JPH0726955B2 - 保存全血試料の調製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は方法に関するものである。特に、本発明はホト
オプチカル（photooptical）手段による分析のための微
粒状検体、特に細胞、細胞小器官などを迅速に調製する
独特な方法に関するものである。この方法は小さい濃度
で存在しかつ／または他の細胞集団に対する相対的割合
の変化が診断上重要である細胞検体を分析するために特
に適切である。この方法はフローサイトメトリー（flow
cytometry）による分析のための全血試料を迅速に調製
するのに特に適切である。

全血の白血球画分を単離および染色する従来技術は主と
して試料の多数の物理的取扱いおよび極めて多数の洗浄
工程を含む。技術文献において認められかつ報告されて
いるように、これらの従来技術では本質的に、試料から
の白血球集団のある程度の限定された現象；試料中に残
っている白血球集団の全体形態の少くとも若干の変化；
白血球集団の表面におけるマーカーの少くとも若干の変
化；および問題とする細胞集団の表面における少くとも
若干の染料の移動が起る。

以後の分析のために全血試料から白血球を調製する際に
今日まで使用されている技術は伝統的に（１）全血試料
の制御された遠心分離によるバフィーコート（buffy co
at）画分の調製，その後の蛍光色素標識コンジュゲート
（conjugate）による染色；（２）溶解試薬および蛍光
色素標識コンジュゲートによる全血試料の同時処理；ま
たは（３）全血試料の制御された遠心分離後にフィコル
−パケ（Ficoll−Paque）密度勾配遠心分離によってバ
フィーコート試料の一層の濃縮（enrichment）を行うこ
とによるバフィーコート画分の調製を含む。このような
濃縮によって、濃縮された単核細胞を含む界面層を回収
することができ、その後にこれらの細胞を蛍光色素標識
コンジュゲートで染色する。

上述の調製方法はいずれも労働集約的であり、問題とす
る白血球を含む画分の物理的取扱いの繰り返しを必要と
し、時間のかかる方法である。来の遠心分離技術を使用
して濃縮白血球試料を得る場合には、細胞の損失が常に
起り、従って問題とする細胞集団の相対的濃度の正確な
測定は実際上不可能である。上述の方法の欠点は以前か
ら認められており、少くとも１種の別法が技術文献：
「アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロ
ジー」Vol.88:4（1987）第447〜456頁およびVol.86:5
（1986）第600〜607頁に記載されているカルドウェル
（Caldwell）の報文中に提案されている。しかし、カル
ドウェルのこれらの報文は彼が従来方法の主な欠点であ
ると信じているこの問題の一面のみに焦点を合わせてい
る。特に、カルドウェルは、染色後かつ分析前における
白血球試料の過度な洗浄によって分析結果の分析誤差が
入ることがあり、特にある種類の病気の患者について白
血球を観察する場合にそうであることを強調している。
カルドウェルは処理時間を短縮し、かつ最終分析前に白
血球試料の過度な取扱い処理に固有の分析誤差を小さく
するために「無洗浄（no wash）」技術の採用を示唆し
ている。カルドウェルの提案した「無洗浄」技術はフィ
コル−パケ密度勾配遠心分離による従来の濃縮リンパ球
画分調製技術を保持しており、この従来技術そのものが
フィコル−パケ試薬の除去に多段の洗浄工程を使用して
いる。次いで、濃縮リンパ球試料をモノクローナル抗体
とコンジュゲートさせた蛍光色素染料で染色する。カル
ドウェルの改善は、未結合コンジュゲートが試料中に残
っていてもよい場合に、バッククラウンドおよびヒスト
グラムの正のピークの両方における壮大した蛍光強さを
観察する点にある。カルドウェルは、このような増大し
た蛍光強さが観察されるのは染色後の洗浄工程を無くし
たためであるとしている。彼はこのような洗浄工程を無
くすことにより染色されたリンパ球画分における損傷が
少なくなり；従ってコンジュゲートと問題とする細胞集
団における表面マーカーとの間の免疫化学的結合を保存
することができると仮定している。カルドウェルの「無
洗浄」法を検討するとはっきりと分るように、混合、渦
の形成および遠心分離によって繰り返される外傷は若干
減少するにすぎない。

