KR100523381B1 - 태아 세포를 동정하는데 사용되는 항배아 헤모글로빈 항체 - Google Patents
태아 세포를 동정하는데 사용되는 항배아 헤모글로빈 항체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈액 샘플로부터의 태아세포를 동정하거나 분리하는 시험관내 방법을 제공한다. 태아 유핵 적혈구 또는 적아구는 배아 헤모글로빈 또는 배아 헤모글로빈 사슬에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 사용함으로써 동정된다. 태아 세포를가 동정되면, 이러한 태아 세포는 태아 핵산 또는 단백질의 동정 또는 증폭에 사용될 수 있도록 처리될 수 있다. 소정의 태아 핵산 또는 단백질의 발생 또는 존재를 검출하면 태아의 성별을 검사하고, 염색체, 단일 유전자 또는 단백질 비정상을 검사하며, 특정의 유전자, 핵산 서열 또는 단백질의 존재 또는 부재를 측정함을 포함한 정량적 또는 정성적 진단 또는 태아기 평가가 가능하다.
Description
본 발명은 혈액 샘플로부터 태아 세포를 분리하고 식별하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 임신중인 여성으로부터의 혈액 샘플중에 있는 모체 세포로부터의 태아 유핵 적혈구 및 적아구의 단리 및 식별에 관한 것이다.
태아 조직, 및 특히 태아 DNA 및 염색체는 통상적으로 태아 게놈의 정밀한 평가를 요하는 산전 진단 및 그 밖의 의료 과정에 사용된다. 현재, 태아 조직은 문헌[참조: Thompson and Thompson Genetics in Medicine, 5th Edition, W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1991]에 기재된 바와 같이 양막천자, 융모막융모 샘플링(CVS: chorionic villus sampling), 태아경, 또는 제대 천자(cordocentesis)를 사용함으로써 얻고 있다.
양막천자에서, 태아 세포를 함유하는 양수 샘플은 주사기와 주사바늘을 사용하여 모체로부터 복부를 통해(transabdominally) 채취된다. 양막천자는 자체의 위험 요소를 안고 있다. 주된 위험은 200회의 양막천자 수행중 1회 발생되는 것으로 추정되는 유산의 유발이다. 그 밖의 위험요소로는 모체 감염 및 태아의 물리적인 손상이 있다. CVS에서, 영양막 조직은 융모막의 융모 영역으로부터 자궁경부 또는 복부를 통해 흡인된다. 이러한 방법을 통한 태아 유산율은 100중 1 만큼 높을 수 있다. 제대 천자 또는 경피적인 탯줄 혈액 샘플링은 초음파 유도를 통해 탯줄로부터 직접적으로 태아 혈액을 얻는 방법이다. 각각의 이러한 침습적인 방법은 모체와 태아 모두에게 위험이 따른다.
따라서, 태아 조직 또는 태아 DNA를 얻는 비침습적인 방법이 요구되고 있다. 또한 임상 연구에서 스크리닝 및 산전 진단을 용이하게 하기 위해서, 모체의 조직으로부터 태아 조직을 분리하고 고밀화시키는 신속하고 신뢰성 있는 방법이 요구되고 있다. 최근, 바람직한 방법으로는 모체의 말초 혈액 순환에서 태아 세포를 동정한 다음, 이러한 세포를 유전자 분석을 위해서 축적하는 방법이 있다.
모체 혈액으로부터 태아 세포를 동정하거나 단리하는 방법은 보다 우세한 모체 세포로부터 드물게 존재하는 태아 세포군을 구별해내는 것에 달려있다. 태아 림프구 및 영양막과 같은 다양한 태아 세포 타입이 태아 DNA에 대한 표적 세포로서 동정 과정에서 사용되고 있지만, 태아 유핵 적혈구 세포(nRBC)(또한 유핵 적혈구로 공지됨)에 대해 더 많은 노력이 수행되었다[참조: Cheuh and Golbus, "The Search for Fetal Cells in the Maternal Circulation", J. Perinatol. Med., 19:411 (1991); Simpson, et al., "Noninvasive Screening for Prenatal Genetic Diagnosis", Bull. WHO, 73:799 (1995); and Cheuh and Golbus, "Prenatal Diagnosis Using Fetal Cells from Maternal Circulation", West. J. Med., 159(3): 308 (1993)].
태아 적혈구 세포는 경태반 출혈의 결과로서 태반을 통과하는 것으로 알려져 있다. 태아는 성체의 혈액중에는 거의 없는 유핵 적혈구를 많이 지니고 있기 때문에, 핵형성의 차이는 모체 세포로부터 태아 세포를 분리하고 동정하는데 유용하다.
