RU2178703C2 - Использование антител против эмбрионального гемоглобина для идентификации плодных клеток - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к способу разделения и распознавания плодных клеток в образцах крови. Более конкретно изобретение относится к способу выделения и распознавания содержащих ядро эритроцитов или эритробластов плода из материнских клеток в образце крови беременной женщины. Сущность способа заключается в том, что содержащие ядро эритроциты или эритробласты плода идентифицируют с использованием антитела или фрагмента антитела, специфичного для эмбрионального гемоглобина или цепи эмбрионального гемоглобина. Техническим результатом является обнаружение нуклеиновых кислот или белков плода, что позволяет провести количественную и качественную пренатальную диагностику, включая определение пола плода, определение хромосомных аномалий, аномалий единичного гена или белка, наличия конкретных генов и последовательностей нуклеиновых кислот. 5 с. и 17 з. п. ф-лы.

Description

Настоящее изобретение относится к методу разделения и распознавания плодных клеток в образцах крови. Более конкретно, настоящее изобретение относится к методу выделения и распознавания содержащих ядро эритроцитов плода или эритробластов из материнских клеток в образце крови беременной женщины.

Плодную ткань и, в частности, ДНК и хромосомы плода обычно используют в пренатальной диагностике и в других процедурах, которые требуют точной оценки генома плода. В настоящее время плодную ткань получают с помощью амниоцентеза - отбора образца из ворсинок хориона (CVS) с использованием фетоскопии или кордоцентеза в соответствии с описанием, приведенным в работе Томпсона (Thompson and Thompson, Genetics in Medicine, 5^th Edition, W. B. Saunders Co. , Philadelphia, 1991).

В случае амниоцентеза образец амниотической жидкости, содержащей клетки плода, с помощью трансбрюшинной процедуры, включающей использование иглы и шприца, отбирают из материнского организма. Амниоцентез характеризуется определенным риском. Основной риск связан с возможностью индуцирования самопроизвольного выкидыша, который по оценкам происходит 1 раз на каждые 200 случаев амниоцентеза. Другой возможный риск включает вероятность инфицирования материнского организма и физическое повреждение плода. В случае отбора образца из ворсинок хориона трофобластную ткань отсасывают из ворсинчатой области хориона трансцервикально или чрезбрюшинно. Уровень потери плода составляет в этом случае 1 на 100 случаев. Метод кордоцентеза или чрескожного умбиликального отбора образца крови позволяет получить кровь плода непосредственно через пупочный канатик с использованием устройства ультразвукового наведения. И каждый из таких инвазивных методов таит в себе риск как для матери, так и для плода.

В этой связи было бы желательно иметь неинвазивный метод получения ткани или ДНК плода. Кроме того, желательно было бы также иметь метод, позволяющий быстро и надежно выделять и обогащать плодную ткань из материнского организма для осуществления скрининга и пренатальной диагностики в клинических лабораториях. В последнее время в качестве предпочтительной технологии рассматривалась идентификация плодных клеток в периферическом кровотоке матери с последующим отбором таких клеток для генетического анализа.

Идентификация или выделение плодных клеток из крови материнского организма основаны на различении редкой популяции плодных клеток среди преобладающих материнских клеток. Несмотря на то, что различные типы плодных клеток, такие как плодные лимфоциты и трофобласты, уже используются в качестве клеток-мишеней для идентификации ДНК плода, наибольшие усилия были направлены на разработку процедуры для содержащих ядро красных кровяных клеток плода (яККК), известных также как содержащие ядро эритроциты (см. Cheuh and Golbus, "The Search for Fetal Cells in the Maternal Circulation", J. Perinatol. Med, 19: 411 (1991); Simpson, et al. , "Noninvasive Screening for Prenatal Genetic Diagnosis"", Bull. WHO, 73: 799 (1995); and Cheuh and Golbus, "Prenatal Diagnosis Using Fetal Cells from Maternal Circulation", West. J. Med. , 159 (3): 308 (1993)).

Считается, что яККК плода проходят через плаценту в результате трансплацентарного кровотечения. Поскольку плод содержит большое количество содержащих ядро эритроцитов, а такие содержащие ядро эритроциты редко встречаются в крови взрослого организма, различие, основанное на наличии ядра, оказалось полезным для отделения и идентификации плодных клеток от материнских клеток.

Для идентификации и обогащения рассматриваемых плодных клеток применяют антитела против поверхностных антигенов клеток, таких как рецептор трансферрина, см. Bianchi, et al. , "Isolation of Fetal DNA from. Nucleated Erythrocytes in Maternal Blood", Proc. Natl. Acad. Sci, 87: 3279 (1990). См. также Bianchi, et al. Заявка на международный патент No. PCT/US90/06623 (WO 91/07660), в которых описывается метод обогащения содержащих ядро красных кровяных клеток плода, полученных из образцов периферической крови с использованием антитела, которое связывается с антигеном на клеточной поверхности плодных клеток.

Брессер с соавт. (Bresser et al. ) в заявке на международный патент No. PCT/US94/08342 (WO 95/03431) описывает применение антител против гемоглобина плода и зондов мРНК для обогащения плодных клеток в материнской крови. Наличие гемоглобина плода было показано с помощью реакции Кляйнхауера-Бетке (Kleinhauer-Betke), которая позволяет дифференцировать гемоглобин плода и взрослого организма на основе характеристик кислотной элюции (См. Kleinhauer, et al. , "Demonstration von fetalem Haoglobin in den Erythrozyten eines Blutausstrichs", Klin. Wochensch. , 35: 637 (1957); and Sauders, et al. , "Enrichment of fetal cells from maternal blood for genetic analysis", American Journal of Human Genetics, 57: 287 (1995)).

Генетический анализ генома плода проводят методом флуоресцентной гибридизации in situ метод (FISH) хромосомо- или геноспецифичных зондов ДНК или РНК при использовании в ряде случаев автоматизированного устройства для записи показаний, а также по методу, основанному на амплификации целевых плодных генов или ДНК (см. Lichter, et al. , "Rapid detection of human chromosome 21 aberration analysis using fluorescence in situ hybridization", Proc. Natl. Acad. Sci. , 85: 9664 (1988); O'Kelley, et al. , "Instrumentation for the genetic evaluation of fetal cells from maternal blood". Am. J. Hum. Genet. , 57: 286 (1995); and Lo, et al. , "Prenatal Sex Determination by DNA amplification from maternal peripheral blood". Lancet, 2: 1363 (1989)).

Настоящее изобретение относится к методу идентификации плодных эритроцитов, предпочтительно содержащих ядро, или эритробластных клеток в образце крови, который включает:
а) контакт образца крови с антителом или фрагментом антитела, действие которого направлено на глобиновую часть эмбрионального гемоглобина, таким образом, что антитело или его фрагмент связываются с плодной клеткой; и
б) идентификацию клеток, которые связались с антителом или его фрагментом в качестве содержащих ядро эритроцитарных или эритробластных клеток.

(Образец крови отбирают в типичном случае из периферической крови матери в период беременности).

В процедуре согласно настоящему методу могут использоваться различные антитела против эмбрионального гемоглобина предпочтительно из числа тех, действие которых направлено против глобиновой эпсилон-цепи и/или глобиновой зета-цепи эмбрионального гемоглобина. Кроме того, могут использоваться другие маркеры плода или зрелых клеток для облегчения и улучшения идентификации или выделения плодных клеток.

Затем, как только плодные клетки удается идентифицировать, их нуклеиновая кислота или белок могут быть амплифицированы или обнаружены внутри клетки для генетического анализа.

В настоящем изобретении предлагаются также различные наборы для использования в рамках приведенных методов. Указанные наборы включают непосредственно или опосредованно меченое антитело против эмбрионального гемоглобина и инструкции по их использованию. Кроме того, в такие наборы необязательно включаются среды для обогащения концентрации плодных клеток в градиенте плотности, реагенты для проведения гемолиза и разрушения красных кровяных клеток, лизирующие средства и зонды нуклеиновых кислот.

Если не оговорено особо, все использованные в описании технические и научные термины имеют общепринятое значение в той области техники, к которой относится настоящее изобретение. В описании приведены предпочтительные методы и материалы, несмотря на то, что в практике или при испытании настоящего изобретения могут использоваться любые методы и материалы, близкие или эквивалентные рассматриваемым. Для целей настоящего изобретения ниже определены некоторые используемые термины.

В контексте настоящего описания термин "эритроциты" или "красные кровяные клетки" или "ККК" включает красные кровяные клетки плода и взрослого организма, которые могут быть как содержащими ядро, так и безъядерными. При этом содержащие ядро эритроциты предпочтительны.