溶解試薬の使用による白血球試料の「濃縮」が、全血試
料を種々の画分に分割するのに使用される一層伝統的な
遠心分離／密度勾配技術の代りになる実行可能な方法で
あることは、今日まで分っていなかった。この限定理由
は、従来の溶解試薬が試料の白血球画分に外傷を与えず
に全血の赤血球画分の溶血を行うことができなかったか
らである。これらの溶解試薬は主に白血球画分において
形態上の大きな変化および小さな変化を生じさせ、この
ような細胞における表面マーカーにおいて変化を生じさ
せる。溶解試薬を使用してある程度の成功を収めた限ら
れた数の例では、追加の試薬を試料に添加して白血球を
溶解試薬による溶解から保護する必要があった：例えば
ブラウン（Brown）等の米国特許第4637986号参照。この
ブラウン特許の検討から分るように、溶解試薬と溶解試
薬による溶解から白血球を保護するのに使用される溶質
との両方を添加することによって、試料の生理学的環境
は著しく変性される。ブラウンの試薬および技術によっ
て調製した試料はフローサイトメトリーによって分析す
ることができ、この際３種主要な副集団（sub−populat
ion）の区別は従来の光散乱の測定によって達成され
る。試料の生理学的環境が変化するので、試料の白血球
における表面マーカーの保存性（integrity）および免
疫化学的応答も変化する。従って、白血球画分を分析す
る際に免疫化学的技術によって精製を行うことはできな
い。しかも、白血球画分が「経時」（新鮮でない）試料
または病気の患者の試料からのものである場合には、こ
のような苛酷な処理に対する白血球の感受性は著しく増
大し；従ってブラウンの試薬および技術の有用性が制限
される。

上述の説明から明らかなように、上述の操作によって白
血球画分に生ずることがある物理的および化学的な外傷
はおそらくこの画分内の多数の細胞に損傷を与えると思
われる。一層望ましくないことには、これらの操作は白
血球、例えば病気の状態の試料のリンパ球副集団に比較
的大きな損傷を与える。従って、このような病気の状態
の試料を従来の濃縮および染色技術によって分析および
モニターできる可能性は厳しく制限される。このような
分析を行おうとする場合には、従来の遠心分離および密
度勾配濃縮プロトコールが好ましく、それはこのような
プロトコールがリンパ球に損傷を与える程度が溶解試薬
の作用より若干小さいからである。

カルドウェルによって観察された彼の「無洗浄」法にお
ける精度および感度の向上は適切な方向へのステップを
意味するが、一層の改善が必要であるのは明らかで、特
に相対的な細胞集団の測定が患者の状態の正確な解析に
とって重要である場合にそうである。上述の説明は明ら
かなように、従来文献の技術のいずれも、カルドウェル
が報告している技術でも、この問題に対する完全な解決
を提供していない。それは実際にいずれの方法でも、溶
解試薬を使用する方法でさえ、１個または２個以上の白
血球副集団において統計的に有意な損失または損傷が生
じ、かつ全調製時間が１時間以上になるからである。こ
の損失は経時試料、本質的に内生栄養に全く欠けている
試料、および病気の状態の試料を取扱う場合には統計的
に一層有意であり、それは栄養を奪われた細胞および病
気の状態を示す細胞の溶解に対する感受性が物理的およ
び化学的な外傷によって相対的に一層高くなるからであ
る。

本発明の目的は、分析結果が試料中の問題とする細胞検
体の数と、適切な場合には試料の他の細胞に対するこの
ような検体の相対濃度との両方を正確に繁栄することを
保証するために試料の内味の細胞検体を維持（conserva
tion）する方法および系を提供することである。従っ
て、本発明は、実際上診断に関係のあるすべて試料成分
を確実に観察できるようにする試料の調製方法に関する
ものである。

本発明方法が従来技術より優れたこのような利点を提供
できるのは調製方法における維持できる性質に基づく。
ここに「維持できる（conservative）」とは、赤血球を
除く実際上すべての血液成分を以後の分析のために保存
できるこの方法の能力を意味するものとする。また、維
持された成分に関する試料の保全性は他の試料を測定す
る際に使用する標準を確立するための第１の真に信頼で
きる手段を提供する。本発明方法は経時全血試料の分
析、および病気の状態の患者からの血液試料に特に良好
に適用することができ、これらの試料では細胞の保全性
を維持するのが困難であり、従って正確な分析は従来不
可能であった。

全血の分析において、特に問題となる診断上関係のある
成分は非赤血球画分である。本発明は、試料調製方法と
伝統的に結びついている洗浄工程および多数の移動工程
を必要とせずに、非赤血球画分を効果的に単離し、しか
もこの画分を効果的に維持できる能力を提供することに
ある。

本発明の好適例においては、全血試料を容器内または室
内に入れる。好ましい室は試料分析用に選定した機器に
おいて使用するのと同じタイプの容器である。本発明の
試料調製方法は、試料と試薬との実際上すべての接触が
室内で行われ、試料とこのような試薬との緊密な相互作
用が適当な間隔、頻度で適当な期間室の内容物に非対称
な渦を形成することにより保証される点において標準と
は異なる。本発明においては、試薬の添加、反応雰囲気
および試料に作用する物理的な力を正確に制御すること
により、診断上重要な非赤血球血液成分のいずれをも洗
浄することなしに、すなわち統計的に有意な損失を生ず
ることなしに、全血試料を、また経時試料または病気の
状態の試料さえも製造することができる。

