WO2005095969A1 - 反応性色素結合磁性粒子及びタンパク質分離精製法 - Google Patents

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Hideji Tajima
Masaaki Takahashi
Toshihisa Ohsima
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    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction

Definitions

  • the present invention relates to a reactive dye-bound magnetic particle having triazine dye power having an affinity ligand for a polymer matrix and a protein subjected to magnetism, and to protein separation and purification using the particle.
  • affinity column chromatography has been widely used as a method for separating and purifying proteins such as enzymes, antibodies, and peptides.
  • a column is packed with an adsorbent in which a ligand having a specific and strong interaction with each target protein is bound to a carrier such as silica gel or agarose, and column chromatography is performed using this as a stationary phase.
  • a carrier such as silica gel or agarose
  • Non-Patent Documents 1 and 2 the triazine dye is already used as an adsorbent.All of the forces are non-magnetic, and these adsorbents are packed in columns and used as a solid phase. And was not used in a liquid phase flow reaction uniformly dispersed in a solution.
  • Non-Patent Document 1 Heackel, R. et al: Hoppe-Seyler's Physiol Chem., 349, 699, 1968.
  • Non-Patent Document 2 Toshihisa Oshima: Clinical Laboratory, 35 (3), 317-320, 1991
  • adsorbents are ligands with different specificities for proteins (substrates, antibodies, coenzymes, etc.) adsorbed or bound to a carrier such as silica gel agarose.
  • a carrier such as silica gel agarose.
  • the current practice of the affinity column chromatography method involves the insoluble support of substrates, coenzymes, antibodies, etc., which have a specific strong interaction with each protein.
  • a solid adsorbent bound to the body is packed into a column for use.
  • these adsorbents are expensive and have low versatility, so they are used to completely remove many impurities contained in proteins. Is expensive as a whole because it is necessary to combine various columns with different interactions.
  • the inventors have proposed a novel triazine dye-bonded magnet as a means for solving the above-mentioned problems. Separation and purification of functional particles and proteins ⁇ iij.
  • the first invention is a reactive dye-bound magnetic particle having a magnetized polymer matrix and a triazine dye bound to the polymer matrix.
  • the reactive dye-bound magnetic particles are fine particles having dispersibility that enables a liquid phase reaction, and the particles are magnetic and have an affinity ligand function bound to a polymer matrix. It has.
  • a polymer gel such as agarose or silica having a hydroxyl group or a reactive polar group, a natural polymer polysaccharide, or a synthetic polymer can be used.
  • the reactive polar group a hydroxyl group, an amino group, a carboxy group and the like are used.
  • the triazine dye (reactive dye) used in the present invention is a triazine dye having a specific affinity for a protein, and can be selected from many types as shown in Table 1.
  • Table 1 lists those that are easily available, such as Sigma (SIGMA), but over 90 other triazine dyes have been prepared. These triazine dyes have, for example, a steric structure similar to a coenzyme as shown by reference numeral 1 in FIG. 1 and have a reactive group such as a sulfone group or an amino group. Is one of the factors of affinity with proteins. Further, in the present invention, since the triazine dye-bound particles are magnetized, the separated proteins can be separated and purified in a uniformly dispersed liquid phase, and then the adsorbed proteins can be easily separated by a magnet. It is characterized by
  • the first invention is to select a triazine dye, which is a type of reactive dye, as an affinity ligand, and to use a specific affinity for a protein derived from its specific structure, thereby making it possible to use various types of proteins. It can be applied to the separation and purification of proteins, and enables the separation and purification of highly versatile proteins. In this case, a low-cost protein separation method became possible by using magnetic particles fixed with a triazine dye, which can be obtained at low cost, without using an expensive ligand. Also, an important point of the first invention is that instead of the conventional non-magnetic adsorbent, particles ⁇ iij which also have a polymer matrix force containing magnetic fine particles are generated. Separation and purification by Furthermore, each protein can be identified by various dyes, and it can be applied to not only separation and purification but also protein analysis.
  • a second invention uses the reactive dye-bound magnetic particles in the separation and purification of proteins.
  • V a protein separation and purification reagent.
  • the second and sixth inventions use a reactive dye-bound magnetic particle as a reagent to separate and purify a protein by using a conventional non-magnetic affinity ligand-bound adsorbent. It became possible to perform liquid phase reaction adsorption by uniform dispersion, which was not possible, and solid-liquid separation using a magnet in the same vessel. Further, since the adsorbed protein can be eluted by a liquid phase reaction, the amount of the eluate can be reduced, and a high-concentration target substance can be obtained by removing a complicated concentration step. Use of the reactive dye-bound magnetic particles also facilitated automation of a series of steps. In other words, by repeating such a reaction and solid-liquid separation using a magnet, it is possible to make complicated multi-stage separation / purification steps continuous, and it is also easy to automate these series of steps using robotics, etc. And
  • a third invention is a reactive dye-bound magnetic particle in which the polymer matrix is a cross-linked polymer gel having a reactive polar group.
