JPH02502487A - 保存全血試料の調製方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 保存全血試料の調製方法 本発明は方法に関するものである。特に、本発明はホトオプチカル（ｐｈｏｔｏ ｏｐｔ　ｉｃａ　１）手段による分析のための微粒状検体、特に細胞、細胞小器 官などを迅速に調製する独特な方法に関するものである。この方法は小さい濃度 で存在しかつ／または他の細胞集団に対する相対的割合の変化が診断上重要であ る細胞検体を分析するために特に適切である。

この方法はフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）による分析 のための全血試料を迅速に調製するのに特に適切である。

全血の白血球画分を単離および染色する従来技術は主として試料の多数の物理的 取扱いおよび極めて多数の洗浄工程を含む。技術文献において認められかつ報告 されているように、これらの従来技術では本質的に、試料からの白血球集団のあ る程度の限定された減少；試料中に残っている白血球集団の全体形態の少くとも 若干の変化；白血球集団の表面にあけるマーカーの少くとも若干の変化；および 問題とする細胞集団の表面における少くとも若干の染料の移動が起る。

以後の分析のために全血試料から白血球を調製する際に今日まで使用されている 技術は伝統的に（１）全血試料の制御された遠心分離によるパフィーコー）　（ ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ）画分の調製、その後の蛍光色素標識コンジニゲー）　（ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）による染色；（２）溶解試薬および蛍光色素標識コンジュ ゲートによる全血試料の同時処理；または（３）全血試料の制御された遠心分離 後にフィコルーバケ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離によってバ フィーコート試料の一層の濃縮（ｅｎｒｉ−ｃｈｍｅｎｔ）を行うことによるバ フィーコート画分の調製を含む。このような濃縮によって、濃縮された単核細胞 を含む界面層を回収することができ、その後にこれらの細胞を蛍光色素標識コン ジユゲートで染色する。

上述の調製方法はいずれも労働集約的であり、問題とする白血球を含む両分の物 理的取扱いの繰り返しを必要とし、時間のかかる方法である。従来の遠心分離技 術を使用して濃縮白血球試料を得る場合には、細胞の損失が常に起り、従って問 題とする細胞集団の相対的濃度の正確な測定は実際上不可能である。上述の方法 の欠点は以前から認められており、少くとも１種の別法が技術文献＝「アメリカ ン・ジャーナル・オブ・クリニカル・バソロジーＪ　Ｖｏｌ、８８：４（１９８ ７）第４４７〜４５６頁およびＶｏｌ、８６：５（１９８６）第６００〜６０７ 頁に記載されているカルドウエル（Ｃａｌｄｗｅｌｌ）の報文中に提案されてい る。しかし、カルドウエルのこれらの報文は彼が従来方法の主な欠点であると信 じているこの問題の一面のみに焦点を合わせている。特に、カルドウエルは、染 色後かつ分析前における白血球試料の過度な洗浄によって分析結果に分析誤差が 入ることがあり、特にある種類の病気の患者について白血球を観察する場合にそ うであることを強調している。カルドウエルは処理時間を短縮し、かつ最終分析 前に白血球試料の過度な取扱い処理に固有の分析誤差を小さくするために「無洗 浄（ｎｏ　ｗａｓｈ）　Ｊ技術の採用を示唆している。カルドウエルの提案した 「無洗浄」技術はフィコルーバケ密度勾配遠心分離による従来の濃縮リンパ球画 分調製技術を保持しており、この従来技術そのものがフィコルーパケ試薬の除去 に多段の洗浄工程を使用している。次いで、濃縮リンパ球試料をモノクロナール 抗体とコンジュゲートさせた蛍光色素染料で染色する。カルドウエルの改善は、 未結合コンジュゲートが試料中に残っていてモヨい場合に、バッククラランドお よびヒストグラムの正のピークの両方における増大した蛍光強さを観察する点に ある。カルドウエルは、このような増大した蛍光強さが観察されるのは染色後の 洗浄工程を無くしたためであるとしている。彼はこのような洗浄工程を無くすこ とにより染色されたリンパ球画分における損傷が少くなり；従ってコンジュゲー トと問題とする細胞集団における表面マーカーとの間の免疫化学的結合を保存す ることができると仮定している。カルドウエルの「無洗浄」法を検討するとはっ きりと分るように、混合、渦の形成および遠心分離によって繰り返される外傷は 若干減少するにすぎない。

溶解試薬の使用による白血球試料のｒｌ縮」が、全血試料を種々の両分に分割す るのに使用される一層伝統的な遠心分離／密度勾配技術の代りになる実行可能な 方法であることは、今日まで分っていなかった。この限定理由は、従来の溶解試 薬が試料の白血球画分に外傷を与えずに全血の赤血球画分の溶血を行うことがで きなかったからである。

