WO2014061371A1 - 分析用担体、その製造方法および使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、生理活性物質を固定化することができる担体、特に好ましくは、生理活性物質を固定化することができ且つ非特異吸着が抑制された担体を簡便に作製し、提供することを目的とする。本発明の分析用担体は、生理活性物質を捕捉する機能を有する分析用担体であって、担体の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第1繰り返しユニットと、側鎖の末端に活性エステル基を有する第2繰り返しユニットと、を有することを特徴とする。
Description
本発明は、生理活性物質を固定するための分析用担体、該担体の製造方法、及び該担体上に生理活性物質を固定した分析用担体の使用方法に関する。
本願は、2012年10月19日に、日本に出願された特願2012-231599号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、2012年10月19日に、日本に出願された特願2012-231599号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
一般的に生理活性物質固定化のための分析用担体は、粒子、基板、繊維、フィルター、膜、シートの形状で提供される場合が多い。
担体が粒子の場合は、カラムや容器に充填して、生理活性物質の反応、分離、精製等にしばしば用いられる。あるいは診断薬としても用いられる。また、担体が基板の場合は、前記同様に診断ツールに用いるなどして使用される。さらに担体が繊維、フィルター、膜、シートの場合は大量の分離、精製ツール等に用いることができる。
担体が粒子の場合は、カラムや容器に充填して、生理活性物質の反応、分離、精製等にしばしば用いられる。あるいは診断薬としても用いられる。また、担体が基板の場合は、前記同様に診断ツールに用いるなどして使用される。さらに担体が繊維、フィルター、膜、シートの場合は大量の分離、精製ツール等に用いることができる。
このような目的の場合、担体表面に確実に生理活性物質を固定化することが必須であり、そのため、以前は樹脂に対する物理化学的吸着による生理活性物質の固定が主流であった。しかしながら、現在では、担体表面に官能基を導入し、生理活性物質を化学結合により固定化する方法がよく採用されている。
これにより、生理活性物質の剥離を防ぐとともに、分子量や構造によらず確実に生理活性物質を固定化することが可能となった。
特許文献1には、磁性体を内包する樹脂製マイクロビーズを乳化重合により作製し、ビーズ表面の官能基にエチレングリコールジグリシジルエーテルを反応させ、モノクローナル抗体を結合させる方法が記載されている。しかしながら、この方法では、マイクロビーズを重合により作製する工程が必要で、それは煩雑であるとともに、必要な粒径、粒度分布を制御することが困難である。
一方、特許文献2には、入手容易な汎用樹脂製マイクロビーズを基材として、その表面を加水分解し、表面に精製したカルボン酸に親水性のスペーサー分子を結合させ、さらにスペーサー分子の官能基に生理活性物質を結合し、親水性により非特異吸着を抑制する方法が記載されている。
この方法により得られるマイクロビーズは、加水分解によりカルボン酸を生じる樹脂を基材として用いる必要がある。また、当該マイクロビーズを、そのスペーサー分子に固定した生理活性物質に親和性の高い物質を捕捉するために使用する場面において、生体由来の夾雑物を多く含む検体を接触させると非特異吸着を抑制しきれない可能性が高い。
本発明は上記実情に鑑み成し遂げられたものであり、生理活性物質を固定化することができる担体、特に好ましくは、生理活性物質を固定化することができ且つ非特異吸着が抑制された担体を簡便に作製し、提供することを目的とする。
また、本発明の他の目的は、上記した生理活性物質の固定に用いられる分析用担体の上に、生理活性物質を固定した担体を提供することにある。
本発明は以下の通りである。
(1)生理活性物質を捕捉する分析用担体であって、担体の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する第1繰り返しユニットと、側鎖の末端に活性エステル基を有する第2繰り返しユニットとを有することを特徴とする分析用担体。
(2)前記ベタイン構造を有する官能基がホスホリルコリン基である(1)記載の分析用担体。
(3)担体の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該担体と、側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する重合性モノマーと、活性エステル基を有する重合性モノマーと、を含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該担体表面に高分子物質を含む層を形成してなる(1)または(2)記載の分析用担体。
(4)前記側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する重合性モノマーが下記の一般式[1]で表されるモノマーを含む(3)記載の分析用担体。
(式中R1は水素原子またはメチル基を示し、R2はベタイン構造を有する官能基を示す。Xは-O-,-S-,-NH-,-CO-,-CONH-で中断されてもよい炭素数0~20の炭化水素鎖を示す。)
(5)前記側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する重合性モノマーが、2-(メタ)アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する(3)または(4)記載の分析用担体。
(6)活性エステル基を有する重合性モノマーが下記の一般式[2]で表されるモノマーを含む(3)乃至(5)いずれか記載の分析用担体。
(式中R3は水素原子またはメチル基を示し、Yは炭素数1~10のアルキレングリコール残基またはアルキレン基を示す。Wは活性エステル基を示す。qは1~100の整数を示す。qが2以上100以下の整数である場合、繰り返されるYは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。)
(7)前記活性エステル基が、p-ニトロフェニル基またはスクシンイミド基と、エステル結合とを含む基である(6)記載の分析用担体。
(8)前記担体の表面に導入する重合性官能基がメタクリル基、アクリル基、及びビニル基よりなる群から選ばれる1種以上である(3)乃至(7)いずれか記載の分析用担体。
(9)前記担体の表面に導入する連鎖移動基がメルカプト基である(3)乃至(7)いずれか記載の分析用担体。
(10)前記担体が無機材料からなる(1)乃至(9)いずれか記載の分析用担体。
(11)前記無機材料が無機酸化物からなる(10)記載の分析用担体。
(12)前記無機酸化物が酸化ケイ素である(11)記載の分析用担体。
(13)前記担体の形状が粒子、基板、繊維、フィルター、膜、シートである(1)乃至(12)記載の分析用担体。
(14)前記担体の表面への重合性官能基、または連鎖移動基の導入が、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤と核となる担体表面の官能基との共有結合の形成によってなされる(3)乃至(13)いずれか記載の分析用担体。
(15)前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤が重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランである(14)に記載の分析用担体。
(16)(1)乃至(15)いずれか記載の分析用担体であって、高分子物質を含む層の前記活性エステル基を介して生理活性物質を固定化したことを特徴とする分析用担体。