  • the third invention makes it possible to make the magnetic particles insoluble in water by using a cross-linked polymer matrix and to increase the reactivity and reaction amount of the dye by making the particles porous.
  • a fourth invention is a reactive dye-bound magnetic particle in which the polymer matrix is a synthetic polymer having a reactive polar group.
  • a fifth invention is a reactive dye-bound magnetic particle in which the reactive polar group is a hydroxyl group, an amino group, or a carboxyl group.
  • the fifth invention uses a polymer matrix having a hydroxyl group, an amino group, or a carboxyl group as a reactive polar group derived from the three-dimensional structure of a triazine dye and binding to a reactive group such as a sulfone group or an amino group. This enabled stable fixing of triazine dyes by chemical bonding.
  • the reactive dye-bound magnet according to claim 1 is contained in a solution containing the target protein.
  • This is a protein separation and purification method in which reactive particles are mixed with reactive particles, and the reactive dye-bound magnetic particles to which the target protein has been adsorbed are separated by magnetic separation using a solution separation, and the adsorbed protein is purified and eluted.
  • FIG. 1 is a structural diagram showing a triazine dye, particles, and a triazine dye conjugate according to an example of the present invention.
  • FIG. 2 is an enlarged view of a reactive dye-bound magnetic particle produced by bonding magnetite to blue sepharose according to an example of the present invention.
  • FIG. 3 is an enlarged view of a reactive dye-bound magnetic particle produced by bonding ferrite to red sepharose according to an example of the present invention.
  • FIG. 4 is an enlarged view of a mixture of reactive dye-bound magnetic particles prepared by binding magnetite to blue sepharose and reactive dye-bound magnetic particles prepared by binding ferrite to red sepharose according to an example of the present invention.
  • the triazine dye-bonded magnetic particles as the reactive dye-bonded magnetic particles of the present invention contain or bind a fine magnetic powder or magnetic fine particles in a polymer matrix, for example, a matrix having a crosslinked polymer gel force. In this manner, the matrix is prepared, and a triazine dye having an affinity function is bonded to the matrix.
  • the dye ligand may be immobilized first, and then the magnetic fine particles may be adsorbed or immobilized to produce the dye ligand-bound magnetic particles.
  • the triazine dye-bound magnetic particles of the present invention have the following properties.
  • Solid-liquid separation can be easily performed with a magnet.
  • the polymer matrix used in the present invention is a polymer matrix such as agarose or silica.
  • Natural high molecular polysaccharides, synthetic polymers having a reactive polar group such as a hydroxyl group, an amino group, or a carboxyl group can be used.
  • a method of magnetizing a matrix a method of swelling these polymer matrices in an aqueous solution, adsorbing dispersed fine magnetic particles in the matrix, and then immobilizing the polymer, There is a method of kneading and molding with fine particles of a body, a method of fixing magnetic fine particles on a polymer particle by a physical or chemical method, and the like.
  • a polymer matrix produced by these methods is used in a solution.
  • any method can be used as long as the particles can be easily integrated and redistributed by a magnet.
  • magnetic fine particles such as iron oxide such as ferrite and magnetite, and manganese-zinc alloy are used. These magnetic particles preferably have a particle size of preferably 1 ⁇ m or less. Further, an aqueous solution of metal ions or the like as a precursor of the magnetic fine particles may be adsorbed on a polymer matrix and then converted into a magnetic material.
  • a triazine dye having an affinity for a protein is used, and these are appropriately selected depending on the type and purpose of the protein.
  • a chemical bond with the triazine dye is performed using a polar group of the polymer matrix, for example, a reactive polar group such as a hydroxyl group, an amino group, or a carboxyl group.
  • the fixing of the dye may be performed before or after the step of magnetizing the polymer matrix, but is appropriately selected according to the type of the polymer matrix.
  • the triazine dye-bound magnetic particles of the present invention can be dissolved in an aqueous solution or an organic solvent! / It must be easily and uniformly dispersed.
  • the specific gravity is desirably in the range of 0.9 to 1.5, preferably 1.0 to 1.3.
  • the triazine dye-bonded magnetic particles may be amorphous as long as they can be easily dispersed in a solution! /, But are preferably spherical or nearly spherical particles having a particle size of 1 to 500 m, more preferably 10 to 500 m. A range of 150 m is desirable.
