WO2007139028A1 - 分離材料およびそれを用いた細胞等の採取方法 - Google Patents

分離材料およびそれを用いた細胞等の採取方法 Download PDF

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Abstract

　本発明は、体液から単球などの細胞または蛋白質を選択的に分離するのに有用な新規な材料およびそれらの製造方法、当該材料を用いた生理機能材料およびそれを用いてなる分離材料、ならびに当該分離材料を用いる単球などの細胞の採取方法、蛋白質の採取方法および樹状細胞の調製方法を提供する。

Description

明 細 書
分離材料およびそれを用いた細胞等の採取方法
技術分野
[0001] 本発明は、体液から単球などの細胞または動物、植物に含まれる蛋白質を選択的 に分離するのに有用な新規な材料およびそれらの製造方法、当該材料を用いた生 理機能材料およびそれを用いてなる分離材料、ならびに当該分離材料を用いる単 球などの細胞の採取方法、蛋白質の採取方法および樹状細胞の調製方法に関する
背景技術
[0002] 近年、細胞表面に存在する糖鎖が多様な生命現象（細胞認識、情報伝達、細胞接 着、分化'増殖、ガン化、ウィルス感染、血液凝固、免疫反応など）に深く関わってい ることが明らかになつている。その現象において相手の分子が糖鎖である場合は、「 糖鎖-糖鎖」相互作用に、相手の分子が蛋白質である場合には、「糖鎖—蛋白質」 相互作用に分類される。前者は、特定の糖鎖構造の組み合わせ関係にある細胞表 面糖鎖同士が結合する様式である。後者は、一方の細胞表面糖鎖が他方の細胞表 面に存在する糖鎖認識蛋白質を認識して結合する様式であり、糖鎖認識蛋白質とし て、レクチン、糖転移酵素、糖加水分解酵素が関与していると言われている。このよう な生命現象にヒントを得て、糖鎖を組み込んだ生理機能性材料 (細胞や蛋白質の分 離材料 'デバイス、センサー）、医薬品などの開発研究が活発に行われている (例え ば、非特許文献 1、 2および 3)。
目的の生理機能を発現する糖鎖含有機能性材料を開発するためには、糖鎖の構 造と生理活性の相関を分子や官能基レベルで研究し、糖鎖分子を自由自在に修飾 したり高分子に導入する技術が求められる。
[0003] このような背景のもと、種々の糖鎖含有高分子が報告されてきた。例えば、単糖、二 糖、オリゴ糖などの糖鎖を組み込んだ高分子 (以下、糖鎖高分子）としては、
1. ポリビュルアルコール型 (例えば、特許文献 1)
2. ポリアタリレート型 (例えば、特許文献 2) 3. ポリスチレン型 (例えば、特許文献 3〜8)
4. ポリエーテル型 (例えば、特許文献 9)
5. ポリエチレンイミン型（例えば、特許文献 10および 11)
6. ポリアミノ酸型 (例えば、特許文献 12〜： 16)
7. ポリウレタン型 (例えば、特許文献 17)
などが知られている。なかでも、特許文献 5において糖鎖高分子を被覆した基材を用 いて肝細胞の選択的接着 ·回収やガン細胞の認識が開示されている。
[0004] 近年、血液、骨髄などの体液に含まれる細胞を分離し、血管などの組織再生ならび にガン患者の免疫賦活を目的として移植する細胞治療が実用化されるともに、治療 に有用な細胞を選択的に分離するための材料、デバイスなどが種々開発されている 。血液に代表される体液中に存在する細胞の中で、単球は、血管再生能を有すると ともに (非特許文献 4、 5)、細胞免疫療法のひとつである樹状細胞療法における樹状 細胞の前駆細胞として注目されてレ、る（非特許文献 6)。血液などの体液から単球を 分離する方法としては以下のものが報告されている。
[0005] 末梢血単球の分離方法としては、細胞の比重差を利用して分離する比重密度勾配 遠心法や、ァフェレ一シスなどによって末梢血から単球を含んだ血液成分を分離し、 付着性の高い単球をポリスチレン製フラスコなどの理化学器具に付着させ、非付着 性細胞の除去を行うことによって単球を分離する方法や、単球に対する抗体を結合 した磁気ビーズを利用して、単球を選択的に分離する方法などが挙げられる。分離さ れた単球は、 IL 4、 GM— CSFなどのサイト力インをカ卩えて培養することにより樹状細 胞に分化誘導され、癌治療用細胞として使用されている。
[0006] しかしながら、比重密度勾配遠心法にて単球を分離する方法は、密度勾配に使用 する液の細胞毒性などの安全性の問題、また遠心洗浄操作などに時間を要し、細胞 のロスが多い、開放系での操作であるためにコンタミネーシヨンを起こしやすいなど操 作性の問題、分離効率の点において非付着性細胞の除去が十分でなくリンパ球の 混入が生じるなど、多くの課題を残している。
また、比重遠心分離法により単核球を分離した後、単球とリンパ球との基材への付 着性の差を利用して、単球を選択的にプラスチックディッシュなどの理化学器具に付 着させる方法が知られている力 本方法は、操作が煩雑であるとともに、分離される 単球の回収率、純度ともに十分なものではない。
抗体を使用した磁気ビーズによる分離法は、単球を比較的高純度に分離すること ができるが、細胞処理に長時間を要し、また高価である。
エルトリエーシヨン法は、傾斜を持つチャンバ一内に細胞浮遊液を入れて遠心し、 一方では緩衝液を遠心と逆方向に流すことで特定の細胞層を形成させる方法である 。この方法は、高純度の単球を得る方法であるが、装置が高価であり、熟練の操作技 術が必要とされ、また細胞分離に長時間を要するという問題を有する。
また、近年、細胞分離フィルターを使用した単球分離方法が報告されている。 例えば、特許文献 18には、有核細胞は捕捉するが赤血球は通過するフィルターに 有核細胞を捕捉させた後、最初の通液方向とは逆方向の液流を惹起させて有核細 胞を回収する方法が開示されている。し力、しながら、同公報は有核細胞を回収するフ ィルターであり、単球に対して選択性を有するものではない。
また特許文献 19には、単球および/または単球由来のマクロファージ選択除去フ ィルター装置が開示されている。し力 ながら、同公報は、マクロファージの粒径を考 慮してフィルターの平均細孔断面積、および嵩密度を規定した物理的な濾過フィル ターであり、単球との親和性を活用して単球を選択的に分離する本発明とは明らか に異なる。
また、特許文献 20に関しても、フィルターの充填密度および繊維径を規定すること により単球の捕捉率が向上することが開示されている力 前記と同様の理由で本発 明とは明らかに異なる。また、単球回収率 50%程度、純度 40%程度と性能も十分と は言えない。
また動'植物及び微生物等生物界に広く存在しているレクチンは、糖鎖を認識する 蛋白質の総称であり、血球や細胞表面等に存在する特定構造の糖鎖と特異的に結 合し、その血球や細胞を凝集させる活性を有している。例えば、ナタマメ由来のコン カナパリン A (ConA)、小麦胚芽ァグルチュン (WGA)は、悪性化細胞を凝集させる ことが知られている。このようにレクチンは、その糖鎖結合特異性、血液型特異性、抗 ガン作用等を利用して、細胞分画試薬、臨床検査試薬、臨床治療薬等として医学上 非常に有用なものであるため、現在種々の個体力 様々なレクチンが単離され、その 機能が精力的に調べられている。未開発のレクチンの特性をさらに明らかにし、実用 的用途を開発していくためには、有用なレクチンを効率的で安価に分離精製する技 術が必要である（非特許文献 7、 8)。
従来より蛋白質分離方法としては、溶解度の差による分画法 (塩析、有機溶媒によ る分別沈殿、酸性沈殿 ·等電点沈殿）、カラムクロマトグラフィーによる分画 (イオン交 換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ァフィニテ ィークロマトグラフィー）が知られている。蛋白質の一種であるレクチンを豆類などの天 然物から分離、精製するには、混在する蛋白質、脂肪、糖、アミノ酸等から分離する 必要があり、その手段として上記の方法の組み合わせ (塩析後、イオン交換やゲルろ 過クロマトグラフィー）が採用されている。し力 このような方法では、レクチンの分離 が十分に行われず、高純度のレクチンを得ることができないという問題があった。そこ で例えば、マルトース、ラタトースなどの糖をリガンドとして固定化した担体を用いたァ フイエティークロマトグラフィー（特許文献 21〜24)ゃマルトース、ラタトース（特許文 献 25)や卵白由来の糖鎖（特許文献 26)などの糖を結合したメタタリレート系ポリマー からなるァフィ二ティークロマトグラフィーが利用されるようになった。このように、レクチ ンを単離するための材料や方法には様々なものが開示されている。
しかしながら、当該方法は、担体表面に糖リガンドを化学結合しているため糖密度 が十分でなぐレクチンの分離が十分に行われず、高純度のレクチンを得ることがで きないという問題があった。
また、硫酸化糖は、インフルエンザウイルス、エイズウイルスに対する親和性が知ら れており、この原理を利用してウィルスを捕捉可能な新しレ、材料およびその製造方法 の開発が要望されている。このような背景のもと、種々の硫酸化糖鎖含有高分子が報 告されてきた。例えば、硫酸化ガラクトース導入ポリアタリレート型 (例えば、特許文献 27)、硫酸化糖導入ポリエチレン型 (例えば、特許文献 28)、硫酸化ダルコサミン導 入ポリエチレン型 (例えば、特許文献 29)などが知られている。
細胞、レクチンを含む蛋白質およびウィルスに対する認識、接着などの生物学的機 能は、細胞表面の糖鎖集合体 (クラスター）とこれと相補的な糖鎖集合体との「糖鎖— 糖鎖相互作用」あるいは「糖鎖 蛋白質相互作用」により発現し、その相互作用の強 さは糖鎖密度と相関していることが知られている。上記特許文献：!〜 17、 25〜29に 開示されている糖鎖高分子において、単糖、二糖、オリゴ糖などの糖鎖は、繰り返し 単位あたり 1個を線状にしか導入できないため、糖鎖クラスターにおける糖鎖密度を 高めて糖鎖の生物学的機能（細胞、レクチンを含む蛋白質およびウィルスに対する 認識、接着など）を十分発現するには、高分子鎖中で、糖鎖が導入された繰り返し単 位を増やす必要がある。しかし、これにより骨格高分子の本来のフィルム形成能、機 械強度などが低下する恐れがある。
また生体適合性、血液適合性の観点から、特許文献 17に開示される様なポリウレタ ン型糖鎖高分子が好ましいが、糖鎖を側鎖に導入する製造工程が保護'脱保護の 操作を必要とするため煩雑で製造コストが高くなる問題点がある。
特許文献 1 :特開昭 63— 238105号公報
特許文献 2 :特開昭 63— 68603号公報
特許文献 3：特開平 7— 304788号公報
特許文献 4：特開平 8— 253495号公報
特許文献 5 :特開平 8— 319317号公報 (特許第 3053764号明細書）
特許文献 6：特開平 8— 253495号公報
特許文献 7：特開 2002— 88094号公報
特許文献 8 :特開 2005— 112987号公報
特許文献 9：特開平 5— 140294号公報
特許文献 10：特開平 5— 140213号公報
特許文献 11 :特開 2002— 302511号公報
特許文献 12：特開平 5— 178986号公報
特許文献 13：特開平 8— 337566号公報
特許文献 14：特開平 9一 227600号公報
特許文献 15：特開平 11 - 60603号公報
特許文献 16 :特開 2003— 73397号公報
特許文献 17 :特開平 11一 71391号公報 特許文献 18：国際公開第 98/32840号パンフレット
特許文献 19：特開平 9— 75076号公報 (特許第 3812909号明細書）
特許文献 20：特開 2004— 129550号公報
特許文献 21 :特開昭 62— 201641号公報
特許文献 22：特許第 2660175号明細書
特許文献 23：特表平 10— 504287号公報
特許文献 24：特許第 3711356号明細書
特許文献 25 :特開昭 63— 68603号公報
特許文献 26 :特許第 1995189号明細書
特許文献 27 :特開平 11— 315091号公報
特許文献 28：特表 2004— 526691号公報
特許文献 29 :特開 2005— 15451号公報
非特許文献 1 :糖鎖分子の設計と生理機能、 2001年、学会出版センター
非特許文献 2 :生理活性糖鎖研究法、 1999年、学会出版センター
非特許文献 3 :糖質エンジニアリングと製品化技術、 1993年、サイエンスフォーラム 非特許文献 4 : Proc. Natl. Acad. Sci., vol.100, No.5:2, 426-2431， 2003
非特許文献 5 : Cardiovasc. Reserch, 49(3): 671-680, 2001
非特許文献 6 : Cancer Res. , vol.59:56- 58.1999
非特許文献 7 :新生化学実験講座 1タンパク質 分離 ·精製'性質、 1993年、 日本生 化学会編、東京化学同人出版
非特許文献 8 :レクチン、 Ν.シヤロン · Η.リス著、大沢利昭'小浪悠紀子訳、 1989年、 学会出版センター
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明の目的は、優れたフィルム形成能を有し、かつ生体適合性、血液適合性、 細胞または蛋白質との親和性などの種々の生理機能が期待される新規材料および その簡便かつ安価な製造方法を提供すること、当該材料を含む生理機能材料およ びそれを用いてなる分離材料を提供すること、ならびに当該分離材料を用いた単球 などの細胞または蛋白質の簡便かつ効率的な採取方法および樹状細胞の簡便かつ 効率的な調製方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、糖構造を有する物質を 少なくとも表面の一部に含む分離材料を用いることにより、単球などの細胞または蛋 白質を簡便かつ効率的に分離することができること、さらに、単球から樹状細胞を簡 便かつ効率的に調製することができることを見出した。
さらに、本発明者らは、上記糖構造を有する物質として、特に以下で規定する特定 の構造を有する糖鎖含有高分子が、優れたフィルム形成能を有するとともに、生体適 合性、血液適合性、細胞または蛋白質との親和性などの種々の生理機能が期待さ れ、単球などの細胞または蛋白質の採取に有用であり得ること、および当該糖鎖含 有高分子が簡便かつ安価な方法で製造され得ることも見出した。
[0010] よって、本発明は、以下を提供する：
〔1〕
1)糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、体液を接触さ せることにより、分離材料に単球を捕捉させる工程、
2)分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった単球を除去する工程、および
3)捕捉された単球を、分離材料力 回収する工程、
をこの順に実施することを特徴とする、単球採取方法。
〔2〕
前記工程 3)において、マンノース、グルコース、ガラクトースおよびフコースからなる 群より選択される 1種類以上の糖を含む細胞回収用溶液を使用して単球を回収する ことを特徴とする、上記〔1〕記載の方法。
〔3〕
上記〔1〕または〔2〕記載の方法によって回収された単球を、さらに分化誘導して樹 状細胞にすることを特徴とする、樹状細胞の調製方法。
〔4〕
1)糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、体液を接触さ せることにより、分離材料に単球を捕捉させる工程、
2)分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった単球を除去する工程、
3)分離材料に捕捉された単球をさらに分化誘導して、榭状細胞を得る工程、およ び
4)分化誘導された樹状細胞を、分離材料から回収する工程、
をこの順に実施することを特徴とする、樹状細胞の調製方法。
[5]
上記〔3〕または〔4〕記載の方法によって得られた、樹状細胞含有組成物。
[6]
1)糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、蛋白質含有液 を接触させることにより、分離材料に蛋白質を捕捉させる工程、
2)分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった蛋白質を除去する工程、およ び
3)捕捉された蛋白質を、分離材料力 回収する工程、
をこの順に実施することを特徴とする、蛋白質採取方法。
〔7〕
蛋白質がレクチンである、上記〔6〕記載の方法。
〔8〕
レクチンがコンカナパリン A (ConA)または小麦胚芽ァグルチニン (WGA)である、 上記〔7〕記載の方法。
〔9〕
上記〔6〕記載の方法によって得られた、レクチン含有組成物。
〔10〕
糖構造を有する物質が、（i)反応性官能基を有する、単糖誘導体、オリゴ糖誘導体 および/または多糖誘導体、あるいは (π)単糖誘導体、オリゴ糖誘導体および Zまた は多糖誘導体を部分構造として有する糖鎖含有高分子である、上記〔1〕〜〔4〕およ び〔6〕〜〔8〕のレ、ずれか 1項記載の方法。
[11] 糖構造を有する物質を構成する糖が、マンノース、グノレコース、ガラクトース、ラタトー ス、フコース、トレハロース、マルトースおよびサイクロ {→6) - a—D—ダルコビラノシ ノレ一（1→3) - a—D—ダルコピラノシル一（1→6) - a—D—ダルコピラノシル一（1 →3) - a _D_ダルコピラノシル一（1→}からなる群から選択される少なくとも 1つの 糖である、上記〔10〕記載の方法。
[12]
糖構造を有する物質が、単糖誘導体、オリゴ糖誘導体および/または多糖誘導体 を部分構造として有する糖鎖含有高分子である、上記〔10〕記載の方法。
〔13〕
糖鎖含有高分子が、
下記一般式 [1一 1]:
[0012] [化 1]
-{ [CO - NH—Rし NH - CO] - [O - R2 - O] }m - #
(02C— R3— CO— NH— R4) p
I
#-{ [CO - NH - R1 - NH— CO] - [O-OLS-O] }n - [1—1]
/ \
(H02C-R3-C02) q (OH) r_p_q
[0013] [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r—lの範囲の整数を表し、 m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し 、n/(m + n)は 0· 01-1.00の範囲の数である。 ]
で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンである、上記〔12〕記載の方法。
[14]
糖鎖含有高分子が、下記一般式 [1一 2]：
[0014] [化 2]
-{ [CO— NH - R1— NH— CO] — [O— R2— O] }m— #
#-{ [CO - NH - Rに丽— CO] - [O-OLS-O] }„- [1— 2]
八
(H02C-R3-C02) P + Q (OH) r—p— q
[0015] [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、 rはオリゴ糖の二級水酸基 の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r—lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/(m + n)は 0· 01~1.00の範囲の数である。 ]
で表されるカルボキシル基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンである、上記〔12〕記載の方 法。
〔15〕
糖鎖含有高分子が、下記一般式 [2— 1]：
[0016] [化 3] -{ [CO- NH-R1- NH-CO] - [0-R2-0] }m— #
(OXM)s
I
#— { [CO-NH-R^NH-CO] - [O - OLS- O] }n- [2—1]
(OH) r_s
[0017] [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、 R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
XMは酸含有基（式中、 Mは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム基又は有機 アミノ基を表し、 Xは酸由来部位を表す）を表し、
sは、酸含有基で修飾されたオリゴ糖の二級水酸基の数を表し、 l≤s≤rの範囲の整 数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/(m + n)は 0.01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表される酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタンである、上記〔12〕記載の方法。
[16]
糖鎖含有高分子が、下記一般式 [3— 1]：
[0018] [化 4]
-{ [CO- NH-R1- NH-CO] - [0 -0] 一 #
(02C-R3-CO-NH-R4-(XM)) p
I
#— { [CO- NH- R1- NH-CO] - [O- OLS-O] }n— [3— 1」
/\
(H02C-R3-C02) , (OH) r— p— q [0019] [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表し、
XMは酸含有基（式中、 Mは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム基又は有機 アミノ基を表し、 Xは酸由来部位を表す）を表し、
sは、酸含有基で修飾された糖残基 R4の水酸基数を表し、 l≤s≤4の範囲の整数を 表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r—lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/ (m + n)は 0· 01〜： 1. 00の範囲の数である。 ]
で表される酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンである、上記〔12〕記載の方 法。
〔17〕
下記一般式 [1 1] :
[0020] [化 5]
- { [CO-NH-R ' -NH-CO] 一 [O— R2_0] ー#
(02C— R3 - CO - NH— R4) p
# - { [CO - NH— R 1— NH - C O] - [O— O L S - O] } n_ [ 1— 1 ]
/ \
(HO2C- R3-C 02) „ (OH) r— p— ,
[0021] [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、 R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r_ lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/ (m + n)は 0. 01〜： 1. 00の範囲の数である。 ]
で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタン。
〔18〕
R3が、エチレン基である、上記〔17〕記載のポリウレタン。
〔19〕
が、グルコース、マンノースまたはガラクトース由来の糖残基である、上記〔17〕記 載のポリウレタン。
[0022] 〔20〕
オリゴ糖力 トレハロース、マルトースまたはラタトースである、上記〔17〕記載のポリ ウレタン。
〔21〕
オリゴ糖が、サイクロ {→6) - a—D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a— D—ダルコ ピラノシル一 (1→6) - a _D—グノレコピラノシノレ一（1→3) - a _D—グノレコピラノ シル一（1→}である、上記〔17〕記載のポリウレタン。
[22]
下記一般式 [1一 2]：
[0023] [化 6] -{ [CO - NH - R1— NH— CO] - [O— R2 - O] }m-ff
#-{ [CO-NH-R'-NH-CO] - [O - OLS— O] }n - [1_2]
/\
(H02C - R3—C02) p*q (OH) r— [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r_lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/(m + n)は 0.01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表される、カルボキシノレ基修飾オリゴ糖含有ポリウレタン。
[23]
R¾\エチレン基である、上記〔22〕記載のポリウレタン。
[24]
が、グルコース、マンノースまたはガラクトース由来の糖残基である、上記〔22〕記 載のポリウレタン。
〔25〕
オリゴ糖力 トレハロース、マルトースまたはラタトースである、上記〔22〕記載のポリ ウレタン。
〔26〕
オリゴ糖が、サイクロ {→6) - a—D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a— D—ダルコ ピラノシル一（1→6) - a—D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a—D—ダルコピラノ シルー（1→}である、上記〔22〕記載のポリウレタン。
〔27〕
下記一般式 [2— 1]:
[0025] [化 7]
-{ [CO-NH-R1- NH - CO] - [O- R2-0] }m—#
(OXM)s
#-{ [CO- NH R1- NH-CO] - [O-OLS-O] }n - [2—1]
I
(OH) r_s
[0026] [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、 R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
XMは酸含有基（式中、 Mは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム基又は有機 アミノ基を表し、 Xは酸由来部位を表す）を表し、
sは、酸含有基で修飾されたオリゴ糖の二級水酸基の数を表し、 l≤s≤rの範囲の整 数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し 、n/(m + n)は 0.01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表される、酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタン。
〔28〕
Xが SOまたは POである、上記〔27〕記載のポリウレタン。
3 3
〔29〕
Xが SOである、上記〔27〕記載のポリウレタン。 [0027] 〔30〕
R3が、エチレン基である、上記〔27〕記載のポリウレタン。
〔31〕
が、グルコース、マンノースまたはガラクトースである、上記〔27〕記載のポリウレタ ン。
[32]
オリゴ糖力 トレハロース、マルトースまたはラタトースである、上記〔27〕記載のポリ ウレタン。
〔33〕
オリゴ糖が、サイクロ {→6)― a—D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a— D—ダルコ ピラノシル一（1→6) - a—D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a—D—ダルコピラノ シル一（1→}である、上記〔27〕記載のポリウレタン。
〔34〕
下記一般式 [3— 1]:
[0028] [化 8]
-{ [CO-匪- R1 -冊- CO] - [0-R2-0] }m— #
(02C— R3—CO—顏ー R4—（XM)S) p
#— { [CO-NH-R1- NH— CO] - [O-OLS-O] }n— [3—1]
/\
(H02C-R3-C02) q (OH) r— p_q
[0029] [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜 12の 2価の炭化水素単位力ら選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表し、 XMは酸含有基（式中、 Mは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム基又は有機 アミノ基を表し、 Xは酸由来部位を表す）を表し、
sは、酸含有基で修飾された糖残基 R4の水酸基数を表し、 l≤s≤4の範囲の整数を 表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r_ lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/ (m + n)は 0. 01〜： 1. 00の範囲の数である。 ]
で表される、酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタン。
〔35〕
Xが S〇または POである、上記〔34〕記載のポリウレタン。
3 3
〔36〕
Xが SOである、上記〔34〕記載のポリウレタン。
3
〔37〕
R3が、エチレン基である、上記〔34〕記載のポリウレタン。
〔38〕
が、グルコース、マンノースまたはガラクトースである、上記〔34〕記載のポリウレタ ン。
〔39〕
オリゴ糖力 トレハロース、マルトースまたはラタトースである、上記〔34〕記載のポリ ウレタン。
〔40〕
オリゴ糖が、サイクロ {→6)―ひ—D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a— D—ダルコ ピラノシル一 ( 1→6) - a _ D—グノレコピラノシノレ一（1→3) - a _ D—グノレコピラノ シル一（1→}である、上記〔34〕記載のポリウレタン。
[41 ]
1 )糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、体液を接触さ せることにより、分離材料に細胞を捕捉させる工程、
2)分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった細胞を除去する工程、および
3)捕捉された細胞を、分離材料力 回収する工程、
をこの順に実施することを特徴とする、細胞採取方法であって、
糖構造を有する物質が、上記〔17〕〜〔40〕のいずれ力 4項に記載のポリウレタンで あることを特徴とする、方法。
[42]
糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む単球分離材料であって、糖構 造を有する物質が、（0反応性官能基を有する、単糖誘導体、オリゴ糖誘導体および
/または多糖誘導体、あるいは (π)単糖誘導体、オリゴ糖誘導体および zまたは多糖 誘導体を部分構造として有する糖鎖含有高分子である、単球分離材料。
〔43〕
糖構造を有する物質を構成する糖が、マンノース、グノレコース、ガラクトース、ラクト ース、フコース、トレハロース、マルトースおよびサイクロ {→6) - a—D—ダルコビラ ノシルー（1→3) - a—D—ダルコピラノシル一（1→6) - a—D—ダルコビラノシル - (1→3) - a—D—ダルコピラノシル一（1→}からなる群から選択される少なくとも 1 つの糖である、上記〔42〕記載の単球分離材料。
〔44〕
糖構造を有する物質を構成する糖が、マンノース、グノレコース、ガラクトース、ラクト ースおよびフコースからなる群から選択される少なくとも 1つの糖である、上記〔43〕記 載の単球分離材料。
〔45〕
フィルターの形状を有する、上記〔42〕〜〔44〕のレ、ずれか 1項記載の単球分離材 料。
〔46〕
液体入口および zまたは液体出口を有する容器を備えた単球分離デバイスであつ て、
当該容器の少なくとも一部に上記〔42〕〜〔45〕のいずれ力 4項記載の単球分離材 料が含まれることを特徴とする、単球分離デバイス。
〔47〕
上記〔17〕〜〔40〕のいずれか 1項記載のポリウレタンを含む生理機能材料。
〔48〕
上記〔17〕〜〔40〕のいずれか 1項記載のポリウレタンを少なくとも表面の一部に含 む分離材料。
〔49〕
細胞分離材料である、上記〔48〕記載の分離材料。
[50]
単球分離材料である、上記〔49〕記載の分離材料。
[51]
蛋白質分離材料である、上記〔48〕記載の分離材料。
〔52〕
レクチン分離材料である、上記〔51〕記載の分離材料。
〔53〕
コンカナパリン A (ConA)または小麦胚芽ァグノレチニン (WGA)分離材料である、 上記〔52〕記載の分離材料。
〔54〕
血液分離材料である、上記〔48〕記載の分離材料。
〔55〕
フィルターの形状を有する、上記〔48〕〜〔54〕のレ、ずれか 1項記載の分離材料。
[56]
液体入口および Zまたは液体出口を有する容器を備えた分離デバイスであって、 当該容器の少なくとも一部に上記〔48〕〜〔55〕記載の分離材料が含まれることを特 徴とする、分離デバイス。
[57]
細胞分離デバイスである、上記〔56〕記載の分離デバイス。
[58] 単球分離デバイスである、上記〔57〕記載の分離デバイス。
〔59〕
蛋白質分離デバイスである、上記〔56〕記載の分離デバイス。
[0032] 〔60〕
レクチン分離デバイスである、上記〔59〕記載の分離デバイス。
[61]
コンカナパリン A (ConA)または小麦胚芽ァグノレチュン (WGA)分離デバイスであ る、上記〔60〕記載の分離デバイス。
[62]
下記一般式 [1一 3] :
[0033] [化 9]
— { [CO— NH—R1 - NH— CO] - [O— R O] }m - #
#-{ [CO— NH— R1—雇一 CO] — [O-OLS-O] }n— [1— 3]
[0034] [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
m nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000 nは 1 1000の整数を表し n/(m + n)は 0.01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表されるオリゴ糖含有ポリウレタンに、下記一般式 [1—4]
[0035] [化 10] co-o
[1-4]
R3— CO
[0036] [式中、 R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表す。 ]で表される酸無水物を反応させ ることを特徴とする、下記一般式 [1 2]：
[0037] [化 11] 一 { [CO - NH - R1— NH— CO] — [O— R2— O] }m - # #-{ [CO - NH— R1 - NH - CO] - [O-OLS-O] }n - [1— 2]
(H02C-R3-C02) pt, (OH) r— p_,
[0038] [式中、
Figure imgf000022_0001
m、 n、 p、 q、 rおよび OLSはそれぞれ上記で定義したとおりであ る]で表されるカルボキシル基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造方法。
〔63〕
下記一般式 [1 2]：
[0039] [化 12]
-{ [CO-NH-R'-NH-CO] 一 [O - R2— O] — ff #-{ [CO— NH— R1—匪—CO] - [O-OLS-O] }n - [1-2]
(HO,C-R3-C02) „ + a (OH) r_.
