に分離、 濃縮及び固定 することができる。 また、 使用する基板を適切に選択することにより、 二次分 離工程から標本化工程までを通して一基板上で処理を実施し、 染色体 遺伝子 診断に適した検査標本を得ることができ、 この検查標本は F I S H法等の検査 手段に直接適用することが可能である。 よって、 母体を侵襲することなく出生 前診断において臨床的価値の高い胎児有核細胞の検査標本を簡便且つ低コスト で製造することができる。

Claims

請求の範囲 ( 1 ) 妊婦から採取した血液試料から、 主に無核赤血球、 白血球及び 血小板を除去して一次分離試料を得る一次分離手段、
( 2 ) 前記一次分離手段で得られた一次分離試料から、 残存する無核赤血 球及び白血球を除去し、 胎児有核細胞を濃縮した二次分離試料を得る二次 分離手段であって、 前記一次分離試料を、 表面に糖鎖高分子を固定化した 基板上で、 細胞を不活性化する条件下において所定濃度のレクチンと共に ィンキュベートすることにより、 前記一次分離試料に含まれる胎児有核細 胞を、 前記レクチンと選択的に結合させ、 レクチン一糖鎖の相互作用によ つて前記基板上に濃縮固定化して二次分離試料とする二次分離手段、 及び
( 3 ) 前記二次分離手段から得た二次分離試料を標本化する標本化手段で あって、 前記胎児有核細胞を濃縮固定化した基板を所定の条件で遠心処理 して検査標本とする標本化手段、
を具備してなることを特徴とする血液細胞分離システム。 前記一次分離手段が、 少なくとも 1 . 0 7 7 m g Z C m3より高い比重 を持つ比重液を用いた比重遠心分離手段であることを特徴とする請求項 1 記載の血液細胞分離システム。 前記比重遠心分離手段で得た胎児有核細胞を含む試料から混入した白 血球等を除去するパンユング手段をさらに具備することを特徴とする請求 項 2に記載の血液細胞分離システム。 前記一次分離手段が、 フィルターを用いた無核赤血球並びに白血球分 離手段であることを特徴とする請求項 1記載の血液細胞分離システム。
5. 前記二次分離手段における、 細胞を不活性化する条件が 0°C以上 3 7°C未満の低温条件又は細胞呼吸を停止させる条件であることを特徴とす る請求項 1記載の血液細胞分離システム。
6. 前記標本化手段における遠心処理の条件が、 ブラスティック製基板を 用いる場合は 100〜1500Gで 1〜15分間であり、 ガラス製基板を 用いる場合には 10〜3000で1〜10分間の一次遠心処理と、 それに 続く 25〜30 OGで 5〜15分間の二次遠心処理であることを特徴とす る請求項 1記載の血液細胞分離システム。
7. 前記標本化手段において遠心分離される基板が、 前記二次分離手段か ら得た二次分離試料に含まれる懸濁液を 1 / 2、 好ましくは 3 / 5に希釈 した F C Sで置換したものであることを特徴とする請求項 1に記載の血液 細胞分離システム。
8. 前記標本化手段から得た検査標本に含まれる胎児有核細胞の染色体及 び z又は遺伝子を検查する検査手段をさらに具備することを特徴とする請 求項 1に記載の血液細胞分離システム。
9. 前記検查手段が、 標本に含まれる胎児有核細胞の核の染色体を染色す る染色手段を具備する請求項 8記載の血液細胞分離システム。
10. 前記染色手段における核の染色が F I SH法による染色手段である請 求項 9記載の血液細胞分離システム。
1 1. 前記検査手段が光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡による染色体検査を含む請求 項 8に記載の血液細胞分離システム。
2 . 前記検査手段が、 標本に含まれる胎児有核細胞から染色体を取り出して 遺伝子を増幅する手段を具備する請求項 8記載の血液細胞分離システム。 3 . 前記増幅手段が P C R法によって実施される請求項 1 2記載の血液細胞 分離システム。 4. 前記検査手段が増幅された遺伝子のスクリ一エング手段を含む請求項 1 2に記載の血液細胞分離システム。 5 . ( 1 ) 妊婦から採取した血液試料から、 主に無核赤血球、 白血球及び血 小板を除去して一次分離試料とする一次分離工程、
( 2 ) 前記一次分離試料を、 表面に糖鎖高分子を固定化した基板上で、 細 胞を不活性化する条件下において所定濃度のレクチンと共にインキュベー トすることにより、 前記一次分離試料に含まれる胎児有核細胞を前記レク チンと選択的に結合させ、 レクチン一糖鎖の相互作用により基板上に濃縮 固定化し、 前記一次分離試料中に残存した白血球を優先的に除去して所望 の胎児有核細胞が濃縮された二次分離試料とする二次分離工程、 次いで、
( 3 ) 前記胎児有核細胞を濃縮固定化した二次分離試料を所定の条件で遠 心処理する標本化工程を具備してなることを特徴とする、 胎児の出生前染 色体及び/又は遺伝子診断用検査標本の製造方法。 6 . 前記一次分離工程が、 少なくとも 1 . O T T m g / c m 3より高い比重 を持つ比重液を用いた比重遠心分離により実施されることを特徴とする請 求項 1 5記載の方法。 7 . 前記比重遠心分離で得た胎児有核細胞を含む試料をパンニングして混入 した白血球等を除去する工程をさらに具備することを特徴とする請求項 1 6に記載の方法。
18. 前記一次分離工程が、 フィルターを用いて無核赤血球並びに白血球を分 離することによつて実施されることを特徴とする請求項 1 5に記載の方法。
19. 前記二次分離工程における、 細胞を不活性化する条件が 0°C以上 37°C 未満の低温条件又は細胞呼吸を停止させる条件であることを特徴とする請 求項 1 5に記載の方法。
20. 前記標本化工程における遠心処理の条件が、 ブラスティック製基板を用 いる場合は 100~1500Gで 1〜15分間であり、 ガラス製基板を用 いる場合には 10〜3000で1〜10分間の一次遠心処理と、 それに続 く 25〜300Gで 5~15分間の二次遠心処理であることを特徴とする 請求項 15に記載の方法。
21. 前記二次分離手段から得た二次分離試料に含まれる懸濁液を 1/2、 好 ましくは 3 Z 5に希釈した F C Sで置換し、 それを前記標本化工程に供す ることを特徴とする請求項 15に記載の方法。
22. 請求項 15から 21のいずれか一項に記載の製造方法によって製造され た、 胎児の出生前染色体及び/又は遺伝子診断用検査標本。
23. 表面に糖鎖高分子を固定化したことを特徴とする請求項 1から 14のい ずれか一項に記載の血液細胞分離システム用の基板。
24. 希少な細胞を含有する試料中に含まれる不要な細胞成分の大部分を除去 する一次分離工程と、 一次分離を施した試料から不要な細胞成分を更に除 去して目的とする希少細胞を分離■濃縮する二次分離工程とを具備するこ とを特徴とする血液細胞分離方法。 1/5
Figure imgf000030_0001
図 1
2/5
Figure imgf000031_0001
図 2
差替え用紙（規則 26》 3/5
♦ is ¾ ， m
曝'
■4 '* -,
図 3
差替え用紙（規則 4/5
Figure imgf000033_0001
4
2x ¾d X- 翻歸
Figure imgf000034_0001
C8Zl/Z0df/X3d soso/εο OAV
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