  • the magnetic particles are dispersed in a solution containing a target protein.
  • This solution is stirred gently by, for example, repeating suction and discharge using a pipette or the like, and the protein is adsorbed to the magnetic particles.
  • the protein-adsorbed triazine dye-bound magnetic particles are brought into contact with a magnet outside the container to perform solid-liquid separation.
  • a nonmagnetic triazine dye (Reactive Blue 2) conjugate is prepared.
  • Reactive Blue 2 manufactured by SIGMA
  • a triazine dye dissolved in 100 ml of water
  • the structural formula is indicated by reference numeral 1 in Fig. 1
  • an additional 10 ml of a 22% NaCl solution was added.
  • the mixture was shaken and stirred for about 30 minutes without using a rotor or the like to the extent that the gel was well mixed with the dye.
  • to carry out the coupling reaction between the dye and the carrier to carry out the coupling reaction between the dye and the carrier,
  • Reactive Blue 2 Make binding magnetic particles.
  • Serum albumin (BSA, manufactured by SIGMA) was dissolved in 50 mM Tris / HCl buffer (pH 7.0) to give a solution containing 2 mg / ml BSA.
  • the triazine dye-bonded magnetic particles prepared in Example 1 were dispersed in this solution and adsorbed at room temperature.
  • the BSA-adsorbed triazine dye-bound magnetic particles were separated by a magnet, washed and separated with a buffer solution, and then eluted with a buffer solution containing 1.5 M NaCl.
  • the eluted BSA was quantified by measuring the eluate at A280 absorbance.
  • a comparative experiment was performed using the non-magnetic triazine dye-bound Sepharose particles obtained in Example 1, and as a result, the amount of BSA adsorbed on the non-magnetic particles showed almost the same value as the magnetic particles of the present invention.
  • Red-bound polymer magnetic particles were obtained.
  • Example 2 Using the triazine dye-bound magnetic particles, a BSA separation experiment was performed in the same manner as in Example 2. The adsorbed BSA was measured at an absorbance of A280. As a result, the BSA adsorption amount of the dye-bound polymer magnetic particles was 25% as compared with the dye-ligand-bound magnetic Sepharose particles prepared in Example 1.
  • Reactive Green 19 (manufactured by SIGMA) as a triazine dye was immobilized on commercially available crosslink agarose (Sepharose CL-4B, manufactured by Amersham Bioscience) in the same manner as in Example 1, and then the particles were impregnated with magnetite fine particles. To form Reactive Green-bound magnetic particles.
  • thermovulgaris IFO 13089 (wet weight: 45 g) in 10 mM phosphate buffer at pH 7.2
  • a crude extract was prepared by sonication and centrifugation.
  • the Reactive Green-bound particles were mixed and adsorbed in the crude extract.
  • the adsorbed enzyme is gradually increased in salt concentration using 250 ml of buffer and 0.5 M NaCl, and the adsorbed protein is eluted in three steps using magnetic separation.
  • the solution containing the target enzyme is dialyzed from the protein eluate, and the target enzyme is extracted stepwise by magnetic separation using ImM coenzyme (NAD) in the presence of 10 mM L-Valine. became.
  • ImM coenzyme NAD
  • the target enzyme (L-Valine dehydrogenase) formed a complex with the substrate (L-Valine) and coenzyme (NAD) and was selectively released.
  • the yield 9.1 mg of the desired highly purified enzyme (L-Valine dehydrogenase) was obtained from 6500 mg of the crude extract of the raw material. It was confirmed that the target enzyme could be efficiently separated and purified by this method.
  • the present invention is used in various fields, for example, in the fields of agriculture and fisheries, food, household goods, pharmacy, hygiene, health, and other medical, engineering, and biochemical fields. It is used in fields where it is necessary to handle biological materials such as macromolecules, but is not limited to these cases.

