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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Abtrennung von Blutplättchen oder
Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs
aus einer sie enthaltenden biologischen Probenahme.
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Die
Erfindung ist sowohl auf Blutplättchen
als auch auf Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs anwendbar.
Unter Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs
versteht man eine Untereinheit oder Vesikulation der Zelle, die
durch jedwede mechanische oder andere Behandlung erhalten wurde
oder sich aus einem Zustand der Zellaktivierung oder einem besonderen
pathophysiologischen Zustand, wie zum Beispiel der Apoptose oder der
Zell- oder Blutplättchenlyse,
ergibt.
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In
der nachfolgenden Beschreibung wird der Ausdruck "Zellen" verwendet, um unterschiedslos,
außer bei
gegenteiliger Angabe, die unterschiedlichen Produkte zu bezeichnen,
die man abzutrennen wünscht,
insbesondere Blutplättchen
und Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs.
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Die
vorliegende Erfindung hat zum speziellen Ziel, von einer Probe die
Moleküle,
die an Zellen gebunden sind, von den gleichen ungebundenen Molekülen abzutrennen,
die in der flüssigen
Phase, insbesondere in löslicher
Form, vorliegen. Diese Moleküle
können
zum Beispiel Zellmarker oder an der Oberfläche der Zellen gebundene Elemente,
wie Antikörper,
oder Liganden sein. In bestimmten Fällen kann es von Interesse
sein, gleichzeitig das an Zellen gebundene Element und das ungebundene
Element, das in der flüssigen
Phase, insbesondere in löslicher
Form, vorliegt, oder auch das Verhältnis zwischen beiden quantitativ
zu bestimmen.
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Führt man
quantitative Bestimmungen von Zellmarkern in Blutproben durch, ist
es erforderlich, die Zellen des Mediums, welche diese Marker tragen,
von den gleichen Markern, die im löslichen Zustand vorliegen und
somit die späteren
quantitativen Bestimmungen verfälschen
können,
abzutrennen.
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Das
geläufigste
Verfahren zur Abtrennung der Zellen besteht darin, die Probe nach
einer eventuellen Vorbehandlung zu zentrifugieren.
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Man
erhält
auf diese Weise ein Pellet, das die Zellen enthält und an dem die gebundenen
Moleküle haften,
während
die ungebundenen Moleküle
in einem Überstand
bleiben (der durch jedwede Methode, insbesondere durch Absaugen/Dekantieren,
entfernt werden kann).
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Dennoch
neigt das Zellpellet bei der Zentrifugation dazu, ungebundene Moleküle gefangen
zu halten. Es ist somit zur Durchführung von Waschungen, um die
Restkonzentration an ungebundenen Molekülen signifikant zu senken,
erforderlich, das Pellet mehrfach wieder zu suspendieren. Es ist
somit auf charakteristische Weise erforderlich, mindestens drei
Waschungen mit einer 1:10-Verdünnung bei
jedem Schritt durchzuführen (100 μl Rückstand
auf 1 ml verdünnt),
um die Restkonzentration an ungebundenen Molekülen um 3 log (1000-fach) zu senken.
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Diese
wiederholten Zentrifugationen haben natürlich zahlreiche Nachteile,
darunter:
- • einen
Verlust an Zellen;
- • eine
Schwächung
der Zellen;
- • eine
Bildung von Aggregaten zwischen den Zellen, die manchmal schwer
rückgängig zu
machen ist. Es handelt sich besonders um die Zellen, die besonders
dazu neigen, aneinander zu haften, und insbesondere um die Blutplättchen;
- • die
Länge des
Verfahrens und die Schwere der Bearbeitung. In der Tat erfordern
drei Waschungen, selbst bei kurzer Zentrifugation (5 Min), insgesamt
fast 30 Min Behandlung;
- • die
Bindungen sind instabil; Bindungen vom Typ Ligand/Rezeptor, Antikörper/Antigen,
Enzym/Substrat sind reversibel und die Dissoziation der gebundenen
Moleküle
ist um so deutlicher, je länger
die Waschzeit ist. Lange Waschzeiten stellen demnach einen um so
deutlicheren Mangel des Verfahrens dar, je schwächer die Affinität des Verbindungspaares
ist (schnelle Dissoziationsgeschwindigkeit). In diesem Fall ist
es unerlässlich,
– die Waschzeit
zu verkürzen;
– das Volumen
der flüssigen
Restphase, die in Kontakt mit den an die Zellen gebundenen Molekülen steht, zu
verringern, was aber gleichermaßen
die Wirksamkeit des Waschens verringert.