[0040] [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜； 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、 OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r—lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1 1000の整数を表し 、n/(m + n)は 0.01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表されるカルボキシル基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンを、
下記一般式 [1一 5]：
[0041] [化 13]
R4—匪 2 [1-5]
[0042] [式中、 R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表す。 ]で表されるアミノ化糖と反応さ せることを特徴とする、下記一般式
[0043] [化 14]
-{ [CO—應—R1— NH— CO] — [O— R2—0] }m— #
(02C— R3— CO -NH-R4) p
I
#_{ [CO—NH— R1— NH— CO] — [O-OLS-O] -一 [1-1]
/\
(H02C— R C02) q (OH) r_p_,
[0044] [式中、 R1 R2、 R3、 R4、 p、 q、 r、 m、 nおよび OLSはそれぞれ上記で定義したとおり である]
で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造方法。
[64]
下記一般式 [1一 3]：
[0045] [化 15] — { [CO- NH - R1- NH-CO] - [O- R2- O] }m— #
#— { [CO - NH- R1- NH- CO] - [O-OLS-O] }n— [1— 3]
I
(OH) r
[0046] [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し 、n/(m + n)は 0· 01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表されるオリゴ糖含有ポリウレタンを、酸修飾試薬と反応させることを特徴とする、下 記一般式 [2— 1]:
[0047] [化 16]
-{ [CO-NH-R^NH-CO] - [O- R2 - O] — #
(OXM)s
I
#_{ [CO-NH-Rし NH-CO] - [O-OLS-O] }n- [2-1]
I
(OH) Γ— ,
[0048] [式中、 Xは、酸由来部位を示し、他の記号は上記と同義である。 ]
で表される酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造方法。
〔65〕
酸修飾試薬が、硫酸化試薬またはリン酸化試薬である、上記〔64〕記載の製造方法
〔66〕 酸修飾試薬が、硫酸化試薬である、上記〔65〕記載の製造方法。
〔67〕
下記一般式 [1 1]:
[0049] [化 17]
-{ [CO - NH— R1— NH - CO] — [0_R2 - O] }m— #
(02C - R3 CO - NH—R4) p
#-{ [CO— NH - R1— NH— CO] - [O— OLS - O] }n - [1 1]
/\
(H02C-R3-C02) „ (OH)「p一,
[0050] [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、 R2は、炭 素数 2〜 12のォキシアルキレン単位および置換基を有してレ、てもよレ、炭素数 2〜 12 の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100単位含有 する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r_lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/(m + n)は 0· 01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンを、酸修飾試薬と反応させることを特 徴とする、下記一般式 [3 1]:
[0051] [化 18] 一 { [CO-NH- R1- NH- CO] - [O- R2- O] }m_#
(02C-R3-CO-NH-R4-(XM)s) „
I
#— { [CO-NH- Ri-NH- CO] - [O- OLS- O] — [3—1]
ノ \
(H02C-R3-C02) , (OH) r_p— q [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表し、
XMは酸含有基（式中、 Mは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム基又は有機 アミノ基を表し、 Xは酸由来部位を表す）を表し、
sは、酸含有基で修飾された糖残基 R4の水酸基数を表し、 l≤s≤4の範囲の整数を 表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r—lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/(m + n)は 0· 01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表される、酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造方法。
〔68〕
酸修飾試薬が、硫酸化試薬またはリン酸化試薬である、上記〔67〕記載の製造方法 [69]
酸修飾試薬が、硫酸化試薬である、上記〔68〕記載の製造方法。 発明を実施するための最良の形態
[0053] 本発明を以下に具体的に説明する。
[0054] 本発明の方法に用いられる分離材料は、糖構造を有する物質を少なくとも表面の 一部に含むことを特徴とする。本発明において、「糖構造を有する物質を少なくとも表 面の一部に含む」とは、 1)分離材料自体が糖構造を有する物質で構成されている場 合、または 2)分離材料の基材と糖構造を有する物質が異なり、分離材料の表面の全 てまたは一部が、糖構造を有する物質で構成される場合のいずれも包含する。
[0055] 本発明の方法において使用される「糖構造を有する物質」としては、単糖、オリゴ糖 および/または多糖構造を物質の部分構造とするもので、それ自体で分離材料に成 形可能な物質、あるいは分離材料の基材の表面に固定化または被覆され得るもので あれば特に限定されず、例えば、反応性官能基を有する単糖誘導体、オリゴ糖誘導 体および/または多糖誘導体、単糖、オリゴ糖および/または多糖を部分構造として 有する糖鎖含有高分子などが挙げられる。
該糖構造を有する物質における糖の種類は特に限定されないが、マンノース、ダル コース、ガラクトース、フコースなどの単糖、またはこれら糖単位を含むオリゴ糖あるい は多糖が好ましぐ例えば、マンノース、グルコース、ガラクトース、ラタトース、フコー ス、トレハロース、マルトース、サイクロ {→6) - a—D—ダルコピラノシル一 (1→3) - ひ一D—グノレコピラノシノレ一 (1→6) - a _D—グノレコピラノシノレ一 (1→3)— ひ一D —グノレコピラノシノレ _ (1→}などが挙げられる。
糖の種類は単数種または複数種のいずれであっても構わなレ、。糖構造とは、これら の糖の部分構造あるいは誘導体を意味する。糖構造の糖がオリゴ糖または多糖類の 場合、直鎖構造または分岐構造のいずれもとり得るが、糖構造の末端糖がマンノー ス、グノレコース、ガラクトースおよびフコースのいずれかより選択される構造を有して レ、ることが好ましい。ここでレ、う末端糖とは、非還元性末端側にある末端の糖を意味 する。
[0056] 本発明の分離材料において、糖構造を有する物質を分離材料の基材に固定化す る場合、その固定化方法としては、イオン結合法、共有結合法などが挙げられ、その 固定の方法としては、公知の種々の方法を特別な制限なしに用いることが出来る。こ の場合には、糖構造を有する物質として、反応性官能基を有する単糖誘導体、オリゴ 糖誘導体、多糖誘導体が好適に使用される。単糖誘導体、オリゴ糖誘導体および/ または多糖誘導体の反応性官能基としては、分離材料の基材と直接またはスぺーサ を介して化学結合するものであれば特に限定されないが、例えば、水酸基、アミノ基 、ァノレデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、 ハロゲン基、サクシ二ルイミド基、酸無水物基などが挙げられる。また、反応性官能基 を有する単糖誘導体、オリゴ糖誘導体および Zまたは多糖誘導体を分離材料に固 定化するにあたり、分離材料の基材の表面に反応性基を導入してもよい。反応性基 を導入する方法としては、例えば、特開平 2— 261833号公報に開示されているハロ ゲンあるいは疑似ハロゲンの固定化、特開平 6— 219051号公報、特許第 1887096 号明細書に開示されているエポキシ基の導入などが好適に利用される。また、分離 材料の基材へ、糖構造を有する物質あるいはその前駆体をグラフト重合することによ り固定化することもできる。この場合には、グラフト重合が可能なスチレン基、メタタリ ル基、ビュル基、アクリル基などを反応性官能基として有する、単糖、オリゴ糖および /または多糖誘導体を糖構造を有する物質として使用できる。その固定化方法とし ては、放射線や電子線を用いた公知の方法を特別な制限なしに用いることが出来る
[0057] 本発明で用いる分離材料において、分離材料の基材が、糖構造を有する物質で 被覆される場合には、当該糖構造を有する物質として、単糖、オリゴ糖および/また は多糖を部分構造として有する糖鎖含有高分子が好適に使用される。そのような糖 鎖含有高分子としては、例えば、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフ イン、ポリアクリノレアミド、ポリエステノレ、ナイロン、ポリイミド、 ラミド、ポリアミド、アタリ ル樹脂などに代表される合成高分子、またはキチン、キトサン、酢酸セルロース、セ ノレロース、 レーヨン、ァガロース、アルギン酸などに代表される天然高分子に、少なく とも 1種の単糖、オリゴ糖および Zまたは多糖構造が導入された高分子などが挙げら れる。
[0058] 分離材料の基材に糖構造を有する物質を被覆する方法は、特に限定されないが、 例えば、被覆層を形成する糖構造を有する物質を溶解した液中に、分離材料の基材 を浸漬する、該溶液を分離材料の基材に噴霧する、あるいは分離材料の基材上に 該溶液を注入するなどのコーティング方法が挙げられる。また、コーティング処理した 基材は、残存する溶液を洗浄により除去した後用いてもよいし、または未洗浄のまま 乾燥して用いてもよい。あるいは、基材を洗浄するが乾燥せずに用いてもよぐ公知 の方法を特別な制限なしに用レ、ることが出来る。また、糖構造を有する物質に重合性 化合物を共存させた溶液で被覆層を形成し、被覆後にさらに架橋反応させてコーテ イングしてもよレ、。
[0059] 本発明の分離材料の形態としては、例えば、シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ、 カートリッジ、カセットなどの平板構造を有する器具の形態、不織布、繊維、多孔体、 球状担体などの連通孔を持つ構造体 (例えば、フィルター）の形態などが挙げられる 力 特に限定されない。
[0060] 本発明で用いる分離材料の基材が、シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ、カートリ ッジ、カセットなどの場合には、その形態、大きさは特に限定されなレ、。また、これらの 材質も特に限定されないが、非反応性ポリマー、あるいは生物親和性金属またはそ の合金などの金属材料などが好ましく使用される。または、これら非反応性ポリマー、 生物親和性金属などでコートまたはメツキされた材料でも良い。
非反応性ポリマーとしては、例えば、アクリロニトリル一ブタジエン一スチレンコポリ マーなどのアクリロニトリルポリマー、ポリテトラフルォロエチレン、ポリクロ口トリフルォ 口エチレン、テトラフルォロエチレン、ポリへキサフルォロプロピレンなどのハロゲン化 ポリマー、ポリアミド、ポリスノレホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ビ ユルク口リドーアクリルコポリマー、カーボネート アクリロニトリル ブタジエンースチ レンコポリマー、スチレン一ブタジエンコポリマー、ポリスチレンなどが挙げられる。 金属材料としては、例えば、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、またはそれ らの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミゥム合金、または 窒化チタン被覆ステンレス鋼などが挙げられる。
なかでも、耐滅菌性を有する素材が特に好ましぐ具体的には、シリコンコートされ たガラス、ポリプロピレン、ポリ塩化ビュル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチ ルペンテンなどが挙げられる。 [0061] また、本発明で用いる分離材料の基材が、シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ、力 ートリッジ、カセットなどの場合は、ガス透過性構造を有する材料を使用したものも好 ましい。ガス透過性構造を有する材料としては、コンタミネーシヨンの抑制が可能な程 度の微細な孔構造またはスリット構造を有する素材、材質的にガス透過性が高レヽ素 材などが挙げられる。ガス透過性が高い素材としては、例えば、ポリメチルペンテン、 環状ポリオレフイン、ォレフィン系熱可塑性エラストマ一、スチレン系熱可塑性エラスト マー、ポリアミド系熱可塑性エラストマ一などが挙げられる力 これらに限定されなレ、。
[0062] 本発明で用いる分離材料の基材は、不織布状または多孔体状であってもよぐこの 場合、基材の平均孔径は、例ぇば、 9 111〜80 111の範囲でぁることが好ましぃ。基 材の素材は、特に限定されないが、例えば、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレン 、ポリオレフイン、ポリアクリノレアミド、ポリエステル、ナイロン、ポリイミド、ァラミド、ポリア ミド、アクリル樹脂などの合成高分子、キチン、キトサン、酢酸セルロース、セルロース 、レーヨン、ァガロース、アルギン酸などの天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラ ス、アルミナなどの無機材料、ステンレス、チタンなどの金属などが挙げられる。
多孔状の形態は、スポンジ状、フェルト状、綿状、繊維状、粒子状、パイプ状、円盤 状、円筒状などのいずれの形態であっても良い。分離材料の基材が球形担体の場 合、粒径は 10 μ m〜2000 μ mが好ましぐ処理効率からより好ましくは 70 μ m〜10 00 /i mである。球形担体の素材としては、例えば、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無 機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアタリレート、架橋ポリアクリルアミド、架 橋ポリスチレン、エチレン 酢酸ビニル共重合体ケン化物、架橋ポリアクリル酸、架橋 ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリルアミドグラフトイ匕ポリエチレンなど の合成高分子化合物、結晶性セルロース、架橋セルロース、セルロース誘導体、架 橋ァガロース、架橋デキストリン、キチン、キトサンなどの多糖類からなる有機担体、さ らにはこれらの組合せによって得られる、有機—有機、有機—無機などの複合担体 などが挙げられるが、これらに限定されない。
[0063] 上記分離材料は、そのまま細胞、蛋白質などの採取方法に用いてもよいし、分離デ バイスの形態で用いることもできる。
本発明において、「分離デバイス」とは、前記分離材料が、液体入口および Zまた は液体出口を有する容器の少なくとも一部に含まれているデバイスである。本発明の 分離デバイスに好適に使用される分離材料は、不織布、繊維、多孔体、球状担体、 フィルターなどの連通孔を有する構造体である。本発明の分離デバイスは、これら分 離材料の構造体を、それぞれの形態にあったカラム、バッグ、カセットなどの容器に 装着'充填、またはフラスコ、バッグなどの培養器具に収納したものなどをいう。好まし くは、前記分離材料は、前記容器内に充填されている。
[0064] 該容器の形態、材質、大きさは特に限定されず、コンテナ、バッグ、チューブ、カラ ム、カセット、フラスコなど任意の形態であってよい。本発明の分離デバイスの一例を 挙げると、容量約 0.：!〜 500ml程度、直径約 0.：!〜 10cm程度の透明または半透明 の筒状容器に、球状担体などの連通孔を有する構造体を充填してカラム形状とした 分離デバイスなどがあげられる。
該デバイスは、さらに、体液流入口および体液流出口のある容器に体液流入口と 体液流出口を仕切るように装着または充填し、フィルターまたはクロスフロー型モジュ ールとすることが好ましい。また、容器に不織布、多孔体を装着または充填する場合 は、単層もしくは複数枚積層することができ、また材料表面が糖構造を有する物質か ら構成されていない材料と組み合わせて装着または充填することもできる。
このような分離デバイスは、例えば、細胞（例、単球など）、蛋白質 (例、 ConA (コン 力ナノくリン A)、 WGA (小麦胚芽ァグルチニン)などのレクチンなど）などを採取する ために有用である。
[0065] 本発明の分離デバイスの容器素材としては、特に限定されるものではなレ、が、非反 応性ポリマーあるいは生物親和性金属またはその合金などの金属材料などが使用さ れる。または、これら非反応性ポリマーや生物親和性金属でコートあるいはメツキされ た材料でも良い。
非反応性ポリマーとしては、例えば、アクリロニトリル一ブタジエン一スチレンコポリ マーなどのアクリロニトリルポリマー、ポリテトラフルォロエチレン、ポリクロ口トリフルォ 口エチレン、テトラフルォロエチレン、ポリへキサフルォロプロピレンなどのハロゲン化 ポリマー、ポリアミド、ポリスノレホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ビ ユルクロリド一アクリルコポリマー、カーボネート一アクリロニトリル一ブタジエン一スチ レンコポリマー、スチレン ブタジエンコポリマー、ポリスチレンなどが挙げられる。 金属材料の例としては、例えば、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、および それらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミゥム合金、お よび窒化チタン被覆ステンレス鋼などが挙げられる。
なかでも、耐滅菌性を有する素材が特に好ましぐ具体例としては、シリコンコートさ れたガラス、ポリプロピレン、ポリ塩化ビュル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメ チルペンテンなどが挙げられる。
[0066] [細胞の採取方法]
以下に、本発明の分離材料を使用した細胞の採取方法を詳細に説明する。
本発明の細胞の採取方法は、上述の本発明の分離材料を、体液に接触させること により行われ、具体的には、以下の工程：!）〜 3)をこの順に含む：
1)糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、体液を接触さ せることにより、分離材料に細胞 (例、単球など）を捕捉させる工程、
2)分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった細胞を除去する工程、および
3)捕捉された細胞を、分離材料力 回収する工程。
なお、上記方法において、分離材料は、上述した分離デバイスの形態で用いること あでさる。
[0067] 本発明の方法において「体液」は、生物、例えば、哺乳動物（ヒト、サル、ラット、マウ ス、ィヌ、ネコ、ゥサギ、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ゥマなど、好ましくはヒト）被検体から 採取される、血液 (例、末梢血液、臍帯血液、サイト力イン類 (例えば、 G— CSFなど） )で誘導された末梢血液など）、骨髄液、リンパ液、胸膜液、腹水、滑液などのほか、 これらの体液のァフェレ一シス産物、遠心分離処理液、細胞懸濁液 (例、所望により フイコール、パーコール、バタティナ一チューブ、リフオプレップ、 HES (ヒドロキシェ チルスターチ）などを用いて比重密度遠心分離処理を施した細胞を含む細胞懸濁液 )なども包含するが、これらに限定されない。
本発明の方法は、特に、体液が血液である場合に適している。
体液は、当該分野で公知の任意の手段で被検体から採取すればよい。また、体液 を採取する際には、一般的に使用されている抗凝固剤として、へパリン、低分子量へ パリン、メシル酸ナファモスタツト、メシル酸ガべキサート、アルガトロバンや、アシッド' シトレート'デキストロース液（ACD液）ゃシトレート'フォスフェート'デキストロース液（
CPD液)などのクェン酸含有抗凝固剤などを使用しても良い。なかでも、クェン酸含 有抗凝固剤またはへパリンが最も好ましい。
[0068] 以下に、分離材料および分離デバイスを用いる場合の代表的な形態をそれぞれ挙 げて、本発明の方法の各工程を詳細に説明する。
[0069] く分離材料またはその基材が、シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ、カートリッジ、 カセットなどの形態を有する場合 >
工程 1)
工程 1)では、糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、体 液を接触させることにより、分離材料に細胞を捕捉させる。具体的には、対象となる体 液を、シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ、カートリッジ、カセットなどを基材とする本 発明の分離材料に注入し、 5分〜 120分間静置または振とうすることにより、該分離 材料に体液を接触させて、分離材料に細胞を捕捉させる。細胞の安定した捕捉およ び細胞のダメージの低減という観点より、接触（静置または振とう）時間は 15分〜 90 分の間であることがより好ましい。
[0070] 工程 2)
工程 2)では、分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった細胞を除去する。 捕捉されなかった細胞の除去方法は、特に限定されないが、例えば、まず、ピペット、 シリンジなどでの吸引またはデカンテーシヨンなどにより体液を除去し、次いで、分離 材料に生理食塩水、培養液、緩衝溶液などを再度注入して、付着した細胞を洗浄除 去し、最後に、上清を前記吸引またはデカンテーシヨンなどで除去することを含む方 法などが挙げられる。捕捉されなかった細胞の除去が不十分な場合は、該方法を数 回繰り返してもよい。
[0071] 工程 3)
工程 3)では、捕捉された細胞を、分離材料から回収する。捕捉された細胞は、例え ば、上記工程 2)で洗浄した後の分離材料に、生理食塩水、培地、細胞保存液など 力 なる回収液、アシッド'シトレート'デキストロース液 (ACD液）、シトレート'フォスフ エート 'デキストロース液（CPD液）などの 2価カチオンキレート剤、または糖含有細胞 回収液などを接触させることにより、回収することができる。
回収液の種類は特に限定されないが、細胞回収率の点から、分離材料の一部を構 成する糖構造の糖と同種の糖含有細胞回収液、例えば、マンノース、グルコース、ガ ラタトース、フコースまたはこれらの混合物を含む糖含有細胞回収液を使用するのが 好ましい。糖含有細胞回収液の糖濃度は、 0. 01 % (W/V)から該糖の 37°Cにおけ る飽和溶解度まで、いずれの濃度でも使用可能であるが、回収効率の点から、好まし くは 0. 1 % (WZV)〜飽和溶解度の 1Z2量であり、より好ましくは 0. 5% (W/V)〜 飽和溶解度の 1Z5量である。また、該糖含有細胞回収液は、必要に応じて、ァシッ ド ·シトレート'デキストロース液（ACD液）、シトレート'フォスフェート'デキストロース 液（CPD液）などの 2価カチオンキレート剤を含んでもよい。
細胞と上記細胞回収液との接触は、 3分〜 30分程度、静置あるいは振とう下で行 われる。所定時間の接触後、ピペッティング、振動の付加、捕捉された細胞に損傷を 与えなレ、程度に回収液を勢レ、よく押し出す (例えばフラッシングなど)方法などにより 、細胞を回収することができる。押し出す手段としては、例えば、空気、不活性ガス、 生理食塩水などが挙げられるが、これらに限定されない。この際、回収効率を上げる ために、 4°Cまでの冷却または 37°Cまでの加温操作を併用してもよい。また、細胞の 回収率が不十分な場合は、上記回収操作を繰り返し行ってもよい。
<不織布、繊維、多孔体、球状担体、フィルターなどの連通孔を有する構造を有す る分離材料が容器の少なくとも一部に含まれてレ、る分離デバイスを用いる場合〉 ここでは、特に、分離材料を分離デバイスの形態で用いる場合について説明する。 工程 1)
工程 1)では、上記分離材料が液体入口および Zまたは液体出口を有する容器の 少なくとも一部に含まれているデバイスに、体液を接触させることにより、分離材料に 細胞を捕捉させる。
上記分離デバイスを使用する場合、「分離デバイスに体液を接触させる」とは、分離 デバイスに体液を通液させることをいう。ここで、通液とは、分離デバイスの液体入口 力 体液を導入し、一定方向に通過させて液体出口から排出させることをいう。分離 デバイスに体液を導入する手段としては、シリンジポンプ、ペリスタポンプなどの機械 を用いる方法や、シリンジを用いた手動通液、高低差を利用した自然落下処理など が挙げられるが、この限りではない。通液の速度は、 0. lml/min〜： 100ml/min の間が好ましぐ体液を該デバイスに 1回通液させてもよいし、循環処理にて複数回 通液させてもよい。
[0073] 工程 2)
工程 2)では、分離デバイスを洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった細胞を除去す る。上記分離デバイスを使用する場合は、分離デバイスに洗浄液を、液体入口から（ 体液流入方向と同一方向）または液体出口から（体液流入方向と逆方向）通液させる ことにより、捕捉されなかった細胞を分離材料から除去する。洗浄液の具体例として は、生理的食塩液、リンゲル液、リン酸緩衝液などの緩衝液、 RPMI1640などの細 胞培養用培地が挙げられるが、この限りではない。洗浄液を導入する手段は、シリン ジポンプ、ペリスタポンプなどの機械を用いる方法や、シリンジを用いた手動通液、高 低差を利用した自然落下処理などが挙げられる力 この限りではない。ポンプにより 通液する場合の流速は、 0. lml/min〜： 100ml/min程度が挙げられる。洗浄液 量は、分離デバイスに用いる分離材料、または分離デバイスの容積により異なるが、 容積の約 1〜5倍程度の体積で洗浄することが好ましレ、。
[0074] 工程 3)
工程 3)では、捕捉された細胞を、分離デバイスから回収する。具体的には、上記分 離デバイスに、生理食塩水、培地、細胞保存液などを含む回収液、またはアシッド · シトレート'デキストロース液（ACD液）ゃシトレート'フォスフェート'デキストロース液（ CPD液)などの 2価カチオンキレート剤を含む回収液、または糖含有細胞回収液な どを通液することにより細胞を回収する。特に、細胞の回収効率から、分離デバイス 中の分離材料の一部を構成する糖構造の糖種と同種の糖含有細胞回収液、例えば 、マンノース、グルコース、ガラクトース、フコースまたはこれらの混合物を含む回収液 を使用するのが好ましい。回収液として糖含有細胞回収液を使用する場合、回収液 の糖濃度は、 0. 01 % (W/V)から該糖の 37°Cにおける飽和溶解度までのいずれ の濃度でも使用可能である力 回収効率の点から、 0. 1 % (W/V)〜飽和溶解度の 1/2量が好ましぐより好ましくは、 0. 5% (W/V)〜飽和溶解度の 1/5量である。 また、該糖含有細胞回収液にアシッド'シトレート'デキストロース液 (ACD液）ゃシト レート'フォスフェート'デキストロース液（CPD液）などの 2価カチオンキレート剤を含 んでもよい。上記分離デバイスと回収液とは、 3分〜 30分程度接触させることが好ま しぐ接触方法としては、静置方式、循環方式などが挙げられる。循環する際の流速 は、 0. lml/min〜200mlZminが好ましレ、。また、この際、回収効率を上げるため に、 4°Cまで冷却、または 37°Cまでの加温操作を併用してもよい。また、細胞の回収 が不十分な場合は、上記回収操作を繰り返してもよい。