Abstract

　本発明は、反応性色素結合磁性粒子およびタンパク質分離精製法に関し、時間と労力を節約して、多段階の一連の工程を自動化することができて、かつ、全体としてコストを削減することができる反応性色素結合磁性粒子およびタンパク質分離精製法を提供することである。反応性色素結合磁性粒子を磁性化された高分子マトリックス、及びこの高分子マトリックスに結合したトリアジン色素を有するように構成し、この反応性色素結合磁性粒子をタンパク質の分離精製に用いる。

Description

明 細 書
反応性色素結合磁性粒子及びタンパク質分離精製法
技術分野
[0001] 本発明は磁性ィ匕された高分子マトリックス及びタンパク質に対するァフィ-ティリガ ンド機能を有するトリァジン色素力 なる反応性色素結合磁性粒子およびこの粒子を 用いたタンパク質分離精製に関するものである。
背景技術
[0002] 従来、酵素、抗体、ペプチドなどタンパク質の分離精製法としてァフィ二ティカラムク 口マトグラフィ法が広く用いられてきた。この場合、 目的とするタンパク質それぞれに 特異的に強 、相互作用を有するリガンドをシリカゲル、ァガロースなどの担体に結合 させた吸着体をカラムに充填し、これを固定相としてカラムクロマトグラフィーを行なつ てきた。この方法では、 目的とするタンパク質を分離精製するために多段階の煩雑な カラム精製が必要となり、多くの時間と労力を必要とした。またこの方法は多段階の固 定相反応であり、このままでは自動化が極めて困難であった。また、これらのカラムァ フィ-ティカラムクロマトグラフィ法においてすでにトリァジン色素が吸着体として用い られている力 いずれも非磁性体であり、またこれらの吸着体はカラムに充填して固 定ィ匕相として用いられるものであって、溶液中に均一分散された液相流動反応で使 用するものではな力つた (非特許文献 1、非特許文献 2)。
[0003] 近年、ポストゲノム研究の主要な課題として、遺伝情報に基づ!/ヽて細胞内で発現さ れて 、るタンパク質の構造や機能を総合的に解析しょうとする 、わゆるプロテオミクス が注目され、このため迅速、簡便且つ自動化可能な新規なタンパク質の分離精製法 が強く望まれている。
[0004] 非特許文献 1 : Heackel,R.et al: Hoppe- Seyler's Physiol Chem., 349, 699, 1968. 非特許文献 2 :大島敏久：臨床検査、 35(3)、 317-320、 1991
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 現在タンパク質の分離精製に用いられて!/ヽるァフィ-ティカラムクロマトグラフィ法に 使用されている吸着体は、タンパク質に対して異なる特異性を持つリガンド (基質、抗 体、補酵素など）をシリカゲルゃァガロースのような担体に吸着または結合させたもの である。タンパク質の分離精製に際してはこれらの吸着体を固定相としてカラムに充 填し、目的とするタンパク質を含む溶液をこのカラムに通過させることにより不純物の 除去および目的物の選択的吸着を行い、分離精製を行なうものである。このような吸 着体を用いるァフィ-ティカラムクロマトグラフィ法は、異なるァフィ-ティ機能を持つ 多くの吸着体をそれぞれのカラムに充填し、試料液をこれらひとつひとつのカラムに 順次に通過させ、多段階の吸着、分離を行なわなければならず多くの時間と労力を 必要とした。
[0006] また、 1本のカラム吸着が終了したあと、これらの吸着体に吸着された目的物を溶出 しなければならないが、このために多量の溶出液を通過させて目的物を取り出さなけ ればならず、得られた溶出液中の目的物の濃度は極めて薄ぐこの溶出液から目的 物のタンパク質を取り出すためには溶出液の濃縮を必要とした。この濃縮工程もまた 、多くの時間と労力を必要とした。
[0007] このように従来の吸着体を用いる方法では、それぞれの反応をマニュアルでバッチ 処理を行なうため、これら多段階の一連の工程を自動化することは極めて困難であつ た。
[0008] 一方、現在行なわれて!/、るァフィ-ティカラムクロマトグラフィ法にお 、ては、それぞ れのタンパク質に特異的に強い相互作用を有する基質、補酵素、抗体などを不溶性 の支持体に結合させた固体吸着体をカラムに充填して使用するもので、一般にこれ ら吸着体は高価であり、また汎用性が低いため、タンパク質に含まれる多くの不純物 を完全に除去するためには相互作用の異なる多種のカラムを組み合わせる必要があ ることから、全体として非常に高コストとなる。
[0009] したがって、解決しょうとする問題点は、カラムァフィ-ティカラムクロマトグラフィ法 は多くの時間と労力を必要とする点、多段階の一連の工程を自動化することが極め て困難である点、および、全体として非常に高コストとなる点である。
