JP6669314B2 - 糖鎖又は糖ペプチドの精製剤及びその使用 - Google Patents
糖鎖又は糖ペプチドの精製剤及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6669314B2 JP6669314B2 JP2019537017A JP2019537017A JP6669314B2 JP 6669314 B2 JP6669314 B2 JP 6669314B2 JP 2019537017 A JP2019537017 A JP 2019537017A JP 2019537017 A JP2019537017 A JP 2019537017A JP 6669314 B2 JP6669314 B2 JP 6669314B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sugar chain
- carrier
- glycopeptide
- monosaccharide
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/32—Bonded phase chromatography
- B01D15/325—Reversed phase
- B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
- B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
- B01J20/261—Synthetic macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon to carbon unsaturated bonds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
- B01J20/28011—Other properties, e.g. density, crush strength
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
- B01J20/28016—Particle form
- B01J20/28019—Spherical, ellipsoidal or cylindrical
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
- B01J20/288—Polar phases
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3268—Macromolecular compounds
- B01J20/327—Polymers obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3291—Characterised by the shape of the carrier, the coating or the obtained coated product
- B01J20/3293—Coatings on a core, the core being particle or fiber shaped, e.g. encapsulated particles, coated fibers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/30—Partition chromatography
- B01D15/305—Hydrophilic interaction chromatography [HILIC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8836—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving saccharides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
- G01N30/52—Physical parameters
Description
〔2〕前記ベタイン構造が下記式(1)で表される構造である、[1]に記載の精製剤。
〔3〕前記カチオン性基が4級アンモニウム基である、〔1〕又は〔2〕に記載の精製剤。
〔4〕前記アニオン性基がリン酸基である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の精製剤。
〔5〕前記ベタイン構造が、ホスホリルコリン基である、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の精製剤。
〔6〕前記化合物が、ベタイン構造を有する側鎖が主鎖に結合したポリマーである、〔1〕〜〔5〕のいずれか一項に記載の精製剤。
〔7〕前記ポリマーが、(メタ)アクリル化合物を含む単量体の重合体である、〔6〕に記載の精製剤。
〔8〕〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の精製剤が、不溶性支持体に固定された、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製用担体。
〔9〕〔6〕又は〔7〕に記載の精製剤が、不溶性支持体に固定された、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製用担体。
〔10〕前記不溶性支持体に固定された前記ポリマーの重量が、前記不溶性支持体の単位表面積(m2)当たり0.5mg〜1.5mgである、〔9〕に記載の精製用担体。
〔11〕前記不溶性支持体が、無機物質により構成されている、〔8〕〜〔10〕のいずれかに記載の精製用担体。
〔12〕比重が、1.05〜3.00である、〔8〕〜〔11〕のいずれかに記載の精製用担体。
〔13〕形状が球状であり、平均粒径が0.5μm〜100μmである、〔8〕〜〔12〕のいずれかに記載の精製用担体。
