CN214952520U - 循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置以及苏木素-伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及医学病理检验和细胞分子生物学技术领域，具体公开了循环肿瘤细胞苏木素‑伊红染色装置以及苏木素‑伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置。苏木素‑伊红HE染色装置包括：细胞小室，所述细胞小室上方开口，且底面为有机材料膜，用于截留循环肿瘤细胞并滤过染色试剂；滤膜，所述滤膜可操作地设置在所述细胞小室中，用于截留循环肿瘤细胞；细胞井，所述细胞井上方开口，用于收集所述细胞小室的滤过液；所述细胞小室可操作地悬挂于所述细胞井的内壁中。该装置还包括微量核酸提取试剂盒和微量核酸浓缩装置，微量核酸提取试剂盒包括用于盛放滤膜并进行核酸提取的微量核酸提取管，微量核酸浓缩装置包括用于支持微量核酸提取管的管座。

Description

循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置以及苏木素-伊红染色和 微量核酸提取、浓缩装置

技术领域

本实用新型涉及医学病理检验和细胞分子生物学技术领域，具体涉及循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置以及苏木素-伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置。

背景技术

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)是1896年TR Ashworth在对患癌病人尸体解剖时通过观察病人的血液发现的与体内相同肿瘤的血液肿瘤细胞。目前CTC检测仍存在病理专业对接断裂缝隙，CTC被普遍认为是必然进入医院肿瘤常规检诊的病理检验或实验中心科细胞苏木素-伊红染色(HE)形态诊断项目，应该由病理HE 常规技术代替非HE染色才能进行病理形态诊断，应由医学病理医师签发诊断报告。

虽然基因组技术近十年来的发展突飞猛进，但现有CTC生物产品技术在临床病理科常规诊断技术中的应用十分薄弱。病理HE染色诊断专业技术作为目前唯一的医学病理诊断的核心技术，是医学肿瘤诊断不可或缺的技术。然而，现有技术一般仍采用FISH荧光杂交和模糊的DAPI染色信号判断CTC的标志物阳性或阴性，例如：美国强生公司使用Cellsearch仪器用上皮细胞抗体荧光标记技术对循环中的乳腺癌上皮样肿瘤细胞进行染色；专利申请CN201710568652.9使用磁珠、 3-4种抗体、微流体吸附等组合设备，然后仍然是进行荧光原位杂交在荧光显微镜下观察。其他如叶酸标记技术、全自动微流体芯片(CytoChipNano)、密度梯度离心技术等，都是对CTC细胞进行荧光原位杂交染色，而且叶酸酶对时间性要求高，容易失活和降低杂交效率，只能获取不足30％的CTC癌细胞，不能全部捕获肿瘤细胞，因此存在假阴性问题。

荧光杂交标志物染色技术中，CTC的检测图像是在载玻片平面的 CTC细胞区域获取荧光原位杂交信号，必须在荧光显微镜暗视野观察点状荧光信号，而无法反映肿瘤细胞全面的核浆形态，因此，荧光杂交标志物染色技术无法满足病理学常规染色诊断技术的要求。此外，武汉某医疗科技股份有限公司使用负压条件下的膜过滤单一技术获取恶性肿瘤细胞，可以进行快速直接单一的亚甲蓝或吉姆萨或DAPI 染色，同时封片观察，但该方法仅能够观察血液细胞模糊蓝色细胞核影像，仅供检验科观察，不能用于病理科肿瘤细胞诊断的核浆染色。目前尚未有CTC病理HE形态诊断产品进入医院常规应用，这形成了生物和医学两领域间转化应用的现实平台裂缝，遏制了生物新技术在临床医学的应用推广。

另一方面，临床和病理检查亟需将CTC进行核酸提取和后续的基因测序和染色体及拷贝量变异检测。但是由于肿瘤患者血液往往仅能够提取到个位数的CTC，全部无损耗提取核酸也仅有100ng左右的微量核酸总量。而且，在市售核酸试剂盒常规提取流程中，通常需要不断地在每个步骤间转移试管，原本罕少的极低浓度核酸在多次更换试管管壁上的滞留，会导致核酸总量降低至检出阈值以下。这些都使得 CTC核酸提取的技术难度很大。已有文献报道CTC能提供的DNA量太少若不经浓缩则无法获得足够的DNA进行下游基因实验(Takeda K, Yamada T,Takahashi G,et al.Analysis of colorectal cancer-relatedmutations by liquid biopsy:Utility of circulating cell-free DNA andcirculating tumor cells[J].Cancer Science,2019.)。目前临床上只能实现 CTC的细胞学形态检测，尚未实现后续核酸提取和基因检测的稳定进行。