트랜스페린 수용체와 같은, nRBC에 특이적인 세포 표면 항원에 대한 항체가 태아 세포를 동정하고 고밀화시키는데 사용되고 있다 [Bianchi, et al., "Isolation of Fetal DNA from Nucleated Erythrocytes in Maternal Blood", Proc. Natl. Acad. Sci, 87:3279 (1990)]. 또한 바이언취(Bianchi) 등의 PCT 국제특허출원 PCT/US90/06623(WO 91/07660)호에는 태아 세포의 세포 표면상의 항원과 결합하는 항체를 사용하여 말초 혈액 샘플로부터의 태아 유핵 적혈구 세포를 고밀화시키는 방법이 기재되어 있다.
브레서(Bresser) 등의 PCT 국제특허출원 PCT/US94/08342(WO 95/03431)호에는 태아 헤모글로빈 항체와 mRNA 프로브를 사용하여 모체 혈액중의 태아 세포를 고밀화시키는 방법이 기재되어 있다. 태아 헤모글로빈의 존재는 산 용리 특징에 의해 성체 헤모글로빈으로부터 태아 헤모글로빈을 구별하는 클레이아우어-베트키 반응(Kleihauer-Betke reaction)에 의해 입증되었다 [Kleihauer, et al., "Demonstration von fetalem hamoglobin in den erythrocyten eines blutausstrichs", Klin. Woschenschr, 35:637 (1957); and Saunders, et al., "Enrichment of fetal cells from maternal blood for genetic analysis", American Journal of Human Genetics, 57:287 (1995)].
태아 게놈의 유전자 분석은 때때로 자동화된 판독을 수행하면서 염색체 또는 유전자 특이적 DNA 또는 RNA 프로브를 형광 인 시튜 하이브리드화(FISH)시키고 표적 태아 유전자 또는 DNA를 증폭시킴으로써 수행된다 [Lichter, et al., "Rapid detection of human chromosome 21 aberration analysis using fluorescence in situ hybridization", Proc. Natl. Acad. Sci., 85:9664 (1988); O'Kelley, et al., "Instrumentation for the genetic evaluation of fetal cells from maternal blood", Am. J. Hum. Genet., 57:286 (1995); and Lo, et al., "Prenatal Sex Determination by DNA amplification from maternal peripheral blood", Lancet, 2:1363 (1989)].
발명의 요약본 발명은 (a) 혈액 샘플을, 배아 헤모글로빈의 글로빈 부분에 대해 유도되고 태아 세포와 결합하는 항체 또는 항체 단편과 접촉시키고, (b) 항체 또는 단편에 결합하는 세포를 태아 유핵 적혈구 또는 적아구 세포로서 동정하는 것을 포함하여, 혈액 샘플중의 태아 적혈구, 바람직하게는 유핵 적혈구 또는 적아구 세포를 동정하는 방법을 제공한다. (혈액 샘플은 전형적으로 임신기 동안 모체 말초 순환 혈액으로부터 얻는다)
다양한 항배아 헤모글로빈 항체 또는 이의 단편이 본 발명의 방법에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 배아 헤모글로빈의 엡실론 글로빈 사슬 및/또는 제타 글로빈 사슬에 대해 유도된 항체 또는 이의 단편이 사용될 수 있다. 또한, 제 2의 태아 또는 성숙 세포 마커를 사용하여 요망되는 태아 세포를 추가로 동정하거나 단리할 수 있다.
선택된 태아 세포가 동정되면, 태아 핵산 또는 단백질은 유전자 분석을 위해 세포내에서 증폭되거나 검출될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기된 방법과 함께 사용하기 위한 다양한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 직접 또는 간접적으로 표지된 항배아 헤모글로빈 항체 및 사용 설명서를 포함한다. 또한, 상기 키트내에는 임의로 태아 세포의 농도를 높이기 위한 밀도 구배 매질, 적혈구를 파괴하는 용혈 시약, 용해제 및 핵산 프로브가 포함된다.
특정 구체예에 대한 상세한 설명달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 나타낸다. 본원에 기술된 방법 및 재료와 유사하거나 등가인 모든 방법 및 재료가 본 발명을 실시하고 시험하는데 사용될 수 있지만, 본원에서는 바람직한 방법 및 재료를 기재하였다. 본 발명의 목적상 본원에 사용된 용어는 다음과 같이 정의된다.
본원에 사용된 용어 "적혈구" 또는 "적혈구 세포" 또는 "RBC"는 성체 및 태아 적혈구 세포를 포함하며, 유핵이거나 무핵일 수 있다. 유핵 적혈구가 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "적아구"는 유핵 전구세포를 의미하며, 이로부터의 망상 적혈구가 적혈구로 발달된다. "정상적아구(normoblast)"는 유핵 적혈구 세포, 즉, 적혈구의 직접적인 전구체이다.