(17)前記生理活性物質が酵素、抗体、レクチン、レセプター、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、糖タンパク質からなる群から選ばれる1種以上のタンパク質;ペプチド;アミノ酸;ホルモン;核酸;糖、オリゴ糖、多糖、シアル酸誘導体、シアル化糖鎖からなる群から選ばれる1種以上の糖鎖;脂質;低分子化合物;上述以外の高分子有機物質;無機物質;若しくはこれらの融合体、または、ウイルス、若しくは細胞を構成する分子から選ばれる少なくとも一つである(16)記載の分析用担体。
(18)(1)乃至(17)いずれか記載の分析用担体の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを酸性水溶液中で加水分解する工程、次いで前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを含む酸性水溶液中で担体を撹拌下、加熱する工程、及び乾燥後、更に加熱する工程、を含む分析用担体の製造方法。
(19)(1)乃至(17)いずれか記載の分析用担体の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を導入した担体と重合性モノマーとを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程、及び乾燥する工程を含む分析用担体の製造方法。
(20)前記重合反応がラジカル重合反応であることを特徴とする(19)に記載の分析用担体の製造方法。
(21)(3)乃至(17)いずれか記載の分析用担体の製造方法であって、高分子物質を含む層を形成した担体に、生理活性物質をリン酸塩緩衝液に溶解した溶液を接触させる工程を含む分析用担体の製造方法。
(22)前記リン酸塩緩衝液のリン酸塩濃度が0.1M以上5M以下である(21)記載の分析用担体の製造方法。
(23)前記リン酸塩がリン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、又はリン酸水素二ナトリウムのいずれかを含む(21)または(22)に記載の分析用担体の製造方法。
(24)(21)乃至(23)のいずれか記載の分析用担体を、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより標的生体物質を回収することを特徴とする分析用担体の使用方法。
(1)生理活性物質を捕捉する分析用担体であって、担体の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する第1繰り返しユニットと、側鎖の末端に活性エステル基を有する第2繰り返しユニットとを有することを特徴とする分析用担体。
(2)前記ベタイン構造を有する官能基がホスホリルコリン基である(1)記載の分析用担体。
(3)担体の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該担体と、側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する重合性モノマーと、活性エステル基を有する重合性モノマーと、を含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該担体表面に高分子物質を含む層を形成してなる(1)または(2)記載の分析用担体。
(4)前記側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する重合性モノマーが下記の一般式[1]で表されるモノマーを含む(3)記載の分析用担体。
(5)前記側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する重合性モノマーが、2-(メタ)アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する(3)または(4)記載の分析用担体。
(6)活性エステル基を有する重合性モノマーが下記の一般式[2]で表されるモノマーを含む(3)乃至(5)いずれか記載の分析用担体。
(7)前記活性エステル基が、p-ニトロフェニル基またはスクシンイミド基と、エステル結合とを含む基である(6)記載の分析用担体。
(8)前記担体の表面に導入する重合性官能基がメタクリル基、アクリル基、及びビニル基よりなる群から選ばれる1種以上である(3)乃至(7)いずれか記載の分析用担体。
(9)前記担体の表面に導入する連鎖移動基がメルカプト基である(3)乃至(7)いずれか記載の分析用担体。
(10)前記担体が無機材料からなる(1)乃至(9)いずれか記載の分析用担体。
(11)前記無機材料が無機酸化物からなる(10)記載の分析用担体。
(12)前記無機酸化物が酸化ケイ素である(11)記載の分析用担体。
(13)前記担体の形状が粒子、基板、繊維、フィルター、膜、シートである(1)乃至(12)記載の分析用担体。
(14)前記担体の表面への重合性官能基、または連鎖移動基の導入が、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤と核となる担体表面の官能基との共有結合の形成によってなされる(3)乃至(13)いずれか記載の分析用担体。
(15)前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤が重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランである(14)に記載の分析用担体。
(16)(1)乃至(15)いずれか記載の分析用担体であって、高分子物質を含む層の前記活性エステル基を介して生理活性物質を固定化したことを特徴とする分析用担体。
(17)前記生理活性物質が酵素、抗体、レクチン、レセプター、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、糖タンパク質からなる群から選ばれる1種以上のタンパク質;ペプチド;アミノ酸;ホルモン;核酸;糖、オリゴ糖、多糖、シアル酸誘導体、シアル化糖鎖からなる群から選ばれる1種以上の糖鎖;脂質;低分子化合物;上述以外の高分子有機物質;無機物質;若しくはこれらの融合体、または、ウイルス、若しくは細胞を構成する分子から選ばれる少なくとも一つである(16)記載の分析用担体。
(18)(1)乃至(17)いずれか記載の分析用担体の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを酸性水溶液中で加水分解する工程、次いで前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを含む酸性水溶液中で担体を撹拌下、加熱する工程、及び乾燥後、更に加熱する工程、を含む分析用担体の製造方法。
(19)(1)乃至(17)いずれか記載の分析用担体の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を導入した担体と重合性モノマーとを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程、及び乾燥する工程を含む分析用担体の製造方法。
(20)前記重合反応がラジカル重合反応であることを特徴とする(19)に記載の分析用担体の製造方法。
(21)(3)乃至(17)いずれか記載の分析用担体の製造方法であって、高分子物質を含む層を形成した担体に、生理活性物質をリン酸塩緩衝液に溶解した溶液を接触させる工程を含む分析用担体の製造方法。
(22)前記リン酸塩緩衝液のリン酸塩濃度が0.1M以上5M以下である(21)記載の分析用担体の製造方法。
(23)前記リン酸塩がリン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、又はリン酸水素二ナトリウムのいずれかを含む(21)または(22)に記載の分析用担体の製造方法。
