CN104603618A - 识别胎儿成红血细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种识别至少一个胎儿成红血细胞的方法，该方法包括：(a)检测选自中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸转运的激活子)成员2亚型A(SLC3A2)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A、转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4、蛋白C9orf5的剪接亚型1、唇腭裂跨膜蛋白1、BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103、抗菌蛋白FALL-39前体、CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、突触素样蛋白的剪接亚型2、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、假定蛋白DKFZp564K247(缺氧诱导的基因1蛋白)(IPI登录号为IPI00295621)、假定蛋白DKFZp586C1924(IPI登录号为IPI00031064)、ALEX3蛋白变体、假定蛋白MGC14288(IPI登录号为IPI00176708)、IPI登录号为IPI00639803的蛋白和IPI登录号为IPI00646289的蛋白中的至少一种胎儿成红血细胞特异标记的表达，其中，所述标记的检出表明所述胎儿成红血细胞的存在。
Description
技术领域
本发明主要涉及用于识别和/或分离至少一个胎儿原始有核红细胞的方法。具体地，本发明涉及一种通过检测至少一种对胎儿原始有核红细胞有特异性的膜蛋白来识别样本中至少一个胎儿原始有核红细胞的方法。
背景技术
目前，染色体和单基因病的产前诊断依赖于通过用于细胞遗传学分析和/或分子分析的创伤性操作(例如羊膜穿刺术、绒膜绒毛取样(CVS)或胎儿血液取样(FBS))来获得的胎儿细胞。这些创伤性测验带有使胎儿流产的小而重大的风险。一方面其由于失去胎儿的恐惧限制诊断测验的理解，而另一方面导致在其他方面健康的胎儿的死亡。
已研究通过富集和分析在母体血液中循环的胎儿细胞和胎儿DNA来诊断胎儿遗传情况的非侵入法。
在进入孕早期母体循环的胎儿细胞中，胎儿原始有核红细胞(FPNRBC)是优选的靶细胞。这是由于其寿命短，并且因此不可能自以前的妊娠中继续留存，不同于具有胎儿淋巴细胞的情形(这种现象可能是误诊的基础)。前三个月FPNRBC包含ε-球蛋白ε，一种当孕早期后表达下降时高度特异的理想的胎儿细胞识别体。
在人体中，直至受孕后10周，在卵黄囊中胚层中产生的胎儿原始有核红细胞(FPNRBCs，胎儿前成红血细胞、孕早期胎儿有核血细胞(FNRBCs))在胚胎循环中仍然是主要的血细胞类型。由于限制使用用于实验室研究的该细胞的纯细胞群，对于人体中该细胞类型的研究已被限制；近来仅显示这些细胞可在孕早期人体胎盘中去核，表明其最终可被分化。前成红细胞与胎儿次级成红血细胞不但它们起源的解剖学位点不同，而且在它们中包含的血红蛋白的类型也不同。
成人无核红细胞(AARBCs，成人红细胞(RBCs))是在长骨骨髓中产生的较小的、平圆形的、易变形的细胞。由于其易得性，近些年，这些细胞已被广泛地研究。使用质谱分析法，描述AARBC膜和细胞质蛋白的特征，并且在小鼠和人类AARBCs之间显示差异。
对非创伤性产前诊断的母体血液的孕早期FPNRBC的富集，由于缺乏特有的针对其表面蛋白的抗体而成为一项困难的工作。当能够使用抗-CD45抗体从母体血液样本中分离WBCs时，从多数成人RBCs中分离FPNRBCs已成为挑战。使用母体血液的孕早期FPNRBCs的非创伤性产前诊断的成功依赖于这些稀有细胞(在百万有核母体细胞中有一个细胞)的富集。
随着自动显微操作、激光捕获显微镜系统以及与阵列CGH技术联合的具有单细胞全基因组扩增的胎儿细胞的下游分析的应用，可以实现从百万个有核母体细胞中回收的少至一个FPNRBC的胎儿DNA的分离和分析的目标。因此，并非不可想象的是，从来自正在进行整倍体妊娠的母体血液中富集的极少数胎儿细胞(～20个细胞)对于非创伤性产前诊断实际上可能是足够的。
据此，在本领域中需要一种用于检测和/或分离FNRBCs的方法，并且为使用在母体血液中存在的FNRBCs的未来NIPD提供作为潜在可靠方式的方法。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供一种识别和/或分离至少一个胎儿成红血细胞的方法，该方法包括：检测选自中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸转运的激活子)成员2亚型A(SLC3A2)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A、转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4、蛋白C9orf5的剪接亚型1、唇腭裂跨膜蛋白1、BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103、抗菌蛋白FALL-39前体、CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、突触素样蛋白的剪接亚型2、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、假定蛋白DKFZp564K247(缺氧诱导的基因1蛋白)(IPI登录号为IPI00295621)、假定蛋白DKFZp586C1924(IPI登录号为IPI00031064)、ALEX3蛋白变体、假定蛋白MGC14288(IPI登录号为IPI00176708)、IPI登录号为IPI00639803的蛋白和IPI登录号为IPI00646289的蛋白中的至少一种胎儿成红血细胞特异标记的表达；其中，所述标记的检出表明所述胎儿成红血细胞的存在。
根据本发明的另一个方面，还提供一种识别胎儿成红血细胞的标记(选自根据本发明的任一方面的胎儿成红血细胞特异标记)，一种使用至少一种胎儿成红血细胞特异标记诊断个体的至少一种产前异常的方法，一种能够结合至少一种胎儿成红血细胞特异标记的抗体或其抗原结合片段，以及一种用于在样本中识别和/或分离胎儿成红血细胞的试剂盒。
附图说明
图1为用瑞特染液染色的FPNRBCs和AARBCs的组织学图像，显示了(A)FPNRBCs(有核的)；(B)无细胞核的AARBCs。
图2为在有机溶剂MeOH和TFE中识别的FPNRBC蛋白质的维恩图。
图3A-B为显示133种FPNRBC膜蛋白的位置和功能的图表。
图4为在AARBCs和FPNRBCs中有潜在表面结构域的膜蛋白的维恩图。
图5为通过逆转录酶-PCR(RT-PCR)确认FPNRBCs的特有膜蛋白的图像。
图6A为在FPNRBCs和AARBCs上的膜蛋白的免疫组织化学的图像。
图6B为通过抗体显示免疫反应强度的统计显著性(*)的箱线图。
图6C为通过抗体显示免疫反应的染色强度的统计显著性(*)的柱状图。
图6D为在FPNRBCs和AARBCs上的膜蛋白的免疫组织化学的图像。
图7A为用NAT-B标记的分选前部分和分选后部分的FPNRBCs和AARBCs上膜蛋白的免疫组织化学的图像。
图7B和7C为显示分选前和分选后，NAT-B阳性部分、NAT-B阴性部分的FPNRBCs百分比的柱状图。
图8为表示基于来自TFE和MeOH提取物的单肽识别的蛋白质的数据和离子评分的表格。
图9为表示从TFE和MeOH提取物中识别的蛋白质的肽序列的表格。
具体实施方式
在本说明书中提到的参考书目为了便利以参考书目列表的形式列出，并且添加在实施例末尾。这些参考书目的全部内容通过引用并入本发明中。
通过不定冠词“一个(a或an)”提及一种要素，并不排除多于一个要素存在的可能性，除非上下文清楚要求有一个且仅有一个要素。因此在此使用的不定冠词“一个(a或an)”通常指“至少一个”。
术语“包括(comprising)”在此定义为“主要，但不必然仅包括”。此外，术语“包括”将由本领域的技术人员自动理解为包括“由…组成(consistingof)”。词语“包括(comprising)”的变形，如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”，有相应变形的含义。
术语“片段”在此定义为蛋白质的全序列的不完整或分离的部分，该部分包含赋予序列蛋白质特性和功能的活性/结合位点。具体地，其可以短至少一个氨基酸。更具体地，所述片段包含能够使蛋白质结合本发明的至少一个标记的结合位点。
术语“抗原结合片段”在此定义为抗体的全序列的不完整或分离的部分，该部分包含赋予序列抗体特性和功能的活性/结合位点。具体地，其可以短至少一个氨基酸。更具体地，所述片段包含能够使抗体结合本发明的至少一个标记的结合位点。
在此使用的术语“成红血细胞(erythroblast)”指具有核的红细胞。具体地，成红血细胞指这样一种有核的前体细胞，网织红细胞从该有核的前体细胞发育为红细胞。“成红血细胞”可以与“幼红细胞(Normoblast)”互换使用，并且指有核红细胞，红细胞的直接前体。例如，所述成红血细胞可以是哺乳动物起源的。具体地，所述成红血细胞可以是原始胎儿成红血细胞或人胎儿成红血细胞。术语“胎儿原始有核红细胞(FPNRBC)”在本发明中定义为在卵黄囊中胚层中产生的细胞，直至受孕后10周，其在胚胎循环中仍然是主要的血细胞类型。术语“FPNRBC”可以与胎儿前成红血细胞或孕早期胎儿有核红细胞(FNRBCs)互换使用。