В контексте настоящего описания термин "эритробласт" обозначает содержащую ядро клетку-предшественник, из которой ретикулоцит развивается в эритроцит. "Нормобласт" означает содержащую ядро красную кровяную клетку, которая является непосредственным предшественником эритроцита.

В контексте настоящего описания термин "эмбриональный" относится к клетке или клеткам, имеющимся в период беременности на втором месяце после зачатия. В типичном случае клетки на всех стадиях развития после эмбриональной стадии до момента рождения обозначаются как плодные.

Плодные клетки крови составляют небольшую часть от общего числа циркулирующих в материнском кровотоке клеток. Считается, что плодные клетки "просачиваются" в материнский кровоток через плаценту. По оценкам частота таких явлений варьирует и составляет примерно от 1 на 10⁸ до 1 на 10¹¹клеток (Holzgreve, W. et al. , Lancet (1990)i: 1220). На ранней стадии беременности красные кровяные клетки плода могут содержать ядра. При этом в отличие от безъядерных плодных эритроцитов они содержат ДНК и могут использоваться для генетического анализа плода, что позволяет избежать инвазивных процедур.

Онтогенез гемоглобина
Гемоглобин взрослого организма в количестве примерно до 99% имеет форму, состоящую из двух альфа-цепей и двух бета-цепей, и примерно до 1% - форму, состоящую из двух альфа-цепей и двух дельта-цепей. Гемоглобин плода содержит две альфа- и две гамма-цепи.

Три более ранних эмбриональных гемоглобина построены на основе зета-(альфа-подобной) и эпсилон-(бета-подобной) цепей. Эмбриональный гемоглобин Gower 2 состоит из двух альфа-цепей и двух эпсилон-цепей, тогда как эмбриональный гемоглобин Gower 1 построен из двух зета-цепей и двух эпсилон-цепей, а эмбриональный гемоглобин Портланда состоит из двух зета-цепей и двух гамма-цепей (См. Gale, et al. , Nature, 280: 162 (1979); и Maniatis, et al. , Ann. Rev. Genetics, 14: 145 (1980)).

В настоящем изобретении показано, что эмбриональные глобиновые цепи все еще присутствуют в плодных яККК примерно до 22 недели беременности, тогда как матричной РНК в них уже нет. Предпочтительно, указанные цепи обнаруживаются в период примерно от 9 до примерно 20 недель беременности. Плод постепенно переключается на продукцию плодного гемоглобина, который составляет примерно 1% от всего количества гемоглобина во взрослом организме, тогда как во взрослых ККК отсутствуют эмбриональные гемоглобины.

Антитела против гемоглобина
Различить имеющиеся в ККК специфичные гемоглобины можно, используя антитела или их фрагменты, действующие специфично на антигеновый сайт глобиновой цепи. В настоящее время коммерчески доступны антитела против глобинов взрослых организмов (альфа и бета), против плодного глобина (гамма) и против эмбрионального эпсилон-глобина. Такие компании как Accurate Chemical и Scientific Corporation (Westburry, NY), а также Cortex Biochem (San Leandro, CA) поставляют антитела против эпсилон-глобина.

Может быть использовано множество иммуногенов для получения антител, специфически взаимодействующих с гемоглобиновой цепью белков. При этом рекомбинантный белок представляет собой предпочтительный иммуноген для получения моноклональных или поликлональных антител. Кроме того, может применяться натуральный белок, либо в чистом виде, либо с наличием примесей. Синтетические пептиды, получаемые с использованием аминокислотной последовательности белковой части гемоглобиновой цепи, также могут применяться для создания антител против белков. Рекомбинантный белок может быть экспрессирован в клетках эукариот или прокариот и далее подвергнут очистке. После этого продукт инъецируют в организм животного, способного к продуцированию антител.

Способы получения поликлональных антител известны специалистам в данной области техники. Вкратце, они состоят в том, что иммуноген, предпочтительно очищенный белок, смешивают с адъювантом и затем используют его для иммунизации животного. Отслеживают иммунную реакцию животного на иммунный препарат с проведением отбора проб крови на анализ и определение титра реактивности. При получении достаточно высокого значения титра антител против иммуногена отбирают кровь у животного и готовят антисыворотку. Далее при желании может быть проведено фракционирование антисыворотки для обогащения антителами, реактивными в отношении нужного белка (См. Harlow, et al. , Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)).

Моноклональные антитела могут быть получены с помощью различных методик, известных специалистам в данной области. Вкратце, они состоят в том, что проводят иммортализацию клеток селезенки животных, иммунизированных нужным антигеном, обычно при проведении слияния с миеломной клеткой (См. Kohler, et al. , Eur. J. Immunol. , 6: 511-519 (1976)). Альтернативные методы проведения иммортализации включают трансформацию вирусом Эпштейна Барр онкогенами или ретровирусами, а также с использованием других известных в технике методов. Проводят скрининг колоний, возникающих из единичных иммортализованных клеток, на продуцирование антител с желательными характеристиками специфичности и сродства к антигену, при этом выход моноклональных антител, продуцируемых такими клетками, может быть повышен с использованием различных технологий, включая инъецирование в брюшную полость позвоночного организма-хозяина. Альтернативно можно выделить последовательности ДНК, которые кодируют моноклональное антитело или его связывающийся фрагмент при скрининге библиотеки ДНК из В-клеток человека, в соответствии с процедурой Хьюза с соавт. (Huse, et al. , Science, 246: 1275-1281 (1989)).

В рамках настоящего изобретения могут использоваться различные компоненты или фрагменты антител. Вариабельные области иммуноглобулина представляют собой как раз те части, которые обеспечивают специфичность распознавания антигена. В частности, специфичность заложена в комплементарных детерминирующих областях (CDR), известных также как гипервариабельные участки иммуноглобулинов. Иммуноглобулины могут быть представлены множеством форм, включая, например, Fv, Fab, F(ab)', F(ab')₂ и другие фрагменты, а также единичные цепи (См. Huston, et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988) и Bird, et al. , Science 242: 423-426 (1988). См. общие аспекты в Hood, et al. , Immunology, Benjamin, NY, 2^nd ed. (1984) и Hunkapiller and Hood, Nature, 323: 15-16 (1986)). Могут использоваться также одноцепочечные антитела, в случае которых гены, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, объединены в единую кодирующую последовательность. Иммуноглобулиновый полипептид также заключает в себе процессированную иммуноглобулиновую цепь, например цепь, содержащую меньше константных доменов, чем в нативном полипептиде. Такие процессированные полипептиды могут быть получены с использованием стандартных методов, таких как введение стоп-кодона в генную последовательность на 5'-конце последовательности домена, которую нужно убрать. При сборке процессированных полипептидов могут быть затем получены процессированные антитела. В контексте настоящего описания термин "антитела" относится также к биспецифичным антителам, которые могут быть получены методами, описанными, в частности, в приведенных ниже ссылках: Glennie, et al. , J. Immunol. , 139: 2367-2375 (1987); Segal, et al. , Biologic Therapy of Cancer Therapy of Cancer Updates, 2(4): 1-12 (1992); and Shalaby, et al. , J. Exp. Med. , 175: 217-225 (1992). Моноспецифичные и биспецифичные иммуноглобулины могут быть также получены с помощью рекомбинантной техники с использованием в качестве организма-хозяина прокариотических или эукариотических клеток.

"Химерные" антитела кодируются иммуноглобулиновыми генами, сконструированными таким образом, чтобы гены, кодирующие легкую и тяжелую цепи, включали генные сегменты иммуноглобулинов разных видов. Например, вариабельные (V) сегменты генов для поликлонального антитела мыши могут быть объединены с константными сегментами (С) человека. Такие химерные антитела, как полагают, должны характеризоваться меньшей антигенностью для человека, чем антитела, включающие мышиные константные области и мышиные же вариабельные области. В контексте настоящего описания термин "химерное антитело" относится также к антителу, которое включает в себя иммуноглобулин, обладающий скелетом, близким к человеческому и в котором любая константная область характеризуется полипептидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 85-90% и предпочтительно примерно на 95% идентична таковой в константной области человеческого иммуноглобулина, т. е. представляет собой так называемый "гуманизированный" иммуноглобулин. См. , например, публикацию РСТ WO 90/07861. На основании этого все участки такого "гуманизированного" иммуноглобулина, за исключением, возможно, комплементарных детерминирующих областей (CDR), по существу, идентичны соответствующим участкам одной или более последовательностей нативного человеческого иммуноглобулина. Там, где это необходимо, остатки скелета могут быть замещены соответствующими остатками внутри или за пределами вида, если показано, что некоторые остатки рамки нарушают структуру CDR. Химерное антитело может также содержать процессированные вариабельные или константные области.