これらの溶解試薬は主に白血球画分において形態上の太きな変化および小さな変 化を生じさせ、このような細胞における表面マーカーにおいて変化を生じさせる 。溶解試薬を使用しである程度の成功を収めた限られた数の例では、追加の試薬 を試料に添加して白血球を溶解試薬による溶解から保護する必要があった：例え ばブラウン（Ｂｒｏｗｎ）等の米国特許第４６３７９８６号参照。このブラウン 特許の検討から分るように、溶解試薬と溶解試薬による溶解から白血球を保護す るのに使用される溶質との両方を添加することによって、試料の生理学的環境は 著しく変性される。ブラウンの試薬および技術によって調製した試料はフローサ イトメトリーによって分析することができ、この際３種主要な副集団（ｓｕｂ− ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の区別は従来の光散乱の測定によって達成される。試料 の生理学的環境が変化するので、試料の白血球における表面マーカーの保全性（ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）および免疫化学的応答も変化する。従って、白血球画分を 分析する際に免疫化学的技術によって精製を行うことはできない。

しかも、白血球画分が「経時」　（新鮮でない）試料または病気の患者の試料か らのものである場合には、このような苛酷な処理に対する白血球の感受性は著し く増大し；従ってブラウンの試薬および技術の有用性が制限される。

上述の説明から明らかなように、上述の操作によって白血球画分に生ずることが ある物理的および化学的な外傷はおそらくこの画分内の多数の細胞に損傷を与え ると思われる。一層望ましくないことには、これらの操作は白血球、例えば病気 の状態の試料のリンパ原則集団に比較的大きな損傷を与える。従って、このよう な病気の状態の試料を従来の濃縮および染色技術によって分析およびモニターで きる可能性は厳しく制限される。このような分析を行おうとする場合には、従来 の遠心分離および密度勾配濃縮プロトコールが好ましく、それはこのようなプロ トコールがリンパ球に損傷を与える程度が溶解試薬の作用より若干小さいからで ある。

カルドウエルによって観察された彼の「無洗浄」法における精度および感度の向 上は適切な方向へのステップを意味するが、一層の改善が必要であるのは明らか で、特に相対的な細胞集団の測定が患者の状態の正確な解析にとって重要である 場合にそうである。上述の説明から明らかなように、従来文献の技術のいずれも 、カルドウエルが報告している技術でも、この問題に対する完全な解決を提供し ていない。それは実際にいずれの方法でも、溶解試薬を使用する方法でさえ、１ 個または２個以上の白血球側集団において統計的に有意な損失または損傷が生じ 、かつ全調製時間が１時間以上になるからである。この損失は経時試料、本質的 に内生栄養に全く欠けている試料、および病気の状態の試料を取扱う場合には統 計的に一層存意であり、それは栄養を奪われた細胞および病気の状態を示す細胞 の溶解に対する感受性が物理的および化学的な外傷によって相対的に一層高くな るからである。

本発明の目的は、分析結果が試料中の問題とする細胞検体の数と、適切な場合に は試料の他の細胞に対するこのような検体の相対濃度との両方を正確に反映する ことを保証するために試料の白味の細胞検体を維持（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ）する方法および系を提供することにある。従って、本発明は、実際上診断に関 係のあるすべて試料成分を確実に観察できるようにする試料の調製方法に関する ものである。

本発明方法が従来技術より優れたこのような利点を提供できるのは調製方法にお ける維持できる性質に基づく。ここに「維持できる（ｃｏｎｓｅｒｖａｔ　１ｖ ｅ）　Ｊとは、赤血球を除く実際上すべての血液成分を以後の分析のために保存 できるこの方法の能力を意味するものとする。また、維持された成分に関する試 料の保全性は他の試料を測定する際に使用する標準を確立するための第１の真に 信頼できる手段を提供する。本発明方法は経時全血試料の分析、および病気の状 態の患者からの血液試料に特に良好に適用することができ、これらの試料では細 胞の保全性を維持するのが困難であり、従って正確な分析は従来不可能であった 。

全血の分析において、特に問題となる診断上関係のある成分は非赤血球画分であ る。本発明は、試料調製方法と伝統的に結び付いている洗浄工程および多数の移 動工程を必要とせずに、非赤血球画分を効果的に単離し、しかもこの画分を効果 的に維持できる能力を提供することにある。

本発明の好適例においては、全血試料を容器内または室内に入れる。好ましい室 は試料分析用に選定した機器において使用するのと同じタイプの容器である。本 発明の試料調製方法は、試料と試薬との実際上すべての接触が室内で行われ、試 料とこのような試薬との緊密な相互作用が適当な間隔、頻度で適当な期間室の内 容物に非対称な渦を形成することにより保証される点において標準とは異なる。

本発明においては、試薬の添加、反応雰囲気および試料に作用する物理的な力を 正確に制御することにより、診断上重要な非赤血球血液成分のいずれをも洗浄す ることなしに、すなわち統計的に有意な損失を生ずることなしに、全血試料を、 また経時試料または病気の状態の試料さえも製造することができる。

特に、本発明の方法および系は、混合の動力学と試薬とが全血試料の非赤血球画 分をその本質的な自然な生理的状態に維持しなから全血試料の赤血球画分の迅速 で本質的に完全な溶血を達成することができる維持できる方法および系を提供す る。従って、本発明の方法および系は、赤血球の溶血前または溶血と同時に行う 白血球画分の１種または２種以上の副集団の選択的染色と両立する。このような 染色の次に、問題とする細胞集団の同定および定量化のために、半自動化または 自動化技術、例えばフローサイトメトリーにより試料を分析することができる。

試料の白血球画分を濃縮および染色するこの方法は、約６０秒またはこれ未満以 内に行うことができ、試料内における白血球の種々の副集団の密集を改善し、試 料における保全性および試料中に存在する全白血球数を維持することができる。