关于CTC的核酸提取，绝大部分现有技术均是针对非纯净CTC细胞提取核酸。尚未见对HE染色的循环肿瘤细胞进行微量核酸提取的同步技术，更没有通过浓缩CTC微量核酸达到检测最低标准总核酸量 (NGS，200ng以上；全基因组，60ng以上)以便开展稳定性的医学检测。

研究人员采用QIAGEN的REPLI-g系列全基因组/转录组扩增试剂盒，对单个癌细胞通过基因随机引物扩增获得了满足实验使用的基因组，但其也不是针对病人的CTC细胞。另有不提取CTC、而是使用标签DNA掺入血液中未知CTC核酸基因组内，然后基于实时定量PCR(Q-PCR)模糊检测CTC的方法。上述所有方法都是湿性实验，必须抽血后立即检测，最多不能超过3小时，否则难以获得检测结果。

此外，Cell search技术是将检出的CTC细胞分布到玻片上进行荧光原位杂交基因的干实验，并不回收CTC细胞进行后续基因组靶向药物等湿实验。珠海某公司富集分离仪是收购了美国Cynvenio公司， CTC富集技术特点是在同一份血样中获得CTC、ctDNA和白细胞三份样本，后续可应用于荧光原位杂交实验基因检测，但不能用于基因测序和芯片，而且漏检率也较高，另外与Cellsearch技术的缺陷相同，该技术对于占肿瘤70％的非Her2、非CKs阳性的细胞也会漏检，更重要的是其也是使用荧光显微镜原位杂交显示CTC的荧光标志，而不是 HE染色光镜观察CTC细胞核浆本身，没有HE染色诊断报告。

目前，提取滤膜上的高纯CTC的核酸干性实验还没有稳定成功，在湿性试管液体环境依靠梯度离心分层或抗体或探针获得的所谓 CTC样本混有超过其7倍数量的中性粒细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞和较原始造血细胞等，是正常人体的二倍体核酸，再采取湿性实验提取极其微量的CTC核酸，导致CTC的肿瘤纯DNA占比在混合DNA 中占25％以下，后续测序检测出真实CTC基因组数据难度很大。

文献报道液体活检提取CTC的DNA的湿性实验方法不只是CTC，还混有非单纯的CTC产物，如细胞游离DNA(cfDNA)、细胞游离RNA (cfRNA)、microRNA(miRNA)和外泌体(Taja,Lozar,Klara,et al.The biology and clinical potential of circulating tumorcells.[J].Radiology and oncology,2019,53(2):131-147.)，用于病人诊疗检测存在明显缺陷。

专利申请CN201611017879.6利用商业试剂盒德国Geriner公司的产品Oncoquick进行细胞密度梯度分离液，采取多孔隔膜分离管分别提取血液ctDNA和有核细胞，即白细胞和肿瘤细胞混合物，未特异提取循环肿瘤细胞，且容积高达15ml；其记载的提取到的该细胞层为“目的细胞层”，而不是单纯的循环肿瘤细胞，其中混有更多量的是粒细胞，淋巴细胞，单核细胞等，仅有少量循环肿瘤细胞，其实验结果也证明所谓的循环肿瘤细胞组的结果还不如非CTC组理想：即所谓的20个CTC组应该检测出标准的15个突变，但CTC组仅检测出10个突变，另两组为非CTC组(无CTC组和混合组)，反而分别检出11个突变和14个突变。

综合以上所述的CTC检测存在的问题主要为：仅针对少数带有人工信号标记的CTC，而非针对抽取血液中的全部CTC，敏感性和特异性较低，且没有应用到病理学科的HE染色报告，导致计数报告结果的可靠性较差；对CTC核酸的提取和浓缩目前没有专用仪器装置，导致病理科事实上不能利用CTC细胞提取和浓缩的微量核酸。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种循环肿瘤细胞苏木素-伊红(HE)染色装置，本实用新型的另一目的是提供一种循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置及其循环肿瘤细胞微量核酸提取试剂盒。