短语“成体去核红细胞(AARBCs，成体红细胞(RBCs))”在此定义为与FPNRBC比较相对较小、平圆状、容易变形且在长骨骨髓中产生的细胞。术语AARBCs可以与成体红细胞(RBCs)互换使用。
术语“哺乳动物”在此被定义为哺乳动物个体，特别是灵长目动物，例如人类。为了研究的目的，受试者可以是非人类。例如，受试者可以是动物模型中适用的动物，例如，猪、马、小鼠、大鼠、奶牛、狗、猫、畜牛、非人类的灵长目动物(例如，黑猩猩)等。
在此使用的术语“样本”指组织、细胞或组成部分(例如体液)的集合，其包括但不局限于，母体组织、母体血液、脐带血、羊水细胞、绒膜绒毛样本、胎儿血液和/或胎儿组织/体液。具体地，胎儿组织可以是滋养层组织、胎盘组织或其结合。在本发明中使用的样本可以预先经过包括但不局限于Ficoll梯度和Percoll梯度的密度梯度纯化。
在此使用的术语“CD45阴性”指任何无信号表达或对天然、重组或合成形式的CD45分子/标记呈阴性的细胞。可以使用任何在本领域中已知的免疫染色法和利用任何抗CD45试剂测定在样本中细胞上的CD45表达的存在。任何用抗-CD45试剂染色呈阳性的细胞由于其可能包括CD45阳性白细胞(WBC)而可以被排除。
在此使用的术语“有核的”指有细胞核的细胞。基于任何本领域中已知的核染色技术，可以区分无核红细胞与有核细胞。
在此使用的术语“产前异常(prenatal disorder)”指胎儿或胚胎在其出生前的疾病或状况。所述产前异常可选自染色体病、基因病或其结合。具体地，所述产前异常可非限制性地选自唐氏综合症、爱德华兹综合征、帕塔综合症、神经管缺陷、脊柱裂、腭裂、泰萨克斯病、镰刀形红细胞贫血症、地中海贫血症、囊性纤维化病、脆性X综合征、脊髓性肌萎缩、强直性肌营养不良、亨廷顿氏舞蹈病、夏-马-图三氏病、血友病、杜氏肌营养不良、线粒体异常、遗传性多发性外生骨疣、成骨不全及其结合等。
目前，由于FPNRBC在母体循环中的稀有性以及用于这些细胞的免疫细胞分选的表面特异性抗原的缺乏，FPNRBCs从母体血液中的富集成为一种挑战。CD71和GPA通常用于从母体血液中富集这些细胞：由于该表面抗原仅在68％的FPNRBCs上表达，因此CD71的这种使用可导致其损耗，并且由于AARBCs的极高背景，GPA与AARBCs和FNRBCs两者都结合，使得富集的样本难以分析。
细胞表面膜蛋白在保持健康方面有主要作用：当在结构上或在功能上改变时，其为造成较多常见已知患病状态(例如球形红细胞增多症、镰刀形红细胞病)的原因以及较少通常认识状况(例如椭圆形红细胞增多症、家族性假高钾血症、脱水遗传性口形红细胞增多症和β-地中海贫血症中的膜缺陷)的原因。关于细胞膜蛋白和其在健康和疾病中的功能的知识能够引导对疾病过程(如疟原虫入侵人体红细胞)的机理的理解以及发展介入治疗的可能性。
与AARBC膜蛋白质组的大量可用信息不同，人胎儿前成红血细胞的蛋白质组目前无可用信息。仅已知其细胞表面抗原(如，CD71和血型糖蛋白A)的极有限的数据和其细胞质血红蛋白的一些信息。FPNRBC的膜蛋白质组的知识可以以两种方式使用：促进在人体中原始红细胞生成的更深入理解，以及识别特异性表面抗原以用于非创伤性产前诊断的从母体血液中富集ε-球蛋白-阳性胎儿前成红血细胞。已提出ε-球蛋白-阳性胎儿前成红血细胞是用于非创伤性产前诊断的理想胎儿细胞类型，并且未来可以为非创伤性产前诊断开发FPNRBC或AARBC上的特有膜蛋白的识别。本发明公开了人FPNRBCs和AARBCs之间的差异。据此，在本领域中需要提供促进识别和/或分离FPNRBCs的标记。
本申请的发明人首次尝试探究FPNRBCs的特有膜蛋白。他们识别具有跨膜结构域的特有表面蛋白，其可以作为通过免疫细胞分选方案从成体RBCs中分离人FPNRBCs的标记使用。针对这些蛋白质的抗体可以实现免疫细胞分选。
根据本发明的一个方面，提供识别至少一个胎儿成红血细胞的方法，其包括：检测选自中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸转运的激活子)成员2亚型A(SLC3A2)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A、转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4、蛋白C9orf5的剪接亚型1、唇腭裂跨膜蛋白1、BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103、抗菌蛋白FALL-39前体、CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、突触素样蛋白的剪接亚型2、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、假定蛋白DKFZp564K247(缺氧诱导的基因1蛋白)(IPI登录号为IPI00295621)、假定蛋白DKFZp586C1924(IPI登录号为IPI00031064)、ALEX3蛋白变体、假定蛋白MGC14288(IPI登录号为IPI00176708)、IPI登录号为IPI00639803的蛋白和IPI登录号为IPI00646289的蛋白中的至少一种成红血细胞特异标记的表达；其中，所述标记的检出表明所述胎儿成红血细胞的存在。具体地，所述胎儿成红细胞为哺乳动物源的。更具体地，所述胎儿成红血细胞为人源的。以下提供个体胎儿成红血细胞特异标记的位置、生理作用(包括与人类胎儿发育相关的那些作用)和与其突变相关的疾病的简要说明。
胎儿成红血细胞特异标记的识别将促进从母体血液中识别和分离FNRBCs，并且因此使用在母体血液中存在的FNRBCs为未来的NIPD提供一种可靠的方法。
胎儿成红血细胞特异标记的简要说明
氨基酸转运蛋白
细胞和细胞器的转运蛋白调节重要化合物(例如，糖、氨基酸、核苷酸、离子和药物)的吸收和输出。转运蛋白的溶质运载体(SLC)系列包括基因编码的被动转运蛋白、离子转运蛋白和离子交换体。
两种氨基酸转运SLC蛋白(SLC1A5和SLC3A2)被鉴定是胎儿前成红血细胞的质膜所特有的。SLC1A5，中性氨基酸转运蛋白B0，是一种在肾和肠中表达的SLC1家族的Na+依赖转运蛋白。在胎儿成红血细胞中识别的SLC1A5氨基酸转运蛋白属于ASCT2系统，其能够以高亲和力转运谷氨酰胺和天冬酰胺，并且以低亲和力转运中性氨基酸甲硫氨酸、亮氨酸和甘氨酸。
SLC3A2(CD98hc)是异二聚体蛋白4F2(CD98)的重链。作为异二聚体的CD98参与底物特异性随轻链的性质改变的氨基酸转运。CD98hc的不同结构域必须与轻链相关。关于人体胎盘的氨基酸转运的研究与CD98hc的mRNAs的表达密切关联，并且还提出这些蛋白在氨基酸和碘甲状腺原氨酸的母-胎转移中的可能作用。发现CD98hc与α4β3整联蛋白位于一处以促进绒毛外滋养层的粘着性和运动力，表明CD98hc在人类胎儿发育中的功能重要性。
这也有在成熟的人体红细胞中氨基酸转运的证据；已之前说明的Na+依赖的氨基酸转运系统，以及近来，与L-型氨基酸转运蛋白1(LAT1)或LAT2轻链相关的CD98hc可能参与人体成体红细胞中S-亚硝基-L-半胱氨酸的细胞吸收。但是，在AARBCs的质谱研究中CD98hc的缺乏很可能是由于在MS期间产生的较小的肽。
阴离子转运蛋白
氯离子(Clc)通道基因(Clc1-10)在从细菌至人的所有生物学分类的门中表达。Clc介导的阴离子转运被认为是大多数Clc蛋白的主要功能。已知三种亚型的Clc6。Clc基因中的突变涉及多种人类疾病，如，肌强直、肾失盐、耳聋、尿蛋白损耗、肾结石、骨质疏松症、失明和溶酶体贮积症。近来在动物模型中的研究表明Ccl6可能主要在细胞内存在于内涵体中。在AARBCs中，已知除小的氯离子通道之外的其他无机离子转运蛋白，如脲转运蛋白-B(SLC14A1)和重碳酸盐/氯化物交换体(SLC4A1,带3)，是有用的。
结合蛋白
能够结合荷尔蒙、生长因子和代谢物的膜受体对细胞生长和细胞功能是重要的。转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3和嗅觉受体11H4被识别为原始胎儿成红血细胞特有的。转铁蛋白受体最初在成熟红细胞样细胞和胎盘中被识别。铁是在红细胞样细胞的全部阶段中的血红蛋白合成的基本需求，通过转铁蛋白受体将铁转运到红细胞样细胞，但是，在AARBCs中没有转铁蛋白受体，这是因为当其变得成熟时，其从网织红细胞中丢失。
鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联受体(GPCRs)有7个跨膜螺旋并在细胞表面上表达，且结合几乎所有已知的突触释放的或分泌到循环系统控制器官功能的神经递质和荷尔蒙。G-蛋白是结合并连接GPCRs至第二信使系统(如，腺苷酸环化酶、磷脂酶和离子传导通道)的主要细胞内分子。由于GPCRs在细胞生理学和疾病中的关键作用，所有已核准药物的40％以GPCRs为靶点，并且是激烈药学研究的主要焦点，并且在胎儿成红血细胞中GPR107的存在不排除使用该细胞类型进行胎儿治疗的潜在研究的可能性。
