JP5343603B2 - コルチゾール分離用モノリス型シリカカラムとその製造方法、及びコルチゾールの分離方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生体小分子分離用モノリス型シリカカラムとその製造方法、及び生体小分子の分離方法に関する。
神経伝達物質やホルモン等の生体小分子の分析には、分離カラムとして逆相カラムを使用した高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が広く用いられている。血漿、血清、唾液、尿などの生体試料中において、生体小分子は、これらの分子よりも分子量が大きいタンパク質や、多量の塩と混在している。そのため、生体試料を用いて生体小分子のHPLC分析を行なう場合には、試料を分離カラムに導入する前に、試料からタンパク質や塩を除くための前処理操作が行われる。この前処理操作を行わず、試料を直接分離カラムに導入すると、試料中のタンパク質が分離カラムの充填材に吸着し、カラム圧が上昇したり、カラム性能が劣化したりすることで、生体小分子を効率よく分離できず、分析感度が低下してしまう。
近年、HPLC分析において高い分離能力をもたらす分離カラムとして、従来の微粒子充填型カラムに替わり、モノリス型シリカカラムが用いられるようになっている（特許文献１参照）。モノリス型シリカカラムは、従来までのシリカ粒子充填型カラムと異なり、三次元ネットワーク状のシリカ骨格とその空隙（「貫通孔」、「マクロポア」、「スルーポア」などと表現される）が一体となった構造を持つ。また、モノリス型シリカカラムのシリカ骨格には、微細孔（「メソポア」とも呼ばれる）が存在している。スルーポアの孔径径は数〜数百μｍ、メソポアの孔径は数〜数十ｎｍの範囲で独立して制御することができる。モノリス型シリカカラムは、これらのポアの存在による分子ふるい効果によって、生体小分子とタンパク質及び塩を分離するものである。
生体由来等の特定成分を分離するための分離材としては、最近、ホスホリルコリン類似基を表面に有する分離材が開発されてきている（特許文献２参照）。ホスホリルコリン類似基含有重合体は、生体膜に由来するリン脂質類似構造に起因して、血液適合性、補体活性、生体物質非吸着性等の特性を有していることが明らかにされている。ホスホリルコリン類似基含有重合体については、近年、こうした機能を利用した生体関連材料の開発が盛んに行われている。特許文献２に開示される分離材では、分離材の表面に存在するホスホリルコリン類似基の割合等を制御することによって、生体由来成分から「細胞」、「タンパク質」又は「情報伝達物質」のいずれかを分離できるとされている（当該文献請求項５参照）。なお、この分離材では、例えば「情報伝達物質」の中から、さらに特定の物質（生体小分子）のみを分離することに関しての検討はなされていない。
生体試料中の神経伝達物質やホルモン等の生体小分子の分析を高精度に行うため、カラムへのタンパク質の吸着を防止して、目的の生体小分子を選択的に分離し、高収率で回収できる分離カラムが求められている。
そこで、本発明は、タンパク質がカラムに吸着することを防止しつつ、生体小分子のうち特に分析対象とする分子を効率よくカラムに保持することが可能な分離カラムを提供することを主な目的とする。
上記課題解決のため、本発明は、スルーポアを形成する三次元ネットワーク状のシリカ骨格とメソポアとして該シリカ骨格に形成された前記スルーポアより孔径の小さい微細孔とを有し、下記式（１）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体によって、前記シリカ骨格と前記微細孔の各々の表面が修飾され、かつ、表面修飾された前記微細孔のポアサイズがコルチゾールの分子サイズに適合する大きさを有し、体液又は該体液の希釈液に含まれるコルチゾールを分離するためのコルチゾール分離用モノリス型シリカカラムを提供する。
(式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示し、Ｒ4は炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ5は水素原子もしくはメチル基を示す。ｎは１〜４の整数である。)
このコルチゾール分離用モノリス型シリカカラムでは、シリカ骨格と該シリカ骨格に形成された微細孔の表面に修飾されたホスホリルコリン類似基含有重合体が有する高い親水性により、タンパク質のカラムへの吸着を防止することができる。また、表面修飾された前記微細孔のポアサイズが、コルチゾールの分子サイズに適合する大きさとされていることにより、コルチゾールを選択的に微細孔内に取り込んで保持することができる。