特に、本発明の方法および系は、混合の動力学と試薬と
が全血試料の非赤血球画分をその本質的な自然な生理的
状態に維持しながら全血試料の赤血球画分の迅速で本質
的に完全な溶血を達成することができる維持できる方法
および系を提供する。従って、本発明の方法および系
は、赤血球の溶血前または溶血と同時に行う白血球画分
の１種または２種以上の副集団の選択的染色と両立す
る。このような染色の次に、問題とする細胞集団の同定
および定量化のために、半自動化または自動化技術、例
えばフローサイトメトリーにより試料を分析することが
できる。試料の白血球画分を濃縮および染色するこの方
法は、約60秒またはこれ未満以内に行うことができ、試
料内における白血球の種々の副集団を密集を改善し、試
料における保全性および試料中に存在する全白血球数を
維持することができる。

本発明は、全血試料の非赤血球細胞画分の濃縮、および
該画分の細胞と該画分の副集団の特徴ある細胞成分にと
って特異的なインディケータ標識結合物質（indicator
labelled binding material）との免疫化学的相互作用
による前記画分の１個または２個以上の副集団の標識付
けを行って、ホトオプチカル測定技術による分析のため
の全血試料を調製する方法を提供し、この方法は微粒状
検体を定量化しかつ／または前記試料にとって内生的な
他の微粒子から前記検体を区別するのに適したホトオプ
チカル機器において試料容器として使用されるタイプの
反応容器を使用し、前記試料を溶解試薬により選択適間
質溶解条件下に置いて前記試料の非赤血球画分を赤血球
画分から効果的に区別できるようにすることにより前記
反応容器内で分析溶試料を調製し；この選択的に間質溶
解された試料のアリコートをホトオプチカル分析装置に
移送し；次いで前記アリコートにホトオプチカル分析を
適用することを特徴とする。

次に本発明を図面を参照して例について説明する。

第１〜６図において第1A〜6A図は散布図であり、第1B〜
第6B図および第1C〜6C図はヒストグラムであり、それぞ
れ例１〜６を示す。

本発明の好適例の一つにおいては、最初に全血試料と染
料とを混合室内で組み合わせる。クールター・コーポレ
ーションから入手できるエピクス （EPICS）ブランド
のフローサイトメータと一緒に使用するのが普通である
タイプの12×75mm試験管が一般的にこの目的に適当であ
る。次いで、試験管およびその内容物を適当な混合装
置、例えばクールターから入手できるキュー−プレプ^TM
（Ｑ−PREP^TM）ミキサでかきまぜることができる。こ
の、ミキサは試験感の流体内容物の制御された混合を行
うことができ、予めプログラムされた適当な間隔で追加
試薬を自動的に供給することができる。最初に、室内で
免疫学的染料を全血試料と接触させ、緩やかな非対称的
渦混合を行うことができる。60秒未満が普通である適当
な保温期間の後に、区別するのに有効な量の新規な溶解
試薬を室内の試料と接触させ、しかる後に適当な抑制剤
（quench）を導入することによりその溶解活性を著しく
遅延させる。染色、赤血球溶解および溶解試薬の活性抑
制というこの全プロセスは、細胞タイプを互に物理的に
単離することなしに、試料の細胞を一つの容器から他の
容器に移すことなしに、また試料の分析または測定の前
に未反応染料および未消費試薬の少くとも一方を室から
除去する必要なしに行うことができる。この染色された
白血球画分はこの目的に適した機器、例えばクールター
・エピクス・モデルＣまたはプロファイル（RROFIL
E）フローサイトメータでさらに分析することができ
る。このような機器で試料を分析することにより、問題
とする染色された白血球画分のはっきりとした密集が認
められるヒストグラムを得ることができる。

本発明の方法および系は次のいくつかの重要な点におい
て独特である：（ａ）全血試料の非赤血球画分を逐次ま
たは同時に迅速に染色および濃縮することができる；
（ｂ）最初に試料中に存在していた白血球の形態および
全数が維持される；（ｃ）染料と問題とする細胞の特徴
のある細胞成分との間の免疫化学的相互作用が保存（pr
eseration）される；（ｄ）分析前24時間までの間、問
題とする副集団の特徴ある大きさおよび／または形状に
重大な変化を起すことなく、染色され濃縮された試料が
保存される；（ｅ）染色シーケンス（sequence）におい
て使用される試薬と溶解シーケンスおよび抑制シーケン
スの両方で使用される試薬とが融和性であってこのよう
な処理工程のいずれの間においても洗浄の必要がない。

本発明の詳細な説明に入る前に、ここで使用するいくつ
かの用語を最初に定義しておくのが有用である。

「染色」および「染色する」という用語は、問題とする
特定の細胞集団を、分析を受ける試料中に存在するのが
普通である他の細胞から区別できるように前記特定の細
胞集団を識別する方法をいう。