本实用新型提供一种循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置，该装置包括：

细胞小室(7)，所述细胞小室(7)上方开口，且底面为有机材料膜，用于截留循环肿瘤细胞并滤过染色试剂；

滤膜(8)，所述滤膜可操作地设置在所述细胞小室(7)中，用于截留循环肿瘤细胞；

细胞井(6)，所述细胞井(6)上方开口，用于收集所述细胞小室(7)的滤过液；所述细胞小室(7)可操作地悬挂于所述细胞井(6) 的内壁中。

优选地，所述细胞小室(7)的底面与所述细胞井(6)的底面之间留有储存滤过液的空间。

优选地，所述滤膜为滤孔直径为6-8μm的PE膜。

所述PE膜为透明滤膜。

以上所述的PE膜即为聚乙烯(Polyethylene)膜，滤孔直径为6-8μm 的PE膜能够有效滤过正常细胞，截留并吸附肿瘤细胞。

优选地，所述滤膜可操作地设置在所述细胞小室的底面上。

优选地，所述细胞小室底面有机材料膜的滤孔直径为0.2-0.4μm。

以上所述的有机材料膜包括但不限于聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane，PC)等。

以上所述的装置中，滤膜(8)自从开始过滤在滤膜上收集到CTC 细胞后，负压和PE膜理化特性牢牢粘附CTC细胞，所有HE染色工序和脱色流程不会移除CTC细胞直到核酸提取时离心消化后脱离膜载体，进入浓缩程序；细胞小室底面的有机材料膜可以滤过各种一过性染液和盐酸、酒精和水等试剂，完成9道以上的复杂染色过程，且不丢失CTC细胞。滤膜(8)和细胞小室(7)配合作用使得循环肿瘤细胞的HE染色、形态观察和后续微量核酸提取的操作更加简便、高效，有效提高微量核酸的提取总量。

以上所述的细胞小室可采用transwell小室，例如：3μl PC滤膜的 transwell小室，便于进入显微镜物镜头在适宜焦距下观察。

现有的生物细胞培养实验使用的transwell小室是一种在培养箱内长期存放培养细胞的装置，主要是为了观察肿瘤细胞侵袭迁移行为或用于药物筛选，而非用于临床病理CTC等细胞的形态诊断，也不用于HE染色。本实用新型对transwell小室进行结构改进，加入另一种 CTC滤膜，以实现高效的CTC的截留和HE染色，使得HE染色过程中复杂多次的染色和观察质控问题能够更加便捷地在光学正置显微镜下而不是倒置显微镜下进行。

优选地，所述装置还包括载玻片(9)和镊子(10)，所述载玻片 (9)用于支持所述滤膜(8)进行光学正置显微镜观察，所述镊子(10) 用于提起所述细胞小室(7)或所述滤膜(8)。

优选地，所述装置还包括移液加样器(17)。

为加快过滤，上述染色装置还可包括滤器，用于将所述滤膜(8) 加压排除液体。

本实用新型还提供一种循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置及其循环肿瘤细胞微量核酸提取试剂盒，其包括所述循环肿瘤细胞H苏木素-伊红染色装置(3)，或者，包括载玻片(9)。

本实用新型的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置及其循环肿瘤细胞微量核酸提取试剂盒可通称为循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置。

以上所述的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置及其循环肿瘤细胞微量核酸提取试剂盒还包括微量核酸提取试剂盒和微量核酸浓缩装置，所述微量核酸提取试剂盒包括微量核酸提取管(11)，用于盛放所述滤膜并进行循环肿瘤细胞的核酸提取。

以上所述的微量核酸提取管(11)适用于微量核酸的提取，其体积可为5ml、2ml、1.5ml、1ml、500μl、200μl等。

所述微量核酸浓缩装置包括用于支持所述微量核酸提取管(11) 的管座(12)。

本领域技术人员可以理解，管座(12)应匹配于所述微量核酸提取管的尺寸。

具体地，所述微量核酸浓缩装置还包括凝集仪(13)或真空浓缩仪(14)。

其中，所述凝集仪(13)包括电机(15)和出风口(16)。

凝集仪(13)或真空浓缩仪(14)可采用市售的核酸冷凝浓缩装置。

优选地，所述循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置及其循环肿瘤细胞微量核酸提取试剂盒还包括：细胞转运PE管(1)，用于收集样本或循环肿瘤细胞；细胞富集分离仪(2)，用于富集分离循环肿瘤细胞；显微镜(4)，用于观察循环肿瘤细胞的形态；细胞数字图像软件工作站(5)，用于采集循环肿瘤细胞的形态信息并利用循环肿瘤细胞的形态、影像、临床多学科综合评分和检视比对分析循环肿瘤细胞并编辑、进行人机对话分析和打印报告。