〔14〕〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の精製剤又は〔8〕〜〔13〕のいずれかに記載の精製用担体と、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドと有機溶剤を含む試料とを接触させ、前記精製剤又は精製用担体に前記糖鎖又は前記糖ペプチドを吸着させることと、上記精製剤又は精製用担体を水に接触させ、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを溶出させることと、を含む、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製方法。
〔15〕〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の精製剤又は〔8〕〜〔13〕のいずれかに記載の精製用担体、及び、キット使用のためのプロトコル情報を含む、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のためのキット。
〔16〕〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の精製剤又は〔8〕〜〔13〕のいずれかに記載の精製用担体を収容した容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬類を導入する試薬導入部と、を備える、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のための装置。
〔P3〕前記ベタイン構造のアニオン部位が、リン酸基を含む上記〔P1〕又は〔P2〕の担体。
〔P4〕前記ベタイン構造が、ホスホリルコリンである前記〔P1〕〜〔P3〕のいずれかの担体。
〔P5〕前記ポリマーが、(メタ)アクリル化合物を含む単量体由来の重合体により構成されている上記〔P1〕〜〔P4〕のいずれかの担体。
〔P7〕前記不溶性支持体が、無機物質により構成されている上記〔P1〕〜〔P6〕のいずれか一項に記載の担体。
〔P8〕比重が、1.05〜3.00である上記〔P1〕〜〔P7〕のいずれか一項に記載の担体。
〔P9〕形状が球状であり、平均粒径が0.5μm〜100μmである上記〔P1〕〜〔P8〕のいずれかの担体。
〔P13〕前記糖ペプチドを濃縮する工程が、バッチ法、又は、スピンカラム法による濃縮工程である上記〔P12〕に記載の糖ペプチドの濃縮方法。
〔P15〕前記糖鎖を濃縮する工程が、バッチ法、又は、スピンカラム法による濃縮工程である上記〔P14〕に記載の糖鎖の濃縮方法。
〔P19〕前記容器の収容物を固液分離する固液分離部を更に備える上記〔P18〕の糖ペプチド濃縮のための装置。
〔P21〕前記容器の収容物を固液分離する固液分離部を更に備える上記〔P20〕の糖鎖濃縮のための装置。
1実施形態において、本発明は、ベタイン構造を有する化合物からなる、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製剤を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の精製剤により、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを効率よく精製することができる。
以下、重合開始剤0.01mmol以上10mmol以下の割合で用いられる。
1.糖ペプチドの濃縮
本実施形態に係る精製剤は、糖ペプチドの濃縮のために好適に用いることができ、糖ペプチドを特異的に捕捉するため、糖鎖を有しない遊離のペプチド断片等の夾雑物を除去して糖ペプチドを濃縮することができる。ここで、濃縮とは、濃縮前に比べて糖ペプチドの濃度や存在比を高めることを意味し、例えば、糖タンパク質の分解物等の糖ペプチドと遊離のペプチド断片等の夾雑物が混在する試料から、糖ペプチドを選択的に回収すること等が含まれる。
本実施形態に係る精製剤は、糖鎖の濃縮のために好適に用いることができ、糖鎖を特異的に捕捉するため、糖鎖以外の夾雑物(タンパク、ペプチド、脂質、塩等)を除去して糖鎖を濃縮することができる。ここで、濃縮とは、濃縮前に比べて糖鎖の濃度や存在比を高めることを意味し、例えば、糖タンパク質から遊離した糖鎖とペプチド断片等の夾雑物が混在する試料から、糖鎖を選択的に回収すること等が含まれる。
1実施形態において、本発明は、上述した精製剤と、単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドと有機溶剤を含む試料とを接触させ、前記精製剤に単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを吸着させることと、上記精製剤を水に接触させ、単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを溶出させることと、を含む、単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製方法を提供する。
カスパーゼ、サブチリシン等が挙げられるが、これらに限定するものではない。
バッチ法による濃縮の場合には、糖ペプチドを含む試料と実施形態に係る精製剤を適当な容器(例えば、マイクロチューブや遠心管、マイクロプレート等)中で反応液に浸漬させ、当該精製剤に糖ペプチドを捕捉させる。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。続いて、担体−糖ペプチド複合体を固液分離し、遊離のペプチド断片等の夾雑物を含む液相部分を除去し当該担体を回収する。固液分離は、重力による自然沈降や遠心分離等により行うことができ、吸引等により液相部分を除去することができる。また、フェライト等の磁性材料を当該担体の不溶性支持体に含ませることで磁力を用いて当該担体を集積することにより固液分離を行ってもよい。その場合には遠心分離等を行う必要はない。また、フィルターに通液させるろ過によって固液分離を行ってもよく、その際には、減圧下又は加圧下で行ってもよい。