- • schließlich bemerkt
man im Fall von Bearbeitungen von infektiösen Materialien die Bildung
von Aerosolen, die man natürlich,
wenn möglich,
zu vermeiden wünscht.
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Im
speziellen Fall der Blutplättchen
führen
die wiederholten Zentrifugationen neben den vorstehend genannten
Problemen zu einer Aggregation und Aktivierung, die für die späteren quantitativen
Bestimmungen immer sehr schädlich
sind und auf jeden Fall die biologischen Eigenschaften der Blutplättchen nach
den verschiedenen Zentrifugationsschritten verändern.
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Deshalb
hat man seit langem versucht, an dem bekannten Verfahren Veränderungen
vorzunehmen, um einige der vorstehend genannten Nachteile zu beheben.
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Es
wurde insbesondere vorgeschlagen, Zentrifugationen auf Serumkissen
durchzuführen,
die für
die Zellen weniger belastend, aber natürlich sehr viel teurer und
vor allem schwieriger durchzuführen
sind, weshalb diese Art von Verfahren nur wenig angewandt wurde.
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Es
wurden ebenfalls Zentrifugationen durch eine hydrophobe Ölphase in
Betracht gezogen (siehe insbesondere P. Poncelet und P. Carayon,
J. Immunol. Methods (1985), 85, 65–74 und Titus JA et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 78, 519). Diese Strategie, die vor allem für radioimmunologische
Messungen verwendet wird, hat einige Vorteile. Sie ist äußerst wirksam,
um die freien Moleküle,
die in der wäßrigen Phase
bleiben, und die gebundenen Moleküle, die mit den Zellen in die
hydrophobe Phase gezogen werden, zu trennen; die Trennung ist schnell,
in der Größenordnung
von 2 Min, und die Restkonzentration an ungebundenen Molekülen beträgt weniger
als 1 %. Darüber
hinaus tritt nach der Trennung sehr wenig Dissoziation von gebundenen
Molekülen auf.
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Dennoch
muss angemerkt werden, dass, wenn man wünscht, die auf diese Weise
abgetrennten Zellen einer Durchflußzytometrie, Mikroskopie oder
biologischen Aktivitätstests
oder auch Wieder-in-Kultur-Bringungen zu unterziehen, diese Technik
natürlich
den Mangel hat, dass die Zellen, wenn sie einmal in das Öl gebracht
wurden, nicht mehr verwendbar sind. Außerdem erzeugt der Kontakt
mit einem Mineralöl
im Fall von Blutplättchen
eine Aktivierung/Aggregation, die sie natürlich für eine spätere Behandlung völlig ungeeignet macht.
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Es
wurden ebenfalls Waschungen auf Filterträgern, zum Beispiel durch Unterdruck,
in Betracht gezogen. Der Vorteil liegt darin, dass man in diesem
Fall weniger Bearbeitung hat. Man kann große Serien bearbeiten und dies
ist leicht auf "Screenings" anpassbar, die Waschungen
sind wirksam und schnell, was von Vorteil ist. Der Hauptmangel ist
die Nichtverfügbarkeit
der Zellen (Wiedergewinnung ausgeschlossen) für Analysen wie die vorstehend
angegebenen.
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Im
Stand der Technik wurden ziemlich allgemeine Verfahren beschrieben,
die das Waschen von Zellen durch Zentrifugation betreffen. Zum Beispiel
beziehen sich die
EP 0 176 080 und
Gadol N. et al. (Diagnostic Immunology, 1985 3 (3) 145–154) auf
Verfahren zum Waschen von mononukleären Zellpopulationen anhand eines
Gels, das für
die Zellen wenig belastend zu sein scheint. Andere Techniken auf
der Grundlage eines hydrophoben Gels werden in der
EP 176 080 , Poncelet et al., Journal
of Immunological Methods, 1985, Bd. 85, Nr. 1, Seiten 65–74 und
Titus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, Bd. 78, Nr. 1, Seiten
519–523
beschrieben. Die
US 3 997 442 bezieht
sich auf eine Methode zur Trennung von zwei Phasen unterschiedlicher
Dichte ausgehend von einer Flüssigkeit,
ausgehend von von einem thixotropen Material, das am Boden des Zentrifugationsröhrchens
abgeschieden ist.