所述细胞富集分离仪优选使用市售滤膜技术的细胞富集分离仪，以获取截留有目标细胞(例如：CTC)的滤膜或PE管，直接同步HE 染色，封片，光镜观察。

所述显微镜可为光学正置平场显微镜、超景深显微镜等。

以上所述的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置及其循环肿瘤细胞微量核酸提取试剂盒的工作流程如下：

1、收集血液样本，利用CTC富集分离仪对血液样本进行处理得 CTC细胞，置于滤膜或PE转运管内；

2、循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置对CTC细胞进行HE染色和脱色；

3、将染色和脱色后的滤膜CTC细胞进行核酸提取，利用凝集仪或真空浓缩仪对核酸浓缩。

具体地，以上所述的循环肿瘤细胞HE染色和微量核酸浓缩装置的工作流程如下：

1、收集血液样本，利用CTC富集分离仪对血液样本进行处理获得CTC细胞

获取患者6ml静脉血，抽取5ml进入CTC富集分离仪，检测流程见仪器标准操作规程说明书；留置1ml静脉血冻存备用，提取血清做 DNA微卫星对照；

2、循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置对CTC细胞进行HE染色和脱色

(1)在普通病理玻片上放置1.2cm细胞井，井内套放3μl PC滤膜的细胞小室，光镜下检查各滤膜平面有无漏损和滤孔大小数量是否正常；

(2)将截留有CTC细胞的PE透明滤膜放入细胞小室底部，滤膜底向下蘸粘1-2次，滤膜原方向放入小室；细胞井内吸2000μl自来水漂洗底部去除淋巴或红细胞等杂质，吸干液体，细胞小室放入细胞井内， 5倍光镜或10×目镜倒置观察装置滤膜方向向上；

(3)将细胞井置于玻片上，室温下井璧滴加70％乙醇1000μl固定 10-20分钟，或中性甲醛500μl汽染固定10-20分钟；

(4)预先分装病理10ml苏木素新染色液4-8℃储存，用时吸取1ml 苏木素液预热到20℃，200μl移液器全吸，沿室璧滴染200μl，自下而上漫染细胞小室并覆盖滤膜，忌摇晃细胞小室；

(5)立即提高细胞小室脱离液平，让苏木素从滤膜缓慢滴下，室温染色约1-2分钟，细胞小室底蘸吸水纸，吸出细胞井底积存苏木素置HE存管回收(细胞小室底面PC膜使得细胞不能通过)；

(6)将细胞小室重新置于细胞井中，井内滴1000μl-2000μl弱碱水或浸入自来水小杯0.3cm，水面没过细胞室内的滤膜高度，上述过程漂洗10-20秒，强光，4-5倍镜下观察染色背景情况质控，忌摇晃细胞小室；

(7)0.1％稀盐酸100μl滴在细胞井内，将小室滤膜放在上方5秒汽染分化，立即加100μl自来水在小室内壁洗去盐酸，漂洗2分钟提出小室放在玻片上，不摇晃，手持细胞井和移液器吸除井内稀盐酸和残水，细胞井放回玻片上，强光，4-5倍镜下观察小室滤膜染色情况；忌摇晃细胞小室；

(8)将细胞小室置于细胞井中，沿井壁加伊红染料200μl，覆盖滤膜染色，约10-20秒，立即提高细胞小室脱离液平，让伊红从滤膜缓慢滴下到细胞井，忌摇晃细胞小室；用移液器从壁孔吸取小井内伊红到储存管回收，立即将小室放回井内；

(9)细胞井内滴1000μl-2000μl自来水或浸入自来水小杯0.3cm，水面没过细胞小室内的滤膜高度，上述过程漂洗10-20秒，2次左右， 5倍光镜镜下观察井内CTC染色情况和质控，忌摇晃细胞小室；然后用眼科镊小心夹持滤膜边缘，取出CTC的HE染色滤膜，水片不封片显微镜观察。