スピンカラム法による濃縮の場合には、フィルター等を内蔵した容器、例えば、フィルターカップ等を用いて行うことができる。フィルターカップとしては、例えば上部と下部に開口部を有し、下部の開口部がフィルターで被覆されているものを用いることができる。フィルターカップを用いる場合には、実施形態に係る精製剤を充填したフィルターカップに、糖ペプチドを含有する試料溶液を投入して通液により当該担体と試料を反応液下で接触させる。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。通液は、重力による自然落下、及び遠心分離等を行ってもよく、また、減圧下若しくは加圧下で通液させてもよい。通液後、担体を通過した遊離のペプチド断片等が含まれる排液を除去する。
1実施形態において、本発明は、上述した精製剤と、単糖以上の長さの糖鎖と有機溶剤を含む試料とを接触させることと、前記精製剤に単糖以上の長さの糖鎖を吸着させることと、上記精製剤を水に接触させ、単糖以上の長さの糖鎖を溶出させることと、を含む、単糖以上の長さの糖鎖の精製方法を提供する。
本実施形態に係る糖ペプチド濃縮のためのキットは、実施形態に係る精製剤、及び、当該キット使用のためのプロトコル等を使用説明書として含んで構成される。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。使用説明書は、紙又はその他の媒体に書かれたもの又は印刷されたものでもよく、磁気テープ、磁気ディスク、光ディスク等の電子媒体に記録されたものでもよい。このように、糖ペプチドの濃縮方法の実施に必要な試薬類をキットとして提供することができる。
本実施形態に係る糖鎖濃縮のためのキットは、実施形態に係る精製剤、及び、当該キット使用のためのプロトコル等を使用説明書として含んで構成される。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。使用説明書は、紙又はその他の媒体に書かれたもの又は印刷されたものでもよく、磁気テープ、磁気ディスク、光ディスク等の電子媒体に記録されたものでもよい。このように、糖鎖の濃縮方法の実施に必要な試薬類をキットとして提供することができる。
1実施形態において本発明は、上述した精製剤を収容した容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬を導入する試薬導入部とを備える、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のための装置を提供する。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。
(2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン由来の構成単位を含むポリマーがシリカビーズに固定化している担体)
本合成例では、シリカビーズ表面上での2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン由来の構成単位を含むポリマー(以下、「MPCポリマー」と記載する。)の合成を例示して説明するが、本発明の範囲を限定する意図ではない。
連鎖移動基を有するシランカップリング剤である(3−メルカプトプロピル)トリメトキシシラン(東京化成工業株式会社製M0928)5gをpH3.0の酢酸水溶液50mLとエタノール50mLとの混合液に添加し、1時間室温で撹拌することでシランカップリング剤を加水分解した後に、不溶性支持体の一例としての無機粒子であるシリカビーズ(平均粒径5μm、細孔径70Å、富士シリシア化学株式会社製SMB70−5)5gを投入し70℃で2時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、100℃で1時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
ポリマーの構成単位となる2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(以下、「MPCモノマー」と記載、日本油脂株式会社製)を、エタノールに溶解させ、0.8mol/Lのモノマー溶液を20mL作製した。そこにAIBNを0.027mol/Lになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ4gを投入し、アルゴンガス雰囲気下、70℃で6時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、エタノールに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりシリカビーズを回収し、乾燥させることで、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン由来の構成単位を含むポリマーがシリカビーズに固定化している担体(以下、単に「担体」と記載する。)を得た。
上記で得られた担体の表面に導入された、ポリマーを含む層の重量は、TGA装置(セイコーインスツルメント社製TG/DTA6200)を用いて、空気雰囲気中、室温から500℃へ10℃/分で昇温し、さらに500℃を1時間維持した後の重量減少率を測定した。この値と、別途BET法で求めた単位重量当たりの粒子の表面積から、粒子の表面に導入された、ポリマーを含む層の重量を算出したところ、1.08mg/m2であった。
本実施例では、上記<合成例>で作製した担体の物性について、固液分離物性の観点から確認した。
本比較例では、セファロースビーズの物性について、固液分離物性の観点から確認し、実施例1との比較により、上記<合成例>で作製した担体の物性と比較した。
本実施例では、上記<合成例>で作製した担体を用いて試料からの糖ペプチドの濃縮をバッチ式及びスピンカラムの双方により確認した。
5mg RNaseB(SIGMA)に超純水50μL、1M 重炭酸アンモニウム水溶液5μL、120mM ジチオスレイトール溶液5μLを加えて、60℃で30分間反応させた。その後、123mM ヨードアセトアミド水溶液10μLを加え、遮光して室温で1時間反応させた。トリプシン400unitを加え、一晩反応させた。超純水を適量加えて、タンパク質の濃度が50μg/μLとなるように調製した。
A.バッチ式の場合