「維持できる（conservative）」という用語は、試料中
に最初に存在していた白血球の全数のほかにその全形態
および免疫化学的反応性を保存する本発明方法の条件お
よび操作工程の両方を意味するものとする。このような
維持は白血球集団を予め固定することなしに達成される
が、このような維持処置に次いで固定することができ
る。

「転頭状（nutative）」および「転頭運動」という用語
は、試料および種々の試薬（染料、溶解試薬、抑制剤お
よび固定剤−使用する場合には）が穏やかなかきまぜ状
態に維持されている反応容器の非対称または偏心混合作
用をいう。反応容器のこのタイプの運動は反応容器の流
体内容物を反応容器内で非対称的に分布させ、反応容器
の一方の側で、他方の側より高い高さまで上昇させる。
この非対称のために容器内に形成する渦は従来のような
挙動を示さない。

「濃縮（enrichment）」という用語は、従来技術に関連
しては、白血球集団であるバフィーコートを全血試料の
他の成分から物理的に分離することをいう。しかし、本
発明に関連しては、「濃縮」は試料の赤血球画分を溶解
した際に白血球集団の同定の容易さを相対的に増大する
ことをいう。試料の赤血球画分の溶血および白血球画分
の僅かな変性の両方を行ってこれらの画分のその後の単
離、確認および／または分析を容易にするために使用さ
れる化学薬品の全体をまとめて「溶解試薬系」と呼ぶ。
本発明に関連しては、このような系は溶解試薬および相
手（companion）抑制剤を含み、該抑制剤は溶解試薬の
溶解活性を実質的に遅延させかつ試料のイオン平衡を回
復させるように配合する。

「区別するのに有効な量」という用語は、本明細書を通
じて、試料の赤血球画分の溶血に有効であるほか、白血
球画分を僅かに変化させてこれらの画分のその後の分
離、同定および／または分析を容易にする溶解試薬の濃
度を意味する。

間質溶解という用語は、赤血球の間質を破壊することを
意味する。

関連する従来技術を説明する際に先に記載したように、
白血球画分を染色する好ましい技術は、インディケータ
である抗体コンジュゲートと問題とする細胞画分の特徴
ある表面マーカーとの免疫化学的相互作用を含む。問題
とする特異的表面マーカーに対する前記コンジュゲート
の相対的な結合活性は、細胞表面におけるエピトープ部
位の正確な位置およびコンフォーメーションによって変
化することがある。問題とする細胞集団またはその細胞
数が病気の状態を示している場合には、これらの細胞は
一層脆くなる傾向があり、従ってこれらの細胞と染料と
の相互作用は物理的外傷および試料雰囲気における化学
的不均衡に対する感応性が一層大きくなる。従って、抑
制剤の添加による短縮された普通10秒未満である溶解試
薬との接触時間およびこれに続く白血球画分のイオン平
衡の回復は、問題とする細胞の全数および特性の両方を
維持する作用をし、従ってこれに続く免疫化学的技術に
よる同定を容易にする。代表的な場合には試料の濃縮染
色時とその後の分析との間には中断があるので、試料を
固定剤と接触させて問題とする白血球画分の物理的な大
きさおよび形状の両方を保存するのが好ましい。このよ
うな固定はこれより前の濃縮および染色の操作と融和性
であり、さらに問題とする細胞集団の相対的で濃度を測
定し決定するために選定した分析手段と融和性であるこ
とが必要である。好適な分析法がフローサイトメトリー
である場合には、選定した固定剤はコンジュゲート染料
の蛍光色素標識の励起エネルギーの波長において、ある
いは蛍光色素の発光波長において自然発光あるいは自動
的な発光を示してはならない。本発明に使用するのに好
適な固定剤はパラホルムアルデヒドである。

本発明方法を実施するに当っては、凝固防止剤、EDTAま
たはヘパリンを入れた管内に標準静脈穿刺技術によって
末梢血液を無菌状態で採取する。この試料を主として好
適な分析用測定装置と一緒に使用されるタイプの混合室
に移す。本発明方法を実施するための半自動化装置にお
いては、次いで試料を適当量の色素、溶解試薬および固
定剤と接触させる。これらの種々の試料物質との接触期
間中に試料を穏やかなかきまぜ状態に維持する。本発明
の好適例の一つでは、溶解試薬系および固定剤の添加前
に染料を全血試料と組み合わせる。溶解試薬の活性は試
料を溶解試薬と最初に接触させてから約10秒後に抑制剤
を添加することにより著しく遅延させる。全プロセスを
約90秒以内に完結させると共に染色を継続することがで
きる。任意の固定剤の染色サイクルの終結時および抑制
剤の添加後に添加するのが好ましい。本発明の他の例で
は、問題とする白血球画分の濃縮を試料の染色に先立っ
て行うことができる。本発明のこの例では、単に染料を
全血試料に添加し、問題とする細胞画分と相互作用させ
る。このような相互作用は、溶解試薬、抑制剤および任
意の固定剤の添加後に、穏やかなかきまぜ下に約15〜60
秒間起る。