本発明は、全血試料の非赤血球細胞画分の濃縮、および該両分の細胞と問題とす る副集団の特徴ある細胞成分にとって特異的なインディケータ４Ｉ識結合物質（ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｌａｂｅｌｌｅｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍａｔｅｒｉａｌ）と の免疫化学的相互作用による前記画分の１個または２個以上の副集団の標識付け を行って、ホトオプチカル測定技術による分析のための全血試料を調製する方法 を提供し、この方法は微粒状検体を定量化しかつ／または前記試料にとって内生 的な他の微粒子から前記検体を区別するのに適したホトオプチカル機器において 主として試料容器として使用されるタイプの普通の反応容器を使用し、前記試料 を溶解試薬により選択的間質溶解条件下に置いて前記試料の非赤血球画分を赤血 球画分から効果的に区別できるようにすることにより前記反応容器内で分析用試 料を調製し；前記選択的間質溶解工程の前、同時あるいは後に、前記副集団の少 くとも１個を結合物質で標識付けし；次いで未反応かつ／または未消費の試薬お よび結合物質の少くとも一方から前記標識側集団を予め分離することなく前記試 料のアリコートを保温（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）室からホトオプチカル分析装置 に移送することを特徴とする。

また、本発明は、全血試料の非赤血球細胞画分の濃縮、および該両分の細胞と問 題とする副集団の特徴ある細胞成分にとって特異的なインディケータ標ｍＭ合物 質との免疫化学的相互作用による前記画分の１個または２個以上の副集団の標識 付けを行って、ホトオプチカル測定技術による分析のための全血試料を調製する に当り、微粒状検体を定量化しかつ／または前記試料にとって内生的な他の微粒 子から前記検体を区別するのに適したホトオプチカル機器において主として試料 容器として使用ささるタイプの普通の反応容器を使用し；前記試料を酸性溶解試 薬により選択的間質溶解条件下に置いて前記試料の非赤血球画分を赤血球画分か ら効果的に区別できるようにすることにより前記反応容器内で分析用試料を調製 し；前記副集団の少くとも１個を結合物質で標識付けし：次いで前記試料のアリ コートを前記反応容器からホトオプチカル分析装置に移送することを特徴とする 。

次に本発明を図面を参照して例について説明する。

第１〜６図において第１Ａ〜６Ａ図は散布図であり、第１Ｂ〜６Ｂ図および第１ Ｃ〜６Ｃ図はヒストグラムであり、それぞれ例１〜６を示す。

本発明の好適例の一つにおいては、最初に全血試料と染料とを混合室内で組み合 わせる。クールター・コーポレーションから入手できるエビクス■（ＥＰＩＣＳ ）ブランドのフローサイトメータと一緒に使用するのが普通であるタイプの１２ Ｘ？５閤試験管が一般的にこの目的に適当である。次いで、試験管およびその内 容物を適当な混合装置、例えばクールターから入手できるキュー−プレグＴ”　 （Ｑ−ＰＲＥＰ”）　ミキサでかきまぜることができる。このミキサは試験管の 流体内容物の制御された混合を行うことができ、予めプログラムされた適当な間 隔で追加試薬を自動的に供給することができる。最初に、室内で免疫学的染料を 全血試料と接触させ、緩やかな非相対的渦混合を行うことができる。６０秒未満 が普通である適当な保温期間の後に、区別するのに有効な量の新規な溶解試薬を 室内の試料と接触させ、しかる後に適当な抑制剤（ｑｕｅｎｃｈ）を導入するこ とによりその溶解活性を著しく遅延させる。染色、赤血球溶解および溶解試薬の 活性抑制というこの全プロセスは、細胞タイプを互に物理的に単離することなし に、試料の細胞を一つの容器から他の容器に移すことなしに、また試料の分析ま たは測定の前に未反応染料および未消費試薬の少くとも一方を室から除去する必 要なしに行うことができる。この染色された白血球画分はこの目的に適した機器 、例えばクールター■・エピクス・モデルＣまたはプロファイル（ＰＲＯＦＩＬ Ｅ）フローサイトメータでさらに分析することができる。このような機器で試料 を分析することにより、問題とする染色された白血球画分のはっきりとした密集 が認められるヒストグラムを得ることができる。

本発明の方法および系は次のいくつかの重要な点において独特である：（ａ）全 血試料の非赤血球画分を逐次または同時に迅速に染色および濃縮することができ る；　（ｂ）最初に試料中に存在していた白血球の形態および全数が維持される ；（Ｃ）染料と問題とする細胞の特徴ある細胞成分との間の免疫化学的相互作用 が保存（ｐｒｅｓｅｒａｔ　１ｏｎ）される；（ｄ）分析前２４時間までの間、 問題とする副集団の特徴ある大きさおよび／または形状に重大な変化を起すこと なく、染色され濃縮された試料が保存される；（ｅ）染色シーケンス（ｓｅｑｕ ｅｎｃｅ）において使用される試薬と溶解シーケンスおよび抑制シーケンスの両 方で使用される試薬とが融和性であってこのような処理工程のいずれの間におい ても洗浄の必要がない。