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Die
Abfolge Zentrifugation auf Albuminkissen oder -gradienten + Molekularsieb-Gelchromatographie schließlich wurde
bereits vorgeschlagen, um Plasmamoleküle zu entfernen, die nicht
an Blutplättchen
gebunden sind. Diese Labortechnik, die verwendet wird, um in bestimmten
Fällen
Plasmaproteine zu entfernen, die nicht an Blutplättchen gebunden sind und mit
Funktionstests wechselwirken können,
bleibt dennoch sehr langwierig und kompliziert in der Durchführung.
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Deshalb
schlägt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Abtrennung von Blutplättchen oder
Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs
aus einer sie enthaltenden Probe vor, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass:
- a) man die Probe in einem Gefäß zentrifugiert,
das an seinem distalen Ende ein kompaktes Gel enthält, wobei
das Gel für
die flüssige
Phase der Probe annähernd
undurchlässig
ist, aber unter den Zentrifugationsbedingungen von den abzutrennenden
Blutplättchen
oder den Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs penetriert
werden kann;
- b) man unter Umständen
den Zentrifugationsüberstand
abtrennt und
- c) man anschließend
die Blutplättchen
oder die Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs,
die in dem Gel enthalten sind, gewinnt; wobei das Gel aus hydrophilen
Teilchen besteht, die im gequollenen Zustand einen Durchmesser zwischen
30 und 500 μm
einschließlich
und vorzugsweise zwischen 90 und 350 μm einschließlich aufweisen.
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Die
Blutplättchen
oder die Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs,
die in dem Gel enthalten sind, werden dann durch Suspendieren des
Gels in einem geeigneten Medium, wie zum Beispiel einem Puffermedium und/oder
einem Medium mit einer speziellen Ionenstärke, gewonnen. Dann werden
die Blutplättchen
oder die Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs
von dem Gel beispielsweise durch Filtration abgetrennt. Dies ermöglicht den
Erhalt einer Blutplättchen-Suspension,
die auf diese Weise bezüglich
der Ausgangsprobe konzentriert werden kann; das Verfahren der vorliegenden
Erfindung kann also auch ein Konzentrationsverfahren sein.
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Dieses
Verfahren beruht auf der Tatsache, dass bei einer Zentrifugation
das Penetrationsvermögen der
in einer Lösung
enthaltenen festen Elemente direkt proportional zu ihrer Masse ist,
so dass die schwersten Teilchen dazu fähig sein werden, in das Gel
einzudringen oder es gegebenenfalls sogar zu durchdringen, während die
löslichen
Teilchen ebenso wie das flüssige
Medium in den meisten Fällen
nicht in der Lage sein werden, das entsprechende Gel zu penetrieren.
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Natürlich muss
das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung für
jede Abtrennung durch Einwirken auf die Natur und die physikalischen
Eigenschaften des Gels sowie auf die Zentrifugationsgeschwindigkeiten an
die Natur der Produkte, die man abzutrennen wünscht, insbesondere an die
Blutplättchen,
angepasst werden, um die gewünschte
Trennung der Phasen zu gewährleisten.
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Dieses
Verfahren ist besonders an die Abtrennung von Molekülen, die
an Zellen gebunden sind, von den gleichen, ungebundenen Molekülen, die
in der flüssigen
Phase, insbesondere in löslicher
Form, vorliegen, ausgehend von einer sie enthaltenden Probe angepasst.
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Das
in dem Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung eingesetzte Gel ist bevorzugt ein hydrophiles Gel, das
aus Teilchen besteht, die im gequollenen Zustand einen Durchmesser
zwischen 30 und 500 μm einschließlich und
vorzugsweise zwischen 90 und 350 μm
einschließlich
aufweisen.
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Ebenso
hat das gequollene Gel, wenn es sich an Ort und Stelle befindet,
Merkmale wie jenes, dass die Konzentration als Teilchen-Trockengewicht
zwischen 0,04 und 0,2 g/ml einschließlich liegt.
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Natürlich kann
das besagte Gel gebrauchsfertig sein, das heißt bereits unten in das Zentrifugationsgefäß eingebracht
sein, oder aber frisch eingebracht werden, das heisst aus einem
verdünnten
Gel, das durch Zentrifugation sedimentiert wird.
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Dieses
Gel wird vorzugsweise aus der Sephadex®-Produktserie
gewählt,
insbesondere den Gelen, die unter den Bezeichnungen G25, G100, G200
oder einer entsprechenden Bezeichnung im Handel sind, welche für die Molekularsieb-Gelchromatographie
geläufig
verwendet werden.
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Die
Zentrifugationsgeschwindigkeit liegt bevorzugt so, dass die Zentrifugalkraft
zwischen 200 g und 5000 g einschließlich liegt.