嗅觉受体(OR)是编码气味受体的最大的哺乳动物基因家族。在原始胎儿成红血细胞中一种OR(OR H家族11亚族)的识别支持造血细胞和组织中的OR的早期报告：Feingold和他的同事报道，在人红白血病和骨髓细胞系中以及在包含红细胞样谱系细胞的组织(如人骨髓和胎儿肝脏)中OR-mRNA的低水平表达。有证据表明在非嗅觉的睾丸组织中OR的表达；已知在人体中hOR17-4的表达及其在精子趋化现象中的功能性作用。此外，还在嗅觉区和延髓(人类)、肝脏(大鼠)及大脑和结肠(小鼠)中观察到具有嗅觉受体典型性质的人体前列腺特异性G-蛋白偶联受体(PSGR)。
催化反应
CAAX异戊二烯基肽链内切酶也称为FACE(法尼基化蛋白-转化酶)，其对于含有CAXX基序的真核蛋白的异戊二烯化对其功能和膜靶向来说是重要的。FACE-1和FACE-2是两种在若干组织(例如，白细胞、卵巢、睾丸、肾脏和胎盘)中表达的人体酶类。Prelamin-A是FACE-1的底物，并且在Prelamin-A切割位点或FACE-1酶中的突变已被记录在如哈-吉早衰症和下颚骨肢端发育不良的遗传疾病中。CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物(一种在胎儿成红血细胞中含7个跨膜结构域的膜内在蛋白)的识别，如在其他人体组织中一样，表明该酶在异戊二烯化蛋白的加工中的可能的持家(house-keeping)作用。
本发明中识别的维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白(VKORC1L1)是亚细胞位置尚未定义的人红细胞样细胞型膜蛋白的首次报告。报告VKORC1为华法林易感。表现抗华法林的人的维生素K-依赖性凝血因子缺陷2型(VKCFD2)是VKORC1突变的结果。由于在妊娠期间接触华法林而引起的是胎儿华法林综合症(华法林胚胎病)是众所周知的。还提出了VKORC1的罕见多态性和不同种之间的差异确定了对华法林的需求。
信号通路
在原始胎儿成红血细胞中识别的蛋白C9ORF5的剪接亚型1被注释为参与信号通路。从9q31上的家族性自主神经功能异常候选区分离一种新型人体转录物CG-2(C9ORF5)，并且其表达在成人和胎儿组织(如，大脑、肺、肝脏和肾脏)中可见。还发现在C9ORF5在该基因的作用未知的前列腺癌中是上调的。
囊泡再循环
突触素样蛋白pantophysin(一种在前成红血细胞中识别的突触素的亚型)被注释为位于质膜/囊泡膜。其是高度保守的并且被认作一种新型神经元和神经内分泌(NE)细胞的突触前标记。Pantophysin位于各种分泌、穿梭运动和内分泌再循环路径的细胞质微囊泡中，并且与突触素共同位于转染的非神经内分泌和神经内分泌细胞以及神经内分泌组织中。pantophysin的在上皮、肌肉组织和成纤维细胞中的非神经元分布已被记录在文献中。
抗微生物蛋白
在胎儿成红血细胞中BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103(在单细胞中BCG诱导的基因，无性繁殖系103)的表达是新颖的。该蛋白首先从用BCG细胞壁诱导的单细胞制备的cDNA库中识别出来。BIGM103与ZIP-样蛋白家族有序列相似性，并与hZIP2和hZIP1匹配，且预计具有锌转运蛋白和金属蛋白酶的活性。已提出在巨噬细胞和树突细胞中在吞噬作用介导的清除微生物组成部分中的可能作用。在胎儿成红血细胞中识别的FALL39是嗜中性粒的抗微生物肽之一，如，天青杀素(CAP-37)和CAP-57。从人骨髓和睾丸中也识别出FALL39。与杀微生物的功能相反，通过基质金属蛋白酶的活化，在卵巢癌中也表现出成熟FALL-39(hCAP-18/LL-37)的新型致癌作用，并且有白细胞浸润与癌症发展之间强关联性的证据。
无已知功能而用作胎儿发育相关研究的候选的蛋白
唇腭裂跨膜蛋白1—至今，无CLPTM1的功能性作用被确定。CLPTM1被报道与顺铂耐受性相关基因-9同源，并且观察到在乳腺癌化疗抵抗的临床样本中表达更多。临床上，叶酸盐缺乏已知与唇裂和/或腭裂有关，并且抗叶酸盐受体的自体抗体被报道存在于具有唇裂的儿童的母体中。叶酸是一种包括引导核酸合成的若干代谢路径中的重要维生素，并且被认为在婴儿期和妊娠期间是必不可少的。CLPTM1胎儿在成红血细胞质膜中的功能性作用需要进一步研究。
缺氧诱导的基因1蛋白(HIG1结构域家族成员1A,HIGD1A)是在缺氧期间表达的基因之一。已报道，在缺氧条件下培养的人造血干细胞/祖细胞以及人子宫颈细胞中的HIGD1A基因表达。在细胞质囊泡和线粒体中HIG1的表达似乎由缺氧和肿瘤微环境应激子(如，葡萄糖剥夺)两者诱导。在人体中，正常的胎儿发育依赖于胎儿可用的氧气和营养。当与成人血循环中的情况对照时，原始胎儿成红血细胞而非成体红细胞中的HIGD1A蛋白表达的识别，与胎盘相对缺氧环境相关。
其他
在胎儿成红血细胞中ALEX3蛋白变体的识别是特有的。ALEX1、ALEX2和ALEX3的基因位于人X染色体上。上皮癌(人肺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌和卵巢癌)的而非其他类型肿瘤的细胞系中ALEX1和ALEX2的mRNA表达的大量降低或丧失引导一种推测：ALEX基因可以起到抑制源于上皮组织的肿瘤的作用。
关于五种被识别的胎儿成红血细胞的蛋白质(有至少一种跨膜结构域)的蛋白质表达或功能鉴别的报道在任何其他细胞/组织中不可用；这五种蛋白质为，假定蛋白DKFZp586C1924、8kDa蛋白、25Kda蛋白、假定蛋白MGC14288和蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)。蛋白质数据库检索(UniProtKB/Swiss-Prot)没有显示这些蛋白质的很多信息。近来，在人类胎儿和成人组织以及小鼠线粒体的免疫定位中，假定蛋白DKFZp586C1924(TMEM 126A)的mRNA表达已被报告。
根据本发明的另一方面，提供识别至少一个胎儿成红血细胞的方法，其包括：检测选自中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸转运的激活子)成员2亚型A(SLC3A2)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A、转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4、蛋白C9orf5的剪接亚型1、唇腭裂跨膜蛋白1、BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103、抗菌蛋白FALL-39前体、CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、突触素样蛋白的剪接亚型2和蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)中至少一种胎儿成红血细胞特异标记的表达，其中，所述标记的检出表明所述胎儿成红细胞的存在。具体地，所述检测包括检测选自蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4和ALEX3蛋白变体中的至少一种胎儿成红血细胞特异标记的表达。
或者，所述胎儿成红血细胞特异标记可以通过抗体、其抗原结合片段等检测。具体地，所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本领域的技术人员将理解能够识别和/或结合胎儿成红细胞特异标记的任何分子或化合物可以用于检测胎儿成红血细胞特异标记。
根据本发明的另一方面，提供一种从样本中分离至少一个胎儿成红血细胞的方法，该方法包括：(a)使所述样本与至少一种能够结合选自中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸运转的激活子)成员2亚型A(SLC3A2)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A、转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4、蛋白C9orf5的剪接亚型1、唇腭裂跨膜蛋白1、BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103、抗菌蛋白FALL-39前体、CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、突触素样蛋白的剪接亚型2、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、假定蛋白DKFZp564K247(缺氧诱导的基因1蛋白)(IPI登录号为IPI00295621)、假定蛋白DKFZp586C1924(IPI登录号为IPI00031064)、ALEX3蛋白变体、假定蛋白MGC14288(IPI登录号为IPI00176708)、IPI登录号为IPI00639803的蛋白和IPI登录号为IPI00646289的蛋白中的至少一种标记的抗体或其抗原结合片段接触；以及(b)从所述样本中分离结合所述抗体或其抗原结合片段的胎儿成红血细胞。
具体地，所述抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其结合。更具体地，使用免疫磁珠分离、流式细胞计或其结合从所述样品中分离结合抗体的胎儿成红血细胞。
可以使用，但不局限于显微操作或任何允许胎儿细胞单独挑取的系统进行从样本中分离哺乳动物有核胎儿细胞。具体地，所述胎儿细胞可以是哺乳动物胎儿成红血细胞。更具体地，所述胎儿细胞可以是原始或人胎儿成红血细胞。
密度梯度和流式分选法可以用于增强胎儿成红细胞从母体血液中的富集和提高纯度。