(24)(21)乃至(23)のいずれか記載の分析用担体を、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより標的生体物質を回収することを特徴とする分析用担体の使用方法。
本発明により生理活性物質を固定化することができる分析用担体、特に反応触媒を必要とせず生理活性物質を固定化することができ、且つ非特異吸着を抑制した担体を簡便に作製し、提供することが可能となった。
以下、本発明の分析用担体、その製造方法および使用方法について説明する。
本発明の分析用担体は、生理活性物質を固定化する機能を有する担体であって、具体的には、担体表面に重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する第1繰り返しユニットと、側鎖の末端に活性エステル基を有する第2繰り返しユニットと、を有することを特徴とする。
側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する第1繰り返しユニットが、検出対象以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制する役割を果たす。
また、側鎖の末端に活性エステル基を有する第2繰り返しユニットがアミノ基を有するさまざまな生理活性物質を効率良く、かつ簡易に担体に結合することを可能とする。これにより、該生理活性物質と特異的に結合する検出対象を捕捉できるようになる。
これらのことから、本発明の分析用担体は、さまざまな生理活性物質を捕捉する機能を有し、該生理活性物質を固定化した担体は、高い選択性をもって検出対象を検出することができる。
ここで、生理活性物質としては、例えば酵素、抗体、レクチン、レセプター、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、糖タンパク質等のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、核酸、糖、オリゴ糖、多糖、シアル酸誘導体、シアル化糖鎖等の糖鎖、脂質、低分子化合物、上述以外の高分子有機物質、無機物質、若しくはこれらの融合体、または、ウイルス、若しくは細胞を構成する分子等を挙げることができる。
前記側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する第1繰り返しユニットは、例えばカルボキシベタイン系モノマー、スルホベタイン系モノマー、ホスホベタイン系モノマーなどに由来するものであり、また、ホスホリルコリン構造を有するモノマーもベタイン構造を有するモノマーの一種である。ベタイン構造により、血清や細胞ライセート等に含まれるタンパク質の非特異吸着を大きく抑制することができる。なかでも、ホスホリルコリン構造を有するモノマーが非特異吸着の抑制効果が高く、好ましい。
また、前記第1繰り返しユニットは、上述したようなベタイン構造を有する官能基に加えて、重合性基を有することが好ましい。重合性基としてはエチレン系不飽和重合性基が好ましい。すなわち、前記第1繰り返しユニットは、ベタイン構造を有する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーであることが好ましい。
また、前記第1繰り返しユニットは、上述したようなベタイン構造を有する官能基に加えて、重合性基を有することが好ましい。重合性基としてはエチレン系不飽和重合性基が好ましい。すなわち、前記第1繰り返しユニットは、ベタイン構造を有する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーであることが好ましい。
ベタイン構造を有する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、下記式[1]で示されるように、(メタ)アクリル基とベタイン構造とを有する官能基が、-O-,-S-,-NH-,-CO-,-CONH-で中断されてもよい炭素数1~20の炭化水素鎖を介して、あるいは直接結合した化合物であることが好ましい。なお、下記式[1]において、Xが炭素数0の炭化水素鎖とは、式中の酸素原子(-O-)と、R2とが直接結合し、Xが単結合であることを意味する。
カルボキシベタイン系モノマーの具体例としては、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(2-カルボキシラトエチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(2-カルボキシラトエチル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(3-カルボキシラトプロピル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(3-カルボキシラトプロピル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(4-カルボキシラトブチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(4-カルボキシラトブチル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(カルボキシラトメチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(カルボキシラトメチル)アミニウム等が挙げられる。
スルホベタイン系モノマーの具体例としては、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(2-スルホナトエチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(2-スルホナトエチル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(3-スルホナトプロピル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(3-スルホナトプロピル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(4-スルホナトブチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(4-スルホナトブチル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(スルホナトメチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(スルホナトメチル)アミニウム等が挙げられる。
ホスホベタイン系モノマーの具体例としては、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(2-ホスホナトエチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(2-ホスホナトエチル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(3-ホスホナトプロピル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(3-ホスホナトプロピル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(4-ホスホナトブチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(4-ホスホナトブチル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(ホスホナトメチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(ホスホナトメチル)アミニウム等が挙げられる。