[0075] 本発明の方法は、特に、単球の採取に適している。単球とは、造血幹細胞由来の 単球系細胞であり、血管再生ゃ樹状細胞への分化誘導など、再生医療、細胞医療 分野に使用される。
本発明の方法で単球を採取する場合、得られた単球は、血管再生用細胞などとし て用いることができる。あるいは、本発明の方法で採取した単球は、後述する「樹状 細胞の調製方法」において前駆細胞として用いることもできる。
[0076] [榭状細胞の調製方法]
本発明はまた、榭状細胞の調製方法および当該方法で得られた樹状細胞に関す る。
本発明の樹状細胞の調製方法としては、上記の本発明の方法で分離材料に捕捉 された単球を、分離材料から回収してさらに樹状細胞へ分化誘導する工程を含む方 法と、分離材料に捕捉された単球を回収せずに、その場で樹状細胞へ分化誘導す る方法とがある。
[0077] 本発明において、樹状細胞とは、単球を IL_4、 GM— CSFなどのサイト力イン類 により分化誘導した未熟樹状細胞、未熟樹状細胞に、さらに TNFひ、 IL1 - /3 , IL _ 6、 PGE2などのサイト力イン類を添加して分化誘導した成熟樹状細胞、抗原提示 能を獲得させる工程 (例、癌抗原の添加）を経て、抗原提示樹状細胞 (例、癌抗原を 提示させた樹状細胞など)などを意味する。
[0078] 以下に、本発明の樹状細胞調製方法を詳細に説明する。
く本発明の分離材料力 捕捉された単球を回収し、さらに樹状細胞へ分化誘導す る方法 >
本方法では、上述した本発明の方法を用いて単球を採取し、さらに分化誘導するこ とにより、榭状細胞を調製することが出来る。
単球の樹状細胞への分化誘導工程は、例えば以下のように実施できる。 単球を、一般的に細胞培養に使用されるシャーレ、フラスコなどの容器に入れ、 G M_CSF、 IL— 4などのサイト力インを含有する培養液を添加する。約 1週間培養す ることにより、単球を未熟樹状細胞に分化させる。さらに、 IL—1 /3、 PGE2、 IL_ 6、 TNF_ひなどのサイト力インを含有する培養液中で約 1週間培養することにより、未 熟樹状細胞を成熟樹状細胞に分化誘導することもできる。
あるいは、必要に応じて、抗原提示能を獲得させる工程 (例、癌抗原の添加など）を 経て、抗原提示樹状細胞 (例、癌抗原を提示させた樹状細胞など)を分化誘導しても よい。
得られた榭状細胞は、例えばピペッティングなどの一般的な回収手段により回収す ること力 Sできる。
[0079] <分離材料に捕捉された単球を回収せずにその場で榭状細胞へ分化誘導する方 法 >
本方法の好ましレ、態様は、以下の工程:！）〜 4)をこの順に含む：
1)糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、体液を接触さ せることにより、分離材料に単球を捕捉させる工程、
2)分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった単球を除去する工程、
3)分離材料に捕捉された単球をさらに分化誘導して、榭状細胞を得る工程、およ び
4)分化誘導された樹状細胞を、分離材料から回収する工程。
なお、本方法においても、分離材料を上記した分離デバイスの形態で用いてもよい ことはいうまでもなレ、。
[0080] 上記工程 1)および 2)は、上述した「細胞採取方法」の工程 1)および 2)に準じて実 施すること力 Sできる。以下、工程 3)および 4)を詳細に説明する。
[0081] 分離材料がシャーレ、フラスコ、プレー バ グ カート ジ カセットなどの形熊を する
[0082] 工程 3)
工程 3)では、分離材料に捕捉された単球をさらに分化誘導して、樹状細胞を得る。 具体的には、捕捉されなかった細胞を工程 2)で洗浄除去した後、分離材料に捕捉 された単球に GM_CSF、 IL— 4などのサイト力インを含有する培養液を添加し、約 1 週間培養することにより、分離材料に捕捉された単球を未熟樹状細胞に分化させる。 その後、未熟樹状細胞を IL—1 /3、 PGE2、 IL_ 6、 TNF_ひなどのサイト力インを 含有する培養液中で約 1週間培養することにより、成熟樹状細胞に分化誘導する。 あるいは、必要に応じて、抗原提示能を獲得させる工程 (例、癌抗原の添加など）を 経て、抗原提示樹状細胞 (例、癌抗原を提示させた樹状細胞）を分化誘導してもよい
[0083] 工程 4)
工程 4)では、分化誘導された榭状細胞を、分離材料から回収する。榭状細胞は、 通常一般的に使用されるピペッティング操作、アシッド'シトレート'デキストロース液（ ACD液）ゃシトレート'フォスフェート'デキストロース液（CPD液）などの 2価カチオン キレート剤を含む細胞回収液の使用などにより、回収することができる。より高い回収 率を実現させる上では、糖含有回収液を利用した回収方法が有利である。好ましい 糖含有回収液としては、分離材料の一部を構成する糖と同種の糖含有細胞回収液、 例えば、マンノース、グルコース、ガラクトース、フコースまたはこれらの混合物を含む 糖含有細胞回収液を使用することが好ましい。糖含有回収液の糖濃度は、 0. 01% ( W/V)から該糖の 37°Cにおける飽和溶解度まで、レ、ずれの濃度でも使用可能であ る力 回収効率の点から、好ましくは 0. 1 % (W/V)〜飽和溶解度の 1/2量であり、 より好ましくは 0. 5。/0 (W/V)〜飽和溶解度の 1/5量である。また、該糖含有細胞 回収液は、必要に応じて、アシッド'シトレート'デキストロース液 (ACD液）ゃシトレー ト 'フォスフェート'デキストロース液（CPD液）などの 2価カチオンキレート剤を含んで あよい。
樹状細胞と上記細胞回収液との接触は、 3分〜 30分程度、静置あるいは振とうで 行われる。所定時間の接触後、ピペッティング、振動の付加、樹状細胞に損傷を与え ない程度に回収液を勢いよく押し出す (例えばフラッシングなど)方法などにより、樹 状細胞を回収することができる。押し出す手段としては、空気、不活性ガス、生理食 塩水などが挙げられる力 これらに限定されない。この際、回収効率を上げるために
、 4°Cまでの冷却または 37°Cまでの加温操作を併用してもよい。また、樹状細胞の回 収が不十分な場合は、上記回収操作を繰り返し行ってもよい。
[0084] 織布、 維、豸 本、 ¾{本、フィルターな の連通孔を する ffi告 {本からなる 離材^ I·» に 埴した 离デバイスを用いる
工程 3)
工程 3)では、上記分離デバイスに捕捉された単球をさらに分化誘導して、樹状細 胞を得る。捕捉されなかった単球を工程 2)で除去した後、分離デバイスに、 GM-C SF、 IL— 4などのサイト力インを含有する培養液を通液し、その後、 GM_CSF、 IL - 4などのサイト力インを含有する培養液中で約 1週間培養することにより、単球を未 熟榭状細胞に分化させる。その後、 IL—1 、 PGE2、 IL— 6、 TNF— αなどのサイ トカインを含有する培養液をさらに通液し、 IL- l i3、 PGE2、 IL— 6、 TNF— αなど のサイト力インを含有する培養液中で約 1週間培養することにより、未熟榭状細胞を 成熟榭状細胞に分化誘導する。
あるいは、必要に応じて、抗原（例、癌抗原）を含有する培養液を通液または接触さ せることによる抗原提示能を獲得させる工程を経て、抗原提示樹状細胞 (例、癌抗原 を提示させた樹状細胞)を分化誘導してもよレ、。
[0085] 工程 4)
工程 4)では、上記工程 3)で分化誘導された榭状細胞を、分離デバイスから回収す る。分化誘導された樹状細胞は、通常一般的に使用されている回収液を用いて通液 するか、あるいはアシッド 'シトレート'デキストロース液（ACD液）、シトレート'フォスフ ヱート 'デキストロース液（CPD液）などの 2価カチオンキレート剤より構成される細胞 回収液を分離デバイスに通液することにより、回収すること力 Sできる。より高い回収率 を実現させる上では、糖含有回収液を利用した回収方法が有利である。好ましい糖 含有回収液としては、分離デバイスを構成する糖と同種の糖含有細胞回収液、例え ば、マンノース、グルコース、ガラクトース、フコースまたはこれらの混合物を含む糖含 有回収液を使用することが好ましい。糖含有回収液の糖濃度は、 0. 01% (W/V) 力 該糖の 37°Cにおける飽和溶解度まで、いずれの濃度でも使用可能であるが、回 収効率の点から、好ましくは 0. 1% (W/V)〜飽和溶解度の 1/2量であり、より好ま しくは 0. 5% (WZV)〜飽和溶解度の 1Z5量である。また、該糖含有細胞回収液は 、必要に応じて、アシッド 'シトレート'デキストロース液（ACD液）ゃシトレート'フォス フェート'デキストロース液（CPD液）などの 2価カチオンキレート剤を含んでもよい。 樹状細胞と上記細胞回収液との接触は、 3分〜 30分程度接触させることが好まし レ、。接触方法としては、回収液を分離デバイスに通液後、分離デバイスを静置または 振とう状態で一定時間保持する方法、あるいは分離デバイスに回収液を循環させる 方法などが挙げられる。循環する際の流速は、 0. lml/min〜200mlZminが好ま しい。所定時間後、樹状細胞を回収する方法としては、振動の付加、樹状細胞に損 傷を与えない程度に回収液を勢いよく押し出す (例えばフラッシングなど)方法などに より榭状細胞を回収する方法が挙げられる。榭状細胞を押し出す手段としては、空気 あるいは不活性ガス、生理食塩水などが挙げられる力 本発明はこれらに限定される ものではない。この際、回収効率を上げるために、 4°Cまで冷却、あるいは 37°Cまで の加温操作を併用してもよい。また樹状細胞の回収が不十分な場合は、上記回収操 作を繰り返し行ってもよい。
[0086] <蛋白質採取方法 >
本発明の分離材料または分離デバイスを用いた蛋白質の採取方法について、以 下に詳細に説明する。
本発明の蛋白質の採取方法は、
1)糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、蛋白質含有液 を接触させることにより、分離材料に蛋白質を捕捉させる工程、
2)分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった蛋白質や蛋白質以外の物質 をを除去する工程、および
3)捕捉された蛋白質を、分離材料力も回収する工程、
をこの順に実施することを特徴とする。
[0087] まず、蛋白質含有液の調製は次のように行う。蛋白質を含む材料をトリス緩衝液 (p Η7· 4)中で破砕し、遠心分離して上清を回収する。これに 45%飽和硫酸アンモニ ゥムを添加し、十分に溶解し、 1時間以上放置した後、遠心分離して沈殿物を集め、 0. 01Mトリス緩衝液（ρΗ7· 4)で透析する。透析した溶液はイオン交換クロマトダラ フィーを行い、 目的の蛋白質画分を回収する。本発明の糖構造を有する物質を少な くとも表面の一部に含む分離材料に接触させる。
[0088] 分離材料またはその某材カ シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ、カートリッジ、力 セットな の形熊を有する場合
工程 1)
工程 1)では、糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、 蛋白質含有液を接触させることにより、分離材料に蛋白質を捕捉させる。具体的には 、対象となる蛋白質含有液を、シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ、カートリッジ、力 セットなどを基材とする本発明の分離材料に注入し、 5分〜 120分間静置または振と うすることにより、該分離材料に蛋白質含有液を接触させて、分離材料に蛋白質を捕 捉させる。蛋白質の安定した捕捉および蛋白質のダメージの低減という観点より、接 触（静置または振とう）時間は 15分〜 90分の間であることがより好ましい。
[0089] 工程 2)
工程 2)では、分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった蛋白質を除去す る。捕捉されなかった蛋白質の除去方法は、特に限定されないが、例えば、まず、ピ ペット、シリンジなどでの吸引またはデカンテーシヨンなどにより蛋白質含有液を除去 し、次いで、分離材料に緩衝溶液などを再度注入して、付着した蛋白質を洗浄除去 し、最後に、上清を前記吸引またはデカンテーシヨンなどで除去することを含む方法 などが挙げられる。捕捉されなかった蛋白質の除去が不十分な場合は、該方法を数 回繰り返してもよい。
[0090] 工程 3)
工程 3)では、捕捉された蛋白質を、分離材料から回収する。捕捉された蛋白質は 、例えば、上記工程 2)で洗浄した後の分離材料に、糖含有溶液などを接触させるこ とにより、回収すること力 Sできる。
回収液の種類は特に限定されないが、蛋白質回収率の点から、分離材料の一部 を構成する糖構造の糖と同種の糖含有溶液、例えば、マンノース、グルコース、ガラ クトース、フコースまたはこれらの混合物を含む糖含有溶液を使用するのが好ましレヽ
。糖含有溶液の糖濃度は、 0. 01% (W/V)から該糖の 37°Cにおける飽和溶解度ま で、いずれの濃度でも使用可能であるが、回収効率の点から、好ましくは 0. 1% (W /V)〜飽和溶解度の 1/2量であり、より好ましくは 0. 5% (W/V)〜飽和溶解度の 1/5量である。また、糖含有溶液にリン酸緩衝液などの緩衝液を含んでいることが好 ましい。
蛋白質と上記細胞回収液との接触は、 3分〜 30分程度、静置あるいは振とう下で 行われる。所定時間の接触後、ピペッティング、振動の付加、捕捉された蛋白質に損 傷を与えない程度に回収液を勢いよく押し出す (例えばフラッシングなど)方法などに より、蛋白質を回収することができる。押し出す手段としては、例えば、空気、不活性 ガス、生理食塩水などが挙げられる力 これらに限定されなレ、。この際、回収効率を 上げるために、 4°Cまでの冷却を併用してもよい。また、蛋白質の回収率が不十分な 場合は、上記回収操作を繰り返し行ってもよい。
不織布、繊維、多孔体、球状担体、フィルターなどの逋通孔を有する構造を有する 分離材料が容器の少なひも一部に含まれている分離デバイスを用いる場合
ここでは、特に、分離材料を分離デバイスの形態で用いる場合について説明する 工程 1)
工程 1)では、上記分離材料が液体入口および/または液体出口を有する容器 の少なくとも一部に含まれているデバイスに、蛋白質含有液を接触させることにより、 分離材料に蛋白質を捕捉させる。
上記分離デバイスを使用する場合、「分離デバイスに蛋白質含有液を接触させる 」とは、分離デバイスに蛋白質含有液を通液させることをいう。ここで、通液とは、分離 デバイスの液体入口から蛋白質含有液を導入し、一定方向に通過させて液体出口 力 排出させることをいう。分離デバイスに蛋白質含有液を導入する手段としては、シ リンジポンプ、ペリスタポンプなどの機械を用いる方法や、シリンジを用いた手動通液 、高低差を利用した自然落下処理などが挙げられるが、この限りではない。通液の速 度は、 0. lml/min〜： 100ml/minの間が好ましぐ体液を該デバイスに 1回通液さ せてもょレ、し、循環処理にて複数回通液させてもょレ、。
[0092] 工程 2)
工程 2)では、分離デバイスを洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった蛋白質を除去 する。上記分離デバイスを使用する場合は、分離デバイスに洗浄液を、液体入口か ら蛋白質含有液流入方向と同一方向に通液させることにより、捕捉されなかった蛋白 質を分離材料から除去する。洗浄液の具体例としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液 などの緩衝液が挙げられる力 この限りではない。洗浄液を導入する手段は、シリン ジポンプ、ペリスタポンプなどの機械を用いる方法や、シリンジを用いた手動通液、高 低差を利用した自然落下処理などが挙げられる力 この限りではない。ポンプにより 通液する場合の流速は、 0. lml/min〜： !OOmlZmin程度が挙げられる。洗浄液 量は、分離デバイスに用レ、る分離材料、または分離デバイスの容積により異なるが、 容積の約 1〜5倍程度の体積で洗浄することが好ましレ、。
[0093] 工程 3)
工程 3)では、捕捉された蛋白質を、分離デバイスから回収する。具体的には、上 記分離デバイスに、糖含有溶液などを通液することにより蛋白質を回収する。特に、 蛋白質の回収効率から、分離デバイス中の分離材料の一部を構成する糖構造の糖 種と同種の糖、例えば、マンノース、グルコース、ガラクトース、フコースまたはこれら の混合物を含む回収液を使用するのが好ましい。糖含有溶液の糖濃度は、 0. 01% (W/V)から該糖の 37°Cにおける飽和溶解度までのいずれの濃度でも使用可能で あるが、回収効率の点から、 0. 1% (W/V)〜飽和溶解度の 1/2量が好ましぐより 好ましくは、 0. 5% (W/V)〜飽和溶解度の 1Z5量である。また、糖含有溶液にリン 酸緩衝液などの緩衝液を含んでレ、ることが好ましレ、。上記分離デバイスと回収液とは 、 3分〜 30分程度接触させることが好ましぐ接触方法としては、静置方式、循環方 式などが挙げられる。循環する際の流速は、 0. lml/min〜200mlZminが好まし レ、。また、この際、回収効率を上げるために、 4°Cまで冷却を併用してもよい。また、蛋 白質の回収が不十分な場合は、上記回収操作を繰り返してもよい。
[0094] 本発明の方法は、特に、レクチンの採取に適している。レクチンとは、糖鎖を認識 する蛋白質の総称であり、血球や細胞表面等に存在する特定構造の糖鎖と特異的 に結合し、その血球や細胞を凝集させる活性を有している。本発明で採取したレクチ ンは、その糖鎖結合特異性、血液型特異性、抗ガン作用等を利用して、細胞分画試 薬、臨床検査試薬、臨床治療薬等として用いることができる。このような用途にはレク チンを上記の方法で分離デバイスから回収して用いても良いし、レクチン—分離デバ イス組成物のまま用いても良い。
[0095] 次に、本発明の方法において糖鎖含有高分子として用レ、られる、本発明の一般式
[1 _ 1]で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタン、一般式 [1 _ 2]で表される カルボキシノレ基修飾オリゴ糖含有ポリウレタン、一般式 [2_ 1]で表される酸修飾オリ ゴ糖含有ポリウレタンおよび一般式 [3_ 1]で表される酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含 有ポリウレタン、ならびに本発明で中間体として用いられる一般式 [1— 3]で表される オリゴ糖含有ポリウレタンについて、それぞれ詳細に説明する。
[0096] 上記一般式 [1 1]、 [1 - 2] , [1 - 3] , [2— 1]および [3— 1]において、 R1は、置 換基を有してレ、てもよレ、炭素数:!〜 16の 2価の炭化水素基である。
上記「置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基」の「炭素数 1 〜16の 2価の炭化水素基」としては、
(1)直鎖または分岐鎖の炭素数 1〜： 16の 2価の脂肪族炭化水素基 [例、直鎖または 分岐鎖の炭素数 1〜： 16のアルキレン基（例、メチレン、エチレン、テトラメチレン、ペン タメチレン、へキサメチレン、オタタメチレン、へキサデカメチレンなど）、直鎖または分 岐鎖の炭素数 2〜： 16のァルケ二レン基（例、ビニレン、プロぺニレンなど）、炭素数 3 〜 16のシクロアルキレン（例、シクロへキシレン）など]、および
(2)炭素数 6〜： 14の 2価の芳香族炭化水素基 [例、炭素数 6〜： 14のァリーレン基 (例 、フエ二レン、ナフチレン、ビフエ二レンなど）など]、ならびに
(3)前記直鎖または分岐鎖の炭素数 1〜： 16の 2価の脂肪族炭化水素基力 選ばれ る少なくとも 1つの基および炭素数 6〜： 14の 2価の芳香族炭化水素基から選ばれる 少なくとも 1つの基を含み、炭素数の合計が 7〜： 16の範囲内である炭化水素基 (例、 式
[0097] [化 19]
Figure imgf000045_0001
[0098] で表される基など）
などが挙げられる。
上記「置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基」の「置換基」と しては、例えば、
(1)炭素数 1〜6のアルキル基 (例、メチルなど）；
(2)炭素数 3〜8のシクロアルキル基（例、シクロへキシルなど）；
(3)炭素数 6〜： 14のァリール基（例、フエニルなど）；
などが挙げられる。これらの置換基は、上記「炭素数:!〜 16の 2価の炭化水素基」の 置換可能な位置に、同一または異なって、 1〜8個、好ましくは 1〜4個置換すること ができる。
[0099] R1の具体例としては、例えば、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、へキサメチレン 基、オタタメチレン基、へキサデカメチレン基、ビニレン基、プロぺニレン基、フエユレ ン基、ナフチレン基、フエニルメチレン基、フエニルエチレン基、ビフエニル基、ビスフ ェニルメチレン基、ビスフエニルエチレン基、フエ二レン基（例、パラフエ二レン基）、キ シリレン基、テトラメチルキシリレン基、トリレン基、ジシクロへキシルメチレン基、 式
[0100] [化 20]
Figure imgf000045_0002
[0101] で表される基などが挙げられ、ビスフエニルメチレン基、フエニルメチレン基およびへ キサメチレン基が好ましい。 一般式 [1 1]、 [1 - 2] , [1 - 3] , [2— 1]および [3— 1]において、 R2は、炭素数 2〜 12のォキシアルキレン基および置換基を有してレ、てもよレ、炭素数 2〜 12の 2価 の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜100単位含有する 2 価の基である。
このようなものとしては、例えば、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレンから選ばれる同 一または異なる単位を合計 1〜100単位含有する 2価の基、置換基を有していてもよ い炭素数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1 〜100単位含有する 2価の基、または炭素数 2〜12のォキシアルキレン単位および 置換基を有していてもよい炭素数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一ま たは異なる単位を合計 1〜： L00単位含有する 2価の基であってよい。
上記「炭素数 2〜 12のォキシアルキレン単位および置換基を有してレ、てもよレ、炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基」は、例えば、式一（BO) — B で表される単位および式
h-l
(E)—で表される単位（式中、 Bは、少なくとも 1種の炭素数 2〜： 12のアルキレン単位 を表し、 Eは、少なくとも 1種の、置換基を有していてもよい炭素数 2〜： 12の 2価の炭 化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を表し、 hおよび iは、それぞれ l≤h ≤100, l≤i≤100の整数である。）から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜 100単位含有する 2価の基である。
上記式—（BO) —B で表される単位における Bの「炭素数 2〜： 12のアルキレン
h-l
基」は直鎖であっても分岐していてもよぐまた、当該単位中に Bが複数存在する（2 ≤h≤100の場合）、 Bは 1種でもよいし、 2種以上でもよい。 BOの具体的なものとし ては、例えば、エチレンォキシ基、プロピレンォキシ基、トリメチレンォキシ基、ブチレ ンォキシ基、テトラメチレンォキシ基などのアルキレンォキシ基を挙げることができ、式 - (BO) —B—で表される単位の具体例としては、例えば、式 _CH -CH -0 h-l 2 2
— CH— CH— CH—で表される単位などが挙げられる。
2 2 2
上記式—（E)—で表される単位において、 Eで表される「置換基を有していてもよ い炭素数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位」における 2価の炭化水素単位は直鎖であつ ても分岐していてもよぐまた飽和基であっても不飽和基であってもよぐ例えば、炭 素数 2〜12のアルキレン（例、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、へキサメチレン 、ノナメチレンなど）、炭素数 2〜： 12のアルケニレン（例、ブタジェニレン、ブテニレン など）などが挙げられる。また、当該「炭素数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位」が有して いてもよい「置換基」としては、例えば、ハロゲン原子 (例、フッ素原子など）、炭素数 1 〜6のアルキル基 (例、メチルなど）などが挙げられる。当該単位中に Eが複数存在す る場合（2≤i≤100の場合）、 Eは 1種でも、 2種以上でもよい。
このような式一（E)—で表される単位の具体的なものとしては、例えば、エチレン基
i
、トリメチレン基、テトラメチレン基、へキサメチレン基、ノナメチレン基、一 CH -CF
2 2
— CF— CF— CF— CH —基、ブタジェニレン基、水添ブタジェニレン基、水添ィ
2 2 2 2
ソプレンの両鎖端の炭素原子から水素原子を 1個ずつ除いて誘導される基などの 2 価の基などが挙げられる。
[0103] また、 R2は、上記式一（B〇） -B- (式中、 Bおよび hは上記のとおりである）で表
h-l
される単位および/または式一（E) （式中、 Eおよび iは上記のとおりである）で表さ
i
れる単位から選ばれる単位に加えて、さらに他の繰り返し単位 [例えば、エチレンァ ジペート基、プロピレンアジペート基、ブチレンアジペート基、へキサメチレンアジべ ート基、ネオペンチルアジペート基などのアルキレンエステル基、へキサメチレンカー ボネート基などのアルキレンカーボネート基、開環力プロラタトン基、ポリ（ジメチルシ 口キシ)ジメチルシリル基などの繰り返し単位]を含有していてもよい。
このような単位を含有する R2の具体例としては、ポリエチレンアジペートジオールな どから両端の OHを除いた 2価の基、ポリ（ジメチルシ口キシ）ジメチルシリル n プ 口ピルビスエトキシ基などが挙げられる。
R2の具体例としては、エチレンォキシ基、プロピレンォキシ基、エチレンアジペート 基、プロピレンアジペート基、へキサメチレンカーボネート基、開環力プロラタトン基な どの繰り返し単位を有する 2価の基、トリメチレン基、テトラメチレン基、 _CH -CF
2 2
-CF -CF -CF -CH—基、水添ブタジェニレン基、水添イソプレンの両鎖端
2 2 2 2
の炭素原子から水素原子を 1個ずつ除いて誘導される 2価の基、ポリジメチルシロキ シジメチルシリル _n—プロピルビスエトキシ基などが好ましい。
[0104] 一般式 [1 _ 1]、 [1 - 2], [1—4]および [3— 1]における R3は、炭素数 2〜4のアル キレン基である。
具体的には、例えば、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基などを挙げる事 ができる。これらのうち、エチレン基、トリメチレン基が好ましぐエチレン基がより好ま しい。
[0105] 一般式 [1 _ 1]、 [ 1— 5]および [3— 1]における R4は、単糖または二糖由来の糖残 基を表す。糖残基とは、糖から一部の水酸基を除いた残基である。 R4に用いられる 単糖または二糖としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、ラタトースな どが挙げられる。
これらのうち、 R4としては、グルコース、マンノースおよびガラクトース由来の糖残基 が好ましく、グノレコース由来の糖残基がより好ましレ、。
[0106] 一般式 [1 _ 1]、 [1 - 2], [1 - 3] , [2 _ 1]および [3 _ 1]における〇LSは、オリゴ糖 の骨格を表す。オリゴ糖の骨格とは、オリゴ糖より全ての水酸基部分を除いた残基で ある。本発明で用いられるオリゴ糖としては、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖であれ ば特に限定されず、二糖、三糖、四糖のいずれであってもよぐ例えば、具体的には 、トレハロース、マルトース、ラタトース、セロビオースなどの二糖、サイクロ {→6) - a D ダルコビラノシルー (1→3) a D ダルコビラノシルー (1→6) a D— グノレコピラノシノレ一（1→3) - a—D—ダルコビラノシノレ一（1→}などの環状四糖など が挙げられる。そのなかでも、 トレハロース、 マルトース、ラタトースなどの二糖力 価 格と反応性の観点から好ましレ、。