根据本发明的又一方面，提供一种诊断个体的至少一种产前异常的方法，该方法包括：(a)根据上述方法在个体的样本中识别至少一个胎儿成红血细胞；(b)分离所述胎儿成红血细胞；以及(c)在所述胎儿成红血细胞中测定至少一种与产前异常相关的遗传标记。具体地，所述产前异常可以选自唐氏综合症、爱德华兹综合征、帕塔综合症、神经管缺陷、脊柱裂、腭裂、泰萨克斯病、镰刀形红细胞贫血症、地中海贫血症、囊性纤维化病、脆性X综合征、脊髓性肌萎缩、强直性肌营养不良、亨廷顿氏舞蹈病、夏-马-图三氏病、血友病、杜氏肌营养不良、线粒体异常、遗传性多发性外生骨疣和成骨不全。更具体地，所述样本可以选自母体组织、母体血液、脐带血、羊水细胞、绒膜绒毛样本、胎儿血液和胎儿组织。具体地，所述方法可以是在活体外进行。
根据本发明的一个方面，提供一个用于识别胎儿成红血细胞的标记，其选自中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸转运的激活子)成员2亚型A(SLC3A2)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A、转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4、蛋白C9orf5的剪接亚型1、唇腭裂跨膜蛋白1、BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103、抗菌蛋白FALL-39前体、CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、突触素样蛋白的剪接亚型2、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、假定蛋白DKFZp564K247(缺氧诱导的基因1蛋白)(IPI登录号为IPI00295621)、假定蛋白DKFZp586C1924(IPI登录号为IPI00031064)、ALEX3蛋白变体、假定蛋白MGC14288(IPI登录号为IPI00176708)、IPI登录号为IPI00639803的蛋白和IPI登录号为IPI00646289的蛋白中。进一步提供能够结合根据本发明的至少一种标记的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供用于根据本发明的任一方面的识别和/或分离胎儿成红血细胞的方法的试剂盒。
实施例
在本领域中已知的且无特别描述的标准分子生物学技术通常遵照在Sambrook和Russel的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringsHarbor Laboratory,New York(2001)中的描述。
本领域的技术人员将理解前述的优选实施方式在设计、构建或操作上可以在不脱离权利要求的范围内经过改变和修改。例如，这些改变意欲通过权利要求的范围覆盖。
实施例1
材料和方法
在各种人体组织和细胞(包括胎儿(滋养层/胎盘))中，进行了对于FPNRBCs的特有质膜蛋白的存在和功能性作用的深入文献研究。这些蛋白质的位置、生理学作用(包括与人类胎儿发育相关的作用)和与其突变相关的疾病的简短说明已与AARBCs的类似功能的可用数据一同在上面提供。
FPNRBCs能够通过CD45阳性细胞的阴性消耗而从母体血液中的WBCs中分离，并且如果FPNRBCs的已知适合的表面抗原可用，这些用于非创伤性产前诊断的理想细胞能够由AARBCs富集。FPNRBCs的膜蛋白通过质谱数据图表表示，并且比较该数据图表与本领域中已知的AARBCs膜蛋白质组的数据图表，来识别AARBCs中缺乏的FPNRBCs的特有表面膜蛋白。
通过质谱数据图表表示的FPNRBCs的膜蛋白可以与已知的AARBCs的膜蛋白质组比较。一种鸟枪蛋白质组学法，与MALDI-TOF/TOF-MS联合的二维液相色谱法(2D-LCMS/MS)用来表征胎儿前成红血细胞的膜蛋白质组的特征。这是关于胎儿前成红血细胞的膜蛋白质组的首次报告。所有识别的273个蛋白的详情被提供，包括它们注释的亚细胞位置、分子功能和跨膜结构域的数量。133(48.7％)个蛋白是膜蛋白，其中37个是质膜蛋白。
通过比较目前研究的数据与AARBCs的膜蛋白来识别FPNRBCs特有的表面膜蛋白以鉴别共同的，并且12个具有跨膜结构域的质膜蛋白和8个具有跨膜域而无已知亚细胞位置的蛋白被识别为FPNRBCs所特有的。除转铁蛋白受体外，从未在红细胞中描述过所有其他19个FPNRBCs特有的膜蛋白。逆转录酶PCR(RT-PCR)和免疫细胞化学证实了2D-LCMS/MS数据。研究结果为非创伤性产前诊断提供用于从母体血液中分离FPNRBCs的潜在表面抗原，并有助于理解这些稀有细胞的生物学。
由于难以获得足够数量的细胞，以前没有尝试FPNRBCs的蛋白质组学分析。经历妊娠终止的患者的胎盘绒毛的有权使用能够汇集细胞以用于2D-LCMS/MS分析。此外，膜蛋白的提取在蛋白质组学中仍是又一个挑战；鼓励使用类似方案从有限的样本(5×107个细胞)中比从AARBCs中回收更多的膜蛋白(总量的48.7％)，这也解释了这些有核细胞的结构复杂性。
对FPNRBCs的大多数蛋白质注释的亚细胞位置和分子功能对该细胞类型是新颖的。被识别FPNRBC膜蛋白显示从转运、催化、结合到结构的多样的生理功能，而大约32％是转运和/或催化的。在膜蛋白中，大多数是从线粒体(48个蛋白)和质膜(37个蛋白)中识别。
组织
从经历选择性孕早期妊娠终止手术的女性中收集的胎盘组织是通过机构审查委员会(Institutional Review Board)核准的，并且所有患者提供书面的知情同意。
胎盘绒毛中FPNRBCs的提取
FPNRBCs从胎盘绒毛中提取，并且AARBCs由志愿者血液样本制备。胎盘组织在终止妊娠时(无月经7+0至9+3周)收集。按照本领域中已知的方案从胎盘绒毛中提取FPNRBCs。在37℃下振荡水浴中，胎盘绒毛在滋养层消化缓冲液(146.3ml HBSS包含0.182g胰蛋白酶和3.75ml 1M Hepes(-Invitrogen-Life-Technologies,NY,USA))中消化进行30分钟，并且使用胎牛血清(Pierce,IL,USA)(5ml/45ml消化缓冲液)终止消化。离心(3000rpm,20℃,10分钟)单细胞悬浮液。包含FPNRBCs的红细胞沉淀在PBS中悬浮，并且使用Percoll 1083(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)(3000rpm，20℃，20分钟)分离。FPNRBC纯度通过细胞离心涂片载玻片的碱性染色确定。在-80℃下，在HES缓冲液(20mM HEPES,pH 7.4,1mM EDTA和250mM蔗糖)和蛋白酶-抑制剂混合物(Roche Diagnostics,曼海姆,德国)中储存膜制品(如果纯度≥90％FPNRBCs)的样本。FPNRBCs和AARBCs的形态在图1中显示。使用CKX41Olympus显微镜的20×/0.40PhP目镜拍摄明场像。条代表10μm。
膜蛋白的制备和消化
集中的FPNRBCs(5×107个细胞)的膜如在本领域中描述的一样制备。储存在HES缓冲液中的细胞通过融化和超声处理来裂解，并且在100,000×g4℃(1h)下超速离心以获得细胞膜沉淀(该细胞膜沉淀然后使用高pH溶液(0.1M Na2CO3，pH11)洗涤)，并用Milli-Q水洗涤两次。使用甲醇(MeOH)/50mM NH4HCO3(60:40，体积/体积)从FPNRBC细胞膜中提取蛋白质，并且如Blonder等人描述的一样进行蛋白质还原、烃化和消化。使用测序级修饰胰蛋白酶(Promega，南安普顿，英国)进行胰蛋白酶消化。离心消化的样本并且在MeOH溶液(60％MeOH在50mM NH4HCO3中)中洗涤沉淀两次。集中上清液(源自MeOH的消化物)，而将所述沉淀在三氟乙醇(TFE)/50mM NH4HCO3(50:50体积/体积)中重悬浮，然后提取的蛋白用50mMNH4HCO3稀释10倍用于第二胰蛋白酶消化以获得上清液(源自TFE的消化物)。两种消化物在-80℃下冻干并保存。
二维液相色谱和质谱(2D-LCMS/MS)
2D-LCMS/MS与我们(Zhang等人，2007)早期描述的基本相同。冻干的消化物在溶剂[(98％H2O，2％乙腈(CAN)和0.05％三氟乙酸(TFA)]中重悬浮，并且在离心后将上清液使用Ultimate-Dual-HPLC系统(Dionex，森尼韦耳，加利福尼亚，美国)分离。所有样本首先在强阳离子交换(SCX)柱(300μm i.d.，×15cm，充满10μm POROS 10S)上分离，并且洗脱的部分在PepMap捕获柱(300μm i.d.，×1mm，充满5μm C18)上捕获，并且通过梯度洗脱至反相柱(毛细管整体柱，200μm i.d.，×5cm)中。在使用Probot微部分收集器(Dionex)以每孔5秒的速度点到192-孔不锈钢MALDI靶板(AB SCIEX，福斯特城，加利福尼亚，美国)上之前，通过25nl混合三通(Upchurch Scientific，橡木港，华盛顿，美国)，以5.4μl/分钟的流速混合LC部分与基质辅助激光解吸/电离(MALDI)基质(7mg/mlα-氰基-4-羟基肉桂酸和130μg/ml柠檬酸铵在75％的CAN中)。