3、HE染色的CTC核酸提取和浓缩

(1)如盖有盖玻片将CTC玻片放入二甲苯中浸泡1小时以脱下盖玻片；

(2)将脱下盖玻片的HE染色CTC玻片上的CTC滤膜用镊子轻轻夹起边缘，放入事先准备好的1.5ml的EP管中；

(3)加入1000μl自来水，浸泡3min，10000×g离心1分钟后，将上层液体吸出留70μl左右的底液(注意枪头伸到底部吸液)；

(4)重复步骤(3)一次；

(5)准备市售血液或组织DNA提取试剂盒；

(6)向装有CTC滤膜的EP管里加入180μl的Buffer TL和15μl的 OB酶，混匀，置于55℃水浴锅消化，约1-2小时(视消化程度，最少需要半个小时)；

(7)加入220μl的Buffer BL，混匀，于70℃孵育15min；

(8)加220μl的无水乙醇，震荡混匀20s，12000rpm，离心1min；

(9)不弃底部滤膜，取上清转入收集柱中，置于收集管上， 12000rpm，离心2min；

(10)弃液及收集管，将收集柱置于一新的收集管上，加入 500μlHB solution，12000rpm，离心2min；

(11)弃液，加入700μl wash buffer，12000rpm，离心1min；

(12)弃液及收集管，将收集柱置于一新的收集管上，加入700μlwash buffer，12000rpm，离心1min；

(13)弃液，12000rpm，离心2min(空甩)；

(14)将收集柱置于一新的1.5ml离心管内，加入20μl 70℃预热的洗脱液，室温静置5min，12000rpm离心4min，滤液即为模板DNA，可重复上述步骤一次；

(15)将提取获得的DNA利用真空浓缩仪或者凝集仪装置进行浓缩至总量符合基因项目实验所需的DNA加样量为止，一般肿瘤的基因检测为6-10μl，可用于全基因组芯片和一代测序，二代测序加样模板；

(16)用DNA定量仪进行DNA定量浓度评估，一般是从4-8ng/μl 浓缩到12ng/μl-20ng/μl以上。

以上核酸提取步骤中，按照市售常规血液DNA提取试剂盒说明书或者以痕量DNA(QIAamp DNA Micro Kit)提取试剂盒操作，提取和纯化CTC的DNA。优选地，与说明书操作不同的是，在最后离心柱洗脱DNA时，在75℃加热孵育15分钟，再重复两次洗脱液洗脱步骤以洗脱柱子上的DNA，洗脱体积为20μl，而非40-50μl，观察离心柱颜色为白色。

对于福尔马林16小时内固定后的肿瘤组织，也可以在病理大体取材时肉眼选取纯肿瘤组织切0.5CM小块，放在EP管内用水或者缓冲液漂洗3-5遍，1-2小时左右，取出剪碎成米粒状糊状，再用PBS缓冲液漂洗，2000rpm离心2次，进入常规DNA提取过程，可避免甲醛等化学试剂对核酸的损伤。

以上步骤(15)中，将20μl洗脱液放入1.5ml EP管中，开盖，在17-20℃环境下风冷浓缩或以市售冷凝核酸浓缩仪浓缩DNA，至体积为7-10μl，CTC核酸总浓度达到60ng/7-10μl以上。

按照上述微量核酸提取方法，样本核酸总量只要达到60ng就可以完成NGS和全基因组芯片检测的需求量，每μl核酸达到8.5ng，总体加样量为7-8μl，即可进行全部CTC无损失不换管微量DNA提取，特别是不换管无损耗冷凝浓缩流程，浓缩完成后进行DNA定量分析。

本实用新型的有益效果在于：

(1)本实用新型提供的循环肿瘤细胞HE染色装置可实现高效的细胞截留和HE染色，细胞在滤膜上可在10秒内快速固定保护形态完整，在数分钟内完成HE染液流程，使得HE染色过程中复杂多次的染色和观察质控问题能够更加便捷地进行。与在平玻片直接滴染进行 HE染色相比，使用该装置不会溢液至边缘外，可避免细胞的丢失以及盖玻片遮挡干扰超景深数字图像分析而使得无法进行数字扫描分析。该装置在用于CTC的HE染色时，可利用少量血液收集其中极少量的CTC并完成无流失的CTC的HE染色。