一般式 [1 1]、 [1 - 2], [1 - 3] , [2— 1]および [3 1]における rは、オリゴ糖の 二級水酸基の総数を表し、例えば、 OLS力 S二糖、三糖、四糖の場合は、 rはそれぞ れ 6、 9、 12となり、 OLS力 S環状四糖の場合は、 rは 10となる。
[0107] 一般式 [1— 1]において、 pは、二塩基酸とアミノ糖で修飾された、オリゴ糖の二級水 酸基（式 _ 0 C_R3_ CO _NH_R4で表される基； R3および R4は上記で定義したと
2
おりである）の数を表し、 l≤p≤rの範囲の整数である。
一般式 [1一 1]において、 qは、二塩基酸で修飾されたオリゴ糖の二級水酸基（式 H O C-R3- CO—で表される基； R3は上記で定義したとおりである）の数を表し、 0≤
2 2
q≤r- lの範囲の整数を表す。 [0108] 一般式 [1 2]において、 p + qは、二塩基酸で修飾されたオリゴ糖の二級水酸基（ 式 HO C— R3— CO—で表される基； R3は上記で定義したとおりである）の数を表し
2 2
、それぞれ、 l≤p≤r、 0≤q≤r— 1の範囲の整数を表す。
[0109] 一般式 [1 _ 1]、 [1 - 2], [1 - 3] , [2— 1]および [3— 1]における、 m、 nは繰り返し 単位数であり、 mfま。〜 1000、 nfま:!〜 1000の整数を表し、 n/ (m+n) fま 0. 01〜1 . 00の範囲であり、吸水性、ポリマー強度、ポリマー成形性のバランスの観点から好 ましくは 0. 02〜0. 80の範囲の数である。なお、一般式 [1 _ 1]、 [1 - 2], [1 - 3] , [ 2 _ 1 ]および [ 3 _ 1 ]における繰り返し単位の配列は、規則的であつても不規則的で あってもよレヽ。
[0110] 一般式 [2_ 1]において、 sは、酸含有基で修飾されたオリゴ糖の二級水酸基の数を 表し、 l≤s≤rの範囲の整数である。ここで、「酸含有基」とは、一般式 [2— 1]におい て式 XMで表される基（式中、 Xおよび Mは上記で定義したとおりである）である。 上記 Xにおける酸由来部位としては、一般式 [2— 1]で表されるポリウレタンが所望 の特性を有する限り、いかなる種類のものでもよいが、 SOまたは P〇が好ましぐ S
3 3
O力 り好ましい。
3
上記 Mにおけるアルカリ金属原子としては、例えば、ナトリウム原子、カリウム原子、 リチウム原子などが挙げられ、好ましくはナトリウム原子、カリウム原子である。
上記 Mにおける有機アミノ基としては、例えば、炭素数 1〜6のアルキル基を 1〜3 個有するアミノ基〔例、モノ C アルキルアミノ基（例、モノメチノレアミノ基、モノェチノレ
1 -6
アミノ基、モノプロピルアミノ基、モノブチルァミノ基、モノペンチルァミノ基、モノへキ シルァミノ基）、ジ C ァノレキルアミノ基 [例、ジメチルァミノ基、ジェチルァミノ基、ジ
1 -6
プロピルアミノ基（例、ジ n—プロピルアミノ基、ジ iso_プロピルアミノ基）、ジブチルァ ミノ基]、トリ C アルキルアミノ基 (例、トリメチルァミノ基、トリェチルァミノ基）〕、炭素
1 -6
数 6〜14の芳香族ァミノ基 [例、 C ァラルキルアミノ基（例、ベンジルァミノ基）、 C
6- 14 6 芳香族複素環ァミノ基 (例、ピリジノレ基) ]などが挙げられ、好ましくはジメチルアミ
- 14
ノ基、トリメチルァミノ基、トリエチノレアミノ基、ピリジル基、ベンジルァミノ基である。
[0111] 一般式 [3 _ 1]において、 pは、酸含有基で修飾された、二塩基酸とアミノ糖で修飾 されたオリゴ糖の二級水酸基（式 _0 C_R3_C〇_NH_R4_ (XM)で表される
2 s 基; R3、
Figure imgf000050_0001
X、 Mおよび sは上記で定義したとおりである）の数を表す。ここで、「酸含 有基」とは、一般式 [3 1]において式 XMで表される基（式中、 Xおよび Mは上記で 定義したとおりである）である。
上記 Xにおける酸由来部位としては、一般式 [3— 1]のポリウレタンが所望の特性を 有する限り、いかなる種類のものでもよレ、が、 SOまたは P〇が好ましぐ SOがより好
3 3 3 ましい。
上記 Mにおけるアルカリ金属原子としては、例えば、ナトリウム原子、カリウム原子、 リチウム原子などが挙げられ、好ましくはナトリウム原子、カリウム原子である。
上記 Mにおける有機アミノ基としては、例えば、炭素数 1〜6のアルキル基を 1〜3 個有するアミノ基〔例、モノ C アルキルアミノ基（例、モノメチノレアミノ基、モノェチノレ
1 -6
アミノ基、モノプロピルアミノ基、モノブチルァミノ基、モノペンチルァミノ基、モノへキ シルァミノ基）、ジ C アルキルアミノ基 [例、ジメチルァミノ基、ジェチルァミノ基、ジ
1 -6
プロピルアミノ基（例、ジ n プロピルアミノ基、ジ iso プロピルアミノ基）、ジブチルァ ミノ基]、トリ C アルキルアミノ基 (例、トリメチルァミノ基、トリェチルァミノ基）〕、炭素
1 -6
数 6〜 14の芳香族ァミノ基 [例、 C ァラルキルアミノ基（例、ベンジルァミノ基）、 C
6- 14 6 芳香族複素環ァミノ基 (例、ピリジノレ基）]などが挙げられ、好ましくはジメチルアミ
- 14
ノ基、トリメチノレアミノ基、トリエチルァミノ基、ピリジノレ基、ベンジルァミノ基である。
[0112] 次に、本発明の一般式 [1 1 ]で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンおよ び一般式 [1 2]で表されるカルボキシノレ基修飾オリゴ糖含有ポリウレタン、ならびに 一般式 [1 3]で表されるオリゴ糖含有ポリウレタン（中間体）の製造方法を、それぞ れ説明する。
[0113] く一般式 [1— 3]で表されるオリゴ糖含有ポリウレタン（中間体)の製造方法〉
本発明において、一般式 [ 1 3]で表されるオリゴ糖含有ポリウレタンは、一般式 [ 1 - 6] :
[0114] [化 21] HO-OLS-OH
(OH)
[0115] [式中、 OLSおよび pは上記で定義したとおりである]
で表されるオリゴ糖、および必要に応じて下記一般式 [1 7]：
[0116] [化 22]
HO-R2-OH [1-7]
[0117] [式中、 R2は上記で定義したとおりである]
で表されるジオールを、下記一般式 [1 8]：
[0118] [化 23]
0 = C=N-R1-N=C = 0 [1-8]
[0119] [式中、 R1は上記で定義したとおりである]
で表されるジイソシァネートと反応させることによって、得ることが出来る。
この際、一般式 [1 6]で表されるオリゴ糖を、必要に応じて一般式 [1 7]で表さ れるジオールとの混合物とし、これを一般式 [1 8]で表されるジイソシァネートと反 応させてもよいし (ワンショット法）、あるいは、まず一般式 [1 8]で表されるジイソシ ァネートを必要に応じて一般式 [1 7]で表されるジオールと共に反応させてプレボ リマーとし、ついで一般式 [1 6]で表されるオリゴ糖を反応させてもよいし (プレポリ マー法 1)、あるいは、まず一般式 [1 6]で表されるオリゴ糖と一般式 [1 8]で表さ れるジイソシァネートとを反応させプレボリマーとし、ついで必要に応じて一般式 [1 7]で表されるジオールと反応させてもょレ、（プレボリマー法 2)。 上記反応の際には、一般式 [1 6]で表されるオリゴ糖、一般式 [1 8]で表される ジイソシァネートおよび一般式 [1 7]で表されるジオールは、それぞれ、 1種でもよ いし、 2種以上の混合物でもよい。
本発明に用いられる前記一般式 [1—8]のジイソシァネートとしては、例えば、テトラ メチレンジイソシァネート、ペンタメチレンジイソシァネート、へキサメチレンジイソシァ ンジイソシァネート、プロぺニレンジイソシァネート、ナフチレンジイソシァネート、フエ シァネート、ジフエニルェタンジイソシァネート、フエ二レンジイソシァネート（例、パラ フエ二レンジイソシァネート）、ビフエニルジイソシァネート、キシリレンジイソシァネート 、テトラメチルキシリレンジイソシァネート、トリレンジイソシァネート、イソホロンジイソシ ァネート、ジシクロへキシルメタンジイソシァネートなどが挙げられる。
また一般式 [1 7]で表されるジオールは、一級水酸基を有するジオールであれば 特に制限はなレ、。具体的には、例えば、エチレングリコール、 1 , 3—プロパンジォー ノレ、 1 , 4 ブタンジオール、 1, 6 へキサンジオール、 1 , 9ーノナンジオール、 2, 2 , 3, 3, 4, 4, 5, 5—ォクタフルオロー 1, 6—へキサンジオールなどの低分子量のジ オール；およびポリエチレングリコール、ポリテトラメチレンエーテルグリコール、ポリプ ロピレンダリコール、エチレンォキシドープロピレンォキシド共重合体、テトラヒドロフラ ンーエチレンォキシド共重合体、テトラヒドロフラン プロピレンォキシド共重合体など のポリエーテノレ系ジォーノレ、ポリエチレンアジペートグリコーノレ、ポリジエチレンアジ ペートグリコール、ポリプロピレンアジペートグリコール、ポリブチレンアジペートグリコ ール、ポリへキサメチレンアジペートグリコール、ポリネオペンチルアジペートグリコー ノレ、ポリ力プロラタトングリコールなどのポリエステル系ジオール、ポリへキサメチレン力 ーボネートグリコ一ノレなどのポリカーボネート系ジォーノレ、ポリブタジエングリコーノレ、 水添ポリブタジエングリコール、水添ポリイソプレングリコールなどのポリオレフイン系 グリコーノレ、ビス（ヒドロキシエトキシ一 n—プロピルジメチルシリル）ポリジメチルシロキ サンなどのシリコーン系ジオールなどの高分子量のジオールなどを挙げることができ る。 [0121] 上記一般式 [1 3]で表されるオリゴ糖含有ポリウレタンを製造する際の溶媒として は、反応物および生成するポリウレタンを溶解し得るものであればよい。具体的には、 たとえば、ジメチルスルホキシド（DMSO)、 N メチルー 2—ピロリドン（NMP)、 N, N—ジメチルホルムアミド（DMF)、 N, N—ジメチルァセトアミド（DMAc)などの有機 溶媒単独もしくはそれらの混合溶媒が挙げられる。
上記一般式 [1— 3]で表されるオリゴ糖含有ポリウレタンを製造する際には、例えば 、窒素など乾燥不活性ガスを通じながら、一般式 [1 _ 8]で表されるジイソシァネート を含む溶液中に、前記一般式 [1一 6]で表されるオリゴ糖、および必要に応じて一般 式 [ 1一 7]で表されるジオールを添加する。
上記反応成分の仕込みモル比は、例えば、一般式 [1一 8]で表される化合物：一般 式 [1一 7]で表される化合物：一般式 [1一 6]で表される化合物力 3 : 0. 01-2. 99 : 0. 01〜3力 S好ましく、より好ましく fま、 3 : 0. 2〜2. 5 : 0. 5〜2. 8である。
上記反応の反応温度は 10〜： 150°Cが好ましぐより好ましくは、 20〜120°Cであり 、反応時間は：!〜 10時間が好ましぐより好ましくは、 2〜6時間である。
反応終了後、一般式 [1 3]
[0122] [化 24]
— { [CO - NH - R 1 - NH - C O] - [O - R2 - O] }m— #
# - { [CO - NH— R 1 -匪一 CO] ― [O-O L S -O] } n— [ 1— 3 ]
(OH) r
[0123] [式中、 R1 R2、〇LS、 m、 nおよび rは上記で定義したとおりである]
で表されるオリゴ糖含有ポリウレタンを得ることができる。当該ポリウレタンは、例えば、 反応溶液をメタノール、アセトン、水などの単独またはこれらの混合溶媒に投入し、濾 過、洗浄、必要に応じて再沈殿精製を繰り返して得られた固体分を室温〜 100°Cで 1〜24時間程度減圧乾燥することにより、精製することができる。
[0124] <一般式 [1 _ 2]で表されるカルボキシノレ基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造方 法 > 次に、一般式 [1 2]で表されるカルボキシル基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製 造方法を説明する。
上記一般式 [1 3]で表されるオリゴ糖含有ポリウレタンを、一般式 [1 4]
[化 25]
CO— o
[ 1 - 4]
R3— C O
[0126] [式中、 は、上記で定義したとおりである]
で表される酸無水物と反応させ、オリゴ糖の二級水酸基の一部あるいは全てを修飾 して、一般式 [1一 2]
[0127] [化 26] 一 { [C O - NH— R 1— NH - C O] - [O - R2— O] }m - #
# - { [CO - NH - R 1 - NH— C O] - [O - O L S— O] 一 [ 1— 2]
/ \
(H02C- R3- C 02) p + , (OH) Γ 一,
[0128] [式中、 R1 R2、 R3、 OLS、 m、 n、 p、 qおよび rは上記で定義したとおりである] で表されるカルボキシル基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンが製造される。
上記反応は、通常、溶媒中で行う。カルボキシル基修飾の際の溶媒としては、反応 物および生成するポリウレタンを溶解し得るものであればよい。具体的には、たとえば 、ジメチルスルホキシド（DMSO)、 N メチル 2—ピロリドン（NMP)、 N, N ジメ チルホルムアミド（DMF)、 N, N ジメチルァセトアミド（DMAc)などの有機溶媒単 独もしくはそれらの混合溶媒が挙げられる。
上記一般式 [1 4]で表される酸無水物としては、コハク酸無水物、ダルタル酸無 水物、アジピン酸無水物などの二塩基酸無水物が好ましく用いられ、コハク酸無水物 が最も好ましい。当該酸無水物は、 1種を単独で用いてもよいし、 2種以上の混合物 として用いてもよい。その使用量は、ポリウレタン中の直鎖オリゴ糖の水酸基を部分的 に修飾する場合は、ポリウレタン中のオリゴ糖の二級水酸基数 (r)に対して 1〜（！ " 1 )倍モルであり、前記水酸基を完全に修飾する場合は、 r 2r倍モル、好ましくは 1· 2 r l.5r1†モノレである。
上記反応では、必要に応じて、触媒として、 4—ジメチルァミノピリジンやイミダゾー ルを 3〜： 10モル％使用することが好ましぐより好ましくは 5モル％使用する。
上記反応の反応温度は、 20〜： 100°C、好ましくは 50 90°Cであり、反応時間は、 1〜24時間、好ましくは 2 20時間である。
反応終了後、一般式 [1一 2]で表される本発明のカルボキシル基修飾オリゴ糖含有 ポリウレタンを得ることができる。当該ポリウレタンは、例えば、反応溶液をメタノール、 アセトン、水などの単独またはこれらの混合溶媒に投入してポリマーを析出させ、濾 過、洗浄、必要に応じて再沈殿精製を繰り返して得られた固体分を室温〜 100°Cで 1 24時間程度減圧乾燥して、精製することができる。
[0129] <一般式 [1 1]で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造方法 > 上記一般式 [1 2]で表されるカルボキシノレ基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンを、下 記一般式 [1 5]：
[0130] [化 27]
R4-NH2 [1-5]
[0131] [式中、 R4は上記で定義したとおりである]で表されるアミノ化糖と反応させることによ り、一般式 [1一 1]で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタン
[0132] [化 28]
-{ [CO— NH - R1 - NH— CO] - [O R2 - O] }ra - #
(02C-R3-CO-NH-R4) p
#-{ [CO— NH - R1 - NH— CO] - [O— OLS— O]し— [1— 1]
/\
(H02C-R3-C02) q (OH) [式中、 R、 R2、 R3、
Figure imgf000056_0001
p、 q、 r、 m、 nおよび OLSはそれぞれ上記で定義したとおり である]が得られる。 一般式 [ 1 5]で表されるアミノ化糖としては、例えば、ダルコ ースァミン、マンノースァミン、ラタトースァミン、ガラクトースァミンなどが好ましぐこれ らのうち、グルコースァミン、マンノースァミンがより好ましぐグルコースァミンが価格 の点で最も好ましい。また、当該アミノ化糖は、 1種を単独で用いてもよいし、 2種以上 の混合物として用いてもよい。その使用量は、 [1— 2]で表されるポリウレタン中の力 ルポキシル基数 (p + q)に対して目的とするアミノ化糖修飾数に応じて調整する。アミ ノ化糖修飾数が 1、 2の場合は、カルボキシノレ基数 (p + q)に対してそれぞれ 1、 2倍 モルであり、アミノ化糖修飾数が 3以上の場合は、カルボキシノレ基数 (p + q)に対して 3倍以上である。
上記反応は、通常、溶媒中で行う。溶媒としては、反応物および生成するポリウレタ ンを溶解し得るものであればよレ、。具体的には、例えば、ジメチルスルホキシド（DM S〇）、 N メチルー 2—ピロリドン（NMP)、 N, N ジメチルホルムアミド（DMF)、 N , N ジメチルァセトアミド（DMAc)などの有機溶媒単独もしくはそれらの混合溶媒 さらにはそれらとメタノーノレ、エタノール、水との混合溶媒が挙げられる。
上記反応は、縮合剤の存在下で行うことが好ましい。縮合剤としては、 1ーェチルー 3 - (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド（EDC) /N ヒドロキシコハク酸イミ ド（NHS)混合物、ジシクロへキシルカーボジイミド（DCC)、 4 (4, 6—ジメトキシ— 1 , 3, 5 トリァジン一 2 ィル） 4 メチルモルホリニゥムクロリド（DMT— MM)などが 用いられる。 EDC/NHS混合物、 DMT— MMが最も好ましい。その使用量は、アミ ノ化糖に対して 0· 5〜： ! · 5倍モル、好ましくは 0· 8〜： 1. 2倍モルである。
上記反応の反応温度は、 20〜60°C、好ましくは 30〜50°C、および反応時間は、 5 〜36時間、好ましくは 10〜20時間である。
反応終了後、本発明の一般式 [ 1一 1]で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレ タンを得ることができる。当該ポリウレタンは、例えば、反応溶媒を留去し、濃縮物にメ タノールや水などの単独またはこれらの混合溶媒を投入してポリマーを洗浄、濾過、 必要に応じて再沈殿精製を繰り返して得られた固体分を室温〜 100°Cで 1〜24時 間程度減圧乾燥して、精製することができる。 [0134] 本発明の上記一般式 [1 1]で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンおよ び一般式 [1 2]で表されるカルボキシノレ基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンは、上記 構造を有することにより、高分子鎖中に導入された糖構造を有する物質により形成さ れる糖集合体の密度が向上するので、種々の生物由来成分に対して優れた生理機 能 (例、単球、リンパ球、顆粒球、幹細胞、ウィルス、蛋白質などに対する捕捉機能な ど）を有し、種々の生理機能材料として用レ、ることができる。ここで、生理機能材料とし ては、例えば、本発明の上記一般式 で表されるポリウレタンまたは一般式 [1 _ 2]で表されるポリウレタンを、分離材料の基材に付与するのに適切な溶液、懸濁 液、ペースト、ポリマーブレンドなどの形態で含む組成物が挙げられ、例えば、当該 ポリウレタンを、溶媒（DMS〇、 NMP、 DMF、 DMAcなどの有機溶媒単独もしくは それらの混合溶媒、水など）に溶解または懸濁させた溶液または懸濁液、当該ポリゥ レタンと、当該ポリウレタンとは非反応性である任意のポリマーとのポリマーブレンドな どが挙げられる力 これらに限定されない。
本発明の生理機能材料は、例えば、血液などの体液と接触する用途、例えば、体 液から単球、リンパ球、顆粒球、幹細胞、ウィルス、蛋白質（レクチンなど）などを採取 するための分離材料、当該材料を用いた分離デバイス、分離フィルター (例、血液分 離フィルター、単球分離フィルター、リンパ球分離フィルター、顆粒球分離フィルター 、幹細胞分離フィルター、ウィルス分離フィルター、蛋白質分離フィルター（例、レクチ ン分離フィルターなど）など）などの各種用途に用いることができる。
[0135] <一般式 [2— 1]で表される酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造方法 >
上記一般式 [1 3]で表されるオリゴ糖含有ポリウレタンを酸修飾試薬と反応させる ことにより、本発明の一般式 [2— 1]
[0136] [化 29]
- { [C O-NH-R ^NH-C O] ― [O-R2一 O] }ra一 #
(OXM) s
I
#— { [C O- NH-R 1- NH- C O] - [O- O L S-O] } n— [ 2—1 ]
(OH) r_s [0137] [式中、各記号は上記で定義したとおりである]
で表される酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタンを得ることができる。
酸修飾試薬としては、例えば、 Xが SOの場合は、トリメチルァミン三酸化硫黄錯体
3
、トリェチルァミン三酸化硫黄錯体、ジメチルホルムアミド三酸化硫黄錯体、ピリジン 三酸化硫黄錯体、クロロスルホン酸などが用いられ、 Xが POの場合は、オルトリン酸
3
、ポリリン酸、五酸化二リン、ォキシ塩化リンなどが用いられる。
上記反応は、通常、溶媒中で行う。溶媒としては、通常、ジメチルホルムアミド、ピリ ジン、ジメチルスルフォキシド（DMSO)などが用いられ、反応温度は、通常 0°C〜80 °C、反応時間は、通常 5分〜 24時間である。必要に応じ、得られた化合物をイオン交 換樹脂（Na+タイプなど）で処理することにより、 Mをアルカリ金属原子 (例、ナトリウム 原子など）などに変換することができる。
[0138] 本発明の上記一般式 [2_ 1]で表される硫酸化オリゴ糖含有ポリウレタンは、上記 構造を有することにより、高分子鎖中に導入された糖構造を有する物質により形成さ れる糖集合体の密度が向上するので、種々の生物由来成分に対して優れた生理機 能 (例、ウィルス、蛋白質などに対する捕捉機能など)を有し、種々の生理機能材料と して用いることができる。ここで、生理機能材料としては、例えば、本発明の上記一般 式 [2— 1]で表される硫酸化オリゴ糖含有ポリウレタンを、分離材料の基材に付与す るのに適切な溶液、懸濁液、ペースト、ポリマーブレンドなどの形態で含む組成物が 挙げられ、例えば、当該ポリウレタンを、溶媒（DMSO、 NMP、 DMF、 DMAcなど の有機溶媒単独もしくはそれらの混合溶媒、水など）に溶解または懸濁させた溶液ま たは懸濁液、当該ポリウレタンと、当該ポリウレタンとは非反応性である任意のポリマ 一とのポリマーブレンドなどが挙げられる力 S、これらに限定されなレ、。
本発明の生理機能材料は、例えば、血液と接触する用途、例えば、体液から単球、 リンパ球、顆粒球、幹細胞、ウィルス、蛋白質（レクチンなど）などを採取するための分 離材料、当該材料を用いた分離デバイス、分離フィルター (例、血液分離フィルター 、単球分離フィルター、リンパ球分離フィルター、顆粒球分離フィルター、幹細胞分離 フィルター、ウィルス分離フィルター、蛋白質分離フィルター（例、レクチン分離フィノレ ターなど)など)などの用途に用レ、られる。 [0139] <一般式 [3— 1]で表される酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造方法 >
上記一般式 [1 1]で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンを、酸修飾試 薬と反応させて、本発明の一般式 [3 1]
[0140] [化 30] 一 { [C O-NH - R 1- NH- C O] - [O-R2- O] }m - #
(0,C -R3-C O-NH- R4- (XM)S) p
# - { [C O-NH- R 1 - NH-C O] - [O- O L S - O] } n— [ 3— 1 ]
/ \
(H02C- R3- C 02) q (OH) r— p一 q
[0141] [式中、各記号は上記で定義したとおりである]
で表される酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンを得ることができる。
酸修飾試薬としては、例えば、 Xが SOの場合は、トリメチルァミン三酸化硫黄錯体
3
、トリェチルァミン三酸化硫黄錯体、ジメチルホルムアミド三酸化硫黄錯体、ピリジン 三酸化硫黄錯体、クロロスルホン酸などが用いられ、 Xが POの場合は、オルトリン酸
3
、ポリリン酸、五酸化二リン、ォキシ塩化リンなどが用いられる。
上記反応は、通常、溶媒中で行う。溶媒としては、通常、ジメチルホルムアミド、ピリ ジン、ジメチルスルフォキシド（DMSO)などが用いられ、反応温度は、通常 0°C〜80 °C、反応時間は、通常 5分〜 24時間である。必要に応じ、得られた化合物をイオン交 換榭脂（Na+タイプなど）で処理することにより、 Mをアルカリ金属原子 (例、ナトリウム 原子など)などに変換することができる。
[0142] 本発明の上記一般式 [3— 1]で表される酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタ ンは、上記構造を有することにより、高分子鎖中に導入された糖構造を有する物質に より形成される糖集合体の密度が向上するので、種々の生物由来成分に対して優れ た生理機能 (例、ウィルス、蛋白質などに対する捕捉機能など)を有し、種々の生理 機能材料として用いることができる。ここで、生理機能材料としては、例えば、本発明 の上記一般式 [3— 1]で表される酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンを、分 離材料の基材に付与するのに適切な溶液、懸濁液、ペースト、ポリマーブレンドなど の形態で含む組成物が挙げられ、例えば、当該ポリウレタンを、溶媒（DMSO、 NM P、 DMF、 DMAcなどの有機溶媒単独もしくはそれらの混合溶媒、水など）に溶解ま たは懸濁させた溶液または懸濁液、当該ポリウレタンと、当該ポリウレタンとは非反応 性である任意のポリマーとのポリマーブレンドなどが挙げられる力 これらに限定され ない。
本発明の生理機能材料は、例えば、血液と接触する用途、例えば、体液から単球、 リンパ球、顆粒球、幹細胞、ウィルス、蛋白質（レクチンなど）などを採取するための分 離材料、当該材料を用いた分離デバイス、分離フィルター (例、血液分離フィルター 、単球分離フィルター、リンパ球分離フィルター、顆粒球分離フィルター、幹細胞分離 フィルター、ウィルス分離フィルター、蛋白質分離フィルター（例、レクチン分離フィノレ ターなど)など)などの用途に用レ、られる。
実施例
[0143] [実施例 A.単球の採取方法および榭状細胞の調製方法]
以下の実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定さ れるものではない。
[0144] (実施例 A1)
(1)細胞分離材料の調製
マンノビオース結合ポリスチレン誘導体（Poly〔N_p_vinylbenzyl_〇_ β _D — mannopyranosyl— (l→4)— D— mannamide] ,生ィ匕学工業 (株)製)を 0. 1 % (W/V)の濃度で蒸留水に溶解した。該溶液を市販の lmlポリスチレンシャーレ（直 径 35mm)に lml添カ卩し、室温で約 1時間静置した。つぎに、上清ポリマーを除去し た後に、生理食塩水 lml添加し、余剰のマンノビオース結合ポリスチレン誘導体を洗 浄後、上清を除去した。本操作を 3回繰り返すことにより、マンノビオース結合ポリスチ レン誘導体コーティングシャーレを調製した。
[0145] (2)単球の分離
翼付注射針を健常人上腕部に穿刺した後、リンパ球分離用チューブ (バタティナ一 チューブ (ベタトン'ディッキンソン製））に血液を約 7· 5ml採取した。採血後、該バク ティナ一チューブに 3· 8%クェン酸溶液を、血液：クェン酸 = 10 : 1になるように添加 し、該バクティナ一チューブを速やかに 3000rpm, 20min,室温にて遠心分離した 。血漿成分を回収した後に、単核球層を別途容器に回収し、生理食塩水を 40mlカロ え、 1500rpm， 5min, 4°Cで遠心分離した。本操作を数回繰り返すことにより、単核 球の洗浄を行った。洗浄した単核球を、上記で回収した血漿に再懸濁し、所定濃度 の単核球懸濁液を調製した。
[0146] 次に、調製した単核球懸濁液 lml (有核細胞数 2. O X 106cells)を（1)のマンノビォ ース結合ポリスチレン誘導体コーティングシャーレに添加した後に、 37。C、 5% COィ ンキュベータ一内にて 30分間静置した。所定時間後、上清の回収を行い、またシャ ーレは生理食塩水 lmlにて 3回洗浄を行った。つぎに 10%マンノース溶液を lml添 加し、 37°C、 5% COインキュベーター内にて 15分間静置した後に、ピペッティング にてシャーレに付着した単球の回収を行った。単球の収率は下式にて求めた。