本発明の方法および系に使用するのに適当な好ましい溶
解試薬は、＞3.0のpK値、約2.6〜4.0の範囲のpHおよび
処理試料のイオン強さを著しく変えない反対イオンを有
する水溶性有機カルボン酸である溶解試薬を区別するの
に有効な量を含有する水溶液である。最も好ましい溶解
試薬は、ギ酸、酢酸およびこれらの混合物からなる群か
ら選定することができる。本発明の好適例においては、
これらの溶解試薬混合物は主要な作用成分としてギ酸を
含有し、酢酸は含有するとしても少量成分として存在し
ているにすぎない。

本発明の方法および糸に使用する溶解試薬は、驚くべき
ことには低濃度好ましくは1.0容量％未満の溶解試薬を
含有する水溶液である。この水溶液は単に溶解試薬を脱
イオン水に添加することにより生成する。この希釈剤に
対する溶解試薬の添加量は約0.05〜約0.5％（V/V）の溶
解試薬を含有する溶液を生成するのに十分な量とする。
本発明の好適例においては、溶解試薬濃度は約0.1〜約
0.25％（V/V）の範囲である。

溶解試薬がギ酸および酢酸の両方を含有する混合物であ
る場合には、酢酸は限定量のギ酸の部分置き換えとして
のみ存在させるのが好ましく、この最約0.05〜0.10％
（V/V）の範囲の濃度でのみ存在させるのが好ましい。

また溶解試薬系は他の従来の添加剤を、これらの添加剤
の存在が溶解試薬系の主な作用成分、例えば、オマジン
ナトリウム（sodium omadine）のような抗菌防腐剤と非
融和性でない範囲まで含有することができる。

溶解試薬は簡単な手による添加あるいは自動化された添
加によって全血試料と組み合わせ、短時間の間室内で相
互作用させることができ、次いで適当な抑制剤の添加に
よって溶解試薬の作用を著しく遅延させることができ
る。この雰囲気中で有効である抑制剤は、血液試料およ
び溶解試薬を含有する水性混合物に添加した際に直ちに
溶解試薬の溶解活性を遅延させることができる必要があ
る。抑制剤の正確な配合は溶解試薬の組成および分析用
測定機器の要件によって指定されることのある他の流体
によって変動することがある。抑制剤は主として溶解試
薬の溶解活性を著しく遅延させかつ／または実質的に中
和するのに有効であり、試料にイオン平衡を回復させる
のに有効である可溶性塩を含有する水溶液である。この
イオン平衡の回復は生き残っている細胞の寿命を延ば
し、例えば“クールター・ブイシーエス（VCS）・フロ
ーサイトメータを使用する場合のように、試料が導電性
であり、電解質を含有していることを必要とする装置に
おいて後で分析することを可能にする。

溶解試薬組成物と一緒に使用するのに適当な抑制剤は、
次の４種の成分：塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、重
炭酸ナトリウムおよび炭酸ナトリウムのうちの少くとも
２種の組合せおよびさらに防腐剤としてアジ化ナトリウ
ムを含有することができ、また含有するのが普通であ
る。本発明の方法および系に関連して、溶解試薬に対す
る抑制剤の効果は、酸性溶解試薬の溶解活性を急激に低
下させることができる能力によって決まる。

また、白血球副集団を区別するのに使用する方法および
装置は、抑制剤の正確な配合に対して導電性、pHなどの
いくつかの要件を課することがある。時にクールター・
ブイシーエスのようなフォーカスド・フロー・アパーチ
ュア（focused flow aperture）分析システムでこのよ
うな区別を行う場合には、抑制剤の組成および容積が５
個の白血球サブクラスを互に最適に分離（区別）するの
に重要である。このタイプの分析系では、抑制剤のイオ
ン平衡を調整してさや流体に対する溶解血液試料の満足
できる導電性の合致を達成する必要がある。好ましい抑
制剤の配合においては、溶解され抑制された血液試料中
の主要なイオン種（ionic species）およびこれらの相
対比はさや状流体中の主要なイオン種およびこれらの相
対比と本質的に同である。試料の成分、例えばフィブリ
ンおよび血小板はpH感応性で、酸性条件下に凝集物を生
成することがあり、生成した凝集物は示差分析を潜在的
に妨害するかあるいはフォーカスド・フロー・アパーチ
ュア・システムの開口を物理的に閉塞することがある。
pH調整に関するこれらの考察は他の分析測定雰囲気にお
いても重要であることがある。