また、ホスホリルコリン構造を有する重合性不飽和モノマーの具体例としては、2-(メタ)アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、2-(メタ)アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、6-(メタ)アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、10-(メタ)アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、2-(メタ)アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、2-(メタ)アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン等が挙げられる。これらの中では、入手容易性から2-(メタ)アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが最も好ましい。
次に、前記側鎖の末端に活性エステル基を有する第2繰り返しユニットは、例えば末端に活性エステル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものが好ましい。
末端に活性エステル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、下記式[2]で示されるように、(メタ)アクリル基と活性エステル基が、アルキレン基または炭素数1~10のアルキレングリコール残基Yの連鎖を介して結合した化合物であることが好ましい。
前記式[2]中のYがアルキレン基である場合、qは1~100の整数であり、好ましくは1~20であり、より好ましくは1~10であり、最も好ましくは1~6である。qの値が大きくなりすぎると、タンパク質の非特異吸着が大きくなる。
前記式[2]中のYがアルキレングリコール残基(ポリオキシアルキレン基)である場合、アルキレングリコール残基Yの炭素数は1~10であり、好ましくは1~6であり、より好ましくは2~4であり、更に好ましくは2~3であり、最も好ましくは2である。炭素数が前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
また、アルキレングリコール残基Yの繰り返し数qは、特に限定されるものではないが、好ましくは1~100の整数であり、より好ましくは2~100の整数であり、更に好ましくは2~95の整数であり、最も好ましくは4~90の整数である。前記繰り返し数qが前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
また、アルキレングリコール残基Yの繰り返し数qは、特に限定されるものではないが、好ましくは1~100の整数であり、より好ましくは2~100の整数であり、更に好ましくは2~95の整数であり、最も好ましくは4~90の整数である。前記繰り返し数qが前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、N-ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
このような活性エステル基としては、たとえばp-ニトロフェニル活性エステル基、N-ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、コハク酸イミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、5-ノルボルネン-2、3-ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、p-ニトロフェニル活性エステル基又はN-ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、p-ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。
前記重合体の前述した第1繰り返しユニットと、第2繰り返しユニットとの共重合比(第1繰り返しユニット/第2繰り返しユニット)は、特に限定されないが、97/3~5/95であることが好ましく、特に90/10~10/90であることが好ましい。共重合比が前記範囲内であると、特に非特異吸着を効果的に抑制するとともに、生理活性物質を固定化する効果、ひいては該生理活性物質と特異的に結合する生体物質の捕捉効果に優れる。
前記共重合比は、例えばX線光電子分光分析(XPS)で元素組成を評価することで算出できる。
前記重合体は、第1繰り返しユニットと第2繰り返しユニットとを含むランダム共重合体であることが好ましい。これにより、第2繰り返しユニットの側鎖の末端に存在する活性エステル基が分散するために、有効に作用することができる。
前記重合体の重量平均分子量は、特に限定されないが、5000~1000000であることが好ましく、特に10000~100000であることが好ましい。重量平均分子量が前記範囲内であると、合成時のハンドリングがよく、また、非特異吸着を効果的に抑制することができる。
前記重合体の重量平均分子量は、特に限定されないが、5000~1000000であることが好ましく、特に10000~100000であることが好ましい。重量平均分子量が前記範囲内であると、合成時のハンドリングがよく、また、非特異吸着を効果的に抑制することができる。
本発明の分析用担体では、前記第1繰り返しユニット、前記第2繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなる重合体が、前記基材(担体)にシランカップリング剤を介して結合されていても良い。これにより、ポリマーが担体から脱離するのを防ぐことができる。
前記側鎖にシランカップリング剤を有するユニットとしては、メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン、3-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、3-メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、3-メルカプトプロピルメチルジエトキシシラン、3-メルカプトプロピルジメチルメトキシシラン、3-メルカプトプロピルジメチルエトキシシラン、メルカプトエチルトリエトキシシランに由来するものが挙げられる。
担体が無機酸化物の場合、前記シランカップリング剤を用いることで、担体表面に存在する水酸基と重合体との間のカップリング反応により、容易に担体と重合体とを結合させることができる。
前記シランカップリング剤を用いることで、ポリマーが担体表面から脱離することを防ぐことができることから、分析用担体としての使用において、繰り返される加熱処理や、洗浄工程において、ポリマーの溶解を防ぐことが可能となる。さらに、ポリマーの脱離に伴い発生する、非特異吸着抑制成分および活性エステル基の低減が抑制され、化学的、物理的に安定した分析用担体を提供することが可能となる。
また、活性エステル基の低減を防ぐことで、生理活性物質の固定化量を高く維持できることから、該生理活性物質が特異的に捕捉する物質(検出対象)の捕捉量が大きくなる。さらに、非特異吸着抑制成分の低減が抑制されていることから検出対象以外のタンパク質等に対する非特異吸着が少なくなり、S/N比の高い分析用担体を提供することができる。
前記担体の基材は、特に限定されるものではなく、有機材料、無機材料を問わず用いることができる。