また、本発明は、このコルチゾール分離用モノリス型シリカカラムを用いるコルチゾールの分離方法を提供する。
さらに、本発明は、スルーポアを形成する三次元ネットワーク状のシリカ骨格とメソポアとして該シリカ骨格に形成された前記スルーポアより孔径の小さい微細孔とを有し、該微細孔がコルチゾールの分子サイズに応じて所定の孔径に形成されたモノリス型シリカカラムを準備する工程と、下記式（１）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を、コルチゾールの分子サイズに応じて所定の分子量に重合した重合体を準備する工程と、前記シリカ骨格と前記微細孔の各々の表面に前記重合体を修飾する工程と、を含む体液又は該体液の希釈液に含まれるコルチゾール分離用モノリス型シリカカラムの製造方法をも提供する。
(式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示し、Ｒ4は炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ5は水素原子もしくはメチル基を示す。ｎは１〜４の整数である。)
このコルチゾール分離用モノリス型シリカカラムでは、シリカ骨格と該シリカ骨格に形成された微細孔の表面に修飾されたホスホリルコリン類似基含有重合体が有する高い親水性により、タンパク質のカラムへの吸着を防止することができる。また、表面修飾された前記微細孔のポアサイズが、コルチゾールの分子サイズに適合する大きさとされていることにより、コルチゾールを選択的に微細孔内に取り込んで保持することができる。
また、本発明は、このコルチゾール分離用モノリス型シリカカラムを用いるコルチゾールの分離方法を提供する。
さらに、本発明は、スルーポアを形成する三次元ネットワーク状のシリカ骨格とメソポアとして該シリカ骨格に形成された前記スルーポアより孔径の小さい微細孔とを有し、該微細孔がコルチゾールの分子サイズに応じて所定の孔径に形成されたモノリス型シリカカラムを準備する工程と、下記式（１）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を、コルチゾールの分子サイズに応じて所定の分子量に重合した重合体を準備する工程と、前記シリカ骨格と前記微細孔の各々の表面に前記重合体を修飾する工程と、を含む体液又は該体液の希釈液に含まれるコルチゾール分離用モノリス型シリカカラムの製造方法をも提供する。
なお、本発明において、微細孔の「ポアサイズ」とは、ホスホリルコリン類似基含有重合体が修飾された状態の微細孔の径をいうものとし、ホスホリルコリン類似基含有重合体が修飾されていない状態の微細孔の径については、単に「孔径」というものとする。
本発明により、タンパク質がカラムに吸着することを防止しつつ、生体小分子のうち特に分析対象とする分子を効率よくカラムに保持することが可能な分離カラムが提供される。
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．生体小分子分離用モノリス型シリカカラムとその製造方法
（１）モノリス型シリカカラム
（２）MPCポリマーによる表面親水化処理
（３）分離対象生体小分子に対する最適化
２．生体小分子の分離方法
（１）分離対象生体小分子
（２）分離対象溶液
（３）分離手順
１．生体小分子分離用モノリス型シリカカラムとその製造方法
（１）モノリス型シリカカラム
（２）MPCポリマーによる表面親水化処理
（３）分離対象生体小分子に対する最適化
２．生体小分子の分離方法
（１）分離対象生体小分子
（２）分離対象溶液
（３）分離手順
１．生体小分子分離用モノリス型シリカカラムとその製造方法
（１）モノリス型シリカカラム
本発明においては、生体小分子を分離するため、スルーポアを形成する三次元ネットワーク状のシリカ骨格にメソポアが形成された構造を有するモノリス型シリカカラムを用いる。モノリス型シリカカラムには、市販のカラムや、上記特許文献１等に開示される公知の方法により得られるカラムを用いることができる。一般に、HPLC用のロッドタイプモノリス型シリカカラムは、有機シランから形成される。シリカ骨格の構造は、例えば、アルコキシシランとポリエチレングリコール（PEG）の酢酸水溶液中で、スピノーダル分解に基づく相分離により生成する過渡的な秩序構造が、ゾル−ゲル転移を伴う有機シランの加水分解−重縮合反応により凍結されることで形成される。また、メソポアは、シリカ骨格の形成後、アンモニア処理を行うことによって形成される。