課題を解決するための手段
[0010] 発明者らは前記の課題を解決するための手段として、新規なトリァジン色素結合磁 性粒子およびタンパク質の分離精製^ iij出した。
[0011] 第 1の発明は磁性化された高分子マトリックス、及びこの高分子マトリックスに結合し たトリァジン色素を有して 、る反応性色素結合磁性粒子である。この反応性色素結 合磁性粒子とは液相反応を可能にする分散性を持つ微小な粒子であって、しかもこ の粒子が磁性であり、且つ高分子マトリックスに結合されたァフィ-ティリガンド機能を 有するものである。本発明に用いられる高分子マトリックスとしては水酸基、反応性極 性基を有するァガロース、シリカなどの高分子ゲル、天然高分子多糖類、合成ポリマ 一などを用いることができる。反応性極性基としては、水酸基、アミノ基、カルボキシ ル基などが用いられる。さらに本発明で使用するトリァジン色素 (反応性色素）はタン ノ ク質に特異的な親和性を有するトリァジン色素であって表 1に示すように多くの種 類から選択することが出来る。
表 1には、シグマ社 (SIGMA)等力も容易に入手できるものを挙げたものであるが、 それ以外のものも含めると 90種類以上のトリァジン色素が調製されている。また、これ らのトリアジン色素は例えば、図 1の符号 1に示されるように補酵素と類似した立体構 造を有し、スルホン基、もしくはアミノ基などの反応基を有し、このような構造がタンパ ク質との親和性の要因のひとつである。さらに本発明においてはこのトリァジン色素 結合粒子が磁性化されていることによって、タンパク質の分離精製が均一に分散され た液相で行なわれた後、吸着されたタンパク質が磁石により容易に分離されることを 特徴とするものである。
[0012] [表 1]
代表的なトリァジン色素の種類と性質
Figure imgf000006_0001
* ： Reactive Blue 19と Reactive Violet 5は vinylsulfonyl誘導体 （-S02CH=CH2) を反応基として持つ。 vinyl 基を介して担体の OH基と結合する。
* * ：色素と酵素、タンパク質間の吸着能によるグループ分けを示す。 グループの番号 （1〜S ) が大きいほど多 量の酵素タンパク質が吸着でき、吸着能が大きいが、各々の酵素、タンパク質により異なり、使用する緩衝 液の種類、 p ll、 夾雑タンパク質の種類^量によっても影響される （非特許文献 2等)。
[0013] 第 1の発明は、ァフィ-ティリガンドとして反応性色素の一種であるトリァジン色素を 選択する事により、その特異的構造に由来するタンパク質との特異的親和性を用い て、多種類のタンパク質の分離'精製に適用することを可能とし、汎用性が高いタン パク質の分離精製を可能にする。この場合、高価なリガンドを使用せず、安価で多種 類が得られるトリァジン色素を固定ィ匕した磁性粒子を用いることにより、低コストのタン パク質分離法が可能となった。また、第 1の発明の重要な点は従来の非磁性の吸着 体に代えて磁性体微粒子を含む高分子マトリックス力もなる粒子^ iij生したことにあり 、このことによりタンパク質の分離'精製において磁石による分離'精製を可能としたこ とである。さらに、それぞれのタンパク質を各種の色素によって識別することも可能で あり、分離精製にとどまらずタンパク解析などへの応用も考えられる。
[0014] 第 2の発明はタンパク質の分離精製において、前記反応性色素結合磁性粒子を用 V、るタンパク質の分離精製試薬である。
[0015] 第 2および第 6の発明は、反応性色素結合磁性粒子を試薬として用いることによつ て、タンパク質の分離精製にお!、て従来の非磁性ァフィ二ティリガンド結合吸着体で は不可能であった均一分散による液相反応吸着と、磁石を用いた固液分離を同一 の容器内で行なうことが可能となった。さらに吸着されたタンパク質の溶出も液相反 応で行なう事が出来るため、溶出液の量が少なくてすみ、煩雑な濃縮工程をはぶい て高濃度の目的物を得ることが可能である。またこの反応性色素結合磁性粒子を用 いることにより、一連の工程の自動化が容易となった。つまり、このような反応と磁石に よる固液分離を繰り返すことにより、複雑な多段の分離'精製工程を連続化すること が可能となり、ロボテイクスなどを用いてこれら一連の工程を自動化することも容易と なる。
[0016] 第 3の発明は高分子マトリックスが反応性極性基を有するクロスリンクされた高分子 ゲルである反応性色素結合磁性粒子である。
[0017] 第 3の発明は、クロスリンクされた高分子マトリックスを用いることによって磁性粒子を 非水溶化し、かつ、多孔質化することにより色素の反応性及び反応量を増加すること が可能となった。