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Somit
umfasst das Verfahren schematisch:
- 1) das Einbringen
einer flüssigen
Probe, die insbesondere die Blutplättchen oder die Mikropartikel
Blutplättchen-Ursprungs
enthält,
in ein Zentrifugationsröhrchen über einem
gelierten System;
- 2) eine Zentrifugation bei geeigneter Geschwindigkeit;
- 3) das Waschen durch Entfernen, insbesondere Absaugen oder Dekantieren,
der flüssigen
Phase;
- 4) das Gewinnen der Blutplättchen
oder der Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs im Gel
oder, wie nachstehend zu sehen, gegebenenfalls unter dem Gel.
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Das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung ermöglicht
somit den Erhalt zweier getrennter Phasen:
- • eines Überstands über dem
Gel, der die gesamten in Lösung
gebliebenden Moleküle
enthält,
in bestimmten Fällen
den Überschuss
an Reagens, aber in anderen Fällen
die löslichen
Zellproteine, die nicht an den Zellen haften geblieben sind, und
- • eines
Gels, das insbesondere die Blutplättchen sowie die Moleküle enthält, die
an diesen Blutplättchen haften.
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Als
Zentrifugationsgefäß wird bevorzugt
ein Röhrchen
verwendet, dessen distales Ende einen geringeren Durchmesser aufweist,
wobei sich das Gel in diesem distalen Teil mit geringerem Durchmesser
befindet. Als "distaler
Teil" oder "distales Ende" wird selbstverständlich der
Teil bezeichnet, der am weitesten von der Öffnung des Röhrchens
entfernt ist. Das Zentrifugationsröhrchen, das somit eine Einengung
in seinem unteren Teil aufweist, ermöglicht einerseits ein Konzentrieren
der Zellen und sichert andererseits dem Gel, wenn es einige Zeit
vor der Verwendung hergestellt wurde, eine bessere Konservierung
zu. Deshalb liegt der Durchmesser des Gelzonenbereichs, das heißt der Durchmesser
des unteren Teils des Röhrchens,
im Allgemeinen bevorzugt zwischen 2 und 7 mm und bevorzugt unter
5 mm. Im Allgemeinen liegt das Verhältnis der Volumina von der
oberen Kammer, das heißt
der Probe oder dem Überstand,
und der Sammelkammer vorzugsweise über 10, was unter diesen Bedingungen
eine bessere Konzentrierung ermöglicht.
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Es
ist ebenfalls möglich,
in einer bevorzugten Ausführungsform
vorzusehen, dass der distale Teil des Röhrchens, in den das Gel eingebracht
ist, an seinem Ende offen ist, wobei diese Öffnung durch einen Filter verschlossen
ist, der das Gel zurückhalten
kann. In diesem Fall mündet
das offene Ende in ein Gefäß, das auf lösbare Weise
mit dem Röhrchen
verbunden sein muss, um die genannten Elemente der Probe, die das
Gel durchquert haben, aufzunehmen.
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Es
sollte daran erinnert werden, dass die Zellen in Abhängigkeit
von ihrer Masse wandern und dass sie im Prinzip im Gel eingeschlossen
bleiben. In diesem Fall kann man die im Gel enthaltenen Zellen zurückgewinnen,
indem man das Gel wieder suspendiert und die Suspension mit einem
Filter filtriert, der die Gelteilchen zurückhält und den Durchtritt der genannten
Elemente zulässt.
Wenn man die Stärke
der Zentrifugation oder die Dauer der Zentrifugation erhöht oder
ein geeignetes Gel verwendet, ist es jedoch möglich, die Zellen dazu zu bringen,
durch das Gel zu wandern. In diesem Fall können sie direkt in das untere
Gefäß gelangen. Verwendet
man eine derartige Vorrichtung, empfiehlt es sich selbstverständlich,
das untere Gefäß vor der
Zentrifugation mit einer Flüssigkeit
zu füllen.
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Das
Gefäß des unteren
Teils kann insbesondere ein Röhrchen
sein, das an den unteren Teil des eigentlichen Zentrifugationsröhrchens
geschraubt ist oder durch jedes beliebige geeignete Mittel mit diesem
verbunden ist. In dieser Ausführungsform
ist es somit möglich,
in dem unteren Gefäß den Aufbau
eines Gradienten vorzusehen, der zwei oder mehreren Dichten entspricht,
was es zugleich erlaubt, bei der Zentrifugation die verschiedenen
Zellsorten in Abhängigkeit
von ihrer Dichte zu trennen. Die Methode, die den Aufbau der Dichtegradienten
erlaubt, ist bekannt und wird hier nicht weiter im Detail beschrieben.