MALDI靶板上的样本使用具有MALDI源的ABI 4700蛋白质组分析仪(AB SCIEX)和飞行时间分析仪TOF/TOFTM光谱装置来分析。对于MS分析，典型地，对每个样本孔累积1000击(shot)。在1kV碰撞能量和～3.0×10-7托碰撞气体压力下，使用氮气进行串联质谱_(MS/MS)分析。依据数据的质量为每个光谱合并3000至6000击。
数据库检索
MASCOT搜索引擎(v2.0；Matrix Science)用于检索串联质谱。GPSExplorerTM软件(v3.6；AB SCIEX)用来为肽和蛋白质的识别创建和搜索含MASCOT搜索引擎的文档。国际蛋白质指数(IPI)人类蛋白质数据库(v3.10)用于胰蛋白酶肽的检索，并且检索出57478个条目。结合所有LC运行的MS/MS质谱用于检索。选择半胱氨酸脲基甲基化、N端乙酰化和焦谷氨酸化以及蛋氨酸氧化作为可变修饰。允许两个漏切。前体容错度调至200ppm并且MS/MS片段容错度为0.4Da。
假阳性率的估算
假阳性率通过比较来自随机数据库与实际数据库的检索结果来计算。最小离子评分C.I.百分比以便实现不高于5％的错误发现率(FDR)并且其在肽水平上用作中断阈值。从随机数据库检索识别的全部蛋白质为单肽匹配。通过该方法从IPI人体数据库中识别的蛋白质被彩色编码为红色、绿色或黑色；那些红色的蛋白质与至少两个肽匹配，并且因此是统计上确信的(FDR为零)；绿色的蛋白质通过单肽识别，其中，匹配分值高于翻转数据库中的最高分值，并且基本上FDR为零；基于单肽匹配识别的黑色蛋白质落入设定阈值为5％FDR内。对于TFE和MeOH提取物，最佳离子评分分别≥33和≥36的排名顶端的肽被包括作为每个蛋白质的计数的肽分析。所有MS/MS光谱进一步被人工验证。
注释
使用GoFig(http://udgenome.ags.udel.edu/gofigure/index.html)基于基因本体学注释获得已识别的蛋白质的亚细胞和功能分类。Swiss-prot和TrEMBL数据库也用于FPNRBCs的特有蛋白的功能性注释。使用TMHMM服务器(v2.0)(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测已识别的蛋白的跨膜域(TMD)的数量。
已识别的特有蛋白质的评估
a)用于特有蛋白质的m-RNA表达的逆转录酶PCR(RT-PCR)
RNA提取—根据制造商的说明使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen，德国)分离来自FPNRBCs的RNA。简单地说，将FPNRBCs(3×106个细胞)在350μl裂解缓冲液中重悬浮，并且通过QIAshredder离心柱。裂解物与350μl 70％乙醇混合，并吸取移入至RNeasy迷你柱，且在15000×g离心15秒。柱中捕获的RNA使用350μl缓冲液RW1洗涤，并且在室温下用10μl脱氧核糖核酸酶(在70μl RDD缓冲液中)孵育15分钟。然后用350μl缓冲液RW1洗涤RNA两次，并用500μl缓冲液RPE洗涤一次，且通过向柱中加入50μl无核糖核酸酶的水以及在15000×g下离心1分钟来回收。
RT-PCR-cDNA模板使用Sensiscript RT试剂盒(Qiagen，德国)合成。简单地说，5μl RNA与寡聚脱氧胸苷酸(oligo-dT)、核糖核酸酶抑制剂、dNTP混合物和无核糖核酸酶的水混合(按照制造商的说明)，并且在70℃下孵育5分钟并在冰上冷冻。将RT缓冲液和RT酶加入至混合物中，并且在25℃(15分钟)、42℃(60分钟)和72℃(15分钟)下孵育并在冰上冷却。PCR混合物含有5μl cDNA的、1×PCR缓冲液、1mM dNTP、8mM MgCl2、2.5U Taq聚合酶和0.6μM引物。变性的(94℃2分钟)混合物通过94℃15秒、～60℃(依据引物对)15秒、72℃1分钟的45个循环来扩增。对每个基因实施在72℃下进行4分钟的延长。还包括RT对照(在RT步骤中无酶)和PCR对照(水空白对照)。PCR产物通过在2％的琼脂糖凝胶中的电泳分离，用溴化乙锭(0.5g/ml)染色并在紫外光下可见。使用数码成像仪(Alpha InnotechCorp.，圣莱安德罗，加利福尼亚)拍摄图片。用于单个基因的扩增的引物对(Sigma-Proligo)在表1中列出。
表1-在利用RT-PCR的mRNA表达研究中使用的引物对
b)通过碱性磷酸酶免疫细胞化学技术定位在FPNRBCs上的特有蛋白
8个市售的抗FPNRBCs的被注释在质膜上以及也在其他膜中特有蛋白或具有未知亚细胞位置的特有蛋白的抗体被用来在FPNRBCs和AARBCs二者上定位其抗原：中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)(Chemicon-International,特曼库拉，加利福尼亚，美国)、溶质运载体家族3成员2亚型A(SLC3A2)、嗅觉受体11H4(OR11H4)和抗菌蛋白FALL-39前体(金环蛇抗微生物肽(Cathelicidin antimicrobial peptide)，CAP-18)(全部来自Abcam，剑桥，英国)、唇腭裂跨膜蛋白1(CLPTM1)、含有Armadillo重复的X-连接的蛋白3(ARMCX3/ALEX3)和CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物(FACE1)(全部来自Novus-Biologicals，利特敦，科罗拉多州)，以及氯离子通道蛋白6(CLCN6)(Santa-Cruz Biotechnology，Inc.，加利福尼亚州，美国)。对于SLC1A5、SLC3A2、OR11H4、CLCN6、CLPTM1、ARMCX3，细胞用4％多聚甲醛固定10分钟或者对于CAP-18和FACE1，细胞用冰冷的甲醇:丙酮(1:1)固定10分钟；接下来的步骤对所有载玻片是共有的：简单地说，用稀释的山羊血清(Sigma-Diagnostics，密苏里州，美国)(在PBS中是1:10)抑制非特异性结合120分钟，其接下来与各自的第一抗体(1:100)在室温下一起孵育60分钟或4℃下过夜。然后载玻片与对应的小鼠或兔子的生物素化的第二抗体(1:100)一起孵育60分钟(Vector-Laboratories，加利福尼亚州，美国)。其接下来用链霉亲和素偶联碱性磷酸酶(Vector-Laboratories)(1:100)一起孵育。在黑暗中用新鲜制备的载体-蓝-底物(Vector-Blue-substrate,Vector-Laboratories)检测免疫反应10分钟。在室温下的加湿室中进行所有孵育，并且在孵育之间的清洗在1×PBST中(5分钟)。在水中冲洗载玻片，并且用核快速染剂染色细胞核(10分钟)，在水中冲洗载玻片，并且用100％乙醇脱水(每次30秒)。空气干燥的载玻片与Vectashield(Vector-Laboratories)安装在一起，并且用光学显微镜分析。测试的每个抗体的染色强度如Lehr等人所述来计算。为统计显著性比较从Adobe Photoshop CS4软件(AdobeSystems，山景城，加利福尼亚)中的亮度直方图函数计算出的平均像素亮度。
掺加血液样本中的FPNRBCs的分离
掺加模型混合物(1×105个FNRBCs在2ml外周血液中)通过CD45损耗(磁性相关的细胞分选)和NAT-B阳性选择分选。通过血细胞计数器检验富集的混合物的FPNRBCs回收，细胞离心涂片到载玻片上并通过瑞特染色识别。
统计分析
使用曼-惠特尼U检验(GraphPad Prism软件，GraphPad Prism Inc，加利福尼亚)比较FPNRBCs和AARBCs之间的平均染色强度(Mean±SD)。当P值＜0.05时，认为差异显著。
FPNRBC膜蛋白
细胞膜蛋白提取是一种挑战，因为许多这样的蛋白具有疏水支链侧链。此外，详细蛋白质组学分析所需要的大量蛋白质限制了限制进入的细胞(如，人体FPNRBCs)的研究。为克服这些困难，从若干滋养层绒毛中获得的细胞膜蛋白质材料被积累和收集，并且开发一种用于最大的细胞膜蛋白回收的方案。使用两种有机溶剂MeOH和TFE，并且使用集中的FPNRBCs样本回收亲水和疏水蛋白质两者。总计识别273个蛋白质，分别是在MeOH中回收的144个和在TFE消化物回收的199个蛋白质，而70个蛋白质是二者共有的(表2；图2)。仅总计识别的蛋白质的26％从两种溶剂中均回收。蛋白质的回收可以通过依序使用含有限样本(5×107个细胞)的两种溶剂来提高。
因为FPNRBCs是有核的，并且还含有其他细胞器，蛋白质识别不但发现质膜蛋白，还发现来自细胞核、线粒体、内质网、高尔基体、微粒体和过氧化物酶体的膜蛋白。
已识别蛋白质的定位注释
总计识别273个蛋白质，并且他们在细胞中的定位已注释(表3)：133个是膜蛋白(表3)，而132个为非膜蛋白，包括16个已被描述为细胞质专有的(表4)。剩余8个的定位还未被分类(表5)。
使用GoFig(http://udgenome.ags.udel.edu/gofigure/index.html)基于基因本体学注释获得已识别的蛋白质的亚细胞定位和功能分类。Swiss-prot和TrEMBL数据库也用于FPNRBCs的特有蛋白的功能性注释。分析133个膜蛋白的亚细胞定位：这些蛋白质中，记录37个位于质膜，48个位于线粒体膜，10个位于内质网膜，并且剩余38个膜蛋白被注释定位于超过一个的细胞位置(图3A)。
膜蛋白的功能性注释
识别的133个膜蛋白的分子功能在图3B中详细说明。记录一些蛋白质具有一种以上功能。大多数是转运蛋白(16.54％)，15.79％是转运和催化，9.77％催化，9.02％结合，6.77％结合和催化，5.26％结合和转运，7.51％结合/催化/转运，3.76％结合/信号转导/催化，3.00％各为结合/信号转导和结构，9.02％未分类，以及10.53％其他功能。