本発明の詳細な説明に入る前に、ここで使用するいくつかの用語を最初に定義し ておくのが有用である。

「染色」および「染色する」という用語は、問題とする特定の細胞集団を、分析 を受ける試料中に存在するのが普通である他の細胞から区別できるように前記特 定の細胞集団を識別する方法をいう。

「維持できる（ｃｏｎｓｅｒνａｔｉｖｅ）」きいう用語は、試料中に最初に存 在していた白血球の全数のほかにその全形態および免疫化学的反応性を保存する 本発明方法の条件および操作工程の両方を意味するものとする。このような維持 は白血球集団を予め固定することなしに達成されるが、このような維持処置に次 いで固定することができる。

「転頭状（ｎｕｔａｔｉｖｅ）Ｊおよび「転頭運動」という用語は、試料および 種々の試薬（染料、溶解試薬、抑制剤および固定剤−使用する場合には）が穏や がながきまぜ状態に維持されている反応容器の非対称または偏心混合作用をいう 。

反応容器のこのタイプの運動は反応容器の流体内容物を反応容器内で非対称的に 分布させ、反応容器の一方の側で、他方の側より高い高さまで上昇させる。この 非対称のために容器内に形成する渦は従来のような挙動を示さない。

「濃縮（ｅｎｒｉｃｈａ＋ｅｎｔ）　Ｊという用語は、従来技術に関連しては、 白血球集団であるバフィーコートを全血試料の他の成分から物理的に分離するこ とをいう。しかし、本発明に関連しては、「濃縮」は試料の赤血球画分を溶解し た際に白血球集団の同定の容易さを相対的に増大することをいう。

試料の赤血球画分の溶血および白血球画分の僅かな変性の両方を行ってこれらの 両分のその後の単離、確認および／または分析を容易にするために使用される化 学薬品の全体をまとめて「溶解試薬系」と呼ぶ。本発明に関連しては、このよう な系は溶解試薬および相手（ｃｏｍｐａｎ　１ｏｎ）抑制剤を含み、該抑制剤は 溶解試薬の溶解活性を実質的に遅延させかつ試料のイオン平衡を回復させるよう に配合する。

「区別するのに有効な量」という用語は、本明細書を通じて、試料の赤血球画分 の溶血に有効であるほか、白血球画分を僅かに変化させてこれらの両分のその後 の分離、同定および／または分析を容易にする溶解試薬の濃度を意味する。

関連する従来技術を説明する際に先に記載したように、白血球画分を染色する好 ましい技術は、インディケータである抗体コンジュゲートと問題とする細胞画分 の特徴ある表面マーカーとの免疫化学的相互作用を含む。問題とする特異的表面 マーカーに対する前記コンジユゲートの相対的な結合活性は、細胞表面における エピトープ部位の正確な位置およびフンフォーメーションによって変化すること がある。問題とする細胞集団またはその細胞数が病気の状態を示している場合に は、これらの細胞は一層脆くなる傾向があり、従ってこれらの細胞と染料との相 互作用は物理的外傷および試料雰囲気における化学的不均衡に対する感応性が一 層大きくなる。従って、抑制剤の添加による短縮された普通１０秒未満である溶 解試薬との接触時間およびこれに続く白血球画分のイオン平衡の回復は、問題と する細胞の全数および特性の両方を維持する作用をし、従ってこれに続く免疫化 学的技術による同定を容易にする。代表的な場合には試料の濃縮染色時とその後 の分析との間には中断があるので、試料を固定剤と接触させて問題とする白血球 画分の物理的な大きさおよび形状の両方を保存するのが好ましい。このような固 定はこれより前の濃縮および染色の操作と融和性であり、さらに問題とする細胞 集団の相対的濃度を測定し決定するために選定した分析手段と融和性であること が必要である。好適な分析法がフローサイトメトリーである場合には、選定した 固定剤はコンジュゲート染料の蛍光色素標識の励起エネルギーの波長において、 あるいは蛍光色素の発光波長において自然発光あるいは自動的な発光を示しては ならない。本発明に使用するのに好適な固定剤はバラホルムアルデヒドである。

本発明方法を実施するに当っては、凝固防止剤、ＥＤＴＡまたはヘパリンを入れ た管内に標準静脈穿刺技術によって末梢血液を無菌状態で採取する。この試料を 主として好適な分析用測定装置と一緒に使用されるタイプの混合室に移す。

本発明方法を実施するための半自動化装置においては、次いで試料を適当量の色 素、溶解試薬および固定剤と接触させる。これらの種々の試薬物質との接触期間 中に試料を穏やかなかきまぜ状態に維持する。本発明の好適例の一つでは、溶解 試薬系および固定剤の添加前に染料を全血試料と組み合わせる。溶解試薬の活性 は試料を溶解試薬と最初に接触させてから約１０秒後に抑制剤を添加することに より著しく遅延させる。全プロセスを約９０秒以内に完結させると共に染色を継 続することができる。任意の固定剤を染色サイクルの終結時および抑制剤の添加 後に添加するのが好ましい。本発明の他の例では、問題とする白血球画分の濃縮 を試料の染色に先立って行うことができる。本発明のこの例では、単に染料を全 血試料に添加し、問題とする細胞画分と相互作用させる。このような相互作用は 、溶解試薬、抑制剤および任意の固定剤の添加後に、穏やかなかきまぜ下に約１ ５〜６０秒間起る。