Meistens genügt
ein Gradient mit zwei Dichten, der es zum Beispiel erlaubt, die
Blutplättchen
von den anderen genannten Elementen des Blutes abzutrennen.
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Unter
den Proben, die nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
behandelt werden können,
sind insbesondere zu nennen:
- • ein plättchenreiches
Plasma;
- • das
Vollblut, das vorzugsweise zuvor mit einer Lösung vom Typ Erythrozytenlyse
behandelt wurde;
- • eine
Zellsuspension in einer dem Aufnahmepuffer entsprechenden oder anderen
Lösung,
wie zum Beispiel:
– einer
Fixierlösung
(Paraformaldehyd, Formol, Glutaraldehyd, Ethanol);
– einer
Lösung
zur differentiellen Lyse (Erythrozytenlyse);
– einer
Lösung
zur enzymatischen (Phospholipase, Trypsin, Proteinase...), chemischen
(Ameisensäure,
Citronensäure,
Essigsäure...)
Behandlung, bevorzugte Lösungen,
wenn die Zellen unbedingt nach dem Stoppen/Neutralisieren durch
Verdünnung
von der Lösung
abgetrennt werden müssen;
– einer
Lösung,
die ein Reagens, immunologisch (Antikörper, Antigen) oder nicht (Ligand),
Enzymsubstrat, Element eines Bindungspaares (wie Biotin, X-biotin,
Avidin...) enthält.
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Wie
vorstehend erwähnt,
ist es besonders interessant, Suspensionen zu verwenden, in welchen
die Zellen mit einem Reagens behandelt worden sind. In der Tat kann
in diesem Fall der Überschuss
an Reagens durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
abgetrennt werden, und es ist möglich,
den Nachweis des Reagens oder übrigens
sogar des Zellmarkers vorzusehen, wenn dies durch Einbringen eines
Nachweiselementes in das Gel möglich
ist.
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So
ist es möglich,
das Einbringen eines mit Hilfe von Produkten wie DDAF (F(ab')2-Fragment
von FITC-konjugierten Anti-Maus-IgG-Antikörpern, von der Firma Eurobio
vermarktet) markierten, zum Beispiel fluoreszierenden Anti-Maus-IgG-Antikörpers in
das Gel vorzusehen und dann in den oberen Teil des Röhrchens ein
Medium einzubringen, das Zellen sowie einen monoklonalen Maus-Antikörper enthält, der
mit diesen Zellen reagiert. Damit die Reaktion vollständig ist,
liegt der monoklonale Antikörper
selbstverständlich
im Überschuss
vor, und unter diesen Bedingungen wird ein Teil der Antikörper an
die Zellen gebunden, die anderen bleiben in Lösung. Nach Behandlung mittels
des Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung dringen die durch die monoklonalen Antikörper markierten
Zellen in das Gel ein und werden in diesem Gel von den fluoreszierenden
Anti-Maus-IgG-Antikörpern erkannt
und werden folglich einen Nachweis erbringen.
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Einer
der Vorteile dieses Verfahrens liegt darin, dass es möglich ist,
vorbehandelte Röhrchen
vorzusehen, die das Gel und den fluoreszierenden Anti-Maus-IgG-Antikörper enthalten,
so dass der Betreiber dann nur noch den Schritt der Bindung der
monoklonalen Antikörper
und die Zentrifugation vornehmen muss, woraufhin der Nachweis indirekt
im Gel auftritt.
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Darüber hinaus
erlaubt die Abtrennung der ungebundenen Moleküle die Verwendung eines Zweitschicht-Reagens
in sehr geringer Menge, was natürlich
die Hintergrundfärbung
der Immunmarkierung beseitigt und folglich die Empfindlichkeit erhöht.
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In
demselben Ansatz kann man auch den Nachweis beispielsweise eines
Zelloberflächenmarkers
vorsehen, insbesondere wenn es sich um Enzyme handelt. Dieses Enzym
muss sowohl im gebundenen Zustand als auch im ungebundenen Zustand
vorliegen. Enthält
das Gel nach der Zentrifugation das Substrat dieses Enzyms mit einem
Chromogen oder einem Fluorogen, kann man die Anwesenheit von Zellen,
die den Enzymmarker tragen, sofort im Gel sichtbar machen.
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Unter
den verwendbaren Enzymen sind insbesondere die zellulären und
gleichzeitig löslichen
Ektoenzyme zu nennen, wie die Enzyme der Gerinnungskette, die von
Leukozyten, Blutplättchen
oder Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs getragen
werden (zum Beispiel die Faktoren Xa, XIa, IXa und das Protein C).