具有跨膜结构域的蛋白质
所有蛋白质的跨膜结构域(TMDs)在表2中提供。在已识别的膜蛋白中预计的跨膜结构域的数量由0至15变化。发现NADH脱氢酶亚单位5具有最大数量的TMD。具有至少一个TMD的原始FPNRBCs的质膜蛋白(25个蛋白质)和已知在其他膜中也存在的质膜蛋白(14个蛋白质)分别在表6和7中呈现。
表5-含有跨膜结构域但位置未知的FPNRBCs的蛋白质
基于单肽的蛋白质识别
在表2中显示的为识别蛋白质基于肽的数量的蛋白质的颜色编码表明：总计273个蛋白质中只有23个为基于单肽匹配识别黑色着色，其落入5％FDR设定阈值内，并且剩余的为FDR为零的红色着色(≤2肽)或绿色着色(通过单肽)。自TFE和MeOH提取物中基于单肽识别的蛋白质，其肽序列和离子评分在图7和8中呈现。由于FPNRBCs的样本限制，不进行超过一个汇集的样本的重复质谱分析。
比较FPNRBCs和AARBCs的质膜蛋白以识别特有的膜蛋白
AARBCs的膜蛋白的基于质谱的识别到目前为止仅通过包括我们研究的几个研究来报告。从发表的文献来看，至今通过质谱来识别的所有AARBC膜蛋白的综合列表已被组织。在最终列表中，仅包括使用GoFig通过基因本体学注释为膜蛋白的那些候选。多余的条目已通过人工比较所有膜蛋白的序列来移除。所有299个非冗余的AARBC膜蛋白最终入围(数据未显示)；从中，为仅包括具有已知或潜在表面域的膜蛋白(例如，膜相关的细胞外蛋白和膜内在蛋白)而入围202个(表8)。人工比较FPNRBCs的膜蛋白与该AARBC膜蛋白的最终列表以识别共有膜蛋白和特有膜蛋白两者。
表6-FPNRBCs的质膜蛋白
表7-已知在其他膜上存在的FPNRBCs的质膜蛋白
AARBCs和FPNRBCs二者共有的膜蛋白
31个蛋白是两种细胞类型共有的。其包括：结构蛋白，如，红细胞带7膜内在蛋白、锚蛋白、血影蛋白、束蛋白、4.1蛋白；具有转运功能的蛋白，如，带3、水通道蛋白、钙-转运三磷酸腺苷酶、钠/钾-转运三磷酸腺苷酶、溶质运载体家族2、促葡萄糖转运蛋白成员1；和质膜结合蛋白，如，Kell血型糖蛋白(CD238)。
FPNRBCs特有的质膜蛋白
膜蛋白和潜在表面域(如注释的)的比较表明仅31个蛋白质是AARBCs和FPNRBCs的共有膜蛋白。进一步分别显示20个蛋白质是FPNRBCs特有的，以及171个是AARBCs特有的(图4)。对FPNRBCs特有的膜蛋白中，9个蛋白注释为仅在质膜上存在的，并且另外3个记录为不但在质膜上而且在ER/高尔基体/囊泡膜上也存在(表9)；但是，发现对FPNRBCs特有的其他8个膜蛋白，其准确的亚细胞位置不可得(表10)。
表9-具有跨膜结构域的FPNRBCs的特有膜蛋白
表10-含有跨膜结构域而位置未知的FPNRBCs的特有膜蛋白
对FPNRBCs特有的膜蛋白主要落入广泛的功能性组中，如，(a)转运蛋白：中性氨基酸转运蛋白B、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸转运的激活子)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A(氯离子转运)；(b)结合蛋白：转铁蛋白受体蛋白、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4；以及(c)催化蛋白：CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1(VKORC1L1)、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)。
逆转录酶PCR(RT-PCR)确定FPNRBCs中的特有膜蛋白的表达
获得来自滋养层绒毛的FPNRBCs，并且全部用于进行质谱实验。为测定是否识别为FPNRBCs特有的蛋白质的确在FPNRBCs中表达，从FPNRBCs中提取的总RNA用于进行RT-PCR。
使用自FPNRBCs中提取的总RNA测试并使用基因特异性引物通过RT-PCR测试FPNRBCs的特有蛋白的mRNA表达(表1)。评估包括13种对FPNRBCs特有的蛋白质的23种蛋白质的mRNA表达(图5)。在图5中，RT对照样本不包括RT酶。在PCR对照样本中，在模板的位置加入水。图5的上部图显示血红蛋白ε链(HBE1)、血红蛋白γ-2链(HBG2)、溶质运载体家族4成员1(SLC4A1)、溶质运载体家族39成员8(SLC39A8)、氯离子通道蛋白6(CLCN6)、天青杀素前体(AZU1)、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1(VKORC1L1)、蛋白GPR107前体(GPR107)、中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达。图5的下部图显示溶质运载体家族3成员2(SLC3A2)亚型A；溶质运载体家族22成员11(SLC22A11)亚型2；抗菌蛋白FALL-39前体；囊泡伴随的膜蛋白2(VAMP2)；转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)；唇腭裂跨膜蛋白1(CLPTM1)；CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物；ATP6VOA1(ZMPSTE24)；空泡质子易位性ATP酶116kDa亚单位a亚型1(ATP6V0A1)；类固醇脱氢酶同源物(HSD17β12)；溶质运载体家族43成员3(SLC43A3)；突触素样蛋白(SYPL1)和蛋白C9orf5(C9orf5)的表达。
除了嗅觉受体11H4(OR11H4)以外，检测所测试的FPNRBCs上的全部特有蛋白质的mRNA表达。没有进行嗅觉受体的扩增可能是由于Feingold和他的同事所提出的累积的mRNA的水平低。
特有的FPNRBCs蛋白的免疫细胞化学定位
假定特有FPNRBCs蛋白的原位定位被认为比蛋白质印迹法更详实，因为质膜蛋白、细胞质蛋白和核蛋白的位置能容易地可视化。这些与AARBCs比较。FPNRBCs上的测试的五种抗体(FACE-1、SLC1A5、CAP-18、ARMCX3和OR11H4)的免疫染色强度显著高于AARBCs上的抗体(≤0.001)；相反，抗-CLCN6抗体染色的AARBCs的强度比FPNRBCs的高得多(＜0.001)。对于CLPTM1和SLC3A2来说，FPNRBCs和AARBCs之间在染色上没有显著差异(图6A-B)。条代表10μm。明场像使用具有连接Image-Pro Discovery软件的EvolutionTMMP colour Media Cybernetics CCD相机的BX61 Olympus显微镜的20×/0.7UPlan APO物镜拍摄。在图6B中，为了统计显著性，比较在Adobe photoshop CS4软件(Adobe Systems，山景城，加利福尼亚州)上由亮度直方图函数计算的平均像素强度。平均染色强度值和免疫反应强度反相关。
八种测试的抗体中的四种的免疫染色强度显著较高(p<0.05；图6C和D)。显著较强的抗体是针对FACE-1、SLC1A5(NAT-B)、ALEX3(ARMCX3)和CLCN6标记的抗体。在图6C中，为了统计显著性，比较在Adobe photoshopCS4软件(Adobe Systems，山景城，加利福尼亚州)上由亮度直方图函数计算的平均像素强度。平均染色强度值和免疫反应强度反相关。使用的检验是曼-惠特尼检验，p<0.05被认为是显著的。
在图6D中，从胎盘绒毛中提取的FPNRBCs相对较大，并且通过由核快速染剂染成红色的核的存在来识别。FPNRBCs和AARBCs分别在第一和第二图板上显示；阴性对照通过省略第一抗体进行，并且阳性对照在所有实验中都进行。
使用抗-NAT-B抗体的FPNRBCs的回收
为测验使用在本发明发现的任意标记分选FPNRBCs的可能性，成人血液样本掺加有FPNRBCs。使用NAT-B(SLC1A5)标记掺加回收的FPNRBCs为大约62.5％(图7B)。分选结果被进一步在免疫组织化学上验证(图7A)。免疫组织化学的研究显示成功使用NAT-B标记回收FPNRBCs。
从各种亚细胞位置识别的有不同功能的133种膜蛋白将有助于探索在医学上FPNRBC的重要性。还提供包括几个已知的细胞质蛋白(例如，血红蛋白链ε、γ、δ)的132种非膜蛋白。
由于难以获得足够数量的细胞，以前没有尝试FPNRBCs的蛋白质组学分析。经历妊娠终止的患者的胎盘绒毛的有权使用能够汇集用于2D-LCMS/MS分析的细胞。此外，膜蛋白的提取在蛋白质组学中仍是另一种挑战；鼓励使用类似方法从有限的样本(5X107个细胞)中比从AARBCs中回收更多的膜蛋白，这也解释了这些有核细胞的结构复杂性。
为大多数FPNRBCs的蛋白质注释的亚细胞定位和分子功能对于这类细胞是新颖的，其对于蛋白质/发育/结构生物学家、病理学家、血液生物学家等是有用的。被识别FPNRBC膜蛋白显示从转运、催化、结合到结构的多样的生理功能，而大约32％是转运和/或催化。在膜蛋白中，大多数是从线粒体(48个蛋白)和质膜(37个蛋白)中识别。
FPNRBCs特有的膜蛋白被识别为潜在的候选者，作为用于通过基于抗体的技术将来分离这类型细胞的表面抗原。基于出版物制备的人AARBC膜蛋白的列表用于比较FPNRBCs的膜蛋白和AARBCs的膜蛋白：12种注释在质膜中的膜蛋白和8种亚细胞位置未知的膜蛋白被发现是FPNRBCs特有的。具有跨膜结构域而亚细胞位置和分子功能未知的蛋白质可含有生物学重要性的新抗原。该比较也显示出171种蛋白质是AARBCs特有的，其没在FPNRBCs的数据集合中被发现。