本発明の方法および系に使用するのに適当な好ましい溶解試薬は、〉３．０の、 に値、約２．６〜４．０の範囲のｐＨおよび処理試料のイオン強さを著しく変え ない反対イオンを有する水溶性有機カルボン酸である溶解試薬を区別するのに有 効な量を含有する水溶液である。最も好ましい溶解試薬は、ギ酸、酢酸およびこ れらの混合物からなる群から選定することができる。本発明の好適例においては 、これらの溶解試薬混合物は主要な作用成分としてギ酸を含有し、酢酸は含有す るとしても少量成分として存在しているにすぎない。

本発明の方法および系に使用する溶解試薬は、驚くべきことには低濃度好ましく は１，０容量％未満の溶解試薬を含有する水溶液である。この水溶液は単に溶解 試薬を脱イオン水に添加することにより生成する。この希釈剤に対する溶解試薬 の添加量は約０．０５〜約０．５％（Ｖ／ν）の溶解試薬を含有する溶液を生成 するのに十分な量とする。本発明の好適例においては、溶解試薬濃度は約０．１ 〜約０．２５％（Ｖ／Ｖ）の範囲である。

溶解試薬がギ酸および酢酸の両方を含有する混合物である場合には、酢酸は限定 量のギ酸の部分置き換えきしてのみ存在させるのが好ましく、この際約０，０５ 〜０．１０％（Ｖ／Ｖ）の範囲の濃度でのみ存在させるのが好ましい。

また溶解試薬系は他の従来の添加剤を、これらの添加剤の存在が溶解試薬系の主 な作用成分、例えば、オマジンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｏｍａｄｉｎｅ）の ような抗菌防腐剤と非融和性でない範囲まで含有することができる。

溶解試薬は簡単な手による添加あるいは自動化された添加によって全血試料と組 み合わせ、短時間の間室内で相互作用させることができ、次いで適当な抑制剤の 添加によって溶解試薬の作用を著しく遅延させることができる。この雰囲気中で 有効である抑制剤は、血液試料および溶解試薬を含有する水性混合物に添加した 際に直ちに溶解試薬の溶解活性を遅延させることができる必要がある。抑制剤の 正確な配合は溶解試薬の組成および分析用測定機器の要件によって指定されるこ とのある他の流体によって変動することがある。抑制剤は主として溶解試薬の溶 解活性を著しく遅延させかつ／または実質的に中和するのに有効であり、試料に イオン平衡を回復させるのに有効である可溶性塩を含有する水溶液である。この イオン平衡の回復は生き残っている細胞の寿命を延ばし、例えば“クールター・ ブイシーニス（νＣＳ）　　・フローサイトメータを使用する場合のように、試 料が導電性であり、電解質を含有していることを必要とする装置において後で分 析することを可能にする。

溶解試薬組成物と一緒に使用するのに適当な抑制剤は、次の４種の成分：塩化す ）ＩＪウム、硫酸す）　ＩＪウム、重炭酸ナトリウムおよび炭酸ナトリウのうち の少くとも２種の組合せおよびさらに防腐剤としてアジ化ナトリウムを含有する ことができ、また含有するのが普通である。本発明の方法および系に関連して、 溶解試薬に対する抑制剤の効果は、酸性溶解試薬の溶解活性を急激に低下させる ことができる能力によって決まる。

また、白血球副集団を区別するのに使用する方法および装置は、抑制剤の正確な 配合に対して導電性、ｐＨなどのいくつかの要件を課することがある。特にクー ルター・ブイシーニスのようなフォーカスト・フロー・アパーチュア（ｆｏｃｕ ｓｅｄ　ｆｌｏｗ　ａｐｅｒｔｕｒｅ）分析システムでこのような区別を行う場 合には、抑制剤の組Ｉ＆および容積が５個の白血球サブクラスを互に最適に分離 （区別）するのに重要である。

このタイプの分析系では、抑制剤のイオン平衡を調整してさや流体に対する溶解 血液試料の満足できる導電性の合致を達成する必要がある。好ましい抑制剤の配 合においては、溶解され抑制された血液試料中の主要なイオンスビーシズ（ｉｏ ｎｉｃ　５ｐｅｃｉｅｓ）およびこれらの相対比はさや状流体中の主要なイオン スピーシズおよびこれらの相対比と本質的に同じである。試料の成分、例えばフ ィブリンおよび血小板はｐＨ感応性で、酸性条件下に凝集物を生成することがあ り、生成した凝集物は示差分析を潜在的に妨害するかあるいはフォーカスト・フ ロー・アパーチュア・システムの開口を物理的に閉塞することがあるｅ　ｐＨｍ 整に関するこれらの考察は他の分析測定雰囲気においても重要であることがある 。

本発明の溶解試薬系と一緒に使用される抑制剤の作用成分の相対的濃度は塩化ナ トＩＪウム約１〜約３％（Ｗ／Ｖ）、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム約 ０．２５〜約０．８％（Ｉｌｌ／Ｖ）、および硫酸す）　ＩＪウム約２〜約４％ （Ｗ／Ｖ）の範囲である。最適抑制剤の成分の相対的量は経験的に決めるのが普 通である。このような調整の目的は溶解血液試料のｐＨを約６．０〜約７．５の 範囲内にし、安定化溶解血液試料の最終オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ） を約３００〜約３３０＋ｎＯｓの範囲内にすることである。フォーカスト・フロ ー・アパーチユア・システムでは、白血球サブクラスの最適な密集は最終血液試 料のオスモル濃度を約３１ｈＯｓに調整することにより達成される。