Es kann sich auch um rein zelluläre
Enzyme handeln, von denen aber ein Hemmstoff oder ein Substrat,
das den Test stört,
in löslicher
Form im Plasma vorliegt.
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Schließlich kann
es sich um Enzyme handeln, die an ein Reagens, zum Beispiel einen
Antikörper,
einen Liganden, Peroxidase-konjugiertes Avidin, β-Galactosidase, Acetylcholinesterase
gekoppelt sind.
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In
allen diesen Verfahren erlaubt die Zentrifugation es, die nicht
an Zellen gebundenen löslichen
Arten zu beseitigen.
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Zahlreiche
Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus den nachstehenden
Beispielen hervor.
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BEISPIEL 1: Messung der
an die Blutplättchen
assoziierten Ig
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Die
Immunglobuline (Ig) liegen normalerweise im Plasma zu 10–20 mg/ml
vor. Das Vorliegen dieser sehr hohen Menge macht ein ausgiebiges
Waschen der in dem Plättchen-reichen
Plasma (PRP) vorliegenden Blutplättchen
vor der Immunmarkierung mit einem Anti-Ig-Antikörper zwingend erforderlich,
d.h. 2 bis 4 Waschungen durch Zentrifugation.
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Diese
wiederholten Zentrifugationen führen
zu:
- • bedeutenden
Einbußen,
die große
Ausgangsproben erforderlich machen (bis zu 5–10 ml Blut), was mit Tests
in der Neonatal-Pädiatrie
unvereinbar ist;
- • die
Blutplättchen
können
in Gegenwart von roten und weißen
Blutkörperchen
nicht durch Zentrifugation gewaschen werden, was dazu verpflichtet,
mit einem PRP zu arbeiten (eine zusätzliche Anfangszentrifugation);
- • einem
hohen Risiko des Ablösens
und Verlusts aller oder eines Teils (also Selektionsverfälschung)
der Anti-Blutplättchen
Ig-Antikörper,
die für
ihre geringe Affinität
bekannt sind (Autoantikörper);
- • einem
Arbeitsaufwand und einer Belegzeit der Zentrifugen (jedes Waschen
erfordert eine schnelle Zentrifuge für 15 min), die nicht vernachlässigbar
sind.
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Bei
der Röhrchen-Gel-Technik
gemäß der vorliegenden
Erfindung kann die Probe unterschiedslos Vollblut oder PRP sein.
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Der Überstand
wird durch einfaches Umdrehen dekantiert (Vorgang 3-mal wiederholt
= 3 Waschungen). Das Gel, das die Zellen (Plättchen +/- rote Blutkörperchen
und weiße
Blutkörperchen)
enthält,
wird in einem geringen Volumen Immunmarkierungspuffer wieder suspendiert.
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Das
Gel wird auf den Maschen eines Filters zurückgehalten (Nylongitter, Öffnung 35 μm), wie zum
Beispiel dem "Cell
Strainer" von Falcon/Becton-Dickinson, und die
Zellen werden nach kurzer Zentrifugation (3 Min, 800 U/Min) für die Immunmarkierung
zurückgewonnen.
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Man
verfügt
dann über
eine Suspension von Plättchen
(+/- rote und weiße
Blutkörperchen),
die frei von Plasma und insbesondere plasmatischen Ig sind und ihre
morphologischen Eigenschaften, was die Analyse durch Durchflusszytometrie
ermöglicht,
ihren anfänglichen
immunologischen Phänotyp
beibehalten haben, die keine assoziierten Antikörper im Verlauf von Waschvorgängen verloren
haben und die durch das Trennverfahren nicht aktiviert wurden.
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Die
Wirksamkeit des durch den Transfer in das Gel durchgeführten "Waschens" wurde unter Verwendung
eines fluoreszierenden Marker-Ig getestet, das in der Ausgangsprobe
und in der Endsuspension quantitativ bestimmt wird. Man hat einen
Verdünnungsfaktor ≥ 1000 zwischen
Ausgangs- und Endkonzentration des Markers gemessen. Dies entspricht
bei einem Plasma, das 10 mg/ml Ig enthält, einer Ig-Restkonzentration ≤ 10 μg/ml in der
Zellsuspension. Eine solche Restkonzentration würde unter den oben genannten
Bedingungen mindestens 2 bis 3 Waschungen der Plättchen beanspruchen.