Термин "скелетная область" в контексте настоящего описания относится к тем частям вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, которые характеризуются относительной консервативностью и сохраняются (например, в отличие от CDR) среди различных иммуноглобулинов у одного вида, в соответствии с определением Кабата с соавт. (Kabat, et al. , Sequences of Proteins of Immunologic Interest, 4^th Ed. , US Dept, Health and Human Services (1987)). В контексте настоящего описания термин "близкая к человеческой скелетная область" представляет собой участок скелетной молекулы, который в каждой имеющейся цепи объединяет по меньшей мере 70 или более аминокислотных остатков, в типичном случае от 75 до 85 или более остатков, идентичных таковым в человеческом иммуноглобулине.

Константная область в последовательностях ДНК человека может быть выделена с помощью хорошо известной процедуры из множества клеток человека, но предпочтительно из иммортализованных В-клеток. Вариабельные области или CDR для целей создания химерных иммуноглобулинов согласно изобретению могут быть аналогичным образом получены из моноклональных антител, которые способны связываться с эмбриональными гемоглобинами или их цепями и которые можно будет затем продуцировать в любой подходящей системе организма млекопитающего, включая мышей, крыс, кроликов, клеточные линии человека или других позвоночных, способных к продуцированию антител по известным методам. Вариабельные области или CDR могут быть получены методом синтеза с помощью стандартной рекомбинантной техники, включающей полимеразно-цепную реакцию (ПЦР), или путем скрининга библиотеки фагов. Методы скрининга с использованием фагов описаны в литературе (см. , например, McCafferty, et al. . Nature, 348: 552-554 (1990); Clackson, et al. , Nature, 352: 624-628; и Marks, et al. , Biotechnology, 11: 1145-1149 (1993)). Могут также использоваться подходящие прокариотические системы, такие как бактерии, дрожжи и фаги.

Последовательности ДНК и хозяйские клетки для проведения экспрессии и секреции иммуноглобулина могут быть получены из разных подходящих для этой цели источников, например, из Американской коллекции культур (American Type Culture Collection "Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", Fifth edition (1985) Rockville, Maryland, USA).

Кроме описанных химерных и "гуманизированных" иммуноглобулинов, другие, по существу, идентичные им модифицированные иммуноглобулины также могут быть с успехом разработаны и произведены с использованием различных известных специалистам методик на основе рекомбинантных ДНК. В общем случае, модификации генов могут быть легко осуществлены с помощью хорошо известных методов, таких как ПЦР и сайтнаправленный мутагенез (См. Gillman and Smith, Gene, 8: 81-97 (1979) и Roberts, et al. , Nature, 328: 731-734 (1987)).

Альтернативно, могут быть получены полипептидные фрагменты, включающие только часть первичной структуры иммуноглобулина. Так, например, может быть желательно получить полипептидные фрагменты иммуноглобулина, которые обладают одной или большим числом активностей, свойственных иммуноглобулинам, в дополнение к распознаванию антигена или отличающихся от этого, например, связывание комплемента.

Метки
Антитела или их фрагменты могут быть помечены непосредственно или опосредованно для целей выделения и идентификации. Подходящие метки включают радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные и хемилюминесцентные вещества, магнитные частицы, гаптены, красители и др. См. Патенты США 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241. В числе других к ним относятся также "репортерные" группы, такие как биотин, которые связываются с группами, такими как стрептавидин или авидин, и которые, в свою очередь, связаны непосредственно или опосредованно с ферментами, такими как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена. Флуоресцентные вещества или флуорохромы включают флуоресцеин, кумарин, родамин, фикоэритрин, хлорид сульфородаминовой кислоты (техасский красный) и др.

Такие обнаруживаемые метки хорошо разработаны в области, к которой относится настоящее изобретение, и, в основном, большая часть из них может использоваться. Предпочтительно применение ферментов или флуоресцентных веществ.

Отбор образцов крови
В методе согласно изобретению предпочтительно используется образец крови, взятый из материнского организма в период беременности; однако могут применяться и другие источники клеток, кроме тех, что удается выделить или идентифицировать в материнском кровотоке. Плодная ткань может быть получена методом амниоцентеза, при отборе биопсийного материала из ворсинок хориона (CVS-метод) с помощью фетоскопии или кордоцентеза для целей анализа, описанного ниже.

В тех случаях, когда источником плодных клеток является материнская кровь, образец крови может представлять собой цельную кровь или полученный при фракционировании компонент крови, содержащий эритроциты или эритробластные клетки плода в моноядерном клеточном слое. В типичном случае готовят источник крови с обогащенной концентрацией плодных клеток до и/или после использования заявленного метода, включающего антитела против эмбрионального гемоглобина. Далее, образец крови суспендируют, высушивают на воздухе или химически фиксируют на твердой матрице перед контактом с антителом.

Хотя в качестве источника плодной ткани может служить материнский организм или плод любого млекопитающего, предпочтительным источником является человек. Предпочтительны также домашние животные, такие как собаки, кошки, коровы, лошади и др.

Методы обогащения в градиенте плотности
Были описаны другие методы, кроме фракционирования крови, в которых используются градиенты плотности и которые содержат агрегированные клетки или сгруппированные агенты, такие как метилцеллюлоза, Isopaque^тм, декстран и Фиколл^тм (Ficoll^тм), как описано в литературе (Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest. , 21 (Suppl. 97): 31-50 (1968) и Bhat, N. М. J. Immunol. Meth, 158: 277-280 (1993)). Isopaque^тм представляет собой натрий-N-метил-3,5-диацетамино-2,4,6-трийодбензоат, как описано в работе Boyum. Фиколл^тм (Ficoll^тм) (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury NY) представляет собой синтетический высокомолекулярный полимер, получаемый при сополимеризации сахарозы и эпихлоргидрина. Молекулы обладают разветвленной структурой с высоким содержанием гидроксильных групп, придающих растворимость в водных средах. Многие из этих агентов легко диффундируют. Указанные агенты способны вызывать агрегацию эритроцитов, что служит основой методов выделения лейкоцитов кровяных клеток. Однако в таких условиях, способствующих агрегации клеток, содержащие ядро красные клетки крови плода могут быть физически захвачены в скопление агрегированных материнских красных клеток крови и поэтому будут осаждаться вместе с материнскими эритроцитами, поскольку средняя плотность агрегатов определяет его седиментационные характеристики.

В литературе описаны градиенты плотности на основе Перколла (Percoll) (Rennie, et al. , Clinica Chemica Acta, 98: 119-125 (1979) и Vincent and Nadeau, Anal. Biochem. , 141: 322-328 (1984)). В исследовании Rennie используется изотонический раствор градиента плотности Перколла для фракционирования эритроцитов по показателям возраста. Лейкоциты (белые клетки крови) удаляют перед центрифугированием, поскольку они могут осаждаться совместно с эритроцитами в условиях изотонического градиента.

Описан метод обогащения плодных, содержащих ядро эритроцитов (Ganshert-Ahlert, et al. , Am. J. Obstet. Gynecol. , 1350-1355 (1992) и РСТ-публикация WO 93/23754) с использованием тройного градиента плотности на цельной материнской крови с последующим применением рецептора трансферрина для обогащения количества содержащих ядро красных кровяных клеток. Для обогащения меченых клеток требуется проточная цитометрия или стадия магнитного разделения. Как отмечается в приведенной выше ссылке (Ganshert-Ahlert), использование трансферринового рецептора не дает надежного метода идентификации плодных клеток в клеточной популяции материнского кровотока.

Предпочтительный метод обогащения, используемый для выделения содержащих ядро красных кровяных клеток плода из клеток материнской популяции, включает следующие стадии: центрифугирование образца крови в первом центрифужном стакане с получением фракции красных кровяных клеток; перенос фракции красных кровяных клеток в верхнюю часть второго центрифужного стакана, при этом второй центрифужный стакан включает среду с градиентом плотности, состоящую из коллоида, диспергированного в плавящемся геле, при том указанный коллоид способен поддерживать красные кровяные клетки, по существу, в неагрегированном состоянии; проведение гемолиза материнских эритроцитов во фракции красных кровяных клеток с получением обогащенной фракции плодных эритроцитов; плавление геля и центрифугирование обогащенной фракции плодных эритроцитов в градиенте плотности среды с получением фракции, обогащенной содержащими ядро эритроцитами плода. См. Патент США 5 432 054.