（１）モノリス型シリカカラム
本発明においては、生体小分子を分離するため、スルーポアを形成する三次元ネットワーク状のシリカ骨格にメソポアが形成された構造を有するモノリス型シリカカラムを用いる。モノリス型シリカカラムには、市販のカラムや、上記特許文献１等に開示される公知の方法により得られるカラムを用いることができる。一般に、HPLC用のロッドタイプモノリス型シリカカラムは、有機シランから形成される。シリカ骨格の構造は、例えば、アルコキシシランとポリエチレングリコール（PEG）の酢酸水溶液中で、スピノーダル分解に基づく相分離により生成する過渡的な秩序構造が、ゾル−ゲル転移を伴う有機シランの加水分解−重縮合反応により凍結されることで形成される。また、メソポアは、シリカ骨格の形成後、アンモニア処理を行うことによって形成される。
モノリス型シリカのスルーポアはスピノーダル分解に基づくゾル−ゲル転移により形成され、メソポアはアンモニア処理により形成されるため、スルーポア及びメソポアの孔径は独立して制御することができる。具体的には、相分離の速度や重縮合による凍結速度、アンモニア処理強度等を変化させることにより、スルーポア径及びメソポア径は、それぞれ数〜数百μｍ、数〜数十ｎｍの範囲で制御できる。本発明では、後述するように、分離対象とする生体小分子の分子サイズに応じて、所定の孔径のメソポアがシリカ骨格に形成されたモノリス型シリカカラムを準備して用いる。
（２）MPCポリマーによる表面親水化処理
モノリス型シリカカラムには、試料中に含まれるタンパク質がシリカモノリスに吸着することを防止するため、三次元ネットワーク状のシリカ骨格の表面（骨格の空隙であるスルーポアの表面）と、シリカ骨格に形成された微細孔の表面（メソポアの表面）に親水性を付与する。
モノリス型シリカカラムには、試料中に含まれるタンパク質がシリカモノリスに吸着することを防止するため、三次元ネットワーク状のシリカ骨格の表面（骨格の空隙であるスルーポアの表面）と、シリカ骨格に形成された微細孔の表面（メソポアの表面）に親水性を付与する。
親水性の付与は、シリカモノリス表面にホスホリルコリン類似基含有重合体を化学修飾することにより行うことができる。ホスホリルコリン類似基含有重合体は、生体膜に由来するリン脂質類似構造に起因する親水性により、タンパク質に対して高い吸着防止効果を発揮する。
ホスホリルコリン類似基含有重合体は、下記式（１）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合させることにより得ることができる。
式（１）中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、フェニル基等が挙げられる。炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基等が挙げられる。また、Ｒ4は炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ5は水素原子又はメチル基を示す。ｎは１〜４の整数を示す。
式（１）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体としては、例えば、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、３−((メタ)アクリロイルオキシ)プロピル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、４−((メタ)アクリロイルオキシ)ブチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、５−((メタ)アクリロイルオキシ)ペンチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、６−((メタ)アクリロイルオキシ)ヘキシル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリエチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリプロピルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリブチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリシクロヘキシルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリフェニルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)プロピル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)ブチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)ペンチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)ヘキシル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート等が挙げられる。中でも２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン：以下、「ＭＰＣ」と略す)が入手性等の点で好ましい。
これらのホスホリルコリン類似基含有単量体は、公知の方法で製造できる。例えば、特開昭５４−６３０２５号公報、特開昭５８−１５４５９１号公報等に示される公知の方法に準じて製造できる。具体的には、環状リン化合物と２−ヒドロキシエチル(メタ)アクリレートとを脱ハロゲン化水素剤のもとで反応させ、次いでトリメチルアミンを反応させることにより、開環させて目的物を得る方法等が挙げられる。ＭＰＣについては、特開昭５４−６３０２５号公報に、その製造方法が記載されている。
ホスホリルコリン類似基含有重合体は、上記のホスホリルコリン類似基含有単量体に必要に応じて他の単量体、例えば、疎水性又は親水性単量体を混合した単量体組成物を重合して得る。他の単量体としては、以下のものが挙げられる。
疎水性単量体としては、例えば、メチル(メタ)アクリレート、エチル(メタ)アクリレート、ブチル(メタ)アクリレート、２−エチルヘキシル(メタ)アクリレート、ラウリル(メタ)アクリレート、ステアリル(メタ)アクリレート等の直鎖又は分岐アルキル(メタ)アクリレート；シクロヘキシル(メタ)アクリレート等の環状アルキル(メタ)アクリレート；ベンジル(メタ)アクリレート、フェノキシエチル(メタ)アクリレート等の芳香族(メタ)アクリレート；ポリプロピレングリコール(メタ)アクリレート等の疎水性ポリアルキレングリコール(メタ)アクリレート；スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系単量体；メチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル系単量体等が挙げられる。これらは単独若しくは混合物として使用できる。
また、親水性単量体としては、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン酸基、アミド基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアミノ塩基、トリアルキルホスホニウム塩基及びポリオキシエチレン基からなる群より選ばれる親水性基を有する単量体等が挙げられる。具体的には、２−ヒドロキシエチル(メタ)アクリレート、２−ヒドロキシブチル(メタ)アクリレート、４−ヒドロキシブチル(メタ)アクリレート等の水酸基含有(メタ)アクリレート；アクリル酸、メタクリル酸等のカルボン酸；スチレンスルホン酸、(メタ)アクリロイルオキシエチルリン酸、２−ヒドロキシ−３−(メタ)アクリルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド等のイオン性基含有単量体；(メタ)アクリルアミド、アミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチル(メタ)アクリレート等の含窒素単量体；ポリエチレングリコール(メタ)アクリレート等が挙げられる。これらは単独若しくは混合物として使用できる。
ホスホリルコリン類似基含有重合体は、上記のホスホリルコリン類似基含有単量体に必要に応じて他の単量体を混合した単量体組成物を、通常のラジカル重合により重合させることにより得ることができる。通常、ホスホリルコリン類似基含有重合体の分子量は、重量平均分子量で、例えば５，０００〜５，０００，０００の範囲とできる。本発明において、ホスホリルコリン類似基含有重合体の分子量は、後述するように、分離対象とする生体小分子の分子サイズに応じて所定の分子量に重合される。