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BEISPIEL 2: Fixierung
von Blutplättchen
für verzögerte Immunmarkierungen
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Für die Messung
der Plättchen-assoziierten
1g sowie für
andere Antigene der Plättchenoberfläche stellt
ein Protokoll zur Zellstabilisierung, das es ermöglicht, die Expression der
interessierenden Antigene auf deren Ausgangsniveau zu halten, ein
grosses und schwieriges Problem dar.
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Die
Lösung
dieses Problems für
Blutplättchen
würde es
ermöglichen,
die Durchflusszytomettie-Analyse (Vorgang, der eine besondere Technik
erfordert) hinsichtlich der Behandlung der Probe (kurzfristig vor
Ort durchzuführender
Vorgang) zu verschieben.
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Eine
sanfte aber zugleich wirksame und standardisierte Fixierung erfordert
eine Behandlung der Zellprobe mit dem löslichen Fixierer von begrenzter
Dauer mit einem Auswechseln des Fixierers gegen ein Konservierungsmedium,
das keinen Fixierer enthält.
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Das
Röhrchen-Gel-System
bietet diese Möglichkeit.
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Die
Probe (PRP, 500 μl)
wird auf diese Weise im Fixierer (PFA, 0,2 %-ig, 500 μl) verdünnt, und
die Inkubation wird 10 Min fortgesetzt.
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Die
quantitative Analyse des immunologischen Phänotyps der Plättchen,
die auf diese Weise fixiert und nach 10 Min sofort vom Fixierer
befreit wurden, hat die Zuverlässigkeit
dieses Protokolls für
eine einwöchige
Konservierung der wesentlichen Plättchen-Antigene gezeigt, auf
welche sich die Protokolle multizentrischer/multinationaler pharmakologischer
Studien richten.
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Das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung kann auch in größerem Maßstab verwendet
werden, um eine schnelle Präparation
gewaschener Blutplättchen
durchzuführen,
was eine Alternative zu der Methode nach Mustard (Methods in Enzymology,
1989, Vol. 169, 3–21)
darstellt. Andererseits wurden bestimmte chemische Behandlungen
von Blutplättchen
und Leukozyten beschrieben (zum Beispiel eine Behandlung mit Citronensäure, pH
4), um die HLA-Antigene zu entfernen und spezifisch die Antikörper nachzuweisen,
die gegen die von HLA verschiedenen Antigene gerichtet sind. Derartige
Behandlungen erfordern natürlich
eine Neutralisation mit der Entfernung bestimmter chemischer Moleküle, die
mit den Zellen in Kontakt stehen, und es ist sicher, dass das Verfahren
gemäß der vorliegenden
Erfindung, das besonders schnell und einfach ist, eine vereinfachte
Durchführung
dieser Art von Vorgang ermöglichen
sollte.
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Ebenso
können
die enzymatischen Behandlungen eine schnelle Abtrennung der zellulären Elemente erfordern
(zum Beispiel Trypsin, PIPLC oder Proteinase K). Eine Standardzentrifugation
lässt die
Zellen über 5
Min in Kontakt mit dem das aktive Enzym enthaltenden Überstand,
während
man dank des Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung in Betracht ziehen kann, die Dauer der Kontaktzeit zu
begrenzen.
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Es
ist ebenfalls möglich,
die Verwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung
in der QIFI-Methode zur Quantifizierung zellulärer Moleküle durch Zytometrie vorzusehen,
die auf indirekten Markierungen (in zwei Schichten monoklonaler
Antikörper
1 + fluoreszierender Anti-Ig) beruht. Diese Methode wird in Poncelet
et al., J. of Immunol. Methods, 85 (1985), 65–74 beschrieben, dessen Inhalt
durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Beschreibung ist. Es
handelt sich um ein schwer anwendbares Prinzip mit einer Gegenmarkierung
(monoklonaler Antikörper
2 ist Träger
eines anderen Fluorochroms). Das Trennverfahren, bei welchem der
Reagenzüberschuss
an monoklonalem Antiköper
1 und Anti-Ig entfernt wird, ermöglicht
es, eine einfach durchzuführende
Gegenmarkierung in Betracht zu ziehen.
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Ebenso
ist es möglich,
bestimmte unerwünschte
Reagenzien schnell zu beseitigen, wie zum Beispiel Aktivatoren,
Zytokine, Boten, kurzfristig toxische Produkte (destilliertes Wasser
für die
Erythrozytenlyse oder Ameisensäure),
Komplexbildner, wie EDTA oder Citrat, oder reaktionsauslösende Ionen,
wie Calcium oder Magnesium.
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BEISPIEL 3: Abtrennungsprotokoll
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- • Herstellung
eines plättchenreichen
Plasmas.