[0147] [数 1] 単職率 （％)
= (シャーレから回収した単球 前の単球数） X 1 0 0 式 （1 )
[0148] 単球数は、シャーレから回収した細胞懸濁液中の白血球数を、血球カウンター (K X- 21NV,シスメッタス (株)製）にて測定し、該細胞懸濁液を CD14— PE蛍光抗体 (日本べタトン ·ディッキンソン (株)製）にて標識を行レ、、フローサイトメーター（BD F ACS Canto, 日本べタトン.ディッキンソン（株）製）にて単球の比率を求め、白血球 数に該単球の比率を掛けることにより求めた。なお播種前の単球数についても播種 前細胞懸濁液を対象に同様の操作を行い求めた。
[0149] 単球の純度は、シャーレから回収した細胞懸濁液を CD14— PE蛍光抗体（日本べ タトン 'ディッキンソン (株）製）にて標識を行レ、、フローサイトメーター（BD FACS Ca nto， 日本べタトン 'ディッキンソン (株)製）にて測定した。その結果、単球の回収率 7 8%、純度 96%で単球が選択的に分離回収されていることがわかった。
[0150] (実施例 A2)
マンノビオース結合ポリスチレン誘導体の代わりに、ラタトース結合ポリスチレン誘導 体 (非還元性末端の糖がガラ外ース、生化学工業 (株)製）を使用した以外は、実施 例 A1と同様の方法にて、単球の回収率、および純度を求めた。その結果、単球の回 収率は 81%、純度 73%で単球が選択的に分離回収されていることがわかった。
[0151] (実施例 A3)
マンノビオース結合ポリスチレン誘導体を、マルトース結合ポリスチレン誘導体（非 還元性末端の糖がグノレコース、生化学工業 (株)製）にした以外は、実施例 A1と同様 の方法にて、単球の回収率、および純度を求めた。その結果、単球の回収率は 76% 、純度 71。/0で単球が選択的に分離回収されていることがわかった。
[0152] (比較例 A1)
ポリマーをコーティングしないポリスチレンシャーレを用いた以外は、実施例 A1と同 様の方法にて単球の収率、純度、樹状細胞回収率を求めた。その結果、単球の回収 率は 56%、純度 46%であった。
[0153] 以上の結果を表 A1にまとめた。
[0154] [表 1] 表 A 1 ： 胞 デバイス いた の
Figure imgf000062_0001
(実施例 A4)
榭状細胞の調製：
実施例 Al (l)記載の方法に準じ調製した、単核球懸濁液 lml (有核細胞数 2. 0 X 106cells)を、実施例 Al (1)記載の方法に準じ調製したマンノビオース結合ポリスチ レン誘導体コーティングシャーレに添加した後に、 37°C、 5% COインキュベーター
2
内にて 30分間静置した。 30分後、上清を除去し、生理食塩水を lml添加後、ゆつく りとシャーレを攪拌し、上清を除去した。該洗浄操作を 5回繰り返すことにより、非捕 捉細胞の洗浄を行った。その後、 IL一 4 : 500IUZml、 GM— CSF : 500IUZmUこ なるように調製した AIM—V (GIBC〇製）培地を 1. 5ml添加し、 6日間培養を行った
[0156] 榭状細胞の回収：
培養 6日後、シャーレ上清中に浮遊している細胞を回収し、さらに、 10%マンノース 溶液を lmlシャーレに添カ卩し、 37°C、 5% COインキュベーター内にて 15分間静置し
2
た。 15分後ピペッティング操作にて、シャーレに捕捉されている細胞を回収し、先に 回収した細胞と合わせて、回収した細胞の総数を血球計算盤にて求めた。
[0157] 樹状細胞の同定：
樹状細胞の回収操作で得られた細胞懸濁液をポリプロピレン製試験管に 200 μ 1 分取し、抗じ014抗体^£標識）、ぉょび抗1^し八_01¾抗体^1丁0:票識）（ベタトン- ディッキンソン製）をそれぞれ 10 μ ΐづっ添加し、冷喑所にて 20分間静置した。所定 時間後、 1500i~pm， 5分間遠心分離を行い、上清を除去した後にリン酸緩衝液を 1 ml添加し、フローサイトメーターにて測定を行った。測定の結果、表面抗原 CD14 + かつ HLA— DR +を単球、 CD14—かつ HLA— DR +を樹状細胞とし各細胞の陽 十生率を求めた。
なお、樹状細胞の回収率は、下式（2)および（3)より求めた。
[0158] [数 2] シヤーレから回収した樹状細胞数
=シャーレから回収した総細胞数 X榭状細胞 ^4率 ' · ■式 （ 2 ) 樹柳胞回収率 (%)
= (シャ レから回収した樹状繊 ¾ /シャーレ捕捉単雌） X I 0 0 · · .式 （3 )
[0159] その結果、樹状細胞の回収率は 47. 6%であった。
[0160] (比較例 A2)
マンノビオース結合ポリスチレン誘導体ポリマーをコーティングしないポリスチレンシ ヤーレを用いた以外は、実施例 A4と同様の方法にて樹状細胞回収率を求めた。そ の結果、樹状細胞の回収率は 23. 6%であった。
[0161] 以上の結果を表 A2にまとめた。 [0162] [表 2] 表 A 2 ： バ ス い 率
Figure imgf000064_0001
1. マンノースァミン固定化細胞分離材料の調製
酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し
、この溶液を特開昭 63— 117039号公報に記載された方法 (振動法）により液滴化し 、凝固させて酢酸セルロースの球形の粒子を得た。得られた球形粒子の粒径は、約 400 μ mであった。この粒子を沈降体積比で、 4規定水酸化ナトリウム水溶液と 1： 1 ( V/V)の割合で混合し、温度 10°C〜15°C、 120分間接触させることにより、加水分 解反応を行った。得られた多孔質セルロース担体を沈降体積で 40ml分取し、 40ml の逆浸透水（Yamato Pure line R〇21、ャマト科学（株）製）を加え、内温を 40 °Cに昇温した。 2N NaOHを 24ml添カ卩し、 40°Cにて 30分間振盪した。次にェピク ロノレヒドリン 8. 2mlを添カ卩し 40°Cにて 2時間反応させた。反応終了後、約 4Lの水に て担体の洗浄を行いエポキシ化担体を得た（エポキシ導入量； 32. 9 z mol/g)。次 にマンノースァミン（シグマ（株)製、分子量 約 215) 0. 783gを、 ρΗΙΟ. 5に調製し た 0. 5M 炭酸水素ナトリウムバッファー 5 lmlに溶解した。そこへエポキシ化担体を 沈降体積で 51mlカ卩え、 37°Cにて 16時間反応を行レ、、マンノースァミンの固定化を 行った。反応終了後、洗浄液が中性になるまで担体の洗浄を行レ、、マンノースァミン 固定化担体を得た。マンノースァミン固定化担体 (沈降体積で 51ml)に逆浸透水を 加え、全量を 102mlにした。そこへモノエタノールァミン 510 /i lを加えて 45°Cにて 2 時間反応を行った。反応終了後、洗浄液が中性になるまで担体の洗浄を行い、本反 応により未反応のエポキシ基の封止反応を行った。
[0164] 2.血液 顆粒球吸着カラムの接触条件
得られた上記マンノースァミン固定化担体をへパリン (へパリンナトリウム注射液、三 菱ゥエルファーマ (株)製)加生理食塩水（へパリンの最終濃度が 5IU/mlになるよう に調製）で洗浄を行い、へパリンの平衡化を行った。次にマンノースァミン固定化担 体の脱泡を行った後、沈降体積で 1. Omlをミニカラム（アクリル製， 内径 10 mm,高さ 10 mm)に充填した。カラム入口側にポリ塩ィ匕ビニル製のチューブ（内径 1 mm,外径 3 mm,長さ 50cm)を装着し、またカラム出口側にも同様のポリ塩ィ匕ビュル製のチュ ーブ (長さ 20cm)を装着した。
[0165] 実施例 Al (1)記載の方法に準じ調製した単核球懸濁液 5ml (総有核細胞数 6. 0
X 105cells)を、流速 0. 2ml/minでミニカラムに通液を開始した。カラム出口側から 単核球懸濁液が出てきた時点を開始時点として、出口側チューブの先端を細胞ブー ル容器に戻し、灌流を 60分間行った。
[0166] [血球数の測定]
所定時間後にカラム出口側の細胞懸濁液を採取し、血球計数装置 (KX— 21NV シスメッタス（株)製)にて白血球数を測定し、単球の比率をフローサイトメーター（FA CSCanto ベタトン'ディッキンソン）にて求め、その結果を表 3に示した。
その結果、リンパ球数の変化は認められなかった力 単球数がカラム処理後大幅に 減少していることから、カラム内細胞分離材料に単球が選択的に捕捉されていること がわかった。結果を表 A3に示す。
[0167] [表 3] 表 A 3： カ ム の
Figure imgf000065_0001
[実施例 B.糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンおよびカルボキシル基修飾オリゴ糖 含有ポリウレタンの製造、ならびにその生理活性の評価]
次に、本発明の糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンおよびカルボキシノレ基修飾ォ リゴ糖含有ポリウレタンの製法を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明 はこれらに限定されるものではない。
重合に使用するモノマー化合物を次のように略称する。 〇LS =オリゴ糖骨格
TRE =トレノ、ロース
CTS =環状四糖：サイクロ {→6) - a—D—ダルコピラノシル一 (1→3)— α— D —ダルコピラノシル一（1→6) - a—D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a— D—グル コピラノシル一（1→}
MDI =メタンジフエニノレジイソシァネート
PPG4 =ポリプロピレングリコール（分子量 400)
PPG7 =ポリプロピレングリコール（分子量 700)
SUC =コハク酸無水物
GluA =ダルコースァミン
2— ManA=マンノースァミン
[0169] (合成例 B1)
MDI— PPG4— TRE (モル比 2Z1Z1)ポリウレタンの合成（プレポリマー法 1) メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）にメタンジフエ二 ルジイソシァネート (5· 85g)とジメチルァセトアミド (65ml)を入れ、攪拌しながら、室 温においてポリプロピレングリコール（平均分子量 400、 4. 68g)を加え、 1時間反応 させた。次にこの反応液にトレハロース（4. 00g)をカ卩え、この温度で 4時間反応させ た。反応溶液を濃縮後、水（500ml)に投入し、生成物を析出させ、濾過、水で洗浄 後、真空乾燥して生成物を得た (収率 81%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20; CH -
3
3. 20-3. 80; -O-CH-CH _〇一、 -CH 一、 -CH-
2 2
3. 86 ； -CH -
2
4. 30-5. 00; -0-CH-0-, 一 OH
7. 16、 7.43; -C H -
6 4
8. 65、 9. 60; -NH-CO- [0170] (合成例 B2) MDI— PPG7— TRE (モル比 2Zl Zl)ポリウレタンの合成（プレポリマー法 1) メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）にメタンジフエ二 ルジイソシァネート (4· 39g)とジメチルァセトアミド (65ml)を入れ、攪拌しながら、室 温においてポリプロピレングリコール（平均分子量 700、 6. 14g)をカ卩え、 1時間反応 させた。次にこの反応液にトレハロース（3. 00g)を加え、この温度で 4時間反応させ た。反応溶液を濃縮後、水（500ml)に投入し、生成物を析出させ、濾過、水で洗浄 後、真空乾燥して生成物を得た (収率 87%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH -
3
3. 20- - 3 . 80 ; -0-CH- CH _〇一、
2
3. 86 ； -CH
4. 30- - 5 . 00 ; -0-CH- 〇一、 -OH
7. 16、 7. 43 ; C H—
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO - (合成例 B3)
MDI— PPG4— CTS (モル比 2Z1 Z1)ポリウレタンの合成（プレポリマー法 1) メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）にメタンジフエ二 ルジイソシァネート (11 · 59g)とジメチルァセトアミド (150ml)を入れ、攪拌しながら、 室温においてポリプロピレングリコール（平均分子量 400、 9. 26g)を加え、 1時間反 応させた。次にこの反応液に環状四糖 (15. 00g)をカ卩え、この温度で 6時間反応させ た。反応溶液を濃縮後、水（1000ml)に投入し、生成物を析出させ、濾過、水で洗 浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 70%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH -
3
3. 20- 3. 80 ; -O-CH-CH _〇一、 -CH一、 -CH-
2 2
3. 86 ； -CH - 4. 30- 5. 00 ; O— CH 〇一、 OH
7. 16、 7. 43 ; — C H—
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO - (合成例 B4)
MDI_PPG7_CTS (モル比 2Zl Zl)ポリウレタンの合成（プレポリマー法 1) メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）にメタンジフエ二 ルジイソシァネート (7. 7g)とジメチルァセトアミド (175ml)を入れ、攪拌しながら、室 温においてポリプロピレングリコール（平均分子量 700、 10. 80g)を加え、 1時間反 応させた。次にこの反応液に環状四糖 (10. OOg)をカ卩え、この温度で 6時間反応させ た。反応溶液を濃縮後、水（1000ml)に投入し、生成物を析出させ、濾過、水で洗 浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 73%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH -
3
3. 20- - 3 . 80 ; -0-CH- CH 〇
2
3. 86 ； -CH
2
4. 30- - 5 . 00 ; -0-CH- 〇一、 -OH
7. 16、 7. 43 ; C H—
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO -
(実施例 B1)
MDI-PPG4-TRE (モル比 2Zl Z l )— 3SUCポリウレタンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 B1のポ リウレタン (1. 00g)とジメチルホルムアミド (25ml)を入れ、攪拌しながら、室温におい てコハク酸無水物（0. 24g)、 4—ジメチルァミノピリジン（0. 025g)をカロえた後、 70 °Cで 5時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水 (75ml)に投入し生成物を析出させ、 1M塩酸を 3滴添加し、濾過、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 95%) そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。 プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1.05、 1.20; CH -
3
2.60 ； -OCO-CH -CH COO—
2 2
3.20-3.80; -O-CH-CH _〇一、 -CH一、 -CH-
2 2
3.86 ； -CH -
2
4.30-5.00; -0-CH-0-,一 OH
7.16、 7.43; -C H -
6 4
8.65、 9.60; -NH-CO-
(実施例 B2)
MDI— PPG4—TRE (モル比 2ZlZl)_3SUC_lManAポリウレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B1のポ リウレタン（1. OOg)とジメチルホルムアミド (30ml)を入れ、攪拌しながら、室温におい て 1—ェチル—3— (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0· 57g)、 N —ヒドロキシコハク酸イミド（0· 34g)、トリエチルァミン（0.59g)を加え溶解させた。次 にこの溶液に D マンノースァミン塩酸塩 (0.53g)を加え、この温度で 24時間反応さ せた。反応溶液を濃縮後、水 (75ml)に投入し、生成物を析出させ、濾過、水で洗浄 後、真空乾燥して生成物を得た (収率 96%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1.05、 1.20; CH -
3
2.50-2.60; -OCO-CH CH— COO—
2 2
3.20-3.80; -O-CH-CH _〇一、一 CH—、 -CH-
2 2
3.86 ； -CH -
2
4.30-5.00; -0-CH-0-,一 OH
6.50 -NH-CO-
7.16、 7.43 -C H -
6 4
8.65、 9.60 -NH-CO- (実施例 B3) MDI-PPG4-TRE (モル比 2Zl Zl )— 5SUCポリウレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 B1のポ リウレタン (1. 00g)をジメチルホルムアミド (25ml)に室温において溶解させた。次に この反応液にジメチルァミノピリジン（0. 025g)を加え、攪拌しながら、コハク酸無水 物（0. 966g)を加え、 70°Cで 5時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水 (75ml)に投 入し、生成物を析出させ、 1M—塩酸を 3滴加えた。沈殿を濾過、水で洗浄後、 80°C で真空乾燥して生成物を得た (収率 91 %)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
[0176] (実施例 B4)
MDI— PPG4—TRE (モル比 2Zl Zl) _ 5SUC_ lManAポリウレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B3のポ リウレタン（1. 00g)とジメチルホルムアミド (35ml)を入れ、攪拌しながら、室温におい て 1—ェチル—3— (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0· 83g)、 N —ヒドロキシコハク酸イミド（0· 49g)、トリエチルァミン（0. 86g)を加え溶解させた。次 にこの溶液に D—マンノースァミン塩酸塩 (0. 46g)を加え、この温度で 24時間反応さ せた。反応溶液を濃縮後、アセトン（100ml)に投入し、生成物を析出させ、濾過、真 空乾燥し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 91 %)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
[0177] (実施例 B5)
MDI-PPG4-TRE (モル比 2Zl Zl ) - 5SUC— 2ManAポリウレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B3のポ リウレタン（1. 00g)とジメチルホルムアミド (35ml)を入れ、攪拌しながら、室温におい て 1 _ェチル _ 3 _ (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0. 83g)、 N —ヒドロキシコハク酸イミド（0. 49g)、トリェチルァミン（0. 86g)を加え溶解させた。次 にこの溶液に D—マンノースァミン塩酸塩 (0. 93g)を加え、この温度で 24時間反応さ せた。反応溶液を濃縮後、アセトン（100ml)に投入し、生成物を析出させ、濾過、真 空乾燥し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 91 %)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。 [0178] (実施例 B6)
MDI— PPG4—TRE (モル比2Zl Zl)—5SUC— 2GluAポリゥレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B3のポ リウレタン (1. OOg)とジメチルホルムアミド (35ml)を入れ、攪拌しながら、室温におい て 1 _ェチル _ 3 _ (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0. 83g)、 N —ヒドロキシコハク酸イミド（0. 49g)、トリエチルァミン（0. 86g)を加え、 1時間反応さ せた。次にこの反応液に D—グルコースァミン塩酸塩 (1. 24g)を加え、この温度で 24 時間反応させた。反応溶液を濃縮後、アセトン（100ml)に投入し、生成物を析出さ せ、濾過、真空乾燥し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た（収率 96%)。 そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH -
3
2. 50- - 2 60 ; -OCO-CH -CH -COO-
2 2
3. 20- - 3 80 ; -O-CH-CH 〇 -CH
2
3. 86 ； -CH
2
4. 30- - 5 00 ; O— CH 〇一、 -OH
6. 50 ； -NH-CO-
7. 16、 7. 43 ; C H—
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO -
[0179] (実施例 B7)
MDI-PPG7-TRE (モル比 2/1 /1) - 3SUCポリウレタンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 2のポリ ウレタン (1. OOg)とジメチルァセトアミド (25ml)を入れ、攪拌しながら、室温において コハク酸無水物（0. 39g)、 4—ジメチルァミノピリジン（0. 025g)をカロえた後、 70。C で 5時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水 (75ml)に投入し生成物を析出させ、 1 M塩酸を 3滴添加し、濾過、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 95%)。 そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
[0180] (実施例 B8) MDI— PPG7—TRE (モル比2Zl Zl)—3SUC—lManAポリゥレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B7のポ リウレタン (1. 00g)とジメチルァセトアミド (30ml)を入れ、攪拌しながら、室温におい て 1 _ェチル _ 3 _ (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0. 47g)、 N —ヒドロキシコハク酸イミド（028g)、トリエチルァミン（0. 82g)を加え、 1時間反応させ た。次にこの反応液に D—マンノースァミン塩酸塩 (0. 53gg)を加え、この温度で 24 時間反応させた。反応溶液を濃縮後、アセトン（100ml)に投入し、生成物を析出さ せ、濾過、真空乾燥し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た（収率 85%)。 そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
[0181] (実施例 B9)
MDI— PPG4— CTS (モル比 2Zl Zl) _ 2SUCポリウレタンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 B3のポ リウレタン (0. 80g)とジメチルホルムアミド (25ml)を入れ、攪拌しながら、室温におい てコノヽク酸無水物（0. 90g)、 4ージメチノレアミノピリジン（0. 025g)をカロえた後、 70 °Cで 5時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水 (75ml)に投入し生成物を析出させ、 1M塩酸を 3滴添加し、濾過、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 73%) そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH -
3
2. 60 ； -OCO-CH -CH COO—
2 2
3. 20- 3. 80 ; -O-CH-CH _〇一、 -CH一、 -CH-
2 2
3. 86 ； -CH -
2
4. 30- 5. 00 ; -0-CH-0- , 一 OH
7. 16、 7. 43 ; -C H -
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO - [0182] (実施例 B10)
MDI - PPG4 - CTS ( ル 2 1 U— 2SUC—1. 4GluAポリウレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B9のポ リウレタン (0. 60g)とジメチルホルムアミド (30ml)を入れ、攪拌しながら、室温におい て 1—ェチル—3— (3 ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0· 35g)、 N —ヒドロキシコハク酸イミド（0. 21g)、トリエチノレアミン（0. 52g)を加え、溶解させた。 次にこの反応液に D—グルコースァミン塩酸塩 (1. 24g)を加え、この温度で 24時間 反応させた。反応溶液をろ過、濃縮後、アセトン（100ml)に投入し、生成物を析出さ せ、濾過、真空乾燥して生成物を得た (収率 67%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH -
3
2. 50- - 2 60 ; -OCO-CH -CH -COO-
2 2
3. 20- - 3 80 ; -O-CH-CH _〇一、 -CH
2 2
3. 86 ； -CH
2
4. 30- - 5 00 ; O— CH 〇一、 -OH
6. 50 ； -NH-CO-
7. 16、 7. 43 ; C H—
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO - (実施例 B11)
MDI— PPG4— CTS (モル比 2Zl Zl)—3SUCポリウレタンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 B3のポ リウレタン (0. 800g)とジメチルホルムアミド (25ml)を入れ、攪拌しながら、室温にお いてコハク酸無水物（0. 26g)、 4—ジメチノレアミノピリジン（0. 25g)をカロえた後、 70 °Cで 5時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水 (75ml)に投入し生成物を析出させ、 1M塩酸を 3滴添加し、濾過、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 70%) そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH - 2. 60 ； -OCO-CH CH— COO—
2 2
3. 20- 3. 80 ; -O-CH-CH一〇一、一 CH—、一 CH—
2 2
3. 86 ； -CH
2
4. 30- 5. 00 ; -0-CH-0- , 一 OH
7. 16、 7. 43 ; -C H -
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO - [0184] (実施例 B12)