1.5mLサンプルチューブに当該ビーズ1mgを添加した。実施例1の溶液Aを200μL加えてビーズを分散させたのち、卓上遠心機を用いて数秒間遠心した。溶液を除いたのち、試料溶液(上記(1)で調製した溶液1μL、超純水99μL、実施例1の溶液A600μLの混合液)を上記<合成例>で作製した担体の入ったチューブに加え、激しく撹拌した。その後、卓上遠心機を用いて遠心し、担体を沈ませ、溶液を除去した。続いて、エタノール:ブタノール:水(体積比 1:5:1、洗浄液とする)700μLを加えて激しく撹拌後、遠心により担体を沈ませ、溶液を除去した。さらに、50%エタノール水溶液700μLを加えて激しく撹拌後、遠心により担体を沈ませ、溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させ超純水13μLに再溶解させた。
スピンカラム(Ultrafree−MC, Millipore Cat#: UFC30HVNB)に上記<合成例>で作製した担体1mgを添加した。実施例1の溶液A 200μLを加えた後、卓上遠心機を用いて数秒間遠心し溶液を除いた。試料溶液(上記(1)で調製した溶液1μL、超純水99μL、実施例1の溶液A 600μLの混合液)を担体の入ったスピンカラムに加え、卓上遠心機を用いて遠心して溶液を除去した。続いて、洗浄液700μLを加え、遠心により溶液を除去した。さらに、50%エタノール水溶液700μLを加えた後、遠心により溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させ超純水13μLに再溶解させた。
上記(2)で調製した各溶液のうち3μLを用いて、表2の条件を用いてLC−MS分析を実施した。得られたトータルイオンクロマトグラムを図3に示す。図3中、横軸は保持時間を(分)を表し、縦軸はシグナル強度(相対値)を表す。糖ペプチド回収処理をする前のサンプルには、シグナルが多数存在していることが確認された(図3の上図)。一方、本発明の手法により糖ペプチドを回収した試料溶液では、シグナルが大幅に減少し、メインのシグナルが一本になっていることを確認した(図3の下図)。このメインピーク(溶出時間5.2〜5.8分)のMS結果を図4に示した。図4中、横軸はm/z値を表し、縦軸はシグナル強度(相対値)を表す。ヘキソース1個に該当する等間隔のピークが多数検出され、RNaseBの代表的な糖鎖である高マンノースが結合したペプチド由来のピークであることを確認した。本発明の手法を用いることで、糖ペプチドを容易に濃縮可能であることを確認した。
本実施例では、上記<合成例>で作製した担体を用いて、試料からの糖鎖濃縮をスピンカラムを用いて確認した。
デキストランの加水物分解物より調製したグルコースのオリゴマー(生化学工業製。品番:800111)を1mg/mLになるように超純水に溶解させ、糖鎖溶液とした。
スピンカラム(Ultrafree−MC, Millipore Cat#: UFC30HVNB)に上記<合成例>で作製した担体10mgを添加した。超純水200μLを加えた後、卓上遠心機を用いて数秒間遠心し溶液を除いた。上記(1)で調製した溶液10μLにアセトニトリル990μLを加えてよく混合した後、担体の入ったスピンカラムに加え、卓上遠心機を用いて遠心して溶液を除去した。続いて、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。再度、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。超純水100μLを加えた後、遠心により溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させた。
上記(2)で得られた乾燥体に2AB標識液(0.35M 2−アミノベンズアミド、1M シアノ水素化ホウ素ナトリウムになるように30%酢酸/70%ジメチルスホキシド溶媒に溶解させた溶液)を10μL加えた。60度で2時間反応させた後、超純水90μLを加えた。
上記(3)で調製した各溶液のうち1μLを用いて、表2の条件を用いてHPLC分析を実施した。得られたピークのうちグルコース1糖〜10糖に該当するピークの面積値を確認した。得られた結果を図5に示す。コントロールサンプルとは、グルコースオリゴマー溶液10μLを乾燥させた後、(3)の工程のみを実施したサンプルを指す。担体により糖鎖回収を実施したサンプルとコントロールのサンプルとで結果がほぼ同じであり、担体を用いて糖鎖を回収するにあたり、糖鎖のロスがほとんど生じないことを確認した。
本比較例では、従来公知のクリーンアップカラム(シリカベースの担体を含むカラム)を用いて糖鎖の濃縮を行い、実施例3の上記<合成例>で作製した担体を用いた糖鎖濃縮との比較を行った。
実施例3と同様の手順により行った。
クリーンアップカラム(住友ベークライト、BS−45403付属品)に超純水200μLを加えた後、卓上遠心機を用いて数秒間遠心し溶液を除いた。糖鎖溶液の準備(上記(1))で調製した溶液10μLにアセトニトリル990μLを加えてよく混合した後、クリーンアップカラムに加え、卓上遠心機を用いて遠心して溶液を除去した。続いて、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。再度、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。超純水100μLを加えた後、遠心により溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させた。
実施例3と同様の手順により行った。
実施例3と同様の手順により行い、得られたピークのうちグルコース1糖〜10糖に該当するピークの面積値を確認した。得られた結果を図6に示す。コントロールサンプルとは、グルコースオリゴマー溶液10μLを乾燥させた後、(3)の工程のみを実施したサンプルを指す。クリーンアップカラムにより糖鎖回収を実施したサンプルからは、単糖、二糖のロスが大きいことを示すデータが得られた。従来公知のクリーンアップカラムは、O型糖鎖のような小さい糖鎖の回収には不十分であることを確認した。
本比較例では、従来公知のグラファイトカーボンを用いて糖鎖の濃縮を行い、実施例3の上記<合成例>で作製した担体を用いた糖鎖濃縮との比較を行った。
実施例3と同様の手順により行った。