有機材料としては、例えばアフィニティクロマトグラフィーの担体として用いられる多孔性のアガロース粒子(商品名:Sepharose)、デキストラン粒子(商品名:Sephadex)の他に、ポリアクリルアミドゲル(商品名:Bio-Gel P、バイオラッド社)、ポリスチレン、エチレン-無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、アクリル系樹脂等の各種樹脂材料等が挙げられる。
有機材料としては、例えばアフィニティクロマトグラフィーの担体として用いられる多孔性のアガロース粒子(商品名:Sepharose)、デキストラン粒子(商品名:Sephadex)の他に、ポリアクリルアミドゲル(商品名:Bio-Gel P、バイオラッド社)、ポリスチレン、エチレン-無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、アクリル系樹脂等の各種樹脂材料等が挙げられる。
また、無機材料としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、アルミニウムおよびこれらの合金や無機酸化物等が挙げられる。これらの中でも無機酸化物が材料自体の強度が高い点で好ましい。中でも、酸化ケイ素が取り扱いやすく最も好ましい。
担体の形状は粒子、基板、繊維、フィルター、膜、シートなど任意である。中でも粒子の場合、表面に重合体が固定化しやすいため、好ましい。基板状の担体としては、例えばスライドガラス形状の平板状の基板や、マルチウェルプレート等を挙げることができる。
粒子状の担体の場合、担体の平均粒径は、目的および用途に応じて適宜選択される。特に、担体が無機物の場合、粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で有機物の粒子を製造する方法に比較して、粒径の制御が容易である。
具体的に、本発明の分析用担体に用いる粒子状の担体の粒径としては、用途によっても異なるが、平均粒径が数nm~100μm程度のものが好ましい。特には、100nm~50μmが好ましく、最も1μm~40μmが好ましい。担体の平均粒径が前記範囲内であると、特に生理活性物質の捕捉量とハンドリングの良さとのバランスに優れる。このような平均粒径は、例えば粒度分布計で測定することができる。
(重合体固定担体の作製)
前記重合体固定担体の作製について述べる。本発明の担体の製造方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、担体表面に、重合性官能基または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を固定化し、前記側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する重合性モノマーと、活性エステル基を有する重合性モノマーおよび該担体を含む混合物とを、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
前記重合体固定担体の作製について述べる。本発明の担体の製造方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、担体表面に、重合性官能基または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を固定化し、前記側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する重合性モノマーと、活性エステル基を有する重合性モノマーおよび該担体を含む混合物とを、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
重合性官能基または連鎖移動基を有するシランカップリング剤としては、前述のシランカップリング剤を好適に用いることができる。
溶媒としてはそれぞれのモノマー、例えばエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、2-ブタノン、メタノール、エタノール、t-ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または2種以上の組み合わせで用いられる。
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、2,2’-アゾビスイソブチルニトリル(以下「AIBN」という)、1,1’-アゾビス(シクロヘキサン-1-カルボニトリル)などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルなどの有機過酸化物などを挙げることができる。
本発明の高分子物質の化学構造は、その結合方式がランダム、ブロック、グラフトなどいずれの形態をなしていてもかまわない。
また、予め重合した高分子物質を担体表面に固定化することで、本発明の重合体固定担体を作製してもよい。この場合、例えば該高分子物質の溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で担体表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行う。
前述の高分子物質の溶液濃度は特に制限されるものではないが、0.05質量%以上が好ましく、より好ましくは0.1~70質量%、さらに好ましくは0.1~50質量%、最も好ましくは0.3~50質量%である。高分子物質溶液中の高分子物質濃度が下限値を下回ると、担体表面に塗布される該高分子物質の量が減少する。そのため、生理活性物質の固定化量が減少し、ひいては該生理活性物質と特異的に結合する生体物質、すなわち標的物質の捕捉効果が低下してしまう。さらには担体に対するタンパク質等の非特異的吸着を抑制する効果も低減される。これらのことにより該高分子物質の溶液濃度が下限値を下回った場合、標的物質を選択的に捕捉する特性が十分に発揮できない恐れが出てくる。
また、該高分子物質を担体に塗布する際、その濃度は、予め所定の濃度に調整しておいてもよいが、塗布する工程において、高分子物質溶液を濃縮しながら担体に塗布することも可能である。低濃度の高分子物質溶液を用いて担体(粒子)に塗布する場合、溶液粘度が低いため、細孔など微細な形状を有する担体表面に対しても溶液が浸透しやすい。このことは担体表面の隅々まで該高分子物質溶液を行き渡らせることができる点で有利であるが、濃度の低さゆえに担体表面を該高分子物質で十分に被覆できない恐れがある。一方、高濃度の高分子物質溶液を用いると、担体表面に塗布される該高分子物質の量が増加すると期待できるが、自ずと溶液の表面張力が高まることで、担体に対する濡れ性が低下し、操作性が悪くなる。これらのことから、複雑な表面形状を有する担体に対して該高分子物質を十分に被覆するには、低濃度溶液から濃縮しながら塗布する方法が望ましいといえる。濃縮方法は特に制限されるものではなく、加熱蒸発、減圧濃縮等、任意の方法を選択することができる。
前記高分子物質の溶液に用いる溶剤としては、該高分子物質を溶解するものであれば特に限定されるものではないが、エタノール、メタノール、イソプロパノール、n-ブタノール、t-ブチルアルコール、n-ペンタノール、シクロヘキサノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、シクロヘキサノン等を挙げることができる。これらの溶剤は、単独または2種以上の組み合わせで用いられる。中でも、エタノール、メタノールが汎用性が高く、かつ乾燥させやすいため好ましい。
また、該高分子物質を、含有するシランカップリング剤を用いて担体表面の官能基と共有結合させる条件は、シランカップリング剤に応じて任意に選択することができる。例えば、アルコキシシランを有する高分子物質の場合、加水分解により生成されたシラノール基が、担体表面の水酸基、アミノ基、カルボニル基、シラノール基等と脱水縮合して共有結合を形成する。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、核となる粒子表面に固定化された高分子物質は容易に溶解したり、核となる粒子から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。高分子物質が熱により変成されない温度範囲内、例えば、60~180℃で5分間~24時間加熱処理するのが好ましい。