[0018] 第 4の発明は高分子マトリックスが反応性極性基を有する合成ポリマーである反応 性色素結合磁性粒子である。
[0019] 第 4の発明は、トリァジン色素との反応性を有する合成ポリマーを用いる事によって クロスリンクを必要とせず、トリァジン色素を容易にそのマトリックス内に固定ィ匕すること が可能となった。
[0020] 第 5の発明は反応性極性基が水酸基またはアミノ基、カルボキシル基である反応性 色素結合磁性粒子である。
[0021] 第 5の発明は、トリァジン色素の立体構造に由来する、スルホン基、もしくはアミノ基 などの反応基と結合する反応性極性基として水酸基またはアミノ基、カルボキシル基 である高分子マトリックスを用いることにより化学結合によるトリァジン色素の安定的な 固定ィ匕を可能にした。
[0022] 第 6の発明は目的とするタンパク質を含む溶液中に請求項 1の反応性色素結合磁 性粒子を混合し、目的タンパク質を吸着させた反応性色素結合磁性粒子を磁気分 離により溶液カゝら分離し、吸着されたタンパク質を精製および溶出させるタンパク質 分離精製法である。
図面の簡単な説明
[0023] [図 1]本発明の実施例に係るトリァジン色素、粒子、および該トリアジン色素結合体を 示す構造図である。
[図 2]本発明の実施例に係るブルーセファロースにマグネタイトを結合して作製した反 応性色素結合磁性粒子の拡大図である。
[図 3]本発明の実施例に係るレッドセファロースにフェライトを結合して作製した反応 性色素結合磁性粒子の拡大図である。
[図 4]本発明の実施例に係るブルーセファロースにマグネタイトを結合して作製した反 応性色素結合磁性粒子およびレッドセファロースにフェライトを結合して作成した反 応性色素結合磁性粒子とを混合したものの拡大図である。
発明を実施するための最良の形態
[0024] 本発明の反応性色素結合磁性粒子としてのトリァジン色素結合磁性粒子は高分子 マトリックス例えば、クロスリンクされた高分子ゲル力もなるマトリックス中に微細な磁性 粉末または磁性体微粒子を含有または結合させることにより磁性ィ匕し、このマトリック スにァフィ-ティ機能を有するトリァジン色素を結合させることにより作製される。また この場合、高分子マトリックスの性質によっては最初に色素リガンドを固定ィ匕し、その 後磁性微粒子を吸着または固定化させて色素リガンド結合磁性粒子を作製しても良 い。
[0025] 本発明のトリァジン色素結合磁性粒子は以下のような性質を有する。
1.バッファーなどの水溶液中で容易に分散し、均一な液相反応を可能にする。
2.磁石により容易に固液分離を行なう事が出来る。
3.磁石を除去することにより再び溶液中に再分散される。
4.異なるトリァジン色素を結合することにより、種々の異なるタンパク質を選択的に吸 着分離できる。
[0026] 本発明に用いられる高分子マトリックスとしてはァガロース、シリカなどの高分子ゲ ル、天然高分子多糖類、水酸基、アミノ基、カルボキシル基などの反応性極性基を有 する合成ポリマーなどを用いることが出来る。
[0027] また、マトリックスを磁性ィ匕する方法としては、これらの高分子マトリックスを水溶液中 で膨潤させ、分散した微小磁性体粒子をマトリックス中に吸着させたのち、固定化す る方法、ポリマーと磁性体微粒子とを混練成形する方法、ポリマー粒子上に物理的あ るいは化学的な方法で磁性体微粒子を固定ィ匕する方法などがあるが、これらの方法 で作製された高分子マトリックスが溶液中に分散された場合、磁石により容易に集積 および再分散されるものであればいずれの方法でもよぐその製法に限定されるもの ではない。
[0028] これらの方法で使用される磁性体微粒子としてはフェライト、マグネタイトのような酸 化鉄、マンガン一亜鉛合金などの磁性体微粒子が用いられる。これらの磁性体微粒 子は粒径として好ましくは 1 μ m以下が望ましい。また、これら磁性体微粒子の前駆体 として金属イオンなどの水溶液を高分子マトリックスに吸着させた後、磁性体に変換し てもよい。
[0029] 本発明で用いられる反応性色素はタンパク質に親和性を有するトリァジン色素が用 いられるが、これらはタンパク質の種類や目的に応じて適宜選択される。
[0030] これらトリァジン色素の高分子マトリックスへの結合方法としては高分子マトリックス の極性基、たとえば水酸基、アミノ基、カルボキシル基などの反応性極性基を用いて トリァジン色素との化学結合を行なう。また色素の固定ィ匕は高分子マトリックスの磁性 化工程の前または後のいずれでも良いが、高分子マトリックスの種類に応じて適宜選 択する。