グラファイトカーボンカラム(シグマアルドリッチ、スペルクリンENVI−Carb C)にアセトニトリル1mLを通液させた。さらに、水3mLを通液させた。続いて、糖鎖溶液の準備(上記(1))で調製した溶液10μLと0.1%酢酸水90μLを混合し、グラファイトカーボンカラムに通液させた。水3mLを通液させ、グラファイトカーボンを洗浄した。0.22μmのフィルターを装着した後、超純水100μLを通液させ、溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させた。
実施例3と同様の手順により行った。
実施例3と同様の手順により行い、得られたピークのうちグルコース1糖〜10糖に該当するピークの面積値を確認した。得られた結果を図7に示す。コントロールサンプルとは、グルコースオリゴマー溶液10μLを乾燥させた後、(3)の工程のみを実施したサンプルを指す。グラファイトカーボンカラムにより糖鎖回収を実施したサンプルでは、全体的に糖のロスが発生し、当該サンプルからは、特に、単糖、二糖では全く糖が回収できていないことを示すデータが得られた。従来公知のグラファイトカーボンは、小さい糖鎖(単糖、二糖等)の回収には特に不向きであることを確認した。
本実施例では、架橋ポリスチレン骨格に下記式(2)で表されるベタイン構造を導入した精製剤を用いて、試料からの糖鎖濃縮をスピンカラムを用いて確認した。
実施例3と同様の手順により行った。
スピンカラム(Ultrafree-MC, Millipore Cat#: UFC30HVNB)に、上述の精製剤10mgを添加した。アセトニトリル200μLを加えた後、卓上遠心機を用いて数秒間遠心し溶液を除いた。上記(1)で調製した溶液10μLにアセトニトリル990μLを加えてよく混合した後、精製剤の入ったスピンカラムに加え、卓上遠心機を用いて遠心して溶液を除去した。続いて、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。再度、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。超純水100μLを加えた後、遠心により溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させた。
実施例3と同様の手順により行った。
実施例3と同様の手順により行い、得られたピークのうちグルコース1糖〜10糖に該当するピークの面積値を確認した。得られた結果を図8に示す。コントロールサンプルとは、グルコースオリゴマー溶液10μLを乾燥させた後、(3)の工程のみを実施したサンプルを指す。精製剤により糖鎖回収を実施したサンプルはコントロールのサンプルと比較して多少ロスがあるものの単糖、二糖といった小さい糖も回収できることを確認した。
Claims (14)
- ベタイン構造を有する化合物を有効成分として含有し、
前記ベタイン構造はアニオン部位、カチオン部位及びリンカーを有し、
前記アニオン部位は、リン酸基、カルボキシル基及びスルホン酸基からなる群より選択される基であり、
前記カチオン部位は、4級アンモニウム基であり、
前記アニオン部位と前記カチオン部位を連結するリンカーは炭素数1〜4のアルキレン基である、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製剤。 - 前記アニオン部位がリン酸基である、請求項1に記載の精製剤。
- 前記ベタイン構造が、ホスホリルコリン基である、請求項1又は2に記載の精製剤。
- 前記化合物が、ベタイン構造を有する側鎖が主鎖に結合したポリマーである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の精製剤。
- 前記ポリマーが、(メタ)アクリル化合物を含む単量体の重合体である、請求項4に記載の精製剤。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の精製剤が、不溶性支持体に固定された、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製用担体。
- 請求項4又は5に記載の精製剤が、不溶性支持体に固定された、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製用担体。
- 前記不溶性支持体に固定された前記ポリマーの重量が、前記不溶性支持体の単位表面積(m2)当たり0.5mg〜1.5mgである、請求項7に記載の精製用担体。
- 前記不溶性支持体が、無機物質により構成されている、請求項6〜8のいずれか一項に記載の精製用担体。
- 比重が、1.05〜3.00である、請求項6〜9のいずれか一項に記載の精製用担体。
- 形状が球状であり、平均粒径が0.5μm〜100μmである、請求項6〜10のいずれか一項に記載の精製用担体。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の精製剤又は請求項6〜11のいずれか一項に記載の精製用担体と、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドと有機溶剤を含む試料とを接触させ、前記精製剤又は精製用担体に前記糖鎖又は前記糖ペプチドを吸着させることと、
前記精製剤又は精製用担体を水に接触させ、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを溶出させることと、を含む、
単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製方法。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の精製剤又は請求項6〜11のいずれか一項に記載の精製用担体、及び、キット使用のためのプロトコル情報を含む、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のためのキット。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の精製剤又は請求項8〜11のいずれか一項に記載の精製用担体を収容した容器を保持する容器保持部と、