MDI— PPG4— CTS (モル比 2Zl Zl) _ 3SUC_ 2. 4GluAポリウレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 Bl 1の ポリウレタン (0. 35g)とジメチルホルムアミド (30ml)を入れ、攪拌しながら、室温にお いて 1 _ェチル _ 3_ (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0. 29g)、 N—ヒドロキシコハク酸イミド（0. 17g)、トリエチルァミン（0. 30g)を加え、 1時間反応 させた。次にこの反応液に D グルコースァミン塩酸塩 (0. 33g)を加え、この温度で 2 4時間反応させた。反応溶液をろ過、濃縮後、アセトン（100ml)に投入し、生成物を 析出させ、濾過、真空乾燥し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 70%) そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
[0185] (実施例 B13)
MDI— PPG4— CTS (モル比 2Zl Zl)—5SUCポリウレタンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 B3のポ リウレタン (0. 80g)とジメチルホルムアミド (25ml)を入れ、攪拌しながら、室温におい てコハク酸無水物（0. 23g)、 4—ジメチルァミノピリジン（0. 025g)をカロえた後、 70 °Cで 5時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水 (75ml)に投入し生成物を析出させ、 1M塩酸を 3滴添加し、濾過、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 60%) そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
(実施例 B 14)
MDI - PPG4 - CTS [モル比 2 / lZ 1 5SUC— 2GluAポリ レ ンの^^ メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B 13の ポリウレタン (0· 50g)とジメチルァセトアミド (30ml)を入れ、攪拌しながら、室温にお いて 1ーェチルー 3—（3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0. 38g)、 N—ヒドロキシコハク酸イミド（0. 23g)、トリエチルァミン（0. 53g)を加え、 1時間反応 させた。次にこの反応液に D—グルコースァミン塩酸塩 (0. 57g)を加え、この温度で 2 4時間反応させた。反応溶液をろ過、濃縮後、アセトン（100ml)に投入し、生成物を 析出させ、濾過、真空乾燥し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 98%) そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
[0187] (実施例 B15)
MDI— PPG4— CTS (モル比 2Zl Zl) _ 5SUC_4GluAポリウレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B 13の ポリウレタン (0. 80g)とジメチルホルムアミド (30ml)を入れ、攪拌しながら、室温にお いて 1ーェチルー 3—（3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（1. 02g)、 N—ヒドロキシコハク酸イミド（0. 60g)、トリェチルァミン（0. 70g)を加え、 1時間反応 させた。次にこの反応液に D—グルコースァミン塩酸塩 (1. 15g)を加え、この温度で 2 4時間反応させた。反応溶液をろ過、濃縮後、アセトン（100ml)に投入し、生成物を 析出させ、濾過、真空乾燥し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 71 %) そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
[0188] (実施例 B16)
MDI-PPG4-CTS (モノレ比 2Zl Zl ) - 5SUC— 3ManAポリウレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B 13の ポリウレタン（1. 00g)とジメチルホルムアミド (30ml)を入れ、攪拌しながら、室温にお いて 1 _ェチル _ 3_ (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0. 64g)、 N—ヒドロキシコハク酸イミド（0. 38g)、トリェチルァミン（0. 66g)を加え溶解させた。 次にこの溶液に D—マンノースァミン塩酸塩 (0. 72g)を加え、この温度で 24時間反 応させた。反応溶液をろ過、濃縮後、アセトン（100ml)に投入し、生成物を析出させ 、濾過、真空乾燥し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 99%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
CO 〇
〇
プロトン 1 1 1 NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH -
3
2. 60 ; -OCO-CH 一 CH— C〇〇一
2 2
3. 20- 3 80 ; -O-CH-CH 一〇一、一 CH —、一 CH—
2 2
3. 86 ； -CH -
2
4. 00 ; 一〇一 CH—〇一、 -OH
6. 50 ； -NH-CO-
7. 16、 7. 43 ; -C Η -
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO -
[0189] (実施例 B17)
MDI— PPG7— CTS (モル比 2Zl Zl)—5SUCポリウレタンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 4のポリ ウレタン (1. 00g)とジメチルホルムアミド (30ml)を入れ、攪拌しながら、室温において コハク酸無水物（0· 21g)、 4—ジメチルァミノピリジン（0. 025g)をカロえた後、 70°C で 5時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水 (75ml)に投入し生成物を析出させ、 1 M塩酸を 3滴添加し、濾過、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 87%)。
[0190] (実施例 B18)
MDI-PPG7-CTS (モノレ比 2Zl Zl ) - 5SUC— 2GluAポリウレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B 17の ポリウレタン (5. 00g)とジメチルホルムアミド (175ml)を入れ、攪拌しながら、室温に おいて 1 _ェチル _ 3_ (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（5. 62g) 、 N—ヒドロキシコハク酸イミド（3. 37g)、トリェチルァミン（5. 86g)をカロえ、 1時間反 応させた。次にこの反応液に D—グルコースァミン塩酸塩 (6. 32g)を加え、この温度 で 24時間反応させた。反応溶液をろ過、濃縮後、アセトン（300ml)に投入し、生成 物を析出させ、濾過、真空乾燥し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 7 3%)。 そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
CO 〇 〇
1. 05、 1 1 11. 20 ; CH -
3
2. 60 ; -OCO-CH -CH 一 COO—
2 2
3. 20- 3 80 ; -O-CH-CH _〇一、 -CH
2 2
3. 86 ； -CH -
2
4. 00 ; -Ο-CH-O- , -OH
6. 50 ； -NH-CO-
7. 16、 7. 43 ; — C Η—
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO -
[0191] (実施例 B18 ' )
MDI-PPG7-CTS (モノレ比 2Zl Zl ) - 5SUC— 2GluAポリウレタンの合成（縮 合剤 DMT— MM法を用いた別法）
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B 17の ポリウレタン (1. 50g)とジメチルホルムアミド (10ml)、次にメタノール (30ml)を入れ、 攪拌しながら、室温において 4 (4, 6 ジメトキシ— 1 , 3, 5 トリァジン— 2—ィル）― 4 メチルモルホリニゥムクロリド（DMT— MM) (1. 62g) /メタノール (5ml)溶液を 添加した。次にこの反応液に D グノレコースァミン塩酸塩 (1 · 26g) /水 (10ml)溶液 を加え、次いでトリェチルァミン（1. 50g)をカ卩え、室温で 9時間反応させた。反応溶 液を濃縮後、メタノール（300ml)に投入し、生成物を析出させ、濾過、メタノールで 洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 50%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
[0192] (実施例 B19)
MDI-PPG7-CTS (モノレ比 2Zl Zl ) - 5SUC— 3GluAポリウレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B 17の ポリウレタン (10. 00g)とジメチルホルムアミド (300ml)を入れ、攪拌しながら、室温に おいて 1 _ェチル _ 3_ (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（10. 83g )、 N—ヒドロキシコハク酸イミド（6. 49g)、トリエチノレアミン（11. 28g)をカロえ、 1時間 反応させた。次にこの反応液に D グルコースァミン塩酸塩 (12. 16g)を加え、この 温度で 24時間反応させた。反応溶液をろ過、濃縮後、アセトン（900ml)に投入し、 生成物を析出させ、濾過、真空乾燥し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収 率 90%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
(実施例 B20)
MDI— PPG7— CTS (モル比 2Zl Zl) _ 5SUC_ 2ManAポリウレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に実施例 B 17の ポリウレタン (1. OOg)とジメチルホルムアミド (40ml)を入れ、攪拌しながら、室温にお いて 1 _ェチル _ 3_ (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0. 50g)、 N—ヒドロキシコハク酸イミド（0. 30g)、トリェチルァミン（0. 52g)をカロえ、 1時間反応 させた。次にこの反応液に D マンノースァミン塩酸塩 (0. 56g)をカ卩え、この温度で 2 4時間反応させた。反応溶液を濃縮後、反応溶液をろ過、濃縮後、アセトン（200ml) に投入し、生成物を析出させ、濾過、真空乾燥し、水で洗浄後、真空乾燥して生成 物を得た (収率 80%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05 1. 20 ; CH -
3
2. 50- 2 60 ; -OCO-CH CH— COO—
2 2
3. 20- 3 80 ; -O-CH-CH 〇 CH
2 2
3. 86 ； 一 CH—
Figure imgf000078_0001
6. 50 ； -NH-CO-
7. 16 7. 43 ; — C Η—
6 4
8. 65 9. 60 ; -NH-CO -
<各サンプルの評価 >
1.本発明のカルボキシノレ基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンおよび糖残基修飾オリゴ 糖含有ポリウレタンの物性を、以下の（1)〜（3)の方法により評価した。 (1)分子量:実施例で製造したポリウレタン誘導体の重量平均分子量 (Mw)は、 GP C (ゲルパーミエーシヨンクロマトグラフ）法を用い、 DMF (ジメチルホルムアミド）を展 開溶媒として標準ポリエチレングリコール (PEG)を基準に RI (示差屈折計)検出器で 測定した。
(2)軟化点：実施例で製造したポリウレタンの軟化点は、融点測定装置を用いて室温 力 加熱し（5°CZ分）、サンプルが溶解した温度をもって測定した。
(3)溶剤可溶性:実施例で得られた各種ポリウレタン (0. lg)がジメチルァセトアミド（ DMAc、 1ml)に溶解するか否かを調べた。 （1)〜（3)の結果を表 B1および B2に示 す。
[0195] <ポリウレタン塗布シャーレの作製 >
合成例で得られた各種ポリウレタン（30mg)をジメチルァセトアミド（10ml)に溶解し 、メンブレンフィルターでろ過をしてポリウレタン溶液を調製した。この溶液 lmlをガラ スシャーレ（直径 35mm)に入れ 70°Cで 3時間減圧乾燥してポリウレタン塗布シヤー レを作製した。
[0196] <ポリウレタンの単球捕捉評価 >
(1)単核球の調製
翼付静注針に上記アダプターを接続し、アダプターのもう一端にホルダーを接続し た。注射針を健常人上腕部に穿刺した後、リンパ球分離用チューブ (バタティナーチ ユーブ (ベタトン'ディッキンソン製））に血液を約 7. 5ml採取した。採血後、該バクティ ナーチューブに 3. 8%クェン酸溶液を、血液：クェン酸 = 10 : 1になるように添加し、 該バクティナ一チューブを速やかに 3000rpm, 20min,室温にて遠心分離した。血 漿成分を回収した後に、単核球層を別途容器に回収し、生理食塩水を 40ml加え、 1 500rpm, 5min, 4°Cで遠心分離した。本操作を数回繰り返すことにより、単核球の 洗浄を行った。洗浄単核球に、上記で回収した血漿に再懸濁し、所定濃度のリンパ 球懸濁液を調製した。
(2)ポリウレタン塗布シャーレとの相互作用
各種ポリウレタン塗布シャーレに生理食塩水 lml添加し上清を除去した。本操作を 3回繰り返すことにより、シャーレの洗浄を行った。つぎに（1)で調製した単核球懸濁 液を lml添加した後に、 37°C、 5% COインキュベーター内にて 30分間静置した。
2
(3)単球収率、および純度の算出
所定時間後、上清の回収を行い、またシャーレは生理食塩水 lmlにて 3回洗浄を 行った。つぎに 10%マンノース溶液を lml添加し、 37。C、 5% COインキュベーター
2
内にて 15分間静置した後に、ピペッティングにてシャーレに付着した単球の回収を 行った。単球の収率は下式にてもとめた。
[0197] [数 3] シャーレから回収した単球数
単球収率 （％) = X 1 0 0 式 （1 ) 播種時単球数
[0198] 単球数は、シャーレ力ら回収した細胞懸濁液中の白血球数を血球カウンター（KX - 21NV,シスメッタス (株））にて求め、該細胞懸濁液を CD14— PE蛍光抗体（日本 ベタトン'ディッキンソン）にて標識を行い、フローサイトメーター（BD FACS Canto, 日本べタトン，ディッキンソン）にて単球の比率を求め、前記白血球数に後記単球の 比率を掛けることにより求めた。なお播種時単球数も播種時細胞懸濁液を対象に同 様にして求めた。
単球の純度は、シャーレから回収した細胞含有液を CD14— PE蛍光抗体（日本べ タトン 'ディッキンソン）にて標識を行い、フローサイトメーター（BD FACS Canto, 日 本べタトン 'ディッキンソン）にて単球の陽性率を求め純度とした。
[0199] 以上の結果を表 B1〜表 B5に示す。
[0200] [表 4]
B 1
Figure imgf000081_0001
[0201] [表 5]
表 B2
Figure imgf000081_0002
[0202] [表 6] B3
Figure imgf000082_0001
[0203] [表 7]
B4
Figure imgf000082_0002
[0204] [表 8] 表 B 5
Figure imgf000083_0001
[0205] 以上の結果から、糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンが、優れた選択的単球捕捉 能を有してレ、ることが示された。
[0206] (実施例 B21)
樹状細胞の調製：
実施例 Al (l)記載の方法に準じ調製した、単核球懸濁液 lml (有核細胞数 2. 0 X 106cells)を、実施例 Al (1)記載の方法に準じ調製したマンノース結合ポリウレタン誘 導体（実施例 B20)コーティングシャーレに添カ卩した後に、 37°C、 5% COインキュべ 一ター内にて 30分間静置した。 30分後、上清を除去し、生理食塩水を lml添加後、 ゆっくりとシャーレを攪拌し、上清を除去した。該洗浄操作を 5回繰り返すことにより、 非捕捉細胞の洗浄を行った。その後、 IL_4 : 500IUZml, GM-CSF : 500IU/ mlになるように調製した AIM_V (GIBC〇製）培地を 1. 5ml添加し、 6日間培養を 行った。
[0207] 樹状細胞の回収：
培養 6日後、シャーレ上清中に浮遊している細胞を回収し、さらに、 10%マンノース 溶液を lmlシャーレに添加し、 37°C、 5% COインキュベーター内にて 15分間静置し
2
た。 15分後ピペッティング操作にて、シャーレに捕捉されている細胞を回収し、先に 回収した細胞と合わせて、回収した細胞の総数を血球計算盤にて求めた。
[0208] 榭状細胞の同定：
榭状細胞の回収操作で得られた細胞懸濁液をポリプロピレン製試験管に 200 β 1 分取し、抗じ014抗体^£標識）、ぉょび抗1^し八_01¾抗体^1丁0:票識）（ベタトン- ディッキンソン製）をそれぞれ 10 μ ΐづっ添加し、冷喑所にて 20分間静置した。所定 時間後、 1500i~pm， 5分間遠心分離を行い、上清を除去した後にリン酸緩衝液を 1 ml添カ卩し、フローサイトメーターにて測定を行った。測定の結果、表面抗原 CD14 + かつ HLA—DR +を単球、 CD14—かつ HLA—DR +を樹状細胞とし各細胞の陽 十生率を求めた。
なお、樹状細胞の回収率は、下式 (A)および（B)より求めた。
[0209] [数 4] シヤーレから回収した榭状細胞数
=シャーレから回収した総細胞数 X榭状細胞,率 · · ■式 （A) 樹状細胞回収率 (%)
= (シャーレから回収した樹状細胞 シャーレ捕捉単赚） X 1 0 0 · · ·式 （B)
[0210] その結果、樹状細胞の回収率は 37. 2%であった。
[0211] マンノース結合ポリウレタン誘導体ポリマーをコーティングしないポリスチレンシヤー レ（比較例 A2)の樹状細胞の回収率は 23. 6%であることから、マンノース結合ポリウ レタン誘導体ポリマーは、高レ、榭状細胞回収率を有してレ、ることが示された。
[0212] [実施例 C.酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造]
次に本発明の酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタンを実施例に基づいて更に詳細に説 明する力 本発明はこれに限定されるものではない。
重合に使用するモノマー化合物などを次のように略称する。
〇LS =オリゴ糖骨格
TRE =トレノ、ロース
LAC =ラタトース MAL =マルトース
MDI =ジフエ二ノレメタンジイソシァネート PPG4 =ポリプロピレングリコール（分子量 400)
PPG7 =ポリプロピレングリコール（分子量 700)
Py =ピリジル基
(合成例 C1)
MDI PPG7—TRE (モル比 3Z2. 5/0. 5)ポリウレタンの合成（プレポリマー法 11
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）にジフエニルメタ ンジイソシァネート（4. 39g)とジメチルァセトアミド（65ml)を入れ、撹拌しながら、室 温においてポリプロピレングリコール（平均分子量 700、 10. 23g)を加え、 1時間反 応させた。次にこの反応液にトレハロース（1. 00g)をカ卩え、この温度で 4時間反応さ せた。反応溶液をメタノール/水（体積比 1/3)混合溶媒に投入し、生成物を析出さ せ、濾過し、メタノール/水溶媒で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 86%) そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMR (溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH
3
3. 20- - 3, . 80 ; -0-CH- CH O—、
2
3. 86 -CH
2
4. 30- - 5, . 00 ; -0-CH- O—、 -OH
7. 16、 7. 43 ; C H—
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO-
(合成例 C2)
MDI— PPG7— LAC (モル比 3 2. 5/0. 5)ポリウレタンの合成（プレポリマー法 11
ジフエニルメタンジイソシァネート（4. 39g)、ジメチルァセトアミド（65ml)、ポリプロ ピレンダリコール（平均分子量 700、 10. 23g)、ラタトース（1. 00g)を用いて合成例 C1と同様にして、生成物を得た (収率 90%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。 プロトン NMR (溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH -
3
3. 20- 3. 80 ; O— CH— CH— O CH CH—
2 2
3. 86 ； -CH
■1. 30- 5. 00 ; -0-CH-0- , -OH
7. 16、 7. 43 ; -C H -
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO-
(合成例 C3)
MDI— PPG7— MAL (モル比 3 2. 5/0. 5)ポリウレタンの合成（プレポリマー法 11
ジフエニルメタンジイソシァネート（4. 39g)、ジメチルァセトアミド（65ml)、ポリプロ ピレンダリコール（平均分子量 700、 10. 23g)、マルトース（1. 00g)を用いて合成例 C1と同様にして、生成物を得た (収率 93%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMR (溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH
3
3. 20- - 3, . 80 ; -0-CH- CH O—、 CH-
2
3. 86 -CH
2
4. 30- - 5, . 00 ; -0-CH- O—、 -OH
7. 16、 7. 43 ; C H—
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO-
(合成例 C4)
MDI PPG4—TRE (モル比 2Z1 Z1)ポリウレタンの合成（プレポリマー法 1) メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）にジフエニルメタ ンジイソシァネート (5. 85g)とジメチルァセトアミド (65ml)を入れ、攪拌しながら、室 温においてポリプロピレングリコール（重量平均分子量 400、 4. 68g)を加え、 1時間 反応させた。次にこの反応液にトレハロース（4. 00g)をカ卩え、この温度で 4時間反応 させた。反応溶液をメタノール Z水（体積比 1Z3)混合溶媒に投入し、生成物を析出 させ、濾過し、メタノール/水溶媒で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 81%
)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMR (溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1.20; CH -
3
3. 20-3.80; -0-CH- CH _〇一、
2
3. 86 ； -CH -
2
4. 30-5.00; -0-CH- O—、 -OH
7. 16、 7.43; -C H -
6 4
8. 65、 9.60; -NH-CO-
(実施例 C1)
MDI— PPG7—TRE (モル ]；_ヒ3/2.5 0.5)_- [SO Pv)ポリウレタンの合成
3
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 C1のポ リウレタン (1.00g)とジメチルホルムアミド（50ml)を入れ溶解させた。撹拌しながら、 室温にぉレ、てピリジン三酸化硫黄錯体 (0.06g)を加え室温で 24時間反応させた。 反応溶液を濃縮後、水を投入し、生成物を析出させ、濾過し、水で洗浄後、真空乾 燥して生成物を得た (収率 94%)。
そのプロトン NMRと IRスペクトルにより目的物であることを確認した。また、プロトン NMRのピリジノレ基の積分値からオリゴ糖 1個あたり硫酸基 2個が導入されていること が分かった。
プロトン NMR (溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1.20; CH -
3
2. 50-2.60; -OCO-CH -CH -COO
2 2
3. 20-3.80; -O-CH-CH一 O—、 -CH
2 ：
3. 86 ； -CH -
2
4. 30-5.00; -0-CH-0-, -OH
6. 50 ； -NH-CO-
7. 16、 7.43; -C H - 8. 10- 9. 00 ; — C H NH (ピリジル基）
5 5
8. 65、 9. 60 ; NH— CO—
IR (KBr) : 1040、 1120cm— 1 (SO )
3
[0218] (実施例 C2)
MDI PPG7— LAC ( ル^ 2 2. 5/0. 5) - (SO Pv)ポリウレタンの合成
3
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 C2のポ リウレタン（1. OOg)とジメチルホルムアミド（50ml)とジメチルスルホキシド（5ml)を入 れ溶解させた。撹拌しながら、室温においてピリジン三酸化硫黄錯体 (0. 06g)をカロ え室温で 24時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水を投入し、生成物を析出させ、 濾過し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 98%)。
そのプロトン NMRと IRスペクトルにより目的物であることを確認した。また、プロトン NMRのピリジノレ基の積分値からオリゴ糖 1個あたり硫酸基 2個が導入されていること が分かった。
[0219] (実施例 C3)
MDI— PPG7— MAL Cモル比 3 2· 5/0. 5) - (SO Pv)ポリウレタンの合成
3
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 C3のポ リウレタン（1. 00g)とジメチルホルムアミド（50ml)とジメチルスルホキシド（5ml)を入 れ溶解させた。撹絆しながら、室温においてピリジン三酸化硫黄錯体 (0. 06g)をカロ え室温で 24時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水を投入し、生成物を析出させ、 濾過し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 98%)。
そのプロトン NMRと IRスペクトルにより目的物であることを確認した。また、プロトン NMRのピリジノレ基の積分値からオリゴ糖 1個あたり硫酸基 2個が導入されていること が分かった。
[0220] (実施例 C4)
MDI_PPG4_TRE (ΐルt匕2Zl U_ (§〇 Pv)ポリウレタンの合成
3
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 C4のポ リウレタン（1. 00g)とジメチルホルムアミド (15ml)を入れ溶解させた。攪拌しながら、 室温においてピリジン三酸化硫黄錯体 (0. 15g)を加え 40°Cで 6時間反応させた。 反応溶液を濃縮後、メタノールを投入し、生成物を析出させ、濾過し、メタノールで洗 浄後、真空乾燥して生成物を得た。