エタノールやメタノールなど極性の高い有機溶剤を用いる場合や、高分子物質自体の親水性が高い場合は、溶剤に含まれる水分や塗布後空気中の水分により、アルコキシシリル基の加水分解が生じるため、特別な加水分解工程を施さなくとも、担体を加熱するだけで固定化することができることが多い。加水分解が不足する場合は、有機溶剤中に水を含有させた混合溶液を用いてもよい。理論上加水分解によりシラノール基を生成するのに必要な水が供給されれば十分であるが、溶液の調製の容易さを考えると、含水量を15質量%以下にするのが好ましい。含水量が多くなると高分子物質が溶媒に不溶となる恐れがある。
該高分子物質を担体表面に固定化させる際、担体表面に高分子物質と反応しうる官能基があればそのまま使用できるが、それがない場合もしくは乏しい場合は、担体表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては特に限定されるものではなく、表面処理剤としてアルコキシシランを用いる方法や、酸・アルカリにより処理する方法、酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ArF、KrFなどのエキシマレーザーで処理する方法等が挙げられる。担体が粒子である場合、アルコキシシランを用いる方法及び/又は酸・アルカリにより処理する方法が好ましい。
表面処理剤として使用するアルコキシシランとしては、特に制限されるものではないが、ジアルコキシシラン、トリアルコキシシラン、テトラアルコキシシラン等が挙げられる。なかでも、一分子あたりのアルコキシシリル基の数が最も多いテトラアルコキシシランが好適に使用される。テトラアルコキシシランを具体的に例示すれば、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトラブトキシシラン、テトラフェノキシシラン等が挙げられる。比較的分子量の小さいものは核となる粒子表面により多くのアルコキシシリル基を与えることができるため、炭素数が3以下のアルコキシシリル基を有するテトラメトキシシラン、テトラエトキシシシラン、テトラプロポキシシランが好ましく、入手性からテトラエトキシシランがより好ましい。これらのアルコキシシランは、単独または2種以上の組み合わせで用いられる。
担体表面をアルコキシシランにより活性化する方法について述べる。条件等は特に制限されるものではないが、例えばアルカリ触媒、及びアルコールを含む溶液に0.05~10質量%となるよう担体を浸漬し、この分散媒中にアルコールに溶解したアルコキシシランを添加しながら行う。担体とアルコキシシランの使用割合は特に制限されるものではないが、例えば担体が粒子の場合、1gに対しアルコキシシラン0.01~10mmolの割合で用いられる。分散媒に含まれるアルコール、及びアルコキシシランを溶解するアルコールとしては特に限定されるものではないが、エタノール、メタノール、イソプロパノール、t-ブチルアルコール等が単独または2種以上の組み合わせで用いられる。なかでも、乾燥させ易く、低廉なメタノールが好ましい。
アルコキシシラン溶液を添加した後、通常、0~50℃で、5~30時間程度撹拌して表面処理される。得られた担体は洗浄後、乾燥する。
上記の処理条件においては、アルコキシシランのアルコキシシリル基と担体表面の官能基との脱水縮合が起こる。この際、同時に高分子物質の固定化に用いられるべきアルコキシシリル基の脱水縮合も起こり得るため、アルコキシシランによる表面処理の効果を十分に発揮するためには、上記の処理の後、担体に酸・アルカリによる処理を施すことが効果的である。特に、アルコキシシリル基の脱水縮合により生じたシロキサン結合の加水分解には酸による処理が好適である。担体表面を酸により処理する方法は特に制限されるものではないが、例えば、上記処理により得られた担体を0.01~3Nの酸に1~5時間程度、浸漬することにより行われる。処理に用いられる酸としては各種公知の無機酸及び/又は有機酸を用いることができる。無機酸としては、硫酸、硝酸、塩酸、フッ酸等が挙げられ、また有機酸としては蟻酸、酢酸、安息香酸等が挙げられるが、短時間で処理を完了するための比較的厳しい処理条件を与えることができる無機酸が好適であり、なかでも高い揮発性から処理後の除去が容易であり、且つ取り扱いが比較的容易な塩酸がより好適である。
(生理活性物質の固定化)
本発明において生理活性物質を担体上に固定化する際には、生理活性物質を溶解又は分散させた液体を付着する方法が好ましい。生理活性物質を溶解又は分散した液体のpHは5.0~11.0であることが好ましく、pH6.0~10がより好ましい。この範囲外であると、生理活性物質が変性・分解する恐れがある。
本発明において生理活性物質を担体上に固定化する際には、生理活性物質を溶解又は分散させた液体を付着する方法が好ましい。生理活性物質を溶解又は分散した液体のpHは5.0~11.0であることが好ましく、pH6.0~10がより好ましい。この範囲外であると、生理活性物質が変性・分解する恐れがある。
生理活性物質付着後は、アミノエタノール等のアミノ基を有する低分子物質で担体を処理し未反応の活性エステル基を失活させてしまうことが好ましい。
固相表面の親水基の特性により、界面活性剤を含む水や緩衝液で洗浄することで、目的物以外の別の物質の固相表面への非特異吸着を抑制することが可能となる。
固相表面の親水基の特性により、界面活性剤を含む水や緩衝液で洗浄することで、目的物以外の別の物質の固相表面への非特異吸着を抑制することが可能となる。
前記生理活性物質は、酵素、抗体、レクチン、レセプター、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、糖タンパク質等のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、核酸、糖、オリゴ糖、多糖、シアル酸誘導体、シアル化糖鎖等の糖鎖、脂質、低分子化合物、上述以外の高分子有機物質、無機物質、若しくはこれらの融合体、または、ウイルス、若しくは細胞を構成する分子から選ばれる少なくとも一つである。
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
<実施例1 担体表面に、重合性官能基を有するシランカップリング剤を固定化し、該ビーズをモノマー溶液中に分散し、高分子物質を合成する場合>
(p-ニトロフェニルオキシカルボニル-ポリエチレングリコールメタクリレート(MEONP)の合成)
0.01molのポリエチレングリコールモノメタクリレート(Blenmer PE-200(n=4)、日本油脂(株)製)を20mLのクロロホルムに溶解させた後、-30℃まで冷却した。-30℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた0.01molのp-ニトロフェニルクロロフォーメート(Aldrich製)と0.01molのトリエチルアミン(和光純薬(株)製)及びクロロホルム20mLの均一溶液をゆっくりと滴下した。-30℃にて1時間反応させた後、さらに2時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してp-ニトロフェニルオキシカルボニル-ポリエチレングリコールメタクリレート(MEONP)を得た。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中1H―NMRで測定し、エチレングリコール残基が平均4.5単位含まれていることを確認した。