[0031] 本発明のトリァジン色素結合磁性粒子は水溶液あるいは有機溶剤中にお！/ヽて容易 に均一に分散されることが必要である。具体的には比重として 0.9— 1.5好ましくは 1.0 — 1.3の範囲が望ましい。またトリァジン色素結合磁性粒子は溶液中で分散が容易 であれば不定形でもよ!/、が、好ましくは球状もしくはこれに近 、形状を有する粒径 1-500 mの粒子、更に好ましくは 10-150 mの範囲のものが望ましい。
[0032] このようなトリァジン色素結合磁性粒子を用いてタンパク質などの分離精製を行なう 場合、まず目的とするタンパク質を含む溶液中に前記磁性粒子を分散する。この溶 液を、例えばピペットなどを用いて吸引'吐出を繰り返すことなどによりゆるやかに攪 拌し、タンパク質を該磁性粒子に吸着する。次にこのタンパク質吸着トリァジン色素結 合磁性粒子を容器の外部に磁石を接触させて固液分離を行なう。
[0033] こうして集積されたタンパク質吸着トリァジン色素結合磁性粒子は次の容器に移さ れ、新しい溶出液を加えて攪拌することにより、吸着されたタンパク質が溶出される。 以上の吸着、固液分離、溶出を多段で繰り返すことにより、数種類の異なるトリアジ ン色素結合磁性粒子を用いて多段階の吸着 ·精製を連続で行なうことが可能となる。 以下に本発明の実施例を図面に基づいて説明するが、本発明はこの実施例により 限定されるものではない。
実施例 1
[0034] トリァジン色素結合磁性粒子の作製について、以下に説明する。
まず、非磁性トリァジン色素（Reactive Blue 2)結合体を作製する。
図 1に示した市販のクロスリンクされたァガロースゲルからなる粒子 2 (Sepharose CL 4B、 Amersham Bioscience製） 100mlをガラスフィルター上に取り、 10倍量の精製水を 用いて吸引洗浄し、この洗浄したゲルを薬さじによって微生物培養坂口フラスコに移 した。
これに 100mlの水に溶かしたトリァジン色素 Reactive Blue 2 (SIGMA製） 0.3g (構造 式を図 1中、符号 1で表示)を加え、塩析効果によって次のカップリング反応の進行を 容易にするために、さらに、 22%NaCl溶液 10mlを加えた。ゲルの破壊を行なわないよ う、ゲルが色素とよく混合する程度に回転子等を用いないで、約 30分間振とう攪拌を 行った。さらに、色素と担体間のカップリング反応を行なうために、 lgの結晶 Na COを
2 3 カロえて、 ρΗΙΟ.5のアルカリ条件下にし、 60°Cで約 12時間振とう攪拌し、反応させた。 反応終了後、ゲル懸濁液をガラスフィルターに移し、 11の水、 11の 1M NaCl、 21の水の 順序でろ液の着色が見られなくなるまで色素ゲルを洗浄した。これによつて、図 1の 符号 3で示す非磁性トリァジン色素結合体が作製される。
[0035] 次に、作製された前記非磁性トリァジン色素結合体を用いてトリァジン色素（
Reactive Blue 2)結合磁性粒子を作製する。
作製した非磁性トリァジン色素結合体 3についての 10グラムを 2%炭酸ナトリウム溶 液中に分散し、常温にて膨潤を行なった。この溶液中に 2%炭酸ナトリウムに分散し た平均径 1 μ mのフェライト微粒子を加えてゆるやかに攪拌し、 10分程度放置し、色 素結合体にフェライト微粒子を取り込ませた後、精製水で洗浄した。
[0036] このようにして得られたトリァジン色素結合磁性セファロース粒子は磁石を容器外か ら接触させることにより、容易に固液分離を行なう事が出来た。
このようにして作製されたトリァジン色素結合磁性粒子を図 2〜図 4に示す。
実施例 2
[0037] トリァジン色素（Reactive Blue 2)結合磁性粒子を用いたタンパク質の分離精製方 法について以下に説明する。
[0038] 実施例 1で得られたトリァジン色素結合磁性セファロース粒子を用いて代表的なタ ンパク質である BSAの吸着実験を行なった。
[0039] 巿販牛血清アルブミン（BSA, SIGMA製）を 50mM Tris/HClバッファー (pH 7.0)に溶 かし、 BSAを 2mg/ml含む溶液とした。この溶液に実施例 1で調整したトリァジン色素 結合磁性粒子を分散し、常温にて吸着させた。
[0040] この BSA吸着トリァジン色素結合磁性粒子を磁石により分離し、さらにバッファー溶 液で洗浄'分離した後、 1.5 M NaClをカ卩えたバッファー溶液にて溶出を行なった。こ の溶出液を A280應の吸光度で測定することにより溶出した BSAを定量した。一方実 施例 1で得られた非磁性トリァジン色素結合セファロース粒子を用いて比較実験を行 なった結果、 BSAの非磁性粒子に対する吸着量は本発明の磁性粒子とほぼ同様の 値を示した。
実施例 3
[0041] 続、て、磁性ポリマーマトリックスを用いるトリァジン色素（Reactive Red 120)結合磁 性粒子によるタンパク質の分離精製について説明する。