(2)本实用新型将细胞小室与滤膜、细胞井、载玻片以及显微镜和微量核酸提取和浓缩装置组成了独特的细胞小室膜-玻片HE染色和核酸提取浓缩一体化装置，可在细胞染色后进行连贯的完整无损的微量核酸提取和浓缩。

该装置综合生物湿性实验和病理干性实验两个特征，使用医学病理技术对湿性样本血液采集到的全部高纯目标细胞进行HE染色，可直接利用显微镜观察干性玻片装置膜片上的细胞形态，在明确为目标细胞后，再接续核酸提取和浓缩装置，保证核酸提取上纯化柱前中不换管，微量DNA不流失，经浓缩后，获得一次性符合基因检测要求的核酸总量；

该装置得到的高纯核酸方便稳定保存，解决了CTC被拍照后只能丢弃或原细胞液体冻存，后期因低温冻融几乎不能再次检测到细胞的问题。

附图说明

图1为本实用新型实施例1的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置。

图2为本实用新型实施例2的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置及其循环肿瘤细胞微量核酸提取试剂盒。

图3为本实用新型实施例2的管座。

图4为本实用新型实施例2的凝集仪。

图5为本实用新型实施例2的真空浓缩仪。

图6为本实用新型实验例CTC的HE染色流程示意图。

图7为本实用新型实验例CTC的HE染色图，其中，A为CTC的荧光原位杂交细胞染色图，B为CTC的HE染色图，C为CTC的亚甲蓝、吉姆萨染色图。

图8为本实用新型实验例中病理HE染色片-病理医师光镜诊断与荧光显微镜FISH试剂染色片或吉姆萨染色片-实验技师报告的区别示意图，从左至右依次为病理HE染色片、FISH试剂染色片和吉姆萨染色片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本实用新型，但不用来限制本实用新型的范围。

实施例1

本实施例提供一种循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置(图1)，该装置包括：

细胞小室(7)，细胞小室(7)上方开口，且底面为有机材料膜，用于截留细胞并滤过染色试剂；有机材料膜为滤孔直径为0.2μm -0.4μm的PC膜；

滤膜(8)，可操作地设置在细胞小室(7)中，用于截留细胞；滤膜为滤孔直径为6μm或8μm的PE膜；

细胞井(6)，细胞井(6)上方开口，用于收集细胞小室(7)的滤过液；细胞小室(7)可操作地悬挂于细胞井(6)的内壁中，细胞小室(7)的底面与细胞井(6)的底面之间留有储存滤过液的空间；

载玻片(9)，用于支持光学正置显微镜观察；

镊子(10)，用于提起细胞小室(7)或滤膜(8)。

实施例2

本实施例提供一种循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置及其循环肿瘤细胞微量核酸提取试剂盒(图2)，包括：

细胞转运PE管(1)，用于收集样本或循环肿瘤细胞，

细胞富集分离仪(2)，用于富集分离循环肿瘤细胞，

细胞HE染色装置(3)，其结构和组成与实施例1的细胞HE染色装置相同；

显微镜(4)，用于观察循环肿瘤细胞的形态；

细胞数字图像软件工作站(5)，用于采集循环肿瘤细胞的形态信息并利用循环肿瘤细胞的形态、影像、临床多学科综合评分和检视比对分析循环肿瘤细胞并编辑、进行人机对话分析和打印报告；

微量核酸提取试剂盒，包括微量核酸提取管(11)，用于盛放滤膜并进行循环肿瘤细胞的核酸提取；

微量核酸浓缩装置，包括用于支持微量核酸提取管(11)的管座 (12)(图3)以及凝集仪(13)(图4)或真空浓缩仪(14)(图5)。

实验例CTC的HE染色以及核酸提取和浓缩

利用实施例2的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置及其循环肿瘤细胞微量核酸提取试剂盒，按照实用新型内容部分记载的细胞HE 染色和微量核酸浓缩装置的工作流程进行CTC的HE染色(流程示意图如图6所示)以及核酸提取和浓缩。