一些蛋白质被发现在两种细胞类型中是共有的(其包括质膜的主要结构和转运蛋白，如，带3、红细胞带7、促葡萄糖转运蛋白(SLCA2A1)、Kell血型糖蛋白(CD238)、水通道蛋白、ATP-结合盒半转运蛋白1和糖蛋白C)，说明FPNRBCs中的这些蛋白质的功能与他们成人的相似物的功能类似。
在本发明中，对未成熟红细胞而非AARBCs来说是发育-阶段特有的质膜蛋白(如转铁蛋白受体和铁蛋白重链)被识别为FPNRBCs特有的；类似地，在数据集合中白细胞特异抗原的缺乏还证实了使用的样本的纯度。
使用RT-PCR通过mRNA表达分析的FPNRBCs特有蛋白的间接确认显示了除嗅觉受体(OR11H4)以外的，所有检测候选物的存在；并且该蛋白质没有检测到的原因可能是由于样本中存在的模板水平低。特有蛋白的RT-PCR结果通过质谱证实他们的识别。这种确认不可能用于AARBCs，因为它们是成熟细胞，没有细胞核或RNA。
蛋白质组识别(接下来在组织和细胞中采取免疫学技术证实他们的表达)在如生物标记发现、药物发现和疾病生物学(例如，膀胱癌的肿瘤异质性研究)的领域是有用的。与AARBCs比较，如通过对这些细胞上的八种抗体中的四种的免疫染色(FACE-1、SLC1A5、CAP-18和OR11H4)来识别的FPNRBCs特有蛋白的较强表达水平支持它们的质谱识别。但是，氯离子物通道蛋白(CLCN6)的表达被发现是相反的(在AARBCs中较强)，并且在本研究中，另外两种蛋白质(SLC3A2和CLPTM1)在它们的免疫染色上没表现任何差异，并且该发现可能是由于使用的抗体的特异性和反应性，或者由于识别的蛋白质的表达水平和亚型。如前所述，FACE-1和CAP-18还被注释为除它们存在于质膜之外也在其他位置存在。
识别用于非创伤性产前诊断的从母体血液中分离FPNRBCs的潜在表面抗原：在母体血液中的这些细胞，能够使用白细胞特异性抗-CD45抗体从WBCs中顺利地分离，然而，由于仅在这些细胞类型中的任意一类中存在的特异性表面抗原的缺乏，从众多AARBCs中选择FPNRBCs仍然富有挑战性。由免疫细胞化学显示的采用质谱和它们在FPNRBCs中的强烈表达的具有跨膜域的特有膜蛋白(如，FACE-1,SLC1A5,CAP-18和OR11H4)的识别已经完成。这些潜在候选物可用于通过依靠免疫细胞分选技术(如，磁性活性细胞分选(MACS)或荧光活性细胞分选(FACS))的阳性选择来从AARBCs中分离该细胞类型。类似地，FPNRBCs中的氯离子通道蛋白的免疫反应的缺乏也对通过该策略从AARBCs中损耗是有用的。
FPNRBCs的特有质膜蛋白的生物学重要性
图8显示FPNRBCs的特有质膜蛋白的位置和生理作用(包括那些与人类胎儿发育相关的)以及与它们的突变相关的疾病。
简单地说，20种特有膜蛋白能够分成7种功能亚型：转运蛋白/通道分子：两种氨基酸转运溶质运载体(SLC)蛋白，中性氨基酸转运蛋白B0(NAT-B；SLC1A5、ATB(0)、ASCT2)，SLC3A2；和阴离子转运蛋白，氯离子通道蛋白6的剪接亚型A。结合蛋白：转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3和嗅觉受体11H4。催化性：CAAX异戊二烯肽链内切酶，也称作法尼基化蛋白-转化酶(FACE)、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1(VKORC1L1)、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)；信号传导：蛋白C9ORF5的剪接亚型1；囊泡再循环：Pantopysin；抗微生物蛋白：BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103(单细胞中BCG诱导的基因，无性繁殖系103)、FALL-39；无已知功能的蛋白质：唇腭裂跨膜蛋白1。
位置和功能未知的蛋白质—关于已识别的FPNRBCs的蛋白质中的五种(有至少一个跨膜结构域)的蛋白质的表达和功能特性的报道是在任何其他细胞/组织中没有得到的；它们是，假定蛋白DKFZp586C1924、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、假定蛋白MGC14288、8KDa蛋白质和25KDa蛋白质。蛋白质数据库检索(UniProtKB/Swiss-Prot)没有显示这些蛋白质的更多信息。
这些关于人类胎儿前成红血细胞的研究能够使这些细胞的生物学理解成为可能，包括血红蛋白的转换和其表达的调控，以及，在某种程度上，关于为非创伤性产前诊断从母体血液中富集这些理想细胞。这些细胞的膜蛋白的蛋白质组学信息将帮助理解生物学以及为非创伤性产前诊断开发从母体血液中富集这些细胞的技术。
实施例2
在三步式富集方案之后使用抗-ASCT2抗体自妊娠终止后(TOP)的母体血液中富集FPNRBCs
从两个患者体内收集10mls TOP后的母体血液。血液样本使用我们实验室的三步式富集方案处理。简单地说，将稀释的血液样本在Percoll 1118密度培养基中分层并离心。收集交界面，并且通过使用抗-CD45磁性珠的磁性活性细胞分选(MACS)来耗尽所有白细胞。来自阴性部分的细胞与抗-ASCT2抗体一起孵育30分钟，并且洗涤，然后再与抗-兔IgG-磁性珠一起孵育用于FPNRBCs的间接MACS(阳性)选择。能够从每个样本中回收20个FPNRBCs(表11)。
表11—使用抗-ASCT2抗体自TOP后的母体血液中富集FPNRBCs
| top后的母体血液 | 胎儿的胎龄 | 体积(ml) | 回收的FPNRBCs |
| MB1 | 8+4周 | 10 | 20 |
| MB2 | 8+5周 | 10 | 20 |
使用抗ABHD12、GPR107、ORH114和ALEX3的抗体的从模型混合物实验中回收胎儿有核成红血细胞
胎儿有核红细胞从胎盘绒毛中提取，并且储存在IMDM培养基中过夜。样本中的FPNRBCs和AARBCs用血细胞计数器计数。新鲜的AARBCs通过在3000rpm下以Ficoll-Plague离心分离稀释的全血20分钟来获得。收集沉淀的RBCs，并用1×PBS洗涤，且还储存在IMDM培养基中。将AARBCs掺加到含有FPNRBCs的管中，以致FPNRBCs的浓度保持在1-9％。在混合物中使用0.5×105或者1×105个FPNRBCs(依据提取的FPNRBCs的可用性)。每个实验依据提取的FPNRBCs的可用性重复进行二次或三次。
细胞混合物通过在2200rpm下离心5分钟沉淀。移除上清液，并且加入适当体积的MACS缓冲液。用于与细胞混合物一起孵育的抗体的浓度是对GPR107、OR11H4和ABHD12来说是1:50，并且对ALEX3来说是1:100。在4℃下孵育30分钟后，在2200rpm下清洗细胞5分钟一次，并且丢弃缓冲液上清。适当加入60μl MACS缓冲液和40μl抗-兔IgG或抗-小鼠IgG珠(Miltenyi)，并且在4℃下孵育30分钟。洗涤后，使用Miltenyi MS柱分离细胞。使用抗-GPR107从模型混合物中回收的FPNRBCs似乎比OR11H4和ABHD12,或ALEX3回收的高(29.4％)。
表12—使用抗4个FPNRBCs特有表面标记的抗体自含有成人无核RBCs的模型混合物中分离FPNRBCs的总结。
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Claims (20)
1.识别至少一个胎儿成红血细胞的方法，该方法包括：
检测选自中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸转运的激活子)成员2亚型A(SLC3A2)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A、转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4、蛋白C9orf5的剪接亚型1、唇腭裂跨膜蛋白1、BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103、抗菌蛋白FALL-39前体、CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、突触素样蛋白的剪接亚型2、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、假定蛋白DKFZp564K247(缺氧诱导的基因1蛋白)(IPI登录号为IPI00295621)、假定蛋白DKFZp586C1924(IPI登录号为IPI00031064)、ALEX3蛋白变体、假定蛋白MGC14288(IPI登录号为IPI00176708)、IPI登录号为IPI00639803的蛋白和IPI登录号为IPI00646289的蛋白中的至少一种胎儿成红血细胞特异标记的表达；