スルーポア及びメソポアの表面へのホスホリルコリン類似基含有重合体の修飾は、シリカモノリス表面にする存在するシラノール基にホスホリルコリン類似基含有重合体を化学的に結合することにより行うことができる。ホスホリルコリン類似基含有重合体の修飾により、シリカ骨格に形成されたメソポアの孔径は、表面修飾されたホスホリルコリン類似基含有重合体の膜厚分だけ小さくなる。そして、このホスホリルコリン類似基含有重合体の修飾によるメソポア孔径の減少量は、修飾する重合体の分子量に依存し、分子量が大きい程メソポア孔径は小さくなる。
（３）分離対象生体小分子に対する最適化
モノリス型シリカカラムによる生体試料中からの生体小分子の分離は、スルーポアとメソポアの孔径の違いによる分子ふるい効果に基づき、生体小分子のみをメソポア内に取り込んで保持することによって行われる。このとき、生体小分子を効率よくメソポア内に保持するためには、目的とする生体小分子の分子サイズとメソポアの孔径が一致していることにより、メソポア内に分離対象外の生体小分子や、分子サイズが大きいタンパク質が入り込まないようにすることが望ましい。
モノリス型シリカカラムによる生体試料中からの生体小分子の分離は、スルーポアとメソポアの孔径の違いによる分子ふるい効果に基づき、生体小分子のみをメソポア内に取り込んで保持することによって行われる。このとき、生体小分子を効率よくメソポア内に保持するためには、目的とする生体小分子の分子サイズとメソポアの孔径が一致していることにより、メソポア内に分離対象外の生体小分子や、分子サイズが大きいタンパク質が入り込まないようにすることが望ましい。
そこで、本発明においては、分離対象とする生体小分子の分子サイズに応じて所定孔径に形成されたメソポア表面を、生体小分子の分子サイズに応じて所定分子量に重合されたホスホリルコリン類似基含有重合体によって表面修飾する。これにより、本発明では、ホスホリルコリン類似基含有重合体によって表面修飾されたメソポアの孔径（ポアサイズ）が、分離対象とする生体小分子の分子サイズに適合する大きさとなるようにする。すなわち、メソポアの孔径から、表面修飾されたホスホリルコリン類似基含有重合体の膜厚分を引いた孔径（ポアサイズ）が、分離対象とする生体小分子の分子サイズに一致するように、モノリス型シリカカラムのメソポア孔径及びホスホリルコリン類似基含有重合体の分子量を調整する。
具体的には、生体小分子としてコルチゾールを分離する場合、例えば、メソポアの孔径を１２ｎｍ程度とし、ホスホリルコリン類似基含有重合体の分子量を３０，０００Ｄａ程度とする。このとき、メソポア表面に修飾されたホスホリルコリン類似基含有重合体の膜厚は数ｎｍ程度となるため、メソポアのポアサイズは、メソポアの孔径（１２ｎｍ）から膜厚（数ｎｍ）を引いて１０ｎｍ程度となる。このメソポアのポアサイズは、コルチゾールの分子サイズ（長さ１２Å、幅６Å）に適合した大きさとなっている。すなわち、メソポアのポアサイズに対して分子サイズが十分に小さいコルチゾールがメソポア内に入り込む一方、分子サイズが大きい夾雑物であるタンパク質がメソポア内に入り込まないようにすることが可能となる。
２．生体小分子の分離方法
（１）分離対象生体小分子
本発明において、分離対象とする生体小分子は、神経伝達物質やホルモン等であって、例えば、アドレナリンやドーパミンなどのカテコールアミン、オキシトシンやエンドルフィンなどの生理活性ペプチド、卵胞ホルモン、黄体ホルモン、男性ホルモン、インスリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモンやこれらの代謝産物、誘導体、中間体等とできる。さらに、分離対象とする生体小分子は、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、トリヨードサイロニン(Ｔ３)、サイロキシン(Ｔ４)、絨毛性ゴナドトロピン(ＨＣＧ)、ヒト胎盤性ラクトーゲン(ＨＰＬ)やこれらの代謝産物等であってもよい。
（１）分離対象生体小分子