Первая стадия центрифугирования дает начальное обогащение, которое отделяет фракцию содержащих ядро красных кровяных клеток низкой плотности и все белые кровяные клетки из фракции безъядерных красных кровяных клеток большей плотности, а также из сыворотки и фракции сывороточных белков. Предпочтительно, чтобы первая центрифужная пробирка была выполнена из мягкого пластического материала, для того чтобы облегчать движение клеток крови по пробирке. Подходящие пробирки описаны в Патенте США 5 422 018. Пластмассовые пробирки в форме песочных часов предпочтительно поддерживаются внутри центрифуги для предотвращения сильной деформации или разрушения пробирки в узких участках центрального канала. Такая поддержка может быть осуществлена с помощью различных средств. Например, пробирка может быть обернута твердым удаляемым литым материалом. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пробирка поддерживается с помощью жидкой поддерживающей среды внутри большего по размеру сосуда, такого как пробирка. Уровень жидкости должен быть таким, чтобы по меньшей мере покрывать узкую часть пробирки. Предпочтительно, чтобы вес того объема жидкостной поддерживающей среды, который замещается опытной пробиркой, был эквивалентен весу объема опытной пробирки и ее содержимого. Предпочтительной для использования жидкой поддерживающей средой является вода.

После первой стадии центрифугирования получают фракцию, включающую в себя содержащие ядро красные кровяные клетки. Эта фракция содержит также белые кровяные клетки. Верхняя часть пробирки содержит фракцию плазмы. Содержащие ядро красные кровяные клетки, которые характеризуются большей плотностью, чем плазма, но меньшей плотностью, чем другие красные кровяные клетки, перемещаются при фракционировании в верхнюю часть скопления красных кровяных клеток, собирающихся сразу под плазмой, и будут в этой связи в различной степени перемешаны с белыми кровяными клетками. Использование откалиброванной пробирки для первого центрифугирования позволяет легко осуществить экстрагирование нужной фракции из узкого участка первой пробирки, что таким образом сводит к минимуму включение других фракций крови, в том числе сыворотки и плазмы, имеющихся на первой стадии центрифугирования.

Фракцию, содержащую красные кровяные клетки и белые кровяные клетки, подвергают гемолизу для дифференцированной деструкции материнских красных кровяных клеток. Дифференциальный гемолиз материнских красных кровяных клеток позволяет осуществить деструкцию значительного числа остающихся материнских красных кровяных клеток при сохранении большинства клеток плодного происхождения (См. Boyer, et al. , Blood, 47(6): 883-897 (1976)). Дифференциальный гемолиз может быть проведен в любом подходящем реакционном сосуде. В предпочтительном варианте реализации изобретения дифференциальный гемолиз материнских красных кровяных клеток проводят в верхней части второго центрифужного стакана так, чтобы реакция гемолиза могла быть остановлена при центрифугировании реакционных продуктов, например консервированных красных кровяных клеток, в градиенте плотности среды, что ведет к удалению красных кровяных клеток от гемолитических реагентов.

Дифференциальный гемолиз основан на том факте, что красные кровяные клетки могут быть разрушены в растворах, содержащих гемолитические агенты, такие как аммониевые (NH_4-) и бикарбонатные (НСО_3-) ионы. Разрушение клеток может быть замедлено ингибиторами фермента карбоангидразы. Уровень карбоангидразы по меньшей мере в пять раз выше в эритроцитах из взрослых организмов, чем в плодных эритроцитах. Так, скорость гемолиза, опосредованного уровнем NH₄-HCO₃, ниже в плодных красных кровяных клетках, включая содержащие ядро плодные красные кровяные клетки, чем в красных кровяных клетках из взрослого организма, особенно в присутствии ингибиторов карбоангидразы. Предпочтительные ингибиторы карбоангидразы для применения согласно изобретению включают ацетазоламид, этоксзоламид (6-этоксизоламид. Сигма Кемикал Ко. (Sigma Chemical Со. )) и метоксзоламид.

Дифференциальный гемолиз приводит к получению популяции белых кровяных клеток в сочетании с красными кровяными клетками, обогащенной в отношении красных кровяных клеток плода. Обогащенную фракцию красных кровяных клеток плода затем центрифугируют в градиенте плотности среды для сбора фракции, обогащенной плодными содержащими ядро красными кровяными клетками, и для удаления фрагментов красных кровяных клеток, появившихся в результате гемолитической реакции, а также большей части белых кровяных клеток. Исходный образец 20 мл периферической крови с имеющимися в нем содержащими ядро красными кровяными клетками плода может быть уменьшен в объеме до 2 микролитров, что позволяет облегчить идентификацию и анализ с помощью микроскопии на предметном стекле или полимеразно-цепной реакции.

На стадии второго центрифугирования используют среду с градиентом плотности. Ожидается, что содержащие ядро красные кровяные клетки после гемолиза будут при разделении в градиенте плотности находиться в равновесии примерно в слое той же самой плотности, что и гранулоциты, представляющие собой компонент фракции белых кровяных клеток, в соответствии с описанием, приведенным в международной заявке РСТ . WO 93/23754. Соответствующий подбор тонуса и плотности градиентной среды позволяет провести разделение и обогащение плодных содержащих ядро эритроцитов из компонентов фракции белых кровяных клеток образца.

Предпочтительная среда с градиентом плотности включает коллоид, диспергированный в плавящемся геле. См. Патент США 5 489 386. Коллоид придает нужную плотность градиентной среде. Так, при изменении концентрации коллоида может быть соответствующим образом изменена плотность среды. Особая природа коллоида позволяет осуществлять иммобилизацию отдельных слоев с конкретной плотностью без диффузии одного слоя в другой, пока среда находится в гелеобразном состоянии. Кроме того, коллоид способен поддерживать клетки крови, по существу, в неагрегированном состоянии. Предпочтительным коллоидом, который придает среде надлежащую плотность, является кремнезем, покрытый поливинилпирролидоном, например Percoll^тм, производимый компанией Pharmacia и распространяемый компанией Sigma Chemical Co.

Среда с градиентом плотности, применяемая для обогащения содержащих ядро эритроцитов, является гипертонической. В гипертонических условиях красные кровяные клетки сморщиваются и становятся более плотными, тогда как белые кровяные клетки в этих условиях сохраняют постоянную плотность. Таким образом, при селективном сморщивании эритроцитов в гипертонической среде плотность этих клеток повышается и они находятся в равновесии при разделении в градиенте плотности со слоем уже другой плотности, нежели белые кровяные клетки.

Методы обогащения - проточная цитометрия и другие
Обогащение образца крови может быть проведено с использованием различных методик, таких как клеточный пэннинг, микродиссекция под световым микроскопом, проточная цитометрия и/или разделение магнитных шариков или частиц. Так, например, антитела, специфичные к маркерам материнского организма или зрелых клеток, и/или антитела, специфичные ко второму плодному маркеру, могут быть введены в способ согласно изобретению с тем, чтобы дополнительно обогатить образец плодными клетками. При этом может быть применен либо метод позитивного, либо метод негативного отбора, то есть может проводиться либо повышение уровня желательных плодных клеток, либо отбор нежелательных зрелых клеток. При этом колонка для связывания антитела может использоваться либо сама по себе, либо в сочетании с другими методиками обогащения.

Мюллер с соавт. (Mueller, et al. , in Lancet, 336: 197 (1990)) описывает метод выделения трофобластных клеток плацентарного происхождения, полученных из крови беременных женщин, с использованием магнитных шариков. Существуют также другие вариации методик, связанные с прикреплением антител к шарикам (см. Thomas, et al. , J. Immunol. , 120: 221 (1989) and deKretser, et al. , Tissue Antigens, 16: 317 (1980)). В литературе обсуждается также альтернативный метод обогащения (Berenson, et al. , J. Immunol. Methods, 91: 11 (1986)), в соответствии с которым высокое сродство между белком авидином и витамином биотином используется для создания непрямого метода иммуноадсорбции.

При проточной цитометрии клетки могут быть проанализированы и рассортированы на проточном сортировщике клеток на основании свойств клеток рассеивать свет вперед и в сторону. В каждом эксперименте устанавливаются эмпирические параметры, связанные со свойствами прямого и бокового рассеивания света. В целом метод состоит в том, что усилитель фотомножительной трубки для обнаружения прямого рассеивания света и бокового рассеивания света корректируется в каждом направлении для распределения групп сигналов от клеток по каналам так, чтобы это было доступно для анализа с использованием способа, хорошо известного специалистам в данной области. В таких условиях получают характерную картину или скаттерграмму. Анализ образцов крови позволяет выявить основные типы клеток на диаграмме рассеяния, а именно моноцитарные клетки, лимфоциты и гранулоциты, каждый из которых имеет различные характеристики светорассеяния. Участок моноцитарных клеток, участок гранулоцитов и участок лимфоцитов клеток на диаграмме рассеяния закрыты, так чтобы клетки, которые классифицируются как моноциты, гранулоциты или лимфоциты, могли быть дальше проанализированы или собраны проточным сортировщиком клеток.