本発明の溶解試薬系と一緒に使用される抑制剤の作用成
分の相対的濃度は塩化ナトリウム約１〜約３％（W/
V）、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム約0.25〜
約0.8％（W/V）、および硫酸ナトリウム約２〜約４％
（W/V）の範囲である。最適抑制剤の成分の相対的量は
経験的に決めるのが普通である。このような調整の目的
は溶解血液試料のpHを約6.0〜約7.5の範囲内にし、安定
化溶解血液試料の最終オスモル濃度（osmolality）を約
300〜約330mOsの範囲内にすることである。フォーカス
ド・フロー・アパーチュア・システムでは、白血球サブ
クラスの最適な密集は最終血液試料のオスモル濃度を約
310mOsに調整することにより達成される。

本発明の好適例においては、溶解試薬と血液試料との有
効な接触の持続期間、すなわち両者を一緒にした時から
抑制剤を添加した時までの期間は10秒未満にする必要が
あり、最も好ましくは６秒あるいはこれ未満とする。上
述したような溶解試薬と血液試料との反応接触（reativ
e contact）の間隔は、このような反応接触が常温すな
わち18〜28℃で起ることを仮定している。

本発明の方法および系において使用する染料は、問題と
する細胞検体、例えばＢ−リンパ球およびＴ−リンパ球
の細胞表面におけるエピトープとの結合に対して特異的
である蛋白質コンジュゲートを形成するインディケータ
である。白血球表面マーカーに特異的な抗体はいくつか
の商業的供給源から入手することができる。本発明の好
適例では、モノクローナル抗体が好適な試薬である。Ｔ
細胞およびＢ細胞における表面マーカーに特異的である
モノクローナル抗体は商業的に容易に得ることができ、
また適当な蛍光色素にコンジュゲートさせることができ
る。

例１〜５に示す１連の分析は、問題とする特定のリンパ
球集団（Ｂ細胞およびＴ細胞）の濃縮および染色に使用
される従来技術と比較することにより本発明の方法およ
び試薬系を評価する際に行った。それぞれの例におい
て、全血試料は問題とする特定の細胞副集団の測定方法
および測定装置と同じく互に共通した。白血球画分の分
離・濃縮技術はこの目的に適した試薬系のそれぞれに対
して確立されているプロトコールに従って実施した。例
６に本発明の方法および試薬系を示す。これらの例をそ
れぞれにおいて、濃縮試料の分析はコールター・エピク
ス・モデルＣ・フローサイトメータで行い、この機器に
対する標準操作プロトコールに従って行った。それぞれ
の分析結果は一連の散布図第1A〜6A図、およびヒストグ
ラム第1B〜6B図および第1C図〜6C図に示した。第１〜５
図は従来技術に関するもので、第６図は本発明の方法お
よび試薬系に関するものである。

例１ この例に使用する試料を調製する際に使用した分離を行
うための材料および方法では、Ｂ細胞およびＴ細胞に特
異的である蛍光色素標識抗体によって染色した後に試料
の洗浄を行う従来の溶解技術による白血球画分の分離・
濃縮を行った〔オルソ・ジアグノスチック・システム
（Ortho Diagnostic System,オルソ・スペクトラム（Or
tho SPECTRUM）IIIレーザー・フロー（Laser Flow）サ
イトメトリー・システム。シトフルオログラフ^TM（CYTO
FLUOROGRAF）〕。試料を調製した後に、Ｂ細胞およびＴ
細胞の相対的濃度をエピクス・モデルＣ・フローサイト
メトリーで求めた。第1A図は健康な提供者からの全血試
料の白血球副集団の散布図である。第1B図はＢ細胞と非
Ｂ細胞との間の相対的なＢ細胞濃度が12.20％であるた
とを示すヒストグラムである。第1C図はＴ細胞と非Ｔ細
胞との間の相対的なＴ細胞濃度が83.30％であることを
示す。

例２ 試料の調製に際しては、クールター・コーポレーション
・イムノロジー・ディビジョンによってイムノライズ
（Immunolyse）という商品名で市販されている試薬系に
ついて説明されている操作に従って、洗剤によって白血
球を溶解した。試料の分析は第１図の試料の場合と同様
にして行った。第2A図は第1A図の散布図について述べた
のと同じ健康な提供者からの全血試料の白血球副集団の
散布図である。第2B図は試料中のＢ細胞の相対的濃度が
15.40％であることを示す。第2C図は試料中のＴ細胞の
相対的濃度が75.59％であることを示す。報告されたＢ
細胞およびＴ細胞の相対的濃度と、第１図に準じて行っ
た分析についての報告された値とを比較した場合の結果
の変動に注目されたい。