本発明において、分離対象とする生体小分子は、神経伝達物質やホルモン等であって、例えば、アドレナリンやドーパミンなどのカテコールアミン、オキシトシンやエンドルフィンなどの生理活性ペプチド、卵胞ホルモン、黄体ホルモン、男性ホルモン、インスリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモンやこれらの代謝産物、誘導体、中間体等とできる。さらに、分離対象とする生体小分子は、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、トリヨードサイロニン(Ｔ３)、サイロキシン(Ｔ４)、絨毛性ゴナドトロピン(ＨＣＧ)、ヒト胎盤性ラクトーゲン(ＨＰＬ)やこれらの代謝産物等であってもよい。
（２）分離対象溶液
分離対象生体小分子を含む溶液としては、特に限定されないが、体液やその希釈液等が
挙げられる。ここで、体液とは、動物体内の脈管又は組織・細胞の間を満たす全ての液体
、及び体内から体外へ放出又は分泌される液体のことを指し、例えば、血液、血漿、血清
、リンパ液、涙液、尿、脊髄液等が挙げられる。本発明に係る生体小分子分離用モノリス型カラムでは、シリカ骨格と該シリカ骨格に形成された微細孔の表面に修飾されたホスホリルコリン類似基含有重合体が有する高い親水性により、タンパク質のカラムへの吸着を防止することができる。そのため、体液等の多量のタンパク質を含む溶液からも高い収率で生体小分子を分離、回収することができる。
分離対象生体小分子を含む溶液としては、特に限定されないが、体液やその希釈液等が
挙げられる。ここで、体液とは、動物体内の脈管又は組織・細胞の間を満たす全ての液体
、及び体内から体外へ放出又は分泌される液体のことを指し、例えば、血液、血漿、血清
、リンパ液、涙液、尿、脊髄液等が挙げられる。本発明に係る生体小分子分離用モノリス型カラムでは、シリカ骨格と該シリカ骨格に形成された微細孔の表面に修飾されたホスホリルコリン類似基含有重合体が有する高い親水性により、タンパク質のカラムへの吸着を防止することができる。そのため、体液等の多量のタンパク質を含む溶液からも高い収率で生体小分子を分離、回収することができる。
また、分離対象生体小分子を含む溶液は、体液等以外にも、例えば、水溶液、有機溶媒を１種類あるいは複数種類含んだ溶液、水溶液と１種類あるいは複数種類の有機溶媒を混合した混合溶液等であってもよい。
（３）分離手順
本発明に係る生体小分子の分離方法では、上述したモノリス型シリカカラムを用いて、目的とする生体小分子を溶液中から分離するものである。具体的には、まず、分離対象生体小分子を含む溶液（以下、サンプル溶液）をモノリス型シリカカラムに通流し、生体小分子をメソポア内に保持させる。サンプル溶液の通流に先立って、カラムには緩衝液や水（これらを「ランニングバッファー」と称する）を通流させておいてもよい。サンプル溶液は、ランニングバッファーの送液を一旦停止して、又はランニングバッファーとともに、カラムに通流される。
本発明に係る生体小分子の分離方法では、上述したモノリス型シリカカラムを用いて、目的とする生体小分子を溶液中から分離するものである。具体的には、まず、分離対象生体小分子を含む溶液（以下、サンプル溶液）をモノリス型シリカカラムに通流し、生体小分子をメソポア内に保持させる。サンプル溶液の通流に先立って、カラムには緩衝液や水（これらを「ランニングバッファー」と称する）を通流させておいてもよい。サンプル溶液は、ランニングバッファーの送液を一旦停止して、又はランニングバッファーとともに、カラムに通流される。
このとき、モノリス型シリカカラムは、従来の微粒子充填型カラムと比較して大きなスルーポアを有しているため、サンプル溶液を低圧でカラムに通流させることができる。さらに、本発明に係るモノリス型シリカカラムでは、スルーポア及びメソポアの表面にホスホリルコリン類似基含有重合体を化学修飾し親水性を付与したことにより、体液やその希釈液などのタンパク質が多量に含まれるサンプル溶液を用いる場合にも、タンパク質がシリカモノリスに吸着されにくい。このため、カラム圧の上昇を抑制することができ、一層低圧でサンプル溶液を送液することが可能とされている。
低圧での送液が可能であることにより、同じ分離能であればカラムの径を従来よりも細くしてカラム容積を小さくすることができため、生体小分子のカラムへの吸着による散逸を抑制することができる。また、少量のサンプル溶液からでも生体小分子を分離することが可能となる。
また、本発明に係るモノリス型シリカカラムでは、ホスホリルコリン類似基含有重合体によって表面修飾されたメソポアの孔径（ポアサイズ）が、分離対象とする生体小分子の分子サイズに適合する大きさとされていることにより、メソポア内に他の生体小分子や、分子量の大きいタンパク質が入り込むことを防止できる。これにより、メソポア内に目的とする生体小分子のみを選択的に取り込んで保持することが可能とされている。