Дальнейший анализ может быть осуществлен при окрашивании клеток с использованием моноклональных антител, меченных флуоресцентным веществом, или при проведении гибридизации клеток in situ с использованием зондов олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты, меченных флуоресцентными веществами. В этих условиях клетки, обладающие способностью к прямому рассеянию света, также анализируются в присутствии флуоресцентного вещества. При использовании антител, меченных флуоресцирующим веществом, проводят контрольные эксперименты с использованием изотипически меченных контрольных моноклональных антител. При использовании зондов олигонуклеотида, связанных с флуоресцентными веществами, контроли включают олигонуклеотидные последовательности, не родственные последовательностям млекопитающих.

Собранные образцы наносят на одно или более предметных стекол, при этом на каждом отдельном предметном стекле должно быть не более чем 2-3000000; необходимо соблюдать осторожность, чтобы осажденные клетки образовали монослой и чтобы концентрация клеток на предметном стекле была достаточно невысокой, так чтобы клетки не наслаивались друг на друга. В других случаях клетки собирают в микроцентрифужные пробирки и фиксируют в суспензии в соответствии с обычной описанной процедурой.

Для обнаружения нуклеиновых кислот в плодных клетках может быть использован проточный цитометр (Coulter, Profile II, Coulter, Haileah, FL). Для сортировки плодных клеток из образца материнской крови может быть использована система Epics Elite (Coulter, Haileah, FL).

Предпочтительно для проведения проточной цитометрии и идентификации плодных клеток использовать лазерный "сортировщик" клеток по интенсивности флуоресценции, в котором используется флуоресцеин в качестве метки или краситель, прямо или опосредованно связывающийся с антителом.

Другие маркеры
Для определения того, является ли клетка плодной, используют второй маркер плода. Так, например, могут использоваться антитела к репрезентативным плодным клеточным маркерам. В случае красных кровяных клеток плода предпочтительно использовать плодный гемоглобиновый маркер, такой как антитело к гамма-цепи плодного гемоглобина.

В качестве маркеров плодных клеток могут также использоваться последовательности РНК, специфичные для плодных клеток. Такие последовательности представляют собой транскрипты, например, гена плодного гемоглобина. Последовательности таких генов и других могут быть получены из банка последовательностей Genetic Sequence Data Bank, GenBank, version 69.0. Зонд ДНК или популяция зондов, включающих такие последовательности, синтезируется в виде олигодезоксинуклеотида с использованием коммерческого синтезатора ДНК, такого как модель 380В (Model 380B) от Applied Biosystems, Inc. , Foster City, CA. Пробы могут состоять из натуральных нуклеотидных оснований или известных аналогов натуральных нуклеотидных оснований, включая те из них, которые модифицированы для связывания с меткой.

В случае негативной селекции может использоваться маркер зрелых клеток, такой как антитело против CD45, CD13 и/или CD34, которое селективно связывается с белыми кровяными клетками. Антитела против CD44 могут также включаться для удаления загрязняющего материала красных кровяных клеток из материнского организма. Добавление антител против CD31 может способствовать специфическому удалению загрязняющих тромбоцитов. Предпочтительно, могут использоваться антитела, действие которых направлено на бета-цепь гемоглобина из взрослого организма.

Нуклеиновые кислоты и белки плода
Как только плодные клетки выделяются из материнской крови, их можно культивировать для увеличения числа клеток, применяемых для диагностики (см. Fibach, et al. , Blood, 73: 100 (1989)).

В соответствии с приведенной ниже процедурой могут быть отобраны или выделены определенные плодные белки и/или нуклеиновые кислоты. Клетки могут быть подвергнуты лизису, что делает доступными для анализа нуклеиновую кислоту или белок. В некоторых случаях плодная ДНК может быть экстрагирована из других комплексов, например, при нагревании, что делает ее доступной для гибридизации с зондами нуклеиновой кислоты. Перед анализом плодная ДНК может быть амплифицирована с использованием таких методов, как полимеразно-цепная реакция (ПЦР) или лигазно-цепная реакция (ЛЦР).

Если проводится реакция амплификации, сортированные образцы амплифицируются в ходе приемлемого числа циклов денатурации и отжига (например, примерно 25-60 циклов). Контрольные образцы могут включать в себя пробирку, в которую не добавляется ДНК, для того чтобы отслеживать ложную позитивную амплификацию. При соответствующей модификации условий ПЦР одновременной амплификации может быть подвергнуто более одного отдельного плодного гена. Эта методика, известная как "мультиплексная" амплификация, была использована с шестью наборами праймеров для диагностики наследственной мышечной дистрофии Дюшенна (см. Chamberlain, et al. , Prenat. Diagn. , 9: 349-355 (1989)). В случае проведения амплификации полученный продукт амплификации представляет собой смесь, которая содержит интересующую амплифицированную ДНК плода, например ДНК, присутствие которой должно быть обнаружено и/или количественно определено.

Амплифицированную исходную плодную ДНК и другие последовательности ДНК отделяют с использованием известных методик. Последующий анализ амплифицированной ДНК также проводят с использованием известных методик, таких как расщепление с применением рестрикционной эндонуклеазы, выявление под ультрафиолетом в агарозных гелях, окрашенных бромидом этидия, секвенирование ДНК или гибридизация с аллель-специфичными олигонуклеотидными пробами (см. Saiki, et al. , Am. J. Hum. Genet. , 43 (Suppl. 5: A35 (1988)). Такой анализ позволяет определить, существуют ли полиморфные различия между образцами амплифицированного "материнского" и "плодного" материалов. Амплифицированная смесь может быть разделена по размеру, и отделенную по размеру плодную ДНК затем приводят в контакт с соответствующим(ими) отобранным(ыми) зондом или зондами ДНК (ДНК должна быть достаточно комплементарной к интересующей плодной ДНК, для того, чтобы она могла гибридизоваться с искомой плодной ДНК в используемых условиях). В основном зонды ДНК метят с использованием описанных выше меток. Плодную ДНК, полученную после разделения по размеру, и отобранные пробы ДНК выдерживают в соответствующих условиях достаточное для гибридизации комплементарных последовательностей ДНК время, что приводит к получению комплексов плодной ДНК/ДНК зонда и затем известными методами проводят выявление этих комплексов. Так, например, если зонд был помечен, комплекс плодная ДНК/меченый зонд ДНК обнаруживают и/или количественно определяют (например, с помощью ауторадиографии, обнаружения флуоресцентной метки). Количество меченого комплекса (и, в этой связи, плодной ДНК) может быть определено при сравнении со стандартной кривой (на основании заданной связи между количеством обнаруженной метки и полученным результатом).

Выявление генетических аномалий
С помощью настоящего метода может быть обнаружено и/или количественно определено наличие плодной ДНК, связанной с заболеваниями или болезненными состояниями. В каждом случае используют соответствующий зонд для выявления интересующей последовательности. Так, например, в качестве зондов используют Stl4 (Oberle, et al. , New Engl. J. Med. , 312: 682-686 (1985)), 49a (Geurin, et al. , Nucleic Acids Res. , 16: 7759 (1988)), KM-19 (Gasparini, et al. , Prenat. Diagnosis, 9: 349-355 (1989)) или подверженные делении для обнаружения гена наследственной мышечной дистрофии Дюшенна (DMD) (Chamberlain, et al. , Nucleic Acids Res. , 16: 11141-11156 (1988)). Stl4 представляет собой высокополиморфную последовательность, выделяемую из длинного плеча Х-хромосомы, которая может использоваться для различения ДНК особи женского пола от материнской ДНК. Она картирована вблизи гена для фактора VIII: С и, в этой связи, может также использоваться для пренатальной диагностики гемофилии А. Могут также использоваться праймеры, соответствующие последовательностям, фланкирующим шесть наиболее часто делетируемых экзонов в гене DMD, которые успешно используются для диагностики DMD с помощью ПЦР (см. Chamberlain, et al. , Nucleic Acids Res. , 16: 11141-11156 (1988)). Другие состояния, которые также могут быть определены при диагностике настоящим методом, включают синдром Дауна, β-талассемию (Саl, et al. , Blood, 73: 372-374 (1989); Саi, et al. , Am. J. Hum. Genet, 45: 112-114 (1989); Saiki, et al. , New Engl. J. Med. , 319: 537-541 (1988)), серповидно-клеточную анемию (Saiki, et al. , New Engl. J. Med. , 319: 537-541 (1988)), фенилкетонурию (DiLella, et al. , Lancet, 1: 497-499 (1988)) и болезнь Гоше (Theophilus, et al. , Am. J. Hum. Genet, 45: 212-215 (1989)).