本発明の好適例においては、溶解試薬と血液試料との有効な接触の持続期間、す なわち両者を一緒にした時から抑制剤を添加した時までの期間は１０秒未満にす る必要があり、最も好ましくは６秒あるいはこれ未満とする。上述したような溶 解試薬と血液試料との反応接触（ｒｅａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔａｃｔ）の間隔は、 このような反応接触が常温すなわち１８〜２８℃で起ることを仮定している。

本発明の方法および系において使用する染料は、問題とする細胞検体、例えばＢ −ＩＪンバ球およびＴ−リンパ球の細胞表面におけるエピトープとの結合に対し て特異的である蛋白質コンジュゲートを形成するインディケータである。白血球 表面マーカーに特異的な抗体はいくつかの商業的供給源から入手することができ る。本発明の好適例では、モノクロナール抗体が好適な試薬である。Ｔ細胞およ びＢ細胞における表面マーカーに特異的であるモノクロナール抗体は商業的に容 易に得ることができ、また適当な蛍光色素にコンジュゲートさせることができる 。

例１〜５に示す１連の分析は、問題とする特定のリンパ球集団（Ｂ細胞およびＴ 細胞）の濃縮および染色に使用される従来技術と比較することにより本発明の方 法および試薬系を評価する際に行った。それぞれの例において、全血試料は問題 とする特定の細胞側集団の測定方法および測定装置と同じく互に共通にした。白 血球画分の分離・濃縮技術はこの目的に適した試薬系のそれぞれに対して確立さ れているプロトコールに従って実施した。例６に本発明の方法および試薬系を示 す。これらの例のそれぞれにおいて、濃縮試料の分析はクールター・エピクス・ モデルＣ・フローサイトメータで行い、この機器に対する標準操作プロトコール に従って行った。それぞれの分析結果は一連の散布口第１Ａ〜６Ａ図、およびヒ ストグラム第１Ｂ〜６Ｂ図および第１Ｃ図〜６Ｃ図に示した。第１〜５図は従来 技術に関するもので、第６図は本発明の方法および試薬系に関するものである。

例１ この例に使用する試料を調製する際に使用した分離を行うための材料および方法 では、Ｂ細胞およびＴ細胞に特異的である蛍光色素標識抗体によって染色した後 に試料の洗浄を行う従来の溶解技術による白血球画分の分離・濃縮を行った〔オ ルソ・ジアグノスチック・システム（Ｏｒｔｈ。

Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍ、　　オルソ・スペクトラム（Ｏｒｔｈ。

ＳＰＥＣＴＲＩＩＭ）　ＩＩＩレーザー・フＯ（Ｌａｓｅｒ　Ｆｌｏｗ）サイト メトリー・システム。シトフルオログラフ”　（ＣＹＴＯＦＬＩＩＯＲＯＧＲＡ Ｆ）　）。

試料を調製した後に、Ｂ細胞およびＴ細胞の相対的濃度をエビクス・モデルＣ・ フローサイトメトリーで求めた。第１Ａ図は健康な提供者からの全血試料の白血 球副集団の散布図である。第１Ｂ図はＢ細胞と非Ｂ細胞との間の相対的なり細胞 濃度が１２．２０％であるたとを示すヒストグラムである。

第１Ｃ図はＴ細胞と非Ｔ細胞との間の相対的なＴ細胞濃度が８３、３０％である ことを示す。

例２ 試料の調製に際しては、クールター・コーポレーション・イムノロジー・ディビ ジョンによってイムノライズ（ｉｍｓｕｎｏｌｙｓｅ）という商品名で市販され ている試薬系について説明されている操作に従って、洗剤によって白血球を溶解 した。試料の分析は第１図の試料の場合と同様にして行った。第２Ａ図は第１Ａ 図の散布図について述べたのと同じ健康な提供者からの全血試料の白血球側集団 の散布図である。

第２Ｂ図は試料中のＢ細胞の相対的濃度が１５．４０％であることを示す。第２ Ｃ図は試料中のＴ細胞の相対的濃度が７５．５９％であることを示す。報告され たＢ細胞およびＴ細胞の相対的濃度と、第１図に準じて行った分析についての報 告された値とを比較した場合の結果の変動に注目されたい。・例３ 試料の調製に際しては、ベクトンーディキンソン＜Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉ ｎｓｏｎ）によってエフニーシーニス（ＦＡＣＳ）という商品名で市販されてい る試薬系について説明されている操作に従って、ジエチレングリコールによって 白血球を溶解した。

第３Ａ図は第１Ａおよび２Ａ図の場合と同じ健康な提供者からの全血試料の白血 球側集団の散布図である。第３Ｂ図は試料中のＢ細胞の相対的濃度が１９．０４ ％であることを示すヒストグラムである。ｊｆＣａＣ図は試料中のＴ細胞の相対 的濃度が６９．１７％であることを示すヒストグラムである。得られた結果と第 １および２図の結果との間には相関関係がないことに注目されたい。しかも、Ｔ 細胞に対するＢ細胞の相対的濃度は著しく移動しており、試料の調製、ジエチレ ングリコールによるＲＢＣの溶解がＴ細胞に対して不当に苛酷なものであること を示す。