其中，所述标记的检出表明所述胎儿成红血细胞的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测包括检测选自中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸转运的激活子)成员2亚型A(SLC3A2)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A、转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4、蛋白C9orf5的剪接亚型1、唇腭裂跨膜蛋白1、BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103、抗菌蛋白FALL-39前体、CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、突触素样蛋白的剪接亚型2和蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)中的至少一种胎儿成红血细胞特异标记的表达。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述检测包括检测选自蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4和ALEX3蛋白变体中的至少一种胎儿成红血细胞特异标记的表达。
4.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述胎儿成红血细胞为哺乳动物源的。
5.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述胎儿成红血细胞为人源的。
6.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述标记通过抗体或其抗原结合片段来检测。
7.一种从样本中分离至少一个胎儿成红血细胞的方法，该方法包括：
(a)使所述样本与至少一种抗体或其抗原结合片段接触，该抗体或其抗原结合片段能够结合选自中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸转运的激活子)成员2亚型A(SLC3A2)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A、转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4、蛋白C9orf5的剪接亚型1、唇腭裂跨膜蛋白1、BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103、抗菌蛋白FALL-39前体、CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、突触素样蛋白的剪接亚型2、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、假定蛋白DKFZp564K247(缺氧诱导的基因1蛋白)(IPI登录号为IPI00295621)、假定蛋白DKFZp586C1924(IPI登录号为IPI00031064)、ALEX3蛋白变体、假定蛋白MGC14288(IPI登录号为IPI00176708)、IPI登录号为IPI00639803的蛋白和IPI登录号为IPI00646289的蛋白中的至少一种标记；以及
(b)从样本中分离与所述抗体或其抗原结合片段结合的胎儿成红血细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，分离包括用能够单独分离所述胎儿成红血细胞的装置来分离所述胎儿成红血细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述装置是至少一种显微操作器。
10.根据权利要求7至9中任意一项所述的方法，其中，所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其结合。
11.根据权利要求7至10中任意一项所述的方法，其中，使用免疫磁性分离、流式细胞计或其结合从所述样本中分离与所述抗体结合的胎儿成红血细胞。
12.一种分离的胎儿成红血细胞，其是根据权利要求7至11中任意一项所述的方法获得的。
13.一种诊断个体的至少一种产前异常的方法，该方法包括：
(a)根据权利要求1至4中任意一项在个体的样本中识别至少一个胎儿成红细胞；
(b)分离所述胎儿成红血细胞；以及
(c)在所述胎儿成红血细胞中测定至少一种与产前异常相关的遗传标记。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述产前异常选自唐氏综合症、爱德华兹综合征、帕塔综合症、神经管缺陷、脊柱裂、腭裂、泰萨克斯病、镰刀形红细胞贫血症、地中海贫血、囊性纤维化病、脆性X染色体综合征、脊髓性肌萎缩、强直性肌营养不良、亨廷顿氏舞蹈病、夏-马-图三氏病、血友病、杜氏肌营养不良、线粒体异常、遗传性多发性外生骨疣和成骨不全。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述样本选自母体组织、母体血液、脐带血、羊水细胞、绒膜绒毛样本、胎儿血液和胎儿组织。
16.根据权利要求13至15中任意一项所述的方法，其中，所述方法为在活体外。
17.一种用于识别至少一个胎儿成红细胞的标记，其选自中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸转运的激活子)成员2亚型A(SLC3A2)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A、转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4、蛋白C9orf5的剪接亚型1、唇腭裂跨膜蛋白1、BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103、抗菌蛋白FALL-39前体、CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、突触素样蛋白的剪接亚型2、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、假定蛋白DKFZp564K247(缺氧诱导的基因1蛋白)(IPI登录号为IPI00295621)、假定蛋白DKFZp586C1924(IPI登录号为IPI00031064)、ALEX3蛋白变体、假定蛋白MGC14288(IPI登录号为IPI00176708)、IPI登录号为IPI00639803的蛋白和IPI登录号为IPI00646289的蛋白中。
18.一种抗体或其抗原结合片段，其能够结合选自中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸转运的激活子)成员2亚型A(SLC3A2)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A、转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4、蛋白C9orf5的剪接亚型1、唇腭裂跨膜蛋白1、BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103、抗菌蛋白FALL-39前体、CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、突触素样蛋白的剪接亚型2、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、假定蛋白DKFZp564K247(缺氧诱导的基因1蛋白)(IPI登录号为IPI00295621)、假定蛋白DKFZp586C1924(IPI登录号为IPI00031064)、ALEX3蛋白变体、假定蛋白MGC14288(IPI登录号为IPI00176708)、IPI登录号为IPI00639803的蛋白和IPI登录号为IPI00646289的蛋白中的至少一种标记，其中，所述标记用于识别至少一个胎儿成红细胞。
19.一种用于在样本中识别和/或分离至少一个胎儿成红细胞的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种能够结合选自中性氨基酸转运蛋白B(SLC1A5)、溶质运载体家族3(二价和中性氨基酸转运的激活子)成员2亚型A(SLC3A2)、氯离子通道蛋白6的剪接亚型A、转铁蛋白受体蛋白1、蛋白GPR107前体的剪接亚型3、嗅觉受体11H4、蛋白C9orf5的剪接亚型1、唇腭裂跨膜蛋白1、BCG诱导的膜内在蛋白BIGM103、抗菌蛋白FALL-39前体、CAAX异戊二烯蛋白酶1同源物、突触素样蛋白的剪接亚型2、维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1样蛋白1、蛋白C20orf22的剪接亚型1(ABHD12)、假定蛋白DKFZp564K247(缺氧诱导的基因1蛋白)(IPI登录号为IPI00295621)、假定蛋白DKFZp586C1924(IPI登录号为IPI00031064)、ALEX3蛋白变体、假定蛋白MGC14288(IPI登录号为IPI00176708)、IPI登录号为IPI00639803的蛋白和IPI登录号为IPI00646289的蛋白中的至少一种FPNRBC标记的抗体和/或其抗原结合片段。
20.根据权利要求13或19所述的方法，其中，所述样本选自母体组织、母体血液、脐带血、羊水细胞、绒膜绒毛样本、胎儿血液和胎儿组织。
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