Генетические аномалии, выявляемые согласно изобретению, могут представлять собой делении, вставки, амплификации, транслокации и перегруппировки.

Так, например, делецию можно не выявить, обнаружив отсутствие связывания при гибридизации зонда с последовательностью-мишенью. Для обнаружения делеции в генетической последовательности готовят популяцию зондов, комплементарных к последовательности нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в нормальной плодной клетке, но отсутствуют в аномальной клетке. Если зонды гибридизуются с последовательностью в исследуемой клетке, то такая последовательность обнаруживается и клетка является нормальной в отношении этой последовательности. Если зонды не гибридизуются с клеточной нуклеиновой кислотой, то это означает, что указанная последовательность не обнаруживается в данной клетке, и клетка обозначается как аномальная, при
том условии, что контрольная последовательность, такая как хромосома X, обнаруживается в той же самой клетке.

Вставка может быть определена при обнаружении связывания меченого зонда с полинуклеотидным повторяющимся сегментом хромосомы. Для обнаружения вставки в генетической последовательности, такой как инсерция в хромосому, или кариотипической аномалии, такой как трисомия хромосомы 21, характерной для синдрома Дауна, получают популяцию зондов, комплементарных данной генетической последовательности. Рассматривая пример синдрома Дауна, можно отметить, что если зонды, комплементарные к хромосоме 21, гибридизуются с тремя видами последовательности хромосомы 21 в клетке, то все три вида последовательности хромосомы 21, таким образом, могут быть обнаружены, что указывает на трисомию, свойственную синдрому Дауна. Если обнаружение проводят, например, с помощью флуоресцентного красителя, то три различные точки флуоресценции, видимые в каждой клетке, также будут указывать на наличие трисомии.

При наличии амплификации конкретного фрагмента ДНК имеет место интенсивность сигнала от меченого зонда к последовательности, которая подвергается амплификации. С использованием любого количества визуализирующих систем анализа такой сигнал оценивается количественно и затем сравнивается с нормальными контролями для определения того, имеет ли место конкретная мутация амплификации.

Наличие транслокации или перегруппировки может быть определено несколькими методами. Так, например, меченый первый зонд может быть связан с маркерным участком хромосомы, который не был подвергнут транслокации. Второй меченый зонд затем связывают со вторым участком на той же самой хромосоме (для выявления перегруппировки) или второй хромосомой (для выявления транслокации), и затем проводят выявление связывания первого и второго зондов. Альтернативно транслокация может быть определена при первом связывании меченого зонда с маркерным участком полинуклеотидной секции хромосомы, которая подверглась транслокации или перегруппировке, обычно во время метафазы. И затем выявляют сам факт связывания меченого зонда.

Так, например, для обнаружения транслокации идентифицируют маркер рассматриваемой хромосомы и приготавливают популяцию зондов для проведения селективной гибридизации с ним. Их маркируют хорошо обнаруживаемой меткой, такой как краситель, который флуоресцирует при определенной длине волны. При этом тестировании также определяется последовательность, которая подверглась транслокации или перегруппировке в случае имеющейся аномалии, в связи с чем приготавливают вторую популяцию зондов для того, чтобы идентифицировать ее. Члены второй популяции зондов маркируют различающимися метками, такими как краситель, который флуоресцирует при различной длине волны, исходящей от первой серии меченых зондов. Проводят гибридизацию in situ с использованием обеих популяций зондов, и результаты гибридизации каждой из популяций зондов сравнивают. Если значения по первой и второй меткам совпадают практически во всех клеточных образцах, то транслокация не имеет места. Если первая метка не совпадает со второй меткой на значительном участке фракции образцов, то транслокация или перегруппировка имеет место (см. Speleman, Clinical Genetics, 41 (4): 169-174 (1992); and Gray, Progress in Clinical and Biol. Res. , 372: 399-411 (1991)).

Гибридизация нуклеиновой кислоты
В контексте настоящего описания термин "нуклеиновые кислоты" относится либо к ДНК, либо к РНК. Термин "последовательность нуклеиновой кислоты" или "полинуклеотидная последовательность" относится к одноцепочечному или двухцепочечному полимеру дезоксирибонуклеотидного или рибонуклеотидного основания, читаемых в направлении от 5'- к 3'- концу. Он включает в себя как самореплицирующиеся плазмиды, инфекционные полимеры ДНК или РНК, так и нефункциональные ДНК или РНК.

"Зонды нуклеиновой кислоты" могут представлять собой фрагменты ДНК или РНК. Фрагменты ДНК могут быть получены, например, при расщеплении плазмидной ДНК или при использовании ПЦР, или могут быть синтезированы либо с применением фосфорамидитного метода (Beaucage and Carruthers, Tetrahedron Lett. , 22: 1859-1862 (1981)), либо с помощью триэфирного метода, также описанного в литературе (Matteucci, et al. , J. Am. Chem. Soc. , 103: 3185 (1981)). Если желательно, может быть затем получен двухцепочечный фрагмент при совместном отжиге химически синтезированных единичных цепей в соответствующих условиях или при синтезировании комплементарной цепи с использованием ДНК-полимеразы и при наличии праймера надлежащей последовательности. Там, где известна конкретная последовательность зонда нуклеиновой кислоты, очевидно, что комплементарная цепь может быть идентифицирована и включена. Комплементарная цепь при этом одинаково хорошо работает в ситуациях, когда мишенью является двухцепочечная нуклеиновая кислота.

Фраза "селективно гибридизуется" относится к зонду нуклеиновой кислоты, который гибридизуется, образует дуплекс или связывается только с конкретной целевой последовательностью ДНК или РНК, когда такие целевые последовательности присутствуют в препарате общей клеточной ДНК или РНК. Термины "комплементарный" или "целевые" последовательности нуклеиновой кислоты относятся к таким последовательностям нуклеиновой кислоты, которые селективно гибридизуются с зондом нуклеиновой кислоты. Соответствующие условия отжига зависят, например, от длины зонда, состава оснований и количества ошибочных спариваний и их положения в зонде и зачастую должны определяться только эмпирически. В литературе имеются сообщения о разработке зондов нуклеиновых кислот и условий отжига (см, например, Sambrook, et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2nd ed. ), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) and Ausubel, et al. , Current Protocols in Molecular Biology, ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)).

Нуклеиновые кислоты, применимые для использования в качестве зондов, химически синтезируются по методу твердофазного фосфорамидитного триэфирного синтеза (впервые описан Beaucage and Carruthers, Tetrahedron Lett. , 22(20): 1859-1862 (1981)) с использованием автоматизированного синтезатора (как описано Needham-VanDevanter, et al. , Nucleic Acids Res. , 12: 6159-6168 (1984)). Очистку олигонуклеотидов проводят либо электрофорезом в нативном акриламидном геле, либо методом анионообменной ВЭЖХ (как описано Pearson and Regnier, J. Chrom. , 255: 137-149 (1983)). Последовательность синтетического олигонуклеотида может быть подтверждена с использованием метода химической деградации Максама и Гилберта (Maxam and Gilbert, in Grossman and Moldave, eds. Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65: 499-560 (1980)).

В настоящее время в технике известно множество методов для измерения специфических ДНК и РНК с использованием техники гибридизации нуклеиновых кислот. Например, один метод оценки наличия или отсутствия ДНК в образце включает оценку переноса в Саузерн-анализе. Вкратце, метод состоит в том, что расщепленную геномную ДНК разгоняют на пластинках с агарозным гелем в буфере и переносят на мембраны. Проводят гибридизацию с использованием зондов нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, зонды нуклеиновой кислоты имеют длину в 20 оснований или больше (см. Sambrook et al. , Методы отбора последовательностей зондов нуклеиновых кислот для использования в гибридизации нуклеиновых кислот). Визуализация гибридизованных частей позволяет качественно определить наличие или отсутствие ДНК.