例４ 試薬の調製に際しては、主としてリンパ域側集団と単球側集団との密度勾配分離 を行った。この操作は専門家に高度に依存しかつ報告されているように実質的な 細胞の損失を招く傾向があることが認められている。第４Ａ図はＩｃＩＡ。

２Ａおよび３Ａ図の場合と同じ健康な提供者からの全血試料の白血球側集団の散 布図である。第４Ｂ図はこのような試料においてＢ細胞の相対的濃度が４．６４ ％であることを示すヒストグラムである。第４Ｃ図はこのような試料においてＴ 細胞の相対的濃度が８８．５５％であるを示すヒストグラムである。

得られた結果と第１．２および３図の結果との間には相関関係がないことに注目 されたい。しかも、Ｔ細胞に対するＢ細胞の相対的濃度は大幅に移動しており、 これはこの操作において繰り返された洗浄および物理的取扱いがＴ細胞に対する よりＢ細胞に対して外傷を一層与え易いことを示す。

例５ 例４の操作を繰り返した。ただし、未反応染料が室内に残留できるようにし、分 析はカルドウエル等の「無洗浄」法によって定められているように行った。散布 図である第５Ａ図は区別できる白血球側集団を示す。第５Ｂ図はＢ細胞の相対的 濃度が８．１４％であることを示すヒストグラムである。

第５Ｂ図はＴ細胞の相対的濃度が８７．７５％であることを示すヒストグラムで ある。Ｂ細胞集団の相対的濃度が増大していること、従って試料の染色の次の洗 浄工程を無くす利点に関するカルドウエル等の観察が確認されることに注目され たい。

例６ 試料の調製に際しては、試料の染色、溶解、抑制、および固定を迅速に（９０秒 未満での経過時間）行った。また試料の調製に際しては、例１〜５の場合と同じ 提供者からの全血試料を使用して、定められた順序で次の試薬を自動計量し、混 合した： ■、材料 １、溶解剤：ギ酸ナトリウム　　　　　　　１．２ｍｆオマジンナトリウム（４ ０％）　　　０，２ｒｄ脱イオン水　　　　　　　　９９８．６ｒｄ２、抑制剤 ：硫酸ナトリウム　　　　　　３１．３０ｇ塩化ナトリウム　　　　　　　１４ ．５０ｇ炭酸ナトリウム　　　　　　　６．００ｇ脱イオン水　　　　　　　　 　ｌＩ２ ３、固定剤ニドリス（ＨＣＬ）緩衝剤　　　　　６．０５ｇパラホルムアルデヒ ド　　　　１０．００ｇ水酸化ナトリウム（５０％）　　　　００．５０ｍｆ脱 イオン水　　　　　　　　　１１ ４、染料　：デクトン・ディキンソン免疫細胞化学系Ｇｌ−ＦＩＴＣ ）！ＬＥ−ＦＩＴＣ クールター・イムノロジー・ディビジョンＭＩＧ−ＦＩＴＣＴＹ−ＲＤＩ ＭＩＧ−ＲＤＩ　　　　　　　　　　　Ｔｌ−ＦＩＴＣＴ８−ＦＩＴＣＢｌ−Ｆ ＩＴＣ 染料、溶解試薬系および固定剤の予定された添加の際には、クールター〇−プレ プ（ＰＲＥＰ）装置を使用し、２５Ｘ７５胴試験管を穏やかにかきまぜながらこ れらの試薬のそれぞれを所定量適当な時に供給し、次のサイクルで操作した＝（ ａ）試料への蛍光色素標識抗体の添加（ｂ）６０秒間にわたる試料および染料の 穏やかなかきまぜ（Ｃ）試料および染料への溶解試薬の添加（ｄ）６秒間のかき まぜ （ｅ）抑制剤の添加 （ｆ）１０秒間のかきまぜ （ｇ：）固定剤の添加 （ハ）フローサイトメータ中への試験管の設置およびＢ細胞およびＴ細胞の相対 的集団についての分析第６Ａ図は第１Ａ、　２Ａ、　３Ａおよび５Ａ図の場合と 同じ健康な提供者からの全血試料の白血球側集団の散布図である。Ｉ６Ｂ図はこ のような試料におけるＢ細胞の相対的濃度が１９．７９％であることを示すヒス トグラムである。第６Ｃ図はこのような試料におけるＴ細胞の相対的濃度が７６ 、９７％であることを示すヒストグラムである。Ｂ細胞の相対的濃度が大きいこ と、これは本発明の方法および試薬系が問題とする関連する副集団の同定に有効 であり、この技術は専門家の関与を最小限にし、洗浄工程を全く行わなくても効 果的であることを示すことに注目されたい。