例３ 試料の調製に際しては、ベクトン−ディキンソンBeckto
n−Dickinson）によってエフエーシーエス（FACS）とい
う商品名で市販されている試薬系について説明されてい
る操作に従って、ジエチレングリコールによって白血球
を溶解した。第3A図は第1Aおよび2A図の場合と同じ健康
な提供者からの全血試料の白血球副集団の散布図であ
る。第3B図は試料中のＢ細胞の相対的濃度が19.04％で
あることを示すヒストグラムである。第3C図は試料中の
Ｔ細胞の相対的濃度が69.17％であることを示すヒスト
グラムである。得られた結果と第１および２図の結果と
の間には相関関係がないことに注目されたい。しかも、
Ｔ細胞に対するＢ細胞の相対的濃度は著しく移動してお
り、試料の調製、ジエチレングリコールによるRBCの溶
解がＴ細胞に対して不当に苛酷なものであることを示
す。

例４ 試薬の調製に際しては、主としてリンパ球副集団と単球
副集団との密度勾配分離を行った。この操作は専門家に
高度に依存しかつ報告されているように実質的な細胞の
損失を招く蛍光があることが認められている。第4A図は
第1A,2Aおよび3A図の場合と同じ健康な提供者からの全
血試料の白血球副集団の散布図である。第4B図はこのよ
うな試料においてＢ細胞の相対的濃度が4.64％であるこ
とを示すヒストグラムである。第4C図はこのような試料
においてＴ細胞の相対的濃度が88.55％であるを示すヒ
ストグラムである。得られた結果と第1,2および３図の
結果との間には相関関係がないことに注目されたい。し
かも、Ｔ細胞に対するＢ細胞の相対的濃度は大幅に移動
しており、これはこの操作において繰り返された洗浄お
よび物理的取扱いがＴ細胞に対するよりＢ細胞に対して
外傷を一層与え易いことを示す。

例５ 例４の操作を繰り返した。ただし、未反応染料が室内に
残留できるようにし、分析はカルドウェル等の「無洗
浄」法によって定められているように行った。散布図で
ある第5A図は区別できる白血球副集団を示す。第5B図は
Ｂ細胞の相対的濃度が8.14％であることを示すヒストグ
ラムである。第5B図はＴ細胞の相対的濃度が87.75％で
あることを示すヒストグラムである。Ｂ細胞集団の相対
的濃度が増大していること、従って試料は染色の次の洗
浄工程を無くす利点に関するカルドウェル等の観察が確
認されることに注目されたい。

例６ 試料の調製に際しては、試料の染色、溶解、抑制、およ
び固定を迅速に（90秒未満での経過時間）行った。また
試料の調製に際しては、例１〜５の場合と同じ提供者か
らの全血試料を使用して、定められた順序で次の試薬を
自動計量し、混合した： I.材料 1.溶解剤：ギ酸ナトリウム 1.2ml オマジンナトリウム（40％） 0.2ml 脱イオン水 998.6ml 2.抑制剤：硫酸ナトリウム 31.30g 塩化ナトリウム 14.50g 炭酸ナトリウム 6.00g 脱イオン水 １ 3.固定剤：トリス（HCL）緩衝剤 6.05g パラホルムアルデヒド 10.00g 水酸化ナトリウム（50％） 00.50ml 脱イオン水 １ 4.染料 ：デクトン・ディキンソン免疫細胞化学系 G1−FITC HLE−FITC クールター・イムノロジー・ディビジョン MIG−FITC TY−RD1 MIG−RD1 T1−FITC T8−FITC B1−FITC 染料、溶解試薬系および固定剤の予定された添加の際に
は、クールターＱ−プレプ（PREP）装置を使用し、25×
75mm試験管を穏やかにかきまぜながらこれらの試薬のそ
れぞれを所定量適当な時に供給し、次のサイクルで操作
した： （ａ）試料への蛍光色素標識抗体の添加 （ｂ）60秒間にわたる試料および染料の穏やかなかきま
ぜ （ｃ）試料および染料への溶解試薬の添加 （ｄ）６秒間のかきまぜ （ｅ）抑制剤の添加 （ｆ）10秒間のかきまぜ （ｇ）固定剤の添加 （ｈ）フローサイトメータ中への試験管の設置およびＢ
細胞およびＴ細胞の相対的集団についての分析 第6A図は第1A,2A,3Aおよび5A図の場合と同じ健康な提供
者からの全血試料の白血球副集団の散布図である。第6B
図はこのような試料におけるＢ細胞の相対的濃度が19.7
9％であることを示すヒストグラムである。第6C図はこ
のような試料におけるＴ細胞の相対的濃度が76.97％で
あることを示すヒストグラムである。Ｂ細胞の相対的濃
度が大きいこと、これは本発明の方法および試薬系が問
題とする関連する副集団の同定に有効であり、この技術
は専門家の関与を最小限にし、洗浄工程を全く行わなく
ても効果的であることを示すことに注目されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ポール・ロナルド・ディー アメリカ合衆国フロリダ州 33184 ノー ス マイアミ ビーチ エヌイー ワンハ ンドレッドナインティフォース ストリー ト 2355 (72)発明者 フィッシャー・ティモシー・ジェイ アメリカ合衆国フロリダ州 33324 プラ ンテーション エスダブリュー エイティ セカンド テラス 1380 (56)参考文献 特開 昭60−61659（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−16872（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−8664（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−112067（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−195358（ＪＰ，Ａ) 実開 昭61−42469（ＪＰ，Ｕ) 特表 昭60−500921（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−502280（ＪＰ，Ａ)