次に、サンプル溶液を通流したモノリス型シリカカラムに、生体小分子を溶出させるためのバッファー（溶出バッファー）を通流する。この溶出バッファーは、上記のランニングバッファーとすることができる。サンプル溶液をランニングバッファーの送液を一旦停止してカラムに通流した場合には、ランニングバッファーの送液を再開することにより、分子ふるい効果によって、まず、タンパク質が溶出され、次に目的とする生体小分子が溶出される。また、サンプル溶液をランニングバッファーとともにカラムに通流した場合にも、まず、タンパク質が溶出され、次に目的とする生体小分子が溶出されてくる。従って、後に溶出されてくる生体小分子を含むバッファー分画を回収することにより、メソポア内に選択的に取り込まれ保持されていた生体小分子を高収率で回収することができる。
このとき、従来のカラムでは、タンパク質及び生体小分子を溶出させるためには、有機溶媒を含むランニングバッファーを用いる必要があった。そのため、回収された生体小分子溶液中に有機溶媒が含まれ、後の分析に問題が生じることがあった。例えば、回収された生体小分子溶液を、ELISAのようなアフィニティー分析に供する場合、抗体やアプタマー等の生体小分子に対するアフィニティーが、生体小分子溶液中の有機溶媒濃度に依存して変化してしまい、分析結果の正確性や再現性に影響が出るおそれがある。これに対して、本発明に係るモノリス型シリカカラムでは、タンパク質及び生体小分子の吸着が起こり難いため、有機溶媒を含まないバッファー（もしくは有機溶媒濃度が低いバッファー）を用いることができ、回収された生体小分子溶液中に含まれる有機溶媒によって後の分析が影響を受けることがない。
１．生体小分子分離用モノリス型シリカカラムを用いたコルチゾールの分離
（１）モノリス型シリカカラムの調製
スルーポア孔径2 μm、メソポア孔径12 nm、カラムサイズφ0.53 mm（外径0.66 mm）× 60 mmの市販のモノリス型シリカカラムを、分子量約30,000DaのMPCポリマーによって表面修飾した。MPCユニット 90 %、3-methacryloyloxypropyltrimethoxysilane ユニット10 %を含むMPCポリマー溶液（0.03%エタノール溶液)を表面処理剤溶液として、カラムに120 min以上送液し、スルーポア及びメソポアの表面に行きわたらせた後、60℃で30分間反応させ、表面処理を行なった。室温に冷却後、カラムにアセトニトリルを数分間送液し、未反応の表面処理剤を洗浄した。
（１）モノリス型シリカカラムの調製
スルーポア孔径2 μm、メソポア孔径12 nm、カラムサイズφ0.53 mm（外径0.66 mm）× 60 mmの市販のモノリス型シリカカラムを、分子量約30,000DaのMPCポリマーによって表面修飾した。MPCユニット 90 %、3-methacryloyloxypropyltrimethoxysilane ユニット10 %を含むMPCポリマー溶液（0.03%エタノール溶液)を表面処理剤溶液として、カラムに120 min以上送液し、スルーポア及びメソポアの表面に行きわたらせた後、60℃で30分間反応させ、表面処理を行なった。室温に冷却後、カラムにアセトニトリルを数分間送液し、未反応の表面処理剤を洗浄した。
（２）HPLCによる分析
調製した生体小分子分離用モノリス型シリカカラムをUV検出器に接続したHPLCシステム（SHISEIDO NANOSPACE）を構築し、5% 唾液（saliva）水溶液に添加したコルチゾールの分離、検出を行った。5 μM コルチゾール 5% saliva水溶液1 μLを、ランニングバッファーに超純水を用い、流速50 μL/minでHPLC分析した。コルチゾールの検出は、波長242 nmにおける吸光度の測定により行った。
調製した生体小分子分離用モノリス型シリカカラムをUV検出器に接続したHPLCシステム（SHISEIDO NANOSPACE）を構築し、5% 唾液（saliva）水溶液に添加したコルチゾールの分離、検出を行った。5 μM コルチゾール 5% saliva水溶液1 μLを、ランニングバッファーに超純水を用い、流速50 μL/minでHPLC分析した。コルチゾールの検出は、波長242 nmにおける吸光度の測定により行った。
比較のため、市販の前処理用分離カラム（CAPCELL PAK MF Ph-1、資生堂、 2.0 mm I.D. × 35 mm)を用いて、同様に、5% saliva水溶液中からのコルチゾールの分離、検出を行った。なお、市販カラムでの分析は、流速200 μL /minにて行った。