前記容器に試薬類を導入する試薬導入部と、
を備える、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のための装置。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017210150 | 2017-10-31 | ||
JP2017210150 | 2017-10-31 | ||
JP2017227180 | 2017-11-27 | ||
JP2017227180 | 2017-11-27 | ||
PCT/JP2018/040499 WO2019088167A1 (ja) | 2017-10-31 | 2018-10-31 | 糖鎖又は糖ペプチドの精製剤及びその使用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2019088167A1 JPWO2019088167A1 (ja) | 2019-11-21 |
JP6669314B2 true JP6669314B2 (ja) | 2020-03-18 |
Family
ID=66333186
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019537017A Active JP6669314B2 (ja) | 2017-10-31 | 2018-10-31 | 糖鎖又は糖ペプチドの精製剤及びその使用 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11136344B2 (ja) |
EP (1) | EP3650456B1 (ja) |
JP (1) | JP6669314B2 (ja) |
DK (1) | DK3650456T3 (ja) |
WO (1) | WO2019088167A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020122072A1 (ja) * | 2018-12-13 | 2020-06-18 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 糖タンパク質から糖鎖を調製する方法、キット、及び、装置 |
CN110669242B (zh) * | 2019-09-02 | 2022-03-04 | 中山大学 | 具有抗蛋白粘附和抗菌功能的高分子材料的表面处理方法 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59169532A (ja) * | 1983-03-17 | 1984-09-25 | Asahi Chem Ind Co Ltd | C反応性蛋白の吸着材 |
JP4621592B2 (ja) | 2003-09-08 | 2011-01-26 | 塩野義製薬株式会社 | 簡易疾患診断およびテーラーメイド治療 |
JP3809177B2 (ja) * | 2004-05-24 | 2006-08-16 | 株式会社資生堂 | アフィニティー粒子及びアフィニティー分離方法 |
JP4434971B2 (ja) * | 2005-01-21 | 2010-03-17 | 住友ベークライト株式会社 | 捕捉ビーズ用マイクロ粒子およびそれを用いた捕捉ビーズならびにバイオチップ |
KR100647315B1 (ko) * | 2005-02-02 | 2006-11-23 | 삼성전자주식회사 | 실란화된 고상 물질을 이용한 핵산의 분리 및 증폭 방법 |
US20100300971A1 (en) | 2005-05-18 | 2010-12-02 | Sequant Ab | Zwitterionic stationary phase as well as method for using and producing said phase |
JP4889400B2 (ja) | 2005-08-29 | 2012-03-07 | 喜三郎 出口 | 糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子の分離分析方法 |
JP4821444B2 (ja) | 2006-06-07 | 2011-11-24 | 住友ベークライト株式会社 | バイオアッセイ用高分子化合物およびこれを用いたバイオアッセイ用基材 |
JP5173691B2 (ja) * | 2008-09-17 | 2013-04-03 | 株式会社 資生堂 | 親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤 |
JP5343603B2 (ja) | 2009-02-16 | 2013-11-13 | ソニー株式会社 | コルチゾール分離用モノリス型シリカカラムとその製造方法、及びコルチゾールの分離方法 |
WO2014061371A1 (ja) * | 2012-10-19 | 2014-04-24 | 住友ベークライト株式会社 | 分析用担体、その製造方法および使用方法 |
JP2016180716A (ja) * | 2015-03-25 | 2016-10-13 | 住友ベークライト株式会社 | アフィニティビーズ |
JP6563855B2 (ja) | 2016-05-26 | 2019-08-21 | トヨタ自動車株式会社 | ホイールカバー |
JP2017227180A (ja) | 2016-06-23 | 2017-12-28 | いすゞ自動車株式会社 | スタータリレー保護装置 |
-
2018
- 2018-10-31 WO PCT/JP2018/040499 patent/WO2019088167A1/ja unknown
- 2018-10-31 US US16/638,563 patent/US11136344B2/en active Active
- 2018-10-31 JP JP2019537017A patent/JP6669314B2/ja active Active
- 2018-10-31 DK DK18872893.5T patent/DK3650456T3/da active