[0042] 表面に水酸基を有する市販のポリマー磁性粒子（平均径 2 μ m Chemagen社製)を バッファー溶液中に分散し、トリアジン色素 Reactive Red 120と pH 10で室温で 3時 間、水酸基とのカップリング反応を行なった。反応後精製水でよく洗浄し、 Reactive
Red結合ポリマー磁性粒子を得た。
[0043] このトリァジン色素結合磁性粒子を用いて実施例 2と同様、 BSAの分離実験を行な い、吸着された BSAを A280應の吸光度で測定した。この結果色素結合ポリマー磁性 粒子は実施例 1で作製した色素リガンド結合磁性セファロース粒子に比較して BSAの 吸着量は 25%であった。
実施例 4
[0044] トリァジン色素（Reactive Green 19)結合磁性粒子による酵素の分離精製
実施例 1と同様の方法でトリァジン色素として Reactive Green 19 (SIGMA製）を巿販 のクロスリンクァガロース（Sepharose CL- 4B、 Amersham Bioscience製）に固定化し、 その後この粒子にマグネタイト微粒子を含浸させて磁ィ匕し、 Reactive Green結合磁性 粒子を作製した。
[0045] この色素結合磁性粒子を用いて、細菌 S. thermovulgaris IFO 13089に存在する Valine脱水素酵素の分離精製を試みた。
[0046] S. thermovulgaris IFO 13089 (湿重量 45g)を pH7.2の 10mMリン酸緩衝液に懸濁後 、超音波破砕、遠心分離により粗抽出液を調製した。この粗抽出液中に前記の Reactive Green結合粒子を混合し吸着を行なった。磁気分離により非吸着のタンパク 質を分離した後、吸着された酵素を緩衝液 250mlと 0.5M NaClを用いて段階的に塩 濃度を上げ、磁気分離を用いて 3段階で吸着タンパク質の溶出を行なった。そのタン パク質溶出液から目的とする酵素を含む溶液を透析し、さらに 10mMの L-Valineの存 在下、 ImMの補酵素 (NAD)を用いて磁性分離により段階的に目的酵素の抽出を行 なった。
目的とする酵素（L-Valine脱水素酵素）は基質 (L-Valine)及び補酵素 (NAD)と複 合体を形成し、選択的に遊離された。収率は、原料の粗抽出物 6500mgから 9.1mgの 目的とする高純度の精製酵素 (L-Valine脱水素酵素）が得られた。この方法によって 目的とする酵素を効率よく分離精製できることが確かめられた。
[0047] 以上説明した各実施例は本発明をより良く理解させるために具体的に説明したもの であって、別形態を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変更しない範 囲で変更可能である。例えば以上の説明にお ヽてはトリァジン色素として Reactive Blue 2, Reactive Red 120および Reactive Green 19についてのみ説明したがこれらに 限られず、少なくとも表 1に記載したトリァジン色素を用いることができる。また、磁性 化された高分子マトリックスについても前述した粒子に限られるものではないことはい うまでもない。
産業上の利用可能性
[0048] 本発明は、種々の分野、例えば、農水産、食品、家庭用品、薬学、衛生や保健等 の医療、工学、生化学の各分野で用いられ、詳細には、タンパク質やタンパク質から 誘導される高分子物質等の生体物質を扱うことが要求される分野で用いられるがこ れらの場合に限られるものではない。
符号の説明
[0049] 1 トリアジン色素
2 粒子
3 トリアジン色素結合体

Claims

請求の範囲
[1] 磁性ィ匕された高分子マトリックス、及びこの高分子マトリックスに結合したトリァジン 色素を有して 、る反応性色素結合磁性粒子。
[2] タンパク質の分離精製において、請求項 1の反応性色素結合磁性粒子を用いるタ ンパク質の分離精製試薬。
[3] 請求項 1の高分子マトリックスが反応性極性基を有するクロスリンクされた高分子ゲ ルである反応性色素結合磁性粒子。
[4] 請求項 1の高分子マトリックスが反応性極性基を有する合成ポリマーである反応性 色素結合磁性粒子。
[5] 請求項 3または請求項 4の反応性極性基が水酸基またはアミノ基、カルボキシル基 である反応性色素結合磁性粒子。
[6] 目的とするタンパク質を含む溶液中に請求項 1の反応性色素結合磁性粒子を混合 し、 目的タンパク質を吸着させた反応性色素結合磁性粒子を磁気分離により溶液か ら分離し、吸着されたタンパク質を精製および溶出させるタンパク質分離精製法。
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