Das Vollblut wird 15 Min bei 170 g zentrifugiert.
Die obere Phase, die dem PRP (Plättchen-reiche
Plasma) entspricht, wird abgehoben.
- • Abtrennung
der Plättchen
– 200 μl PRP werden
zu 2 ml geeignetem Puffer im Gelröhrchen gegeben,
– Zentrifugation
5 Min – 1
200 g,
– Entfernung
der oberen flüssigen
Phase durch Umdrehen,
– 2
Waschungen des die Plättchen
enthaltenden Gels in einem geeigneten Puffer (Zugabe von 2 ml Puffer in
das Röhrchen über das
Gel und Entfernung durch Umdrehen),
– Suspendieren des Gels und
der Plättchen
mittels einer Pipette,
– Übertragen
der Suspension auf einen Filter in einem Röhrchenstopfen,
– Zentrifugation
des verschlossenen Röhrchens,
die Gelteilchen werden vom Filter zurückgehalten, während die
Plättchen
nach unten in das Röhrchen "fallen",
– Entfernung
des Filterstopfens und Sammeln des Filtrats.
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BEISPIEL 4: Eigenschaften
des Gels
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- • Ausbeute:
51 % (siehe nachstehende Tabelle 1 und 1)
– Zählung der
Plättchen
im Filtrat, Zählung
auf einen Mikroliter beziehen,
– Vergleich dieser Zählung mit
der des Ausgangs-PRP,
– Aufstellen
eines Verhältnisses
Zählung
Filtrat/Zählung
RPR, als Prozentsatz dargestellt.
- • Erhaltung
der Unversehrtheit der Plättchen
Abwesenheit
einer Aktivierung der Plättchen
im Verlauf des Trennvorgangs (siehe Tabelle 1). Das Aktivierungsniveau
der Plättchen
wird durch die Messung der spezifischen Oberflächenmarker objektiviert.
Die
Plättchen
werden als nicht aktiviert betrachtet, wenn GMP140 unter 500 Kopien
pro Plättchen
liegt.
Erhaltung der Plättchenreaktivität (Tabelle
1). Die Erhaltung der Plättchenreaktivität wird durch
die quantitativen Veränderungen
bestimmter Oberflächenmarker
infolge einer in-vitro-Aktivierung definiert. Es wurden gewählt:
– GMP140,
das nur auf den aktivierten Plättchen
exprimiert wird,
– GpIIb/IIIa,
dessen Wert während
der Aktivierung zunimmt,
– GpIb,
dessen Wert während
der Aktivierung durch Einschluss fällt.
Die Plättchenreaktivität bleibt
für den
Aktivator TRAP erhalten.
-
TABELLE
1: MERKMALE DER PLÄTTCHEN,
DIE IM GELRÖHRCHEN
ABGETRENNT WURDEN
-
BEISPIEL 5: Verwendung
des Gelröhrchens
im Rahmen von Thrombopenien
-
Die
Ausbeute ist für
jede Plättchenzählung reproduzierbar.
So bestätigt
sich das Trennverfahren für eine
normale Plättchenzählung (150
bis 400 × 10
9 Plättchen/Liter).
Um eine größere Anzahl
an Plättchen
zu erhalten, ist bei den thrombopenischen Proben (10 × 10
9 bis 150 × 10
9 Plättchen pro
Liter Blut) eine Erweiterung des Volumens der Probe bis auf μl 500 durchführbar, siehe
nachstehende Tabelle 2. TABELLE
2
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BEISPIEL 6: spezielle
Anwendung
-
Messung
der mit den Blutplättchen
assoziierten Immunglobuline (PAIg). Vergleich der Techniken Waschung/Abtrennung
in einem Gelröhrchen
und durch mehrfache Zentrifugation (siehe nachstehende Tabelle 3).
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Das
Verfahren des Abtrennens/Waschens der Blutplättchen durch Zentrifugation
kann diese Zellen aktivieren, was zu einer Freisetzung der inneren
Ig führt,
die für
Ergebnisse durch Überschuss
verantwortlich sind. Die Messung der PAIg wurde an einer normalen
Probe durchgeführt,
deren Blutplättchen
mittels Gelröhrchen
oder mittels 3 Zentrifugationen gewaschen wurden. Es liegt in der
Tat eine höhere
gemessene Zahl an PAIg für
den Vorgang des Abtrennens/Waschens durch Zentrifugation vor (Tabelle
3). TABELLE
3: VERGLEICH DER WASCHTECHNIKEN