図１に、生体小分子分離用モノリス型シリカカラムと市販の前処理用分離カラムで得られたクロマトグラムを示す。生体小分子分離用モノリス型シリカカラムでは、溶出時間６分付近にコルチゾールのピーク（図中、符号A参照）が認められる。また、市販の前処理用分離カラムでは、溶出時間４分付近にピーク（符号B参照）が認められる。図に示すように、生体小分子分離用モノリス型シリカカラムでは、市販の前処理用分離カラムに比べて、高いコルチゾールのピークが検出され、高収率でコルチゾールを分離できていることが分かる。
本発明に係る生体小分子分離用モノリス型シリカカラムによれば、低圧での送液が可能で、カラム容積を小さくして少量のサンプル溶液からでも比較的高濃度で生体小分子を分離できる。そのため、本発明は、マイクロチップを用いた医療診断バイオチップ等のμ−ＴＡＳ分野において、少量のサンプル溶液から生体小分子を高感度に検出するために利用でき、装置のマイクロ化に寄与できる。
また、本発明に係る生体小分子分離用モノリス型シリカカラムによれば、生体小分子を、有機溶媒を含まない溶液中に回収できる。そのため、本発明は、μ−ＴＡＳ分野において、バイオセンサー等の高感度検出を行う場合に、生体小分子溶液から有機溶媒を除去する作業を不要として、装置の自動化を容易にするために寄与できる。
Claims (3)
- スルーポアを形成する三次元ネットワーク状のシリカ骨格とメソポアとして該シリカ骨格に形成された前記スルーポアより孔径の小さい微細孔とを有し、
下記式（１）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体によって、前記シリカ骨格と前記微細孔の各々の表面が修飾され、かつ、表面修飾された前記微細孔のポアサイズがコルチゾールの分子サイズに適合する大きさを有し、
体液又は該体液の希釈液に含まれるコルチゾールを分離するためのコルチゾール分離用モノリス型シリカカラム。
(式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示し、Ｒ4は炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ5は水素原子もしくはメチル基を示す。ｎは１〜４の整数である。) - スルーポアを形成する三次元ネットワーク状のシリカ骨格とメソポアとして該シリカ骨格に形成された前記スルーポアより孔径の小さい微細孔とを有し、
下記式（１）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体によって、前記シリカ骨格と前記微細孔の各々の表面が修飾され、かつ、表面修飾された前記微細孔のポアサイズがコルチゾールの分子サイズに適合する大きさを有し、
体液又は該体液の希釈液に含まれるコルチゾールを分離するためのモノリス型シリカカラムを用いるコルチゾールの分離方法。
(式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示し、Ｒ4は炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ5は水素原子もしくはメチル基を示す。ｎは１〜４の整数である。) - スルーポアを形成する三次元ネットワーク状のシリカ骨格とメソポアとして該シリカ骨格に形成された前記スルーポアより孔径の小さい微細孔とを有し、該微細孔がコルチゾールの分子サイズに応じて所定の孔径に形成されたモノリス型シリカカラムを準備する工程と、
下記式（１）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を、コルチゾールの分子サイズに応じて所定の分子量に重合した重合体を準備する工程と、
前記シリカ骨格と前記微細孔の各々の表面に前記重合体を修飾する工程と、を含む体液又は該体液の希釈液に含まれるコルチゾール分離用モノリス型シリカカラムの製造方法。
(式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示し、Ｒ4は炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ5は水素原子もしくはメチル基を示す。ｎは１〜４の整数である。)
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