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】全血試料の非赤血球細胞画分の濃縮、およ
   び該画分の細胞と該画分の副集団の特徴ある細胞成分に
   とって特異的なインディケータ標識結合物質との免疫化
   学的相互作用による前記画分の１個または２個以上の副
   集団の標識付けを行って、ホトオプチカル測定技術によ
   る分析のための全血試料を調製するに当り、 （ａ） 微粒状検体を定量化しかつ／または前記試料に
   とって内生的な他の微粒子から前記検体を区別するのに
   適したホトオプチカル機器において試料容器として使用
   されるタイプの反応容器を使用し； （ｂ） 前記試料を酸性溶解試薬により選択的間質溶解
   条件下に置いて前記試料の非赤血球画分を赤血球画分か
   ら効果的に区別できるようにすることにより前記反応容
   器内で分析用試料を調製し； （ｃ） この選択的に間質溶解された試料のアリコート
   をホトオプチカル分析装置に移送し；次いで （ｄ） 前記アリコートにホトオプチカル分析を適用す
   る ことを特徴とする全血試料の調製方法。
2. 【請求項２】前記移送工程を、未消費の溶解試薬または
   未結合のインディケータ標識結合物質から前記標識副集
   団を予め分離することなく達成する請求項１記載の方
   法。
3. 【請求項３】前記移送工程を、溶解試薬およびエンディ
   ケータ標識結合物質の相互および全血試料に対する相対
   的濃度が、前記試料内に遊離の状態で残っている未反応
   および／または未消費の溶解試薬系およびインディケー
   タ標識結合物質の少なくとも一方および試料の他の成分
   から、問題とする画分の標識副集団を予め分離すること
   なく、問題とする画分の標識副集団を他の試料成分から
   効果的に区別することを可能にするように行う請求項１
   記載の方法。
4. 【請求項４】試料調製の際に、前記全血試料の赤血球画
   分を有効量の酸性溶解試薬によって間質溶解し、前記溶
   解試薬の溶解活性を停止しかつ前記試料のイオン平衡を
   回復させるのに有効な相手試薬で前記溶解試薬の活性を
   抑制する追加の工程を行う請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】試料調製の際に、前記全血試料と前記溶解
   試薬とを接触させると共に穏やかな非対称的渦混合を行
   って、前記試料の微粒子を前記試料の全体にわたって本
   質的に均一な濃度に維持する請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】前記試料調製の所要時間は90秒未満である
   請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】染色後に前記全血試料を固定剤と接触させ
   る請求項５記載の方法。
8. 【請求項８】前記全血試料は、該試料の内生栄養が本質
   的に完全に消費されて細胞が脆くなっている経時全血検
   体を含んでいる請求項５記載の方法。
9. 【請求項９】前記全血試料は、リンパ球形状、および／
   または全細胞リンパ球集団、および／または相対的細胞
   リンパ球集団に変化が生じる疾病にかかっている疑いの
   ある患者からの全血検体を含んでいる請求項５記載の方
   法。
10. 【請求項１０】前記溶解試薬は3.0より大きいpKを有す
    る有機カルボン酸を間質溶解有効量含有している請求項
    １〜４のいずれか一つの項に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記溶解試薬は約2.6〜約4.0の範囲のpH
    を有する請求項１〜４のいずれか一つの項に記載の方
    法。
12. 【請求項１２】前記溶解試薬は約2.6〜約4.0の範囲のpH
    を有する間質溶解有効量の有機カルボン酸を含有する請
    求項１〜４のいずれか一つの項に記載の方法。
13. 【請求項１３】前記溶解試薬はギ酸、酢酸およびこれら
    の混合物からなる群から選定した有機酸である請求項１
    〜４のいずれか一つの項に記載の方法。
14. 【請求項１４】前記間質溶解を約10秒で達成する請求項
    ４記載の方法。
15. 【請求項１５】前記間質溶解の前に、前記標識付けを約
    15〜60秒で行う請求項３記載の方法。
16. 【請求項１６】前記試料調製工程の前に、前記全血試料
    をインディケータ標識結合物質と接触させる請求項４記
    載の方法。
17. 【請求項１７】前記試料調製工程と同時に、前記全血試
    料をインディケータ標識結合物質と接触させる請求項４
    記載の方法。
18. 【請求項１８】前記試料調製工程の後で、前記全血試料
    をインディケータ標識結合物質と接触させる請求項４記
    載の方法。