そのプロトン NMRと IRスペクトルにより目的物であることを確認した。また、プロトン NMRのピリ 〇ジ 1ノレ基の積分値からオリゴ糖 1個あたり硫酸基 2個が導入されていること が分かった。
プロトン NMR (溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH -
3
2. . 60 ; -OCO-CH -CH 一 COO—
2 2
3. 20- 3, . 80 ; -O-CH-CH _〇一、 -CH
2 ：
3. 86 -CH -
2
4.
Figure imgf000089_0001
. 00 ; _〇_CH— O—、 -OH
6. 50 -NH-CO-
7. 16、 7. 43 ; C H—
6 4
8. 10- 9. . 00 ; — C H NH (ピリジル基）
5 5
8. 65、 9. 60 ; NH— CO—
IR (KBr) : 1040、 1120cm (SO )
3
[0221] <各サンプルの評価 >
評価方法
(1)溶剤可溶性:実施例で得られた各種ポリウレタン (0. lg)がジメチルァセトアミド（ lml)に溶解するか否かを調べた。
(2)軟化点：実施例で製造したポリウレタンの軟化点は、融点測定装置を用いて室温 力 加熱し（5°CZ分）、サンプルが溶解した温度をもって測定した。
(3)溶剤可溶性:実施例で得られた各種ポリウレタン (0. lg)がジメチルァセトアミド（ lml)に溶解するか否かを調べた。
結果を表 C1に示す。
[0222] [表 9] c i
Figure imgf000090_0001
[0223] 以上の結果から、本発明の酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタンが、熱可塑性と溶剤可 溶性を有してレ、ること力 S示された。
[0224] [実施例 D.酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタン]
次に、本発明の酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンを実施例に基づレ、て 更に詳細に説明する力 本発明はこれに限定されるものではない。
重合に使用するモノマー化合物を次のように略称する。
〇LS =オリゴ糖骨格
TRE =トレノ、ロース
MDI =ジフエ二ノレメタンジイソシァネート
PPG4 =ポリプロピレングリコール（分子量 400)
PPG7 =ポリプロピレングリコール（分子量 700)
SUC =コハク酸無水物
GluA =ダルコースァミン
ManA=マンノースァミン
Py =ピリジル基
[0225] (合成例 D1)
MDI— PPG4—TRE (モル比 2Z1 Z1)ポリウレタンの合成（プレポリマー法 1) メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）にジフエニルメタ ンジイソシァネート (5· 85g)とジメチルァセトアミド (65ml)を入れ、攪拌しながら、室 温においてポリプロピレングリコール（重量平均分子量 400、 4. 68g)を加え、 1時間 反応させた。次にこの反応液にトレハロース（4. 00g)をカ卩え、この温度で 4時間反応 させた。反応溶液をメタノール/水（体積比 1/3)混合溶媒に投入し、生成物を析出 させ、濾過し、メタノール/水溶媒で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 81 %
)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMR (溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH -
3
3. 20- 3. 80 ; -0-CH- CH _〇一、 ■CH-
2
3. 86 ； -CH -
2
4. 30- 5. 00 ; -0-CH- O—、 -OH
7. 16、 7. 43 ; -C H -
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO-
(合成例 D2)
MDI— PPG7— TRE (モル比 2Z1 Z1)ポリウレタンの合成（プレポリマー法 1) メカ二カノレスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）にジフエニルメタ ンジイソシァネート (4· 39g)とジメチルァセトアミド (65ml)を入れ、攪拌しながら、室 温においてポリプロピレングリコール（重量平均分子量 700、 6. 14g)を加え、 1時間 反応させた。次にこの反応液にトレハロース（3. 00g)をカ卩え、この温度で 4時間反応 させた。反応溶液をメタノール/水（体積比 1/3)混合溶媒に投入し、生成物を析出 させ、濾過し、メタノール/水溶媒で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 87% )。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH -
3
3. 20- 3. 80 ; -0-CH- CH _〇一、
2
3. 86 ； -CH -
2
4. 30- 5. 00 ; -0-CH- O—、 -OH
7. 16、 7. 43 ; -C H -
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO- [0227] (合成例 D3)
MDI— PPG7— TRE (モル比 3Ζ2· 5/0. 5)ポリウレタンの合成（プレポリマー法 11
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）にメタンジフエ二 ルジイソシァネート (4. 39g)とジメチルァセトアミド (65ml)を入れ、撹拌しながら、室 温においてポリプロピレングリコール（平均分子量 700、 6. 14g)をカ卩え、 1時間反応 させた。次にこの反応液にトレハロース（1. OOg)をカ卩え、この温度で 4時間反応させ た。反応溶液をメタノール/水（体積比 1/3)混合溶媒に投入し、生成物を析出させ 、濾過し、メタノール/水溶媒で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た（収率 86%)。 そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
[0228] (合成例 D4)
MDI-PPG4-TRE (モノレ比 2Zl Zl) - 3SUCポリウレタンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 1のポリ ウレタン (1. OOg)とジメチルァセトアミド (25ml)を入れ、攪拌しながら、室温において コハク酸無水物（0· 24g)、 4 ジメチルァミノピリジン（0. 025g)をカロえた後、 70°C で 5時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水 (75ml)に投入し生成物を析出させ、 1 M塩酸を 3滴添加し、濾過し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 95%) そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMR (溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH
3
2. 50- 2. 60 ; -OCO-CH -CH -COO -
2 2
3. 20- 3. 80 ; -O-CH-CH _〇一、 -CH
2 2
3. 86 ； -CH -
2
4. 30- 5. 00 ; -0-CH-0- , -OH
7. 16、 7. 43 ; -C H -
6 4
8. 65、 9. 60 ; -NH-CO-
[0229] (合成例 D5) MDI— PPG4—TRE (モル比2Zl Zl)—3SUC—lManAポリゥレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 4のポリ ウレタン（1. 00g)とジメチルホルムアミド (30ml)を入れ、攪拌しながら、室温において 1 _ェチル _ 3_ (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（EDC、 0. 57g) 、 N—ヒドロキシコハク酸イミド（0. 34g)、トリエチルァミン（0. 59g)を加え溶解させた 。次にこの溶液に D—マンノースァミン塩酸塩 (0. 53g)をカ卩え、この温度で 24時間反 応させた。反応溶液を濃縮後、水に投入し、生成物を析出させ、濾過し、水で洗浄後 、真空乾燥して生成物を得た (収率 96%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMR (溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20 ; CH -
3
2. 50- 2. 60 ; -OCO-CH -CH 一 COO—
2 2
3. 20- 3. 80 ; -O-CH-CH一〇一、一 CH—、一 CH—
2 2
3. 86 ； -CH
2
4. 30- 5. 00 ; 一〇一 CH— O—、 -OH
6. 50 ； -NH-CO- 7. 16、 7. 43 : C H—
6 4
8. 65、 9. 60 : -NH-CO-
[0230] (合成例 D6)
MDI-PPG4-TRE (モル比 2Zl Zl ) 5SUCポリウレタンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 D1のポ リウレタン (1. 00g)をジメチルァセトアミド (25ml)に室温において溶解させた。次にこ の反応液にジメチルァミノピリジン（0. 025g)をカ卩え、攪拌しながら、コハク酸無水物（ 0. 966g)を加え、 70°Cで 5時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水 (75ml)に投入 し、生成物を析出させ、 1M塩酸 (0. 25ml)をカ卩えた。沈殿を濾過し、水で洗浄後、 8 0°Cで真空乾燥して生成物を得た (収率 91%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
[0231] (合成例 D7) MDI— PPG4—TRE(モル比2ZlZl)—5SUC— 2GluAポリゥレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 5のポリ ウレタン (1. OOg)とジメチルァセトアミド (35ml)を入れ、攪拌しながら、室温において 1_ェチル _3_ (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0. 83g)、 N— ヒドロキシコノ、ク酸イミド（0. 49g)を加え、 1時間反応させた。次にこの反応液に D— グルコースァミン塩酸塩 (1. 24g)、トリェチルァミン（1. 45g)を加え、この温度で 24 時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水に投入し、生成物を析出させ、濾過し、水で 洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 96%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
プロトン NMRプロトン（溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05 1. 20; CH -
2. 50-2. 60; OCO-CH -CH -COO-
2 2
3. 20-3. 80; O-CH-CH 〇
CH CH-
3. 86 ； CH
4. 30-5. 00; -0-CH-0- OH
6. 50 -NH-CO- 7. 16 7.43 C H - 8. 65 9. 60 -NH-CO- (合成例 D8)
MDI-PPG7-TRE (モル比 2/1 /1) - 3SUCポリウレタンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 D2のポ リウレタン (2. OOg)とジメチルァセトアミド (50ml)を入れ、攪拌しながら、室温におい てコハク酸無水物（0. 79g)、 4—ジメチルァミノピリジン（0. 025g)をカロえた後、 70 °Cで 5時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水 (75ml)に投入し生成物を析出させ、 1M塩酸を 3滴添加し、濾過し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 84% そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。 [0233] (合成例 D9)
MDI— PPG7—TRE (モル比2Zl Zl)—3SUC—lManAポリゥレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 D8のポ リウレタン (1. 50g)とジメチルァセトアミド (50ml)を入れ、攪拌しながら、室温におい て 1 _ェチル _ 3 _ (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0. 47g)、 N —ヒドロキシコハク酸イミド（0. 28g)、トリエチノレアミン（0. 62g)を加え、 1時間反応さ せた。次にこの反応液に D—マンノースァミン塩酸塩 (0. 53g)を加え、この温度で 24 時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水に投入し、生成物を析出させ、濾過し、水で 洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 78%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
[0234] (合成例 D 10)
MDI— PPG7—TRE (モル比 3Z2. 5/0. 5)—5SUCポリウレタンの合成 メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 D3のポ リウレタン (5. OOg)とジメチルァセトアミド (100ml)を入れ、撹拌しながら、室温におい てコハク酸無水物（1. 15g)、 4—ジメチルァミノピリジン（0· 035g)を加えた後、 70 °Cで 5時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水 (75ml)に投入し生成物を析出させ、 1M塩酸を 3滴添加し、濾過し、水で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 98% ) 0
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
[0235] (合成例 D11)
MDI— PPG7— TRE (モル比 3/2· 5/0. 5)— 5SUC— IManAポリウレタンの メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 D 10の ポリウレタン (3. OOg)とジメチルァセトアミド (100ml)を入れ、撹拌しながら、室温にお いて 1 _ェチル _ 3_ (3—ジメチルァミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（0. 50g)、 N—ヒドロキシコハク酸イミド（0. 30g)、トリェチルァミン（0. 66g)をカロえ、 1時間反応 させた。次にこの反応液に D—マンノースァミン塩酸塩 (0. 28g)をカ卩え、この温度で 2 4時間反応させた。反応溶液を濃縮後、水に投入し、生成物を析出させ、濾過し、水 で洗浄後、真空乾燥して生成物を得た (収率 85%)。
そのプロトン NMRにより目的物であることを確認した。
(実施例 D1)
MDI_PPG4_TRE(ΐルt匕2Zl U_3SUC_lManA_CSO Ρ !ポ]^ 7レ
3
タンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 D5のポ リウレタン（0.100g)とジメチルホルムアミド (15ml)を入れ溶解させた。攪拌しながら 、室温においてピリジン三酸化硫黄錯体 (0. 15g)を加え 8時間反応させた。反応溶 液を濃縮後、水を投入し、生成物を析出させ、濾過し、水で洗浄後、真空乾燥して生 成物を得た。
そのプロトン NMRと IRスペクトルにより目的物であることを確認した。
プロトン NMR (溶媒：重ジメチルスルホキシド）
1. 05、 1. 20; CH
3
2. 50- -2. .60; -OCO-CH CH— COO—
2 2
3. 20- -3. .80; -O-CH-CH 〇一、 CH
2 ：
3. 86 CH—
2
4. 30- -5. .00; 一〇一 CH— O—、 -OH
6. 50 J -NH-CO-
7. 16、 7. 43; C H—
6 4
8. 10- -9. .00; C H Ν·Η+
5 5
8. 65、 9. 60; -NH-CO-
IR(KBr) :1040、 1120cm (SO )
3
(実施例 D2)
MDI_PPG4_TRE(モノレJ； l/l)__5SUC_2GluA_2〔SO Pv)ポリウレ
3
タンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 D7のポ リウレタン（1.00g)とジメチルホルムアミド (15ml)を入れ溶解させた。攪拌しながら、 室温においてピリジン三酸化硫黄錯体 (0.30g)を加え 8時間反応させた。反応溶液 を濃縮後、水を投入し、生成物を析出させ、濾過し、水で洗浄後、真空乾燥して生成 物を得た。
そのプロトン NMRと IRスペクトルにより目的物であることを確認した。
[0238] (実施例 D3)
MDI— PPG7—TRE ( ル^ 3Z2. 5/0. 5)_- 5SUC- lManA^SO Ρ )ポ卫
3 ウレタンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 Dl 1の ポリウレタン（1. OOg)とジメチルホルムアミド (50ml)を入れ溶解させた。撹拌しながら 、室温においてピリジン三酸化硫黄錯体 (0. 027g)を加え 8時間反応させた。反応 溶液を濃縮後、水を投入し、生成物を析出させ、濾過し、水で洗浄後、真空乾燥して 生成物を得た。
そのプロトン NMRと IRスペクトルにより目的物であることを確認した。
[0239] (実施例 D4)
MDI— PPG7— TRE ( ル比 3 2· 5/0. 5)—— 5SUC— IManA— 2 ( 〇 Ργΐ
3 ポリウレタンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 11のポ リウレタン（1. OOg)とジメチルホルムアミド (50ml)を入れ溶解させた。撹拌しながら、 室温においてピリジン三酸化硫黄錯体 (0. 054g)を加え 8時間反応させた。反応溶 液を濃縮後、水を投入し、生成物を析出させ、濾過し、水で洗浄後、真空乾燥して生 成物を得た。
そのプロトン NMRと IRスペクトルにより目的物であることを確認した。
[0240] (実施例 D5)
MDI_PPG7_TRE (^ル^ 2Z1 U_ 3SUC_ lManA_ (_SO Ρ !ポ]^ 7レ
3
タンの合成
メカニカルスターラーを装着した 4口フラスコ（窒素ガス置換済み）に合成例 8のポリ ウレタン（1. 00g)とジメチルホルムアミド (70ml)を入れ溶解させた。攪拌しながら、室 温においてピリジン三酸化硫黄錯体 (0. 078g)を加え 8時間反応させた。反応溶液 を濃縮後、水を投入し、生成物を析出させ、濾過し、水で洗浄後、真空乾燥して生成 物を得た。
そのプロトン NMRと IRスペクトルにより目的物であることを確認した。
[0241] <各サンプルの評価 >
評価方法
(1)分子量：実施例で製造したポリウレタン誘導体の重量平均分子量 (Mw)は、 DM F (ジメチルホルムアミド）を展開溶媒として標準ポリエチレン (PE)を基準に測定した
(2)軟化点：実施例で製造したポリウレタンの軟化点は、融点測定装置を用いて室温 力 加熱し（5°C/分）、サンプルが溶解した温度をもって測定した。
(3)溶剤可溶性:実施例で得られた各種ポリウレタン (0. lg)がジメチルァセトアミド（ lml)に溶解するか否かを調べた。
結果を表 D1に示す。
[0242] [表 10] D 1
Figure imgf000098_0001
[0243] 以上の結果から、糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンが、熱可塑性と溶剤可溶性 を有してレ、ることが示された。
[0244] [実施例 E.ポリウレタンのレクチン捕捉'分離評価]
(1)レクチン溶液の調製 FITCをラベルした 2種類のレクチン ConA— FITC (生化学工業 (株）製）、 WGA FITC (生ィ匕学工業（株）製）の 0. 0125、 0. 0250、 0. 050mg/mlのジン酸緩衝 液 (PH7.2)を調製した。
(2)検量線の作製：上記 2種のレクチン溶液を石英セルに取り、蛍光強度（装置名： 日本分光 (株)製、蛍光分光光度計 FP_6500、波長 519nm)を濃度に対してプロ ットし、直線が得られることを確認した。
(3)ポリウレタン塗布シャーレとの接触
実施例 B18で得られたポリウレタンを塗布したシャーレにリン酸緩衝液（ρΗ7·2)を lml添加し、上清を除去した。本操作を 3回繰り返すことによりシャーレを洗浄した。
(4) 0. 050mg/mlのリン酸緩衝液（pH7.2)の蛍光強度（I 0 )を測定した。 3mlを、実 施例 B18で得られたポリウレタンを塗布したガラスシャーレにそれぞれ入れた。 20°C で 30分放置した後、上清を石英ガラスセルに取り、蛍光強度（I )を測定した。
レクチン捕捉率は次式によって求めた。 捕捉率（％) = (1 1 -ι0)/(ι 0) χ ιοο 結果を実施例 Elおよび E2として以下の表 Eにそれぞれ示す。なお、比較のため、 ポリウレタンを塗布していないシャーレを用いて同様の実験を行った（比較例 E1およ び E2)。
[表 11]
E
Figure imgf000099_0001
実施例 B18 : MDI— PPG7— CTS〈モル比 2/1 /1 )— 5SUC— 2GluAポリウレタン 上記より、本発明の糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンは、優れたレクチン捕捉能 を有することがわ力 た。
本発明で採取したレクチンは、その糖鎖結合特異性、血液型特異性、抗ガン作用 等を利用して、細胞分画試薬、臨床検査試薬、臨床治療薬等として用いることができ る。このような用途にはレクチンをレクチン一分離デバイス組成物のまま用いても良い
産業上の利用可能性
[0247] 本発明の方法によれば、単球などの細胞またはレクチンなどの蛋白質を簡便かつ 高純度、高収率で回収することが可能となる。また、本発明の方法に従い、単球をさ らに樹状細胞へ分化誘導することによって、簡便かつ高効率に樹状細胞を調製する こと力 Sできる。
また、本発明の糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタン、カルボキシル基修飾オリゴ糖 含有ポリウレタン、酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタンおよび酸修飾糖残基修飾オリゴ糖 含有ポリウレタンは、溶媒可溶性および熱可塑性であり、フィルム形成能に優れる。さ らに、これらのポリウレタンは、特定の細胞（例、単球など）、蛋白質、ウィルスなどの 捕捉能に優れるため、細胞、蛋白質およびウィルスの分離、分析などの分野での高 機能性材料、特に、血液と接触する用途 (例、血液、細胞、単球、蛋白質などを採取 するための各種分離デバイス、分離フィルターなど)などに有用である。
また、なかでも、本発明の酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタンおよび酸修飾糖残基修 飾オリゴ糖含有ポリウレタンは、オリゴ糖または糖残基がさらに酸修飾されているので
、特定の細胞、蛋白質およびウィルスとの親和性が期待される。そのため、これらの ポリウレタンは、医療や生活用品の分野での高機能性材料として有用である。
[0248] 本出願は、 日本で出願された特願 2006— 148620、特願 2006— 149031、特願 2006— 163955および特願 2006— 179690を基礎としており、その内容は本明糸田 書にすべて包含される。また、本明細書で引用した特許文献および非特許文献は、 引用したことによってその内容の全てが開示されたと同程度に本明細書中に組み込 まれるものである。

Claims

請求の範囲
[1] 1)糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、体液を接触さ せることにより、分離材料に単球を捕捉させる工程、
2)分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった単球を除去する工程、および
3)捕捉された単球を、分離材料力 回収する工程、
をこの順に実施することを特徴とする、単球採取方法。
[2] 前記工程 3)におレ、て、マンノース、グルコース、ガラクトースおよびフコースからなる 群より選択される 1種類以上の糖を含む細胞回収用溶液を使用して単球を回収する ことを特徴とする、請求項 1記載の方法。
[3] 請求項 1または 2記載の方法によって回収された単球を、さらに分化誘導して樹状 細胞にすることを特徴とする、樹状細胞の調製方法。
[4] 1)糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、体液を接触さ せることにより、分離材料に単球を捕捉させる工程、
2)分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった単球を除去する工程、
3)分離材料に捕捉された単球をさらに分化誘導して、榭状細胞を得る工程、およ び
4)分化誘導された樹状細胞を、分離材料から回収する工程、
をこの順に実施することを特徴とする、樹状細胞の調製方法。
[5] 請求項 3または 4記載の方法によって得られた、樹状細胞含有組成物。
[6] 1)糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、蛋白質含有液 を接触させることにより、分離材料に蛋白質を捕捉させる工程、
2)分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった蛋白質を除去する工程、およ び
3)捕捉された蛋白質を、分離材料力も回収する工程、
をこの順に実施することを特徴とする、蛋白質採取方法。
[7] 蛋白質がレクチンである、請求項 6記載の方法。
[8] レクチンがコンカナパリン A (ConA)または小麦胚芽ァグルチニン (WGA)である、 請求項 7記載の方法。 請求項 6記載の方法によって得られた、レクチン含有組成物。
糖構造を有する物質が、（i)反応性官能基を有する、単糖誘導体、オリゴ糖誘導体 および/または多糖誘導体、あるいは (ii)単糖誘導体、オリゴ糖誘導体および/また は多糖誘導体を部分構造として有する糖鎖含有高分子である、請求項:!〜 4および 6 〜8のレ、ずれか 1項記載の方法。
糖構造を有する物質を構成する糖が、マンノース、グノレコース、ガラクトース、ラクト ース、フコース、トレハロース、マノレトースおよびサイクロ {→6) - a _D—グノレコピラ ノシル一（1→3) - a _D_ダルコピラノシル一（1→6) - a _D_ダルコビラノシル - (1→3) - a _D_ダルコピラノシル一（1→}からなる群から選択される少なくとも 1 つの糖である、請求項 10記載の方法。
糖構造を有する物質が、単糖誘導体、オリゴ糖誘導体および/または多糖誘導体 を部分構造として有する糖鎖含有高分子である、請求項 10記載の方法。
糖鎖含有高分子が、
下記一般式 [1 1] :
[化 1]
- { [CO 題— R 1— NH— C O] — [O— R2— O] } —#
(02C -R3- CO-NH- R4) p
# { [C O— NH—R 1— NH—C O] — [O— O L S— O] } n— [ 1— 1 ]
/ \
(H02C-R3-C 02) q (OH) r p一
[式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表し、 OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r—lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/ (m + n)は 0. 01〜： 1. 00の範囲の数である。 ]