Сходным образом нозерн-анализ может быть использован для обнаружения мРНК. Вкратце, метод состоит в том, что мРНК выделяют из данного клеточного образца с использованием метода кислотной гуанидин-фенол-хлороформной экстракции. Затем мРНК подвергают электрофорезу для разделения имеющихся видов мРНК, и мРНК переносят с геля на нитроцеллюлозную мембрану. Как в случае Саузерн-блоттинга, используют меченые пробы для идентификации наличия или отсутствия соответствующей мРНК.

В настоящее время специалистам в данной области известно множество режимов для проведения гибридизации нуклеиновых кислот. Так, например, общий режим включает сэндвич-анализ и конкурентный или заместительный анализ. Техника гибридизации в основном описана в литературе в приведенных ниже ссылках ("Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach", Ed. Hames, and Higgins, IRL Press. , 1985; Gall and Pardue, Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 63: 378-383 (1969); and John, Burnsteil and Jones, Nature, 223: 582-587 (1969)).

Желательно использование в качестве фиксатора этанола, в частности, в виде раствора 80% этанол/вода (объем/объем), на стадии подготовки клеток к гибридизации in situ. Другие используемые осаждающие фиксаторы включают в себя уксусную кислоту, метанол, ацетон и их сочетания, например смесь этанола/метанола 3: 1. Другие используемые фиксаторы также хорошо известны специалистам в данной области. Фиксация и гибридизация фиксируемых клеток в общем описана в патенте США 5 225 326. Фиксаторы должны способствовать лучшей сохранности клеточной морфологии, сохранять и поддерживать доступность антигенов и содействовать высокой эффективности процесса гибридизации. В качестве фиксаторов могут также выступать некоторые соли и очень высокие температуры, что достигается, например, при пронесении предметного стекла над пламенем.

Фиксаторы могут содержать соединения, которые фиксируют клеточные компоненты за счет сшивания их друг с другом, такие, например, как параформальдегид, глютаральдегид или формальдегид. Сшивающие агенты, которые сохраняют ультраструктуру, часто снижают эффективность гибридизации за счет образования сетки, которая захватывает нуклеиновые кислоты и антигены и делает их недоступными для зондов и антител. Некоторые сшивающие агенты также модифицируют нуклеиновые кислоты с помощью ковалентных связей, что мешает дальнейшему образованию гибрида.

Раствор для гибридизации в типичном случае содержит хаотропные денатурирующие агенты, которые включают в себя формамид, мочевину, тиоциантема гуанидин, трихлорацетат, тетраметиламин, перхлорат и иодид натрия. Может использоваться любой буфер, который поддерживает значение рН по меньшей мере примерно от 6,0 до примерно 8,0 и предпочтительно в диапазоне от 7,0 до 8,0.

Разное
Для осуществления настоящего изобретения могут использоваться различные типы твердых носителей. Такие поддерживающие носители включают стекло, найлон, нитроцеллюлозу и другое. Наиболее предпочтительно использование стеклянных или пластмассовых предметных стекол для микроскопии. Использование таких носителей и процедуры нанесения образца на них известны специалистам в данной области. Выбор поддерживающего материала носителя зависит от способа визуализации клеток и от процедуры количественного определения.

Кроме того, для распознавания хроматина, ядерных белков, ядерных компонентов ДНК и др. могут использоваться красители, специфичные для окрашивания ядер. Такие красители включают в себя метиленовый синий, гематоксилин, ДАФ 1 (диаллилфталат), иодид пропидиния, тионин и др.

Настоящее изобретение охватывает также различные методы окрашивания хромосом. Окрашивание хромосом описано в патенте США 5447841. В типичном случае гетерогенные смеси меченых фрагментов нуклеиновых кислот и зондов не содержат повторяющихся последовательностей. Может быть окрашен полный геном, отдельные хромосомы, субрегионы хромосом и др. , обычно на стадии метафазы клеточного цикла.

Наборы
Может быть получен набор, используемый при осуществлении метода согласно изобретению выделения и обнаружения интересующей плодной ДНК, в таком случае, как, например, обнаружение хромосомной аномалии, связанной с заболеванием или другим состоянием, в образце материнской крови. Он включает, например, контейнер для хранения необходимых реагентов; реагенты и необязательно твердый носитель для использования с целью отделения комплексов, содержащих ядро плодных клеток/специфических антител, от других компонентов образца или для удаления комплексов материнских клеток со специфическим антителом. Предпочтительно, в рамках настоящего изобретения разработан набор для идентификации содержащих ядро эритроцитарных или эритробластных клеток плода, который включает в себя меченое антитело к эмбриональному гемоглобину, при этом указанная метка представляет собой флуорохром, фермент или биотин. Альтернативно, антитело к эмбриональному гемоглобину связывают с антигенным гаптеном, и второе меченое антитело, действие которого направлено на гаптен или гемоглобиновое антитело, используют для захвата. В число компонентов набора могут входить другие ингредиенты, такие как пробирка для фракционирования крови, реагенты для гемолиза, среда с градиентом плотности, лизируюшие агенты, меченые зонды нуклеиновой кислоты и другие, а также инструкция по применению.

Так, например, реагенты в наборе, используемом для обнаружения искомой плодной ДНК после амплификации плодной ДНК с использованием ПЦР, могут включать: 1) по меньшей мере одно антитело, специфичное к эмбриональному гемоглобину или его цепи; отобранные праймеры ДНК для использования в амплификации плодной ДНК методом ПЦР; и по меньшей мере один зонд ДНК, комплементарный к плодной ДНК, подлежащей обнаружению (искомой плодной ДНК). Как указано, набор может также включать в себя твердый носитель, который используется для отделения образованных комплексов от других компонентов образцов. Таким твердым носителем может быть, например, стекло в предметном стекле, нитроцеллюлозный фильтр или иммуномагнитные шарики, а также может иметь вложенное в набор антитело, селективное относительно антитела, имеющегося в комплексах плодной содержащей ядро клетки/специфичного антитела. Другие наборы могут включать в себя раствор, содержащий коктейль для фиксации/гибридизации, и один или более меченых зондов. Набор может также содержать средства и инструкции для проведения реакции гибридизации. Кроме того, набор может включать фотопленку или эмульсию для записи результатов анализов, проведенных в соответствии с настоящим изобретением.

Еще одним аспектом настоящего изобретения может быть набор, применяемый для обогащения и обнаружения плодных клеток в образце крови, например в образце материнской крови или крови пупочного канатика. Такой набор может содержать один или более реагентов для приготовления градиента плотности с целью концентрирования плодных клеток. Могут быть также включены меченые антитела, применяемые для обнаружения плодных клеток и/или зондов, специфичных для мРНК и/или ДНК плодной клетки, и средства и инструкции для проведения обогащения плодных клеток.

Альтернативный набор может содержать одно или более антител, желательно связанных с твердым носителем, для реализации позитивного или негативного способа концентрирования плодных клеток в образце, зонды, специфичные для определенных последовательностей хромосомной ДНК, средства и инструкции для проведения обогащения плодных клеток с использованием, центрифугирования в градиенте плотности или проточной цитометрии и необязательно один или более реагентов для приготовления градиента плотности, который позволяет концентрировать плодные клетки.

Такой набор необязательно может содержать реагенты и материалы для реализации любого из методов согласно изобретению в автоматизированном режиме.

Примеры
Приведенные ниже примеры даны только с целью иллюстрации и никоим образом не с целью ограничения области настоящего изобретения. Специалистам со средним уровнем знаний в данной области очевидно, что в настоящее изобретение, не выходя за рамки данной области, могут быть внесены вариации и модификации.

Готовят клиновидные мазки из крови канатика абортированного плода после 14 недель беременности, цельной крови матери (после аборта) и смеси в пропорции 1: 25 указанной выше крови из канатика и образца материнской крови. Мазки высушивают под вентилятором в течение получаса при комнатной температуре, фиксируют в 100% метаноле при -20^oС в течение 10 минут и затем в 100% ацетоне в течение 10 минут при -20^oС.

Затем предметные стекла промывают в PBS (10 мМ фосфатно-буферный раствор (рН 7,4)) в течение 5 минут при комнатной температуре при умеренном перемешивании и фиксируют в 2% формальдегиде/PBS при комнаткой температуре в течение 10 минут при умеренном перемешивании. После промывания предметных стекол дважды в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре при умеренном перемешивании предметные стекла затем промывают дважды TBS (100 мМ трис-HCl, рН 7,6) в течение 5 минут при комнатной температуре при умеренном перемешивании.