CTC的HE染色结果如图7所示。

图7的A为现有技术中CTC的荧光原位杂交细胞染色图像，结果显示，暗视野，不染细胞浆等微细结构，无法显示癌细胞形态和结构，不能用于病理诊断染色规范。

图7的B为利用本实用新型的装置进行CTC的HE染色的图像，结果显示，癌细胞核浆结构清晰，细胞核深蓝色，细胞浆淡红色，区别明显；还可见分叶核中性粒细胞，嗜天青胞浆，核、胞浆、细胞膜都很清晰，红细胞浆也很清晰。

图7的C为CTC的亚甲蓝、吉姆萨染色图，结果显示，癌细胞浆蓝色与细胞核蓝色颜色相同，难以区别癌细胞和内皮细胞全部形态。

本实用新型的HE染色装置与FISH染色的玻片观察的人员和工具不同(图8)：FISH染色为技术人员用荧光显微镜观察，HE染色为诊断病理医师用光镜观察。本实用新型的HE染色装置改变了应用昂贵的FISH荧光显微镜、昂贵的试剂、暗视野片或亚甲蓝染色(吉姆萨)作为CTC检测结果的判断标准，更新为病理医师用廉价的光镜观察的HE染色明场片为常规诊断判断标准，使得具有病理资质诊断能力的病理医生成为CTC诊断的核心。

利用现有技术的装置和核酸提取方法，普通核酸提取得到的核酸体积通常为40-50μl/EP管，DNA浓度为10ng/μl以上，总量200-400ng； CTC的核酸通常浓缩为7-10μl/EP管，浓缩后DNA浓度也仅仅为 8-10ng/μl以上，DNA总量仅仅为60-80ng以上。

利用本实用新型的装置进行CTC的核酸提取和浓缩的结果如表 1所示。

表1 CTC核酸提取与普通核酸提取

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本实用新型作了详尽的描述，但在本实用新型基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本实用新型精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本实用新型要求保护的范围。

Claims (10)

1.循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置，其特征在于，包括：

细胞小室(7)，所述细胞小室(7)上方开口，且底面为有机材料膜，用于截留循环肿瘤细胞并滤过染色试剂；

滤膜(8)，所述滤膜可操作地设置在所述细胞小室(7)中，用于截留循环肿瘤细胞；

细胞井(6)，所述细胞井(6)上方开口，用于收集所述细胞小室(7)的滤过液；所述细胞小室(7)可操作地悬挂于所述细胞井(6)的内壁中。

2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置，其特征在于，所述细胞小室(7)的底面与所述细胞井(6)的底面之间留有储存滤过液的空间。

3.根据权利要求1或2所述的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置，其特征在于，所述滤膜为滤孔直径为6-8μm的PE膜。

4.根据权利要求1或2所述的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置，其特征在于，所述有机材料膜的滤孔直径为0.2-0.4μm。

5.根据权利要求1或2所述的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置，其特征在于，所述装置还包括载玻片(9)和镊子(10)，

所述载玻片(9)用于支持光学正置显微镜观察，

所述镊子(10)用于提起所述细胞小室(7)或所述滤膜(8)。

6.循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的循环肿瘤细胞苏木素-伊红HE染色装置(3)。

7.根据权利要求6所述的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置，其特征在于，还包括微量核酸提取试剂盒和微量核酸浓缩装置，

所述微量核酸提取试剂盒包括微量核酸提取管(11)，用于盛放所述滤膜并进行循环肿瘤细胞的微量核酸提取。

8.根据权利要求7所述的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置，其特征在于，所述微量核酸浓缩装置包括用于支持所述微量核酸提取管(11)的管座(12)。

9.根据权利要求7或8所述的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置，其特征在于，所述微量核酸浓缩装置还包括凝集仪(13)或真空浓缩仪(14)。

10.根据权利要求6所述的循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置，其特征在于，还包括：

细胞转运PE管(1)，用于收集样本或循环肿瘤细胞，

细胞富集分离仪(2)，用于富集分离循环肿瘤细胞，

显微镜(4)，用于观察循环肿瘤细胞的形态，

细胞数字图像软件工作站(5)，用于采集循环肿瘤细胞的形态信息并利用循环肿瘤细胞的形态、影像、临床多学科综合评分和检视比对分析循环肿瘤细胞并编辑、进行人机对话分析和打印报告。

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