0.01molのポリエチレングリコールモノメタクリレート(Blenmer PE-200(n=4)、日本油脂(株)製)を20mLのクロロホルムに溶解させた後、-30℃まで冷却した。-30℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた0.01molのp-ニトロフェニルクロロフォーメート(Aldrich製)と0.01molのトリエチルアミン(和光純薬(株)製)及びクロロホルム20mLの均一溶液をゆっくりと滴下した。-30℃にて1時間反応させた後、さらに2時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してp-ニトロフェニルオキシカルボニル-ポリエチレングリコールメタクリレート(MEONP)を得た。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中1H―NMRで測定し、エチレングリコール残基が平均4.5単位含まれていることを確認した。
(担体表面へのシランカップリング剤の導入)
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン(Gelest社製SIM6486.5)13gをpH3.0の酢酸水溶液50mLとエタノール50mLとの混合液に添加し、シランカップリング剤を加水分解した後に、シリカビーズ(平均粒径5μm、細孔径70Å、富士シリシア化学株式会社製SMB70-5)10gを投入し70℃で2時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、100℃で1時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン(Gelest社製SIM6486.5)13gをpH3.0の酢酸水溶液50mLとエタノール50mLとの混合液に添加し、シランカップリング剤を加水分解した後に、シリカビーズ(平均粒径5μm、細孔径70Å、富士シリシア化学株式会社製SMB70-5)10gを投入し70℃で2時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、100℃で1時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
(担体表面への高分子物質の固定化)
2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(以下MPCモノマーと記載、日本油脂株式会社製)と先に合成したMEONPを、エタノールとメチルエチルケトンの混合溶媒に溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は0.8mol/L、それぞれのモル比はMPCモノマー、MEONPの順に80:20、50:50、20:80である。そこにAIBNを0.08mol/Lになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ10gを投入し、アルゴンガス雰囲気下、70℃で22時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、ジメチルスルホキシドに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、乾燥させた。
2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(以下MPCモノマーと記載、日本油脂株式会社製)と先に合成したMEONPを、エタノールとメチルエチルケトンの混合溶媒に溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は0.8mol/L、それぞれのモル比はMPCモノマー、MEONPの順に80:20、50:50、20:80である。そこにAIBNを0.08mol/Lになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ10gを投入し、アルゴンガス雰囲気下、70℃で22時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、ジメチルスルホキシドに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、乾燥させた。
<実施例2 予め高分子物質を合成し、該高分子物質を担体に塗布する場合>
(高分子物質の合成)
MPCモノマー、MEONP、3-メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン(MPDMS)を、エタノールとメチルエチルケトンの混合溶媒に溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は0.8mol/L、それぞれのモル比はMPCモノマー、MEONP、MPDMSの順に47:47:6である。そこにAIBNを0.08mol/Lになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、60℃で4時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテルとクロロホルムの混合溶媒中に滴下し、沈殿を収集、エタノールとメチルエチルケトンの混合溶媒に再溶解し、濃度を0.3wt%に調製した。
MPCモノマー、MEONP、3-メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン(MPDMS)を、エタノールとメチルエチルケトンの混合溶媒に溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は0.8mol/L、それぞれのモル比はMPCモノマー、MEONP、MPDMSの順に47:47:6である。そこにAIBNを0.08mol/Lになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、60℃で4時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテルとクロロホルムの混合溶媒中に滴下し、沈殿を収集、エタノールとメチルエチルケトンの混合溶媒に再溶解し、濃度を0.3wt%に調製した。
(シリカビーズのコート)
平均粒径5ミクロンのシリカビーズを前記高分子物質の溶液に浸漬し、ボルテックスミキサーでよく攪拌した。この混合液をロータリーエバポレータで濃縮した。さらに吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた後、100℃で2時間加熱処理を施した。その後、エタノールとメチルエチルケトンの混合溶媒中に浸漬し、ボルテックスミキサーでよく攪拌、洗浄した。吸引ろ過によりビーズを回収し、乾燥させた。
平均粒径5ミクロンのシリカビーズを前記高分子物質の溶液に浸漬し、ボルテックスミキサーでよく攪拌した。この混合液をロータリーエバポレータで濃縮した。さらに吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた後、100℃で2時間加熱処理を施した。その後、エタノールとメチルエチルケトンの混合溶媒中に浸漬し、ボルテックスミキサーでよく攪拌、洗浄した。吸引ろ過によりビーズを回収し、乾燥させた。
(1次抗体固定化)
実施例1および2で得られた粒子各20mgに対し、50μg/mLに調製したCRP抗体(Abnova製)のリン酸水素二カリウム溶液1mLを加え、室温にて1晩転倒混和した。0.05%Tween20含有PBSで3回洗浄した。さらに0.1mol/Lの2-アミノエタノール(溶媒:pH9.5、0.05mol/LのTris-HCl緩衝液)で室温下、1時間処理し、活性エステル基の不活性化を行った。