で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンである、請求項 12記載の方法。
[14] 糖鎖含有高分子が、下記一般式 [1一 2]：
[化 2]
- { [CO— NH— R i— NH— CO] — [O— R2— O] }m- #
#ー{ [C O - NH - R 1—匪一 CO] - [O-O L S -O] } n- [ 1— 2]
八
(H02C- R3-C02) p + q (OH) r一 p— q
[式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、 rはオリゴ糖の二級水酸基 の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r—lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/ (m + n)は 0. 01〜： 1. 00の範囲の数である。 ]
で表されるカルボキシル基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンである、請求項 12記載の方 法。
[15] 糖鎖含有高分子が、下記一般式 [2— 1]：
[化 3] 一 { [CO- NH- R1- NH-CO] - [O- R2_0] }m-ff
(OXM)s
I
#— { [CO-NH— R1— NH- CO] - [O- OLS— O] }n—
I
(OH) ―
[式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、 R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
XMは酸含有基（式中、 Mは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム基又は有機 アミノ基を表し、 Xは酸由来部位を表す）を表し、
sは、酸含有基で修飾されたオリゴ糖の二級水酸基の数を表し、 l≤s≤rの範囲の整 数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/(m + n)は 0· 01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表される酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタンである、請求項 12記載の方法。
糖鎖含有高分子が、下記一般式 [3— 1]：
[化 4]
— { [CO-NH-R!-NH-CO] - [O - R2 - O] }ra— #
(02C-R3-CO-NH-R -(XM)) p
#-{ [CO- NH-Ri-NH- CO] - [O-OLS-O] }n- [3— 1]
八
(H02C-R3-C02) q (OH) r— p— q [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表し、
XMは酸含有基（式中、 Mは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム基又は有機 アミノ基を表し、 Xは酸由来部位を表す）を表し、
sは、酸含有基で修飾された糖残基 R4の水酸基数を表し、 l≤s≤4の範囲の整数を 表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r—lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/(m + n)は 0· 01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表される酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンである、請求項 12記載の方 法。
下記一般式 [1 1]:
[化 5]
-i [CO— NH— R1—匪一 CO] - [O— R2— O] }m— #
(02C - R3- C O-NH- R4) D
#— { [CO— NH— R1—匪一 CO] - [O-OLS-O] }n - [1— 1]
/ \
(H02C-R3-C02) q (OH) r— p— a
[式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、 R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r_lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し 、n/(m + n)は 0.01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタン。
[18] R3が、エチレン基である、請求項 17記載のポリウレタン。
[19] R4が、グルコース、マンノースまたはガラクトース由来の糖残基である、請求項 17記 載のポリウレタン。
[20] オリゴ糖力 トレハロース、マルトースまたはラタトースである、請求項 17記載のポリ ウレタン。
[21] オリゴ糖力 サイクロ {→6)― a D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a— D—ダルコ ピラノシル一（1→6) - a—D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a—D—ダルコピラノ シルー（1→}である、請求項 17記載のポリウレタン。
[22] 下記一般式 [1 2]：
[化 6]
-{ [CO 題— R1 - NH - CO] - [O - R2—0] }m— #
ff-{ [CO 題— R1—匪— CO] - [O-OLS-O] }n- [1-2]
(H02C-R3-C02) p + q (OH) r_p_q
[式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、 R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r_lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し 、n/(m + n)は 0.01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表される、カルボキシノレ基修飾オリゴ糖含有ポリウレタン。
[23] R3が、エチレン基である、請求項 22記載のポリウレタン。
[24] R4が、グルコース、マンノースまたはガラクトース由来の糖残基である、請求項 22記 載のポリウレタン。
[25] オリゴ糖力 トレハロース、マルトースまたはラタトースである、請求項 22記載のポリ ウレタン。
[26] オリゴ糖力 サイクロ {→6)― a—D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a— D—ダルコ ピラノシル一（1→6) - a—D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a—D—ダルコピラノ シルー（1→}である、請求項 22記載のポリウレタン。
[27] 下記一般式 [2— 1]:
[化 7]
-{ [CO- NH- R1- NH - CO] - [O- R2-0] }m—#
(OXM)s
#ー{ [CO- NH - R1 - NH- CO] - [O- OLS- O] }n— [2— 1]
ほ中、 R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
XMは酸含有基（式中、 Mは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム基又は有機 アミノ基を表し、 Xは酸由来部位を表す）を表し、
sは、酸含有基で修飾されたオリゴ糖の二級水酸基の数を表し、 l≤s≤rの範囲の整 数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し 、 n/ (m + n)は 0. 01〜： 1. 00の範囲の数である。 ]
で表される、酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタン。
[28] Xが SOまたは POである、請求項 27記載のポリウレタン。
3 3
[29] Xが SOである、請求項 27記載のポリウレタン。
3
[30] R3が、エチレン基である、請求項 27記載のポリウレタン。
[31] R4が、グルコース、マンノースまたはガラクトースである、請求項 27記載のポリウレタ ン。
[32] オリゴ糖力 トレハロース、マルトースまたはラタトースである、請求項 27記載のポリ ウレタン。
[33] オリゴ糖力 サイクロ {→6)― a —D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a— D—ダルコ ピラノシル一 (1→6) - a _D—グノレコピラノシノレ一（1→3) - a _D—グノレコピラノ シル一（1→}である、請求項 27記載のポリウレタン。
[34] 下記一般式 [3— 1] :
[化 8] 一 { [CO-NH-R ^NH-C O] - [O- R2- O] } m— #
(02C— R3— CO— NH - Rし（XM)S) p
I
#ー{ [CO - NH - R i-NH- CO] - [O- O L S- O] } n— [3— 1 ]
(H02C - R3— C 02) q (OH) r_p_q
[式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表し、
XMは酸含有基（式中、 Mは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム基又は有機 アミノ基を表し、 Xは酸由来部位を表す）を表し、
sは、酸含有基で修飾された糖残基 R4の水酸基数を表し、 l≤s≤4の範囲の整数を 表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r—lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し 、 n/ (m + n)は 0· 01〜： 1. 00の範囲の数である。 ]
で表される、酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタン。
[35] Xが S〇または POである、請求項 34記載のポリウレタン。
3 3
[36] Xが S〇である、請求項 34記載のポリウレタン。
3
[37] R3が、エチレン基である、請求項 34記載のポリウレタン。
[38] R4が、グルコース、マンノースまたはガラクトースである、請求項 34記載のポリウレタ ン。 [39] オリゴ糖力 トレハロース、マルトースまたはラタトースである、請求項 34記載のポリ ウレタン。
[40] オリゴ糖力 サイクロ {→6)― a —D—ダルコビラノシノレ一（1→3) - a— D—ダルコ ピラノシル一 (1→6) - a _D—グノレコピラノシノレ一（1→3) - a _ D—グノレコピラノ シル一（1→}である、請求項 34記載のポリウレタン。
[41] 1)糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む分離材料に、体液を接触さ せることにより、分離材料に細胞を捕捉させる工程、
2)分離材料を洗浄液で洗浄して、捕捉されなかった細胞を除去する工程、および
3)捕捉された細胞を、分離材料力 回収する工程、
をこの順に実施することを特徴とする、細胞採取方法であって、
糖構造を有する物質が、請求項 17〜40のいずれか 1項に記載のポリウレタンであ ることを特徴とする、方法。
[42] 糖構造を有する物質を少なくとも表面の一部に含む単球分離材料であって、糖構 造を有する物質が、（i)反応性官能基を有する、単糖誘導体、オリゴ糖誘導体および /または多糖誘導体、あるいは (ii)単糖誘導体、オリゴ糖誘導体および/または多糖 誘導体を部分構造として有する糖鎖含有高分子である、単球分離材料。
[43] 糖構造を有する物質を構成する糖が、マンノース、グノレコース、ガラクトース、ラクト ース、フコース、トレハロース、マルトースおよびサイクロ {→6) - a—D—ダルコビラ ノシルー（1→3) - a—D—ダルコピラノシル一（1→6) - a—D—ダルコビラノシル - (1→3) - a—D—ダルコピラノシル一（1→}からなる群から選択される少なくとも 1 つの糖である、請求項 42記載の単球分離材料。
[44] 糖構造を有する物質を構成する糖が、マンノース、グノレコース、ガラクトース、ラクト ースおよびフコースからなる群から選択される少なくとも 1つの糖である、請求項 43記 載の単球分離材料。
[45] フィルターの形状を有する、請求項 42〜44のいずれか 1項記載の単球分離材料。
[46] 液体入口および Zまたは液体出口を有する容器を備えた単球分離デバイスであつ て、
当該容器の少なくとも一部に請求項 42〜45のいずれ力 4項記載の単球分離材料 が含まれることを特徴とする、単球分離デバイス。
請求項 17〜40のいずれか 1項記載のポリウレタンを含む生理機能材料。
請求項 17〜40のいずれか 1項記載のポリウレタンを少なくとも表面の一部に含む 分離材料。
細胞分離材料である、請求項 48記載の分離材料。
単球分離材料である、請求項 49記載の分離材料。
蛋白質分離材料である、請求項 48記載の分離材料。
レクチン分離材料である、請求項 51記載の分離材料。
コンカナパリン A (ConA)または小麦胚芽ァグノレチュン (WGA)分離材料である、 請求項 52記載の分離材料。
血液分離材料である、請求項 48記載の分離材料。
フィルターの形状を有する、請求項 48〜54のいずれか 1項記載の分離材料。 液体入口および/または液体出口を有する容器を備えた分離デバイスであって、 当該容器の少なくとも一部に請求項 48〜55記載の分離材料が含まれることを特徴 とする、分離デバイス。
細胞分離デバイスである、請求項 56記載の分離デバイス。
単球分離デバイスである、請求項 57記載の分離デバイス。
蛋白質分離デバイスである、請求項 56記載の分離デバイス。
レクチン分離デバイスである、請求項 59記載の分離デバイス。
コンカナパリン A (ConA)または小麦胚芽ァグノレチニン (WGA)分離デバイスであ る、請求項 60記載の分離デバイス。
下記一般式 [1一 3]：
[化 9]
- { [CO— NH— R 1— NH— C O] ― [〇一 R2— O] }m— #
#— { LCO— NH— R 1— NH— C O] - [O— O L S— O] } - [ 1 - 3 ]
(OH) [式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、 R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/(m + n)は 0.01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表されるオリゴ糖含有ポリウレタンに、下記一般式 [1—4]：
[化 10]
CO— O
I I [1-4]
R3— CO
[式中、 R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表す。 ]で表される酸無水物を反応させ ることを特徴とする、下記一般式 [1_2]：
[化 11]
-{ [CO— NH— R1— NH— CO] - [O— R2— O] }m— #
#-{ [CO— 一 R1—丽一 CO] — [O-OLS-O] }n— [1-2]
/\
(H02C-R3-C02) p + q (OH) r— p—q
[式中、 R1 R2、 R3、 m、 n、 p、 q、 rおよび〇LSはそれぞれ上記で定義したとおりであ る]で表されるカルボキシル基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造方法。
下記一般式 [1 2]：
[化 12] -{ [CO— NH— R1—匪一 CO] - [O— R2— O] }m— # tf— { [CO—NH—R1—題— CO] — [O-OLS-O] }n— [1— 2]
(H02C— R3— C02) p + q (OH) r— p
[式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r—lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/(m + n)は 0· 01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表されるカルボキシル基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンを、
下記一般式 [1 5]：
[化 13]
Rし NH2 [1-5]
[式中、 R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表す。 ]で表されるアミノ化糖と反応さ せることを特徴とする、下記一般式
[化 14] 一 { [CO— NH— R1— NH— CO] - [O— R2— O] 一 #
(02C— R3—CO—匪— R4) p
I
#-{ [CO—NH - R1— NH— CO] - [O-OLS-O] }n- [1— 1]
/ \
(H02C-R3-C02) , (OH) ni
[式中、 R1 R2、 R3、 R4、 p、 q、 r、 m、 nおよび OLSはそれぞれ上記で定義したとおり である]
で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造方法。
[64] 下記一般式 [1一 3] :
[化 15]
-{ [CO-NH-R^NH-CO] 一 [O— R2— O] し一 #
#ー{ LCO— NH— R1— NH—CO] - [O—OLS— O] 一 [1-3]
[式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、 R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し 、n/(m + n)は 0· 01〜： 1.00の範囲の数である。 ]
で表されるオリゴ糖含有ポリウレタンを、酸修飾試薬と反応させることを特徴とする、下 記一般式 [2— 1]:
[化 16] -{ [CO -匪- Ri-NH-CO] - [O- R2-0] }m— #
(OXM)s
I
#— { [CO-NH-R1- NH - CO] - [O-OLS-O] }n- [2—1]
(OH) r_s
[式中、 Xは、酸由来部位を示し、他の記号は上記と同義である。 ]
で表される酸修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造方法。
[65] 酸修飾試薬が、硫酸化試薬またはリン酸化試薬である、請求項 64記載の製造方法
[66] 酸修飾試薬が、硫酸化試薬である、請求項 65記載の製造方法。
[67] 下記一般式 [1一 1]:
[化 17]
-{ [CO— NH— R1—題一 CO] — [O— R2— O] }m— #
(02C— R3— CO—薦ー R4) p
I
#-{ [CO— NH— R1—匪一 CO] - [O-OLS-O] }n— [1— 1]
/\
(H02C-R3-C02) q (OH)「p— ,
[式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、 R2は、炭 素数 2〜 12のォキシアルキレン単位および置換基を有してレ、てもよレ、炭素数 2〜 12 の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100単位含有 する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表し、 OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r—lの範囲の整数を表し、
m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し
、n/ (m + n)は 0. 01〜： 1. 00の範囲の数である。 ]
で表される糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンを、酸修飾試薬と反応させることを特 徴とする、下記一般式 [3— 1] :
[化 18]
- { [CO-NH-R x-NH-C O] - [0-R2-0] } m— #
(02C- R3- C O-NH-R4- (XM)S) p #— { [CO-NH-R 1— NH— CO] - [O- O L S— O] } n- [3— 1 ]
(H02C - R3 - C02) q (OH) Γ— p一 Q
[式中、
R1は、置換基を有していてもよい炭素数 1〜： 16の 2価の炭化水素基を表し、
R2は、炭素数 2〜： 12のォキシアルキレン単位および置換基を有していてもよい炭素 数 2〜： 12の 2価の炭化水素単位から選ばれる同一または異なる単位を合計 1〜： 100 単位含有する 2価の基を表し、
R3は、炭素数 2〜4のアルキレン基を表し、
R4は、単糖または二糖由来の糖残基を表し、
XMは酸含有基（式中、 Mは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム基又は有機 アミノ基を表し、 Xは酸由来部位を表す）を表し、
sは、酸含有基で修飾された糖残基 R4の水酸基数を表し、 l≤s≤4の範囲の整数を 表し、
OLSは、一級水酸基を 2個有するオリゴ糖の骨格を表し、
rはオリゴ糖の二級水酸基の総数を表し、
pおよび qはそれぞれ l≤p≤r、 0≤q≤r_ lの範囲の整数を表し、 m、 nはそれぞれ繰り返し単位数であり、 mは 0〜： 1000、 nは 1〜1000の整数を表し 、n/ (m + n)は 0· 01〜： 1. 00の範囲の数である。 ]
で表される、酸修飾糖残基修飾オリゴ糖含有ポリウレタンの製造方法。
[68] 酸修飾試薬が、硫酸化試薬またはリン酸化試薬である、請求項 67記載の製造方法
[69] 酸修飾試薬が、硫酸化試薬である、請求項 68記載の製造方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009057574A1 (ja) * 2007-10-30 2009-05-07 Kaneka Corporation ポリウレタン誘導体およびそれを用いた白血球除去用フィルター材
JP2009207381A (ja) * 2008-03-03 2009-09-17 Kaneka Corp 単球捕捉用デバイス
WO2013069503A1 (ja) * 2011-11-09 2013-05-16 株式会社カネカ 幹細胞分離方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130202675A1 (en) 2012-02-03 2013-08-08 Dynasil Biomedical Corporation Systems and methods for the fabrication of tissue patches
US9833538B2 (en) 2015-08-07 2017-12-05 Xcede Technologies, Inc. Adhesive compositions and related methods
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US9540548B1 (en) 2015-08-07 2017-01-10 Xcede Technologies, Inc. Adhesive compositions and related methods

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08119994A (ja) * 1994-10-19 1996-05-14 Ryoji Nakagawa キクイモ由来のレクチンおよびその分離精製法
JPH11315091A (ja) * 1998-03-05 1999-11-16 Agency Of Ind Science & Technol 硫酸化ガラクトース化合物及びその中間体並びに該硫酸化ガラクトース化合物の製造方法
WO2000058443A1 (fr) * 1999-03-30 2000-10-05 Netech Inc. Procede de separation selective de cellules sanguines au moyen de lectine
WO2002055021A2 (en) * 2001-01-12 2002-07-18 Univ Emory Glycopolymers and free radical polymerization methods
WO2003004616A2 (en) * 2001-07-05 2003-01-16 Phylogix, Inc. Dendritic cell isolation methods
WO2003033522A1 (en) * 2001-10-19 2003-04-24 Natimmune A/S Isolation of lectins
WO2003050532A1 (fr) * 2001-12-11 2003-06-19 Netech Inc. Systeme de separation de cellules sanguines
WO2004072262A2 (en) * 2003-02-10 2004-08-26 Northwest Biotherapeutics, Inc. Cultured cd14+ antigen presenting cells
WO2005070964A1 (ja) * 2004-01-27 2005-08-04 Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. 単球の単離方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08119994A (ja) * 1994-10-19 1996-05-14 Ryoji Nakagawa キクイモ由来のレクチンおよびその分離精製法
JPH11315091A (ja) * 1998-03-05 1999-11-16 Agency Of Ind Science & Technol 硫酸化ガラクトース化合物及びその中間体並びに該硫酸化ガラクトース化合物の製造方法
WO2000058443A1 (fr) * 1999-03-30 2000-10-05 Netech Inc. Procede de separation selective de cellules sanguines au moyen de lectine
WO2002055021A2 (en) * 2001-01-12 2002-07-18 Univ Emory Glycopolymers and free radical polymerization methods
WO2003004616A2 (en) * 2001-07-05 2003-01-16 Phylogix, Inc. Dendritic cell isolation methods
WO2003033522A1 (en) * 2001-10-19 2003-04-24 Natimmune A/S Isolation of lectins
WO2003050532A1 (fr) * 2001-12-11 2003-06-19 Netech Inc. Systeme de separation de cellules sanguines
WO2004072262A2 (en) * 2003-02-10 2004-08-26 Northwest Biotherapeutics, Inc. Cultured cd14+ antigen presenting cells
WO2005070964A1 (ja) * 2004-01-27 2005-08-04 Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. 単球の単離方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009057574A1 (ja) * 2007-10-30 2009-05-07 Kaneka Corporation ポリウレタン誘導体およびそれを用いた白血球除去用フィルター材
JP2009207381A (ja) * 2008-03-03 2009-09-17 Kaneka Corp 単球捕捉用デバイス
WO2013069503A1 (ja) * 2011-11-09 2013-05-16 株式会社カネカ 幹細胞分離方法
JPWO2013069503A1 (ja) * 2011-11-09 2015-04-02 株式会社カネカ 幹細胞分離方法

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