Образцы обрабатываются блокирующим агентом при нанесении 20 мкм TNBB (0,5% блокирующий реагент (Boehringer Mannheim) и 1% БСА в 100 мМ TBS) на покровном стекле размером 24х60 для окрашивания с обеих сторон. Затем мазки помещают образцом вниз в пятно TNBB. Препарат с покровным стеклом помещают в пластмассовую коробку для хранения предметных стекол, которую, в свою очередь, помещают в открытую влажную камеру, содержащую пропитанное водой бумажное полотенце. И, наконец, влажную камеру ставят в эксикатор и всю конструкцию помещают на 15 мин при комнатной температуре под вакуум (Precision Vacuum Pump Model DD20). Предметные стекла удаляют из эксикатора и проводят иммунное окрашивание.

Покровные стекла осторожно удаляют и к каждому предметному стеклу добавляют 100 мкл коктейля, содержащего в разведении 1: 250 мышиное анти-НbЕ (эмбриональный гемоглобин эпсилон) (моноклональное) антитело и в разведении 1: 10 кроличье анти-HbF (гамма-глобина плода) (поликлональное) биотинилированное антитело в TNBB/0,75% Tween 20. Мазки покрывают свежим покровным стеклом и, как показано выше, предметные стекла инкубируют в пластмассовой коробке для хранения покровным стеклом вниз в открытой влажной камере в эксикаторе, помещенном под вакуум на 15 мин.

Покровные стекла осторожно удаляют и предметные стекла промывают при комнатной температуре при умеренном перемешивании в TBS в течение 10 мин и затем дважды промывают в течение 5 мин. К каждому предметному стеклу добавляют 100 мкл второго коктейля, содержащего в разведении 1: 100 меченное флуоресцеин-изотиоцианатом козье антитело антимышинное в разбавлении 1: 100 техасский красный, конъюгированный с лошадиным антикроличьим антителом в TNBB/0,75% Tween 20 и инкубируют под вакуумом, как указано выше.

Покровные стекла осторожно удаляют. и предметные стекла промывают при комнатной температуре при умеренном перемешивании в TBS в течение 10 мин и затем промывают дважды в течение 5 мин. Затем предметные стекла высушивают на воздухе и помещают в прибор Vectrashield/DAPI.

Результат:
Указанная выше система окрашивает эмбриональный гемоглобин (hBE, эпсилон-гемоглобин) зеленым флуоресцирующим флуоресцеин-изотиоцианатом, и плодный гемоглобин (HbF, гамма-гемоглобин) флуоресцирующим техасским красным. И, кроме того, ядра содержащих ядро клеток окрашиваются в голубой цвет контрастным красителем DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиндолом).

Антитело против НbЕ (эмбрионального гемоглобина) очень специфично. Флуоресценция флуоресцеин-изотиоцианата (эмбрионального гемоглобина) наблюдалась только в красных кровяных клетках из мазков канатика и смеси крови из канатика: материнской крови. Наблюдались также как содержащие ядро, так и зрелые HbЕ-положительные красные кровяные клетки. Ни в одном из мазков не было обнаружено окрашивания флуоресцеином белых кровяных клеток.

Флуоресценция техасского красного (гамма-гемоглобина) наблюдалась в зрелых красных кровяных клетках во всех трех типах мазков: из канатика, из материнской крови и в их смеси. Она также наблюдалась в содержащих ядро красных кровяных клетках из мазков канатика и смеси из крови канатика: материнской крови. Содержащие ядро красные кровяные клетки, окрашенные или неокращенные, не были обнаружены в мазках из материнской крови. Флуоресценция техасского красного также наблюдалась в цитоплазме некоторых гранулоцитов из мазков, взятых из канатика и материнской крови. Неизвестно, отражает ли эта красная флуоресценция в гранулоцитах поглощение гемоглобина гранулоцитами или представляет собой артефакт полихлонального происхождения антитела.

Мазки, взятые из канатика и смеси, также содержат содержащие ядро и зрелые красные кровяные клетки и окрашиваются положительно как на гамма-, так и на эмбриональный гемоглобин.

Все публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящее описание в качестве ссылок в том объеме, насколько каждая такая индивидуальная публикация или патентная заявка специфически соответствует включению в настоящее описание в качестве ссылки.

Приведенное выше описание предпочтительных вариантов реализации настоящего изобретения представлено только лишь с целью иллюстрации и примера. Они никоим образом не являются исчерпывающими и не нацелены на ограничение настоящего изобретения раскрытыми в них точными формами и очевидно, что различные модификации и вариации возможны в свете приведенного выше описания, которые будут, тем не менее, лежать в рамках настоящего изобретения.

Несмотря на то, что приведенное выше описание изобретения достаточно детально раскрывает его с помощью иллюстраций и примеров, приведенных для большей ясности, очевидно, что некоторые изменения и модификации могут быть внесены в рамках и в духе приведенной формулы изобретения.

Claims (22)

1. Способ идентификации эритроцита или эритробласта плода в образце крови, взятой у беременной женщины в стадии от 9 до 22 недель беременности, при этом указанный способ включает в себя: а) контакт образца крови с антителом или фрагментом антитела против эпсилон-глобиновой цепи эмбионального гемоглобина, при этом антитело или его фрагмент представляет собой первый плодный маркер и при этом антитело или его фрагмент связываются с плодной клеткой; и б) идентификацию клеток, которые связались с антителом или его фрагментом в качестве плодных эритроцитарных или эритробластных клеток.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образец крови представляет собой материнскую кровь человека и плодный эритроцит представляет собой содержащий ядро эритроцит.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антитело представляет собой поликлональное антитело.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное антитело прямо или опосредованно помечено.

6. Способ по п. 1, включающий в себя также контакт образца крови со вторым плодным маркером.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что второй плодный маркер представляет собой антитело или фрагмент этого антитела против гамма-глобиновой цепи плодного гемоглобина.

8. Способ по п. 1, включающий в себя также контакт образца крови с маркером зрелой клетки.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что маркер зрелой клетки представляет собой антитело или фрагмент этого антитела против бета-глобиновой цепи гемоглобина взрослого организма.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки крови находятся в суспензии.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образец крови высушивают на воздухе или химически фиксируют на твердой матрице перед или после контакта с антителом или его фрагментом.

12. Способ по п. 1, включающий в себя также обогащение концентрации плодных клеток в образце крови перед приведением их в контакт с антителом или его фрагментом, для идентификации плодных клеток.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что плодные клетки обогащены в результате применения проточной цитометрии, фракционирования крови, разделения в градиенте плотности или разделения с использованием магнитных шариков.

14. Способ по п. 1, включающий в себя также отбор или выделение нуклеиновой кислоты или белка, содержащихся в плодной клетке после проведения идентификации плодных клеток.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что нуклеиновую кислоту или белок амплифицируют или выявляют.

16. Набор для идентификации плодного содержащего ядро эритроцита или эритробласта в образце крови, взятой у беременной женщины в стадии от 9 до 22 недель беременности, включающий в себя: а) меченое антитело против эпсилон-глобиновой цепи эмбрионального гемоглобина; и б) инструкции по применению.

17. Набор по п. 16, отличающийся тем, что антитело метят с помощью флуорохрома или фермента.

18. Набор для идентификации плодного содержащего ядро эритроцита или эритробласта в образце крови, взятой у беременной женщины в стадии от 9 до 22 недель беременности, включающий в себя: а) антитело против эпсилон-глобиновой цепи эмбрионального гемоглобина, меченное антигенным гаптеном; б) меченое второе антитело против гаптена или против эпсилон-глобиновой цепи эмбрионального гемоглобина; и в) инструкции по применению.

19. Набор для идентификации плодного содержащего ядро эритроцита или эритробласта в образце крови, взятой у беременной женщины в стадии от 9 до 22 недель беременности, включающий в себя: а) антитело против эпсилон-глобина эмбрионального гемоглобина, конъюгированное с биотином; б) меченую молекулу авидина или стрептавидина и в) инструкции по применению.

20. Набор по п. 19, включающий также: а) пробирку для фракционирования крови; б) реагент для гемолиза и в) среду с градиентом плотности.

21. Набор для отбора или выделения последовательности нуклеиновой кислоты в плодном содержащем ядро эритроците или эритробласте, включающий в себя: а) меченое антитело против эпсилон-глобиновой цепи эмбрионального гемоглобина, используемое для идентификации плодных клеток; б) среду с градиентом плотности; в) агент для лизирования плодных клеток после проведения идентификации указанных клеток; г) меченый зонд нуклеиновой кислоты, специфичный в отношении отобранной или выделенной последовательности нуклеиновой кислоты; и д) инструкции по применению.

22. Набор по п. 21, отличающийся тем, что меченый зонд нуклеиновой кислоты представляет собой зонд ДНК или РНК.