実施例1および2で得られた粒子各20mgに対し、50μg/mLに調製したCRP抗体(Abnova製)のリン酸水素二カリウム溶液1mLを加え、室温にて1晩転倒混和した。0.05%Tween20含有PBSで3回洗浄した。さらに0.1mol/Lの2-アミノエタノール(溶媒:pH9.5、0.05mol/LのTris-HCl緩衝液)で室温下、1時間処理し、活性エステル基の不活性化を行った。
(CRPとの反応)
CRP抗体を固定化した粒子5mgに3μg/mLに調製したCRPのPBS溶液1mLを加え、室温にて1時間転倒混和した。遠心分離で粒子を回収後0.05%Tween20含有PBSで3回洗浄した。
CRP抗体を固定化した粒子5mgに3μg/mLに調製したCRPのPBS溶液1mLを加え、室温にて1時間転倒混和した。遠心分離で粒子を回収後0.05%Tween20含有PBSで3回洗浄した。
(2次抗体との反応)
CRPを反応させた粒子に、1μg/mLに調製したHRP標識化CRP抗体(Abnova製)溶液を1mL加え、室温にて1時間転倒混和した。遠心分離で粒子を回収後0.05%Tween20含有PBSで3回洗浄した。
CRPを反応させた粒子に、1μg/mLに調製したHRP標識化CRP抗体(Abnova製)溶液を1mL加え、室温にて1時間転倒混和した。遠心分離で粒子を回収後0.05%Tween20含有PBSで3回洗浄した。
(CRP捕捉量の定量)
HRP標識化CRP抗体を反応させた粒子を、住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットを用いて発色させ、450nmの吸光度を測定することによりCRPの捕捉量を見積もった。
HRP標識化CRP抗体を反応させた粒子を、住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットを用いて発色させ、450nmの吸光度を測定することによりCRPの捕捉量を見積もった。
<比較例>
CRP抗体を固定化せずに、2-アミノエタノールで不活性化のみを行った粒子に対し、実施例と同様のCRP捕捉量測定を行った。
CRP抗体を固定化せずに、2-アミノエタノールで不活性化のみを行った粒子に対し、実施例と同様のCRP捕捉量測定を行った。
いずれの実施例においても、比較例よりも吸光度が大きく上昇しており、CRP抗体を固定化したビーズがCRPを捕捉できていることがわかる。
本発明により生理活性物質を固定化することができる担体、特に反応触媒を必要とせず生理活性物質を固定化することができ、且つ非特異吸着を抑制した担体を簡便に作製し、提供することが可能となった。
Claims (24)
- 生理活性物質を捕捉する分析用担体であって、
担体の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する第1繰り返しユニットと、
側鎖の末端に活性エステル基を有する第2繰り返しユニットと
を有することを特徴とする分析用担体。 - 前記ベタイン構造を有する官能基がホスホリルコリン基である請求項1記載の分析用担体。
- 担体の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、
該担体と、側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する重合性モノマーと、活性エステル基を有する重合性モノマーと、を含む重合性成分を混合し、
次いで重合反応を進行させることにより、
該担体表面に高分子物質を含む層を形成してなる請求項1または2に記載の分析用担体。 - 前記側鎖にベタイン構造を有する官能基を有する重合性モノマーが、2-(メタ)アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する請求項3または4に記載の分析用担体。
- 前記活性エステル基が、p-ニトロフェニル基またはスクシンイミド基と、エステル結合とを含む基である請求項6記載の分析用担体。
- 前記担体の表面に導入する重合性官能基がメタクリル基、アクリル基、及びビニル基よりなる群から選ばれる1種以上である請求項3乃至7いずれか1項に記載の分析用担体。
- 前記担体の表面に導入する連鎖移動基がメルカプト基である請求項3乃至7いずれか1項に記載の分析用担体。
- 前記担体が無機材料からなる請求項1乃至9いずれか1項に記載の分析用担体。
- 前記無機材料が無機酸化物からなる請求項10に記載の分析用担体。
- 前記無機酸化物が酸化ケイ素である請求項11に記載の分析用担体。
- 前記担体の形状が粒子、基板、繊維、フィルター、膜、シートである請求項1乃至12いずれか1項に記載の分析用担体。
- 前記担体の表面への重合性官能基、または連鎖移動基の導入が、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤と核となる担体表面の官能基との共有結合の形成によってなされる請求項3乃至13いずれか1項に記載の分析用担体。
- 前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤が、重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランである請求項14に記載の分析用担体。
- 請求項1乃至15いずれか1項に記載の分析用担体であって、高分子物質を含む層の前記活性エステル基を介して生理活性物質を固定化したことを特徴とする分析用担体。
- 前記生理活性物質が酵素、抗体、レクチン、レセプター、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ及び糖タンパク質からなる群から選ばれる1種以上のタンパク質;ペプチド;アミノ酸;ホルモン;核酸;糖、オリゴ糖、多糖、シアル酸誘導体及びシアル化糖鎖からなる群から選ばれる1種以上の糖鎖;脂質;低分子化合物;上述以外の高分子有機物質;無機物質;若しくはこれらの融合体、または、ウイルス、若しくは細胞を構成する分子から選ばれる少なくとも一つである請求項16に記載の分析用担体。
- 請求項1乃至17いずれか1項に記載の分析用担体の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを酸性水溶液中で加水分解する工程、次いで前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを含む酸性水溶液中で担体を撹拌下、加熱する工程、及び乾燥後、更に加熱する工程、を含む分析用担体の製造方法。
- 請求項1乃至17いずれか1項に記載の分析用担体の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を導入した担体と重合性モノマーとを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程、及び乾燥する工程を含む分析用担体の製造方法。
- 前記重合反応がラジカル重合反応であることを特徴とする請求項19に記載の分析用担体の製造方法。
- 請求項3乃至17いずれか1項に記載の分析用担体の製造方法であって、高分子物質を含む層を形成した担体に、生理活性物質をリン酸塩緩衝液に溶解した溶液を接触させる工程を含む分析用担体の製造方法。
- 前記リン酸塩緩衝液のリン酸塩濃度が0.1M以上5M以下である請求項21に記載の分析用担体の製造方法。
- 前記リン酸塩がリン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、又はリン酸水素二ナトリウムのいずれかを含む請求項21または22に記載の分析用担体の製造方法。
- 請求項21乃至23のいずれか1項に記載の分析用担体を、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより標的生体物質を回収することを特徴とする分析用担体の使用方法。
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