- 2018-10-31 EP EP18872893.5A patent/EP3650456B1/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US11136344B2 (en) | 2021-10-05 |
DK3650456T3 (da) | 2021-07-26 |
US20200216484A1 (en) | 2020-07-09 |
EP3650456B1 (en) | 2021-07-07 |
JPWO2019088167A1 (ja) | 2019-11-21 |
EP3650456A1 (en) | 2020-05-13 |
WO2019088167A1 (ja) | 2019-05-09 |
EP3650456A4 (en) | 2020-08-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2009238686B2 (en) | Chromatography medium | |
AU2009332900B2 (en) | Nucleic acid purification method | |
Huang et al. | Stationary phases for the enrichment of glycoproteins and glycopeptides | |
JP5026070B2 (ja) | ポリマー粒子 | |
CN107709251B (zh) | 用于分析样品制备的组合物和方法 | |
WO2004068511A2 (en) | Formation of superparamagnetic particles | |
JP6669314B2 (ja) | 糖鎖又は糖ペプチドの精製剤及びその使用 | |
Vergara-Barberan et al. | Current trends in affinity-based monoliths in microextraction approaches: A review | |
EP2266675B1 (en) | Chromatography medium, preparation method of the same, and method for producing virus vaccine using the chromatography medium | |
JP5421900B2 (ja) | アフィニティー粒子の製造方法 | |
JP5866880B2 (ja) | 生理活性物質固定化用粒子、生理活性物質固定粒子及び糖親和性物質捕捉粒子 | |
EP2794052A1 (en) | Bioseparation compositions and methods for making and using same | |
JP2022184990A (ja) | バイオセパレーションのための複合材料 | |
JPWO2007126151A1 (ja) | 機能性粒子およびそれを用いた標的物質の分離方法 | |
WO2020122072A1 (ja) | 糖タンパク質から糖鎖を調製する方法、キット、及び、装置 | |
JP2024014364A (ja) | 糖類含有化合物の精製方法および糖類含有化合物の精製キット | |
Varilova et al. | Separation media in affinity chromatography of proteins-A critical review | |
JP2023078060A (ja) | 糖類含有化合物の精製方法及び糖類含有化合物の精製キット | |
WO2005095969A1 (ja) | 反応性色素結合磁性粒子及びタンパク質分離精製法 | |
JP6028488B2 (ja) | 分析用担体、その製造方法および使用方法 | |
CN113567601B (zh) | 一种糖链聚合物修饰微球材料及其制备方法和应用 | |
JP5701587B2 (ja) | ビタミンd結合タンパク質に特異的に結合する化合物 | |
JP2022026938A (ja) | 糖鎖を標識する方法及びキット | |
WO2015022854A1 (ja) | 糖鎖試料を標識するための化合物 | |
JP2024048692A (ja) | 糖類含有化合物の処理方法及び糖類含有化合物の分析方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190705 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190705 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20190705 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20190801 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190813 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20191009 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191121 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20191121 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200128 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200210 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6669314 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R157 | Certificate of patent or utility model (correction) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R157 |