ＦＩＧ、　　Ｉ　　　　　　　　　　ＦＩＧ、　　２ＦＩＧ　、ＩＡ　　　　　 　　　　　ＦＩＧ　、　２ＡＦＩＧ、旧　　　　　ＦＩＧ　、　２８ＦＩＧ　、 　Ｉｃ　　　　　　　　　ＦＩＧ　、　２ＣＦＩＧ、３　　　　　　　　　ＦＩ Ｇ、４ＦＩＧ　、　３Ａ　　　　　　　　　ＦＩＧ　、　４ＡＦＩＧ　、　３８ 　　　　　　　　　　ＦＩＧ　、　４８ＦＩＧ　、３０　　　　　　　　　　　 ＦＩＧ　、４ＣＦＩＧ、　　５　　　　　　　　　　　ＦＩＧ、　　６ＦＩＧ、 ５Ａ　　　　　　　　　　ＦＩＧ、６ＡＦＩＧ　、５８　　　　　　　　　ＦＩ Ｇ、６８ＦＩＧ　、　５ＣＦＩＧ　、　６Ｃ 国際調査報告 せ衆国フロリダ州　３３３２４　　プランテーション　エスダブニイテイセカン ド　テラス　１３８０

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．全血試料の非赤血球細胞面分の濃縮、および該面分の細胞と問題とする副集 団の特徴ある細胞成分にとって特異的なインディケータ標識結合物質との免疫化 学的相互作用による前記面分の１個または２個以上の副集団の標識付けを行って 、ホトオプチカル測定技術による分析のための全血試料を調製するに当り、 （ａ）微粒状検体を定量化しかつ／または前記試料にとって内生的な他の微粒子 から前記検体を区別するのに適したホトオプチカル機器において主として試料容 器として使用されるタイプの普通の反応容器を使用し；（ｂ）前記試料を溶解試 薬により選択的間質溶解条件下に置いて前記試料の非赤血球面分を赤血球画分か ら効果的に区別できるようにすることにより前記反応容器内で分析用試料を調製 し； （ｃ）前記選択的間質溶解工程の前、同時あるいは後に、前記副集団の少くとも １個を結合物質で標識付けし；次いで （ｄ）未反応かつ／または未消費の試薬および結合物質の少くとも一方から前記 標識副集団を予め分離することなく前記試料のアリコートを保温室からホトオプ チカル分析装置に移送する ことを特徴とする全血試料の調製方法。
2. ２．全血試料の非赤血球細胞画分の濃縮、および該面分の細胞と問題とする副集 団の特徴ある細胞成分にとって特異的なインディケータ標識結合物質との免疫化 学的相互作用による前記画分の１個または２個以上の副集団の標識付けを行って 、ホトオプチカル測定技術による分析のための全血試料を調製するに当り、 （ａ）徴粒状検体を定量化しかつ／または前記試料にとって内生的な他の微粒子 から前記検体を区別するのに適したホトオプチカル機器において主として試料容 器として使用されるタイプの普通の反応容器を使用し；（ｂ）前記試料を酸性溶 解試薬により選択的間質溶解条件下に置いて前記試料の非赤血球画分を赤血球面 分から効果的に区別できるようにすることにより前記反応容器内で分析用試料を 調製し； （ｃ）前記副集団の少くとも１個を結合物質で標識付けし；次いで （ｄ）前記試料のアリコートを前記反応容器からホトオプチカル分析装置に移送 する ことを特徴とする全血試料の調製方法。
3. ３．前記移送工程を、未反応かつ／または未消費の試薬および結合物質の少くと も一方から前記標識副集団を予め分離することなく達成する請求項２記載の方法 。
4. ４．前記移送工程を、溶解試薬およびインディケータ標準結合物質の相互および 全血試料に対する相対的濃度が、試料内に遊離の状態で残っている未反応および ／または未消費の溶解試薬系およびインディケータ標識結合物質の少くとも一方 および試料の他の成分から、問題とする標識副集団を予め分離することなく、問 題とする標識副集団を他の試料成分から効果的に区別することができるように行 う請求項２記載の方法。
5. ５．前記溶解試薬は約２．６〜約４．０の範囲のｐＨを有する請求項１〜３のい ずれか一つの項に記載の方法。
6. ６．溶解試薬は約２．６〜約４．０の範囲のｐＨを有する間質溶解有効量の有機 カルボン酸である請求項１〜３のいずれか一つの項に記載の方法。
7. ７．溶解試薬はギ酸、酢酸およびこれらの混合物からなる群から選定した有機酸 である請求項１，２および４のいずれか一つの項に記載の方法。
8. ８．溶解試薬の溶解活性を停止し、試料のイオン平衡を回復させるのに有効な相 手試薬で前記溶解試薬の活性を抑制する追加の工程を行う請求項１，２および４ のいずれか一つの項に記載の方法。
9. ９．結合物質で標識付けした後に試料を固定剤と接触させる請求項１〜３のいず れか一つの項に記載の方法。
10. １０．前記反応容器内で全血試料と溶解試薬およびインディケータ標識結合物質 とを穏やかな渦混合によって接触させて試料の前記面分の副集団を試料全体にわ たって本質的に均一な濃度に維持する請求項１〜３のいずれか一つの項に記載の 方法。
11. １１．前記調製工程において、試料と試薬および結合物質とを接触させ、前記反 応容器の非対称運動によって穏やかな混合を生じさせ、前記調製の所要時間を９ ０秒未満にする請求項１，２および４のいずれか一つの項に記載の方法。