본원에 사용된 용어 "배아"는 임신 2 개월 동안의 착상으로부터의 세포 또는 세포들을 의미한다. 전형적으로는 배아 단계 후부터 출산까지의 발생 단계가 태아로 일컬어진다.
태아 혈액 세포는 모체 혈류중에서 순환하는 희귀 세포이다. 태아 세포는 태반을 통해 모체 혈류로 "누출"되는 것으로 믿어진다. 이러한 희귀한 사건의 빈도에 대한 산정치는 다양하기는 하지만, 약 108 세포중의 1 내지 1011 세포중의 1로 보고되었다 [Holzgreve, W. et al., Lancet (1990) i:1220]. 임신 초기 동안, 태아 적혈구 세포는 유핵일 수 있다. 따라서, 무핵 태아 적혈구와는 달리, 이러한 세포는 태아 DNA를 함유하고 있으며, 침습적인 과정을 필요로 하지 않으면서 태아의 유전자 분석에 사용될 수 있다.
헤모글로빈의 개체발생
성체 헤모글로빈의 약 99%는 두 개의 알파 사슬과 두 개의 베타 사슬로 구성되며, 약 1%는 두 개의 알파 사슬과 두 개의 델타 사슬로 구성된다. 태아 헤모글로빈은 두 개의 알파 사슬과 두 개의 감마 사슬을 함유한다.
세 가지의 보다 초기의 배아 헤모글로빈은 제타 (알파 유사 사슬) 및 엡실론 (베타 유사 사슬)로 구성된다. 배아 고우어 2(embryonic Gower 2)는 두 개의 알파 사슬과 두 개의 엡실론 사슬로 구성되지만, 배아 고우어 1 헤모글로빈은 두 개의 제타 사슬과 두 개의 엡실론 사슬로 구성되며, 배아 헤모글로빈 포틀랜드(Portland)는 두 개의 제타 사슬과 두 개의 감마 사슬로 이루어진다 [Gale, et al., Nature, 280:162 (1979); and Maniatis, et al., Ann. Rev. Genetics, 14: 145 (1980)].
본 발명에 의하면, 배아 글로빈 사슬은 임신 약 22주째까지 태아 RBC에 여전히 존재한다는 것이 입증되었지만, 메신저 RNA는 더 이상 존재하지 않는다. 바람직하게는, 이러한 사슬은 임신 약 9주 내지 약 20주째에 검출된다. 태아는 결국 태아 헤모글로빈을 생산하는 것으로 전환되며, 이는 성체 헤모글로빈의 약 1%로서 발견된다. 성체 RBC에는 배아 헤모글로빈이 존재하지 않는다.
헤모글로빈 항체
RBC중의 다양한 특이적 헤모글로빈은 글로빈 사슬의 항원성 부위에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 사용함으로써 구별될 수 있다. 성인 글로빈 (알파 및 베타)에 대한 항체, 태아 글로빈(감마)에 대한 항체 및 배아 엡실론 글로빈에 대한 항체는 시판되고 있다. 어큐레이트 케미칼 앤드 사이언티픽 코포레이션(Accurate Chemical and Scientific Corporation; Westbury, NY), 및 코르텍스 바이오켐(Cortex Biochem; San Leandro, CA)은 엡실론 글로빈 항체를 공급하고 있다.
많은 면역원이 헤모글로빈 사슬 단백질과 특이적으로 반응하는 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다. 재조합 단백질은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 생성을 위한 바람직한 면역원이다. 천연 단백질이 또한 순수하거나 순수하지 않은 형태로 사용될 수 있다. 헤모글로빈 사슬 단백질 아미노산 서열을 사용함으로써 제조된 합성 펩티드가 또한 단백질에 대한 항체의 생성을 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 재조합 단백질은 진핵 세포 또는 원핵세포에서 발현될 수 있으며, 정제될 수 있다. 그런 다음 생성물은 항체를 생성시킬 수 있는 동물내로 주입된다.
폴리클로날 항체의 제조 방법은 본 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다. 요약하면, 면역원, 바람직하게는 정제된 단백질을 애쥬번트와 혼합하고, 동물을 면역화시킨다. 면역원 제제에 대한 동물의 면역 반응을 시험 출혈물을 취하고 반응성의 역가를 측정함으로써 모니터링한다. 면역원에 대한 항체의 적절하게 높은 역가를 얻은 경우에, 혈액을 동물로부터 채취하여 항혈청을 제조한다. 바람직한 경우 단백질에 대해 반응성인 항체를 고밀화시키기 위해 항혈청의 추가 분별화를 수행할 수 있다 [Harlow, et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pulications, New York (1988)].
모노클로날 항체는 본 기술분야의 당업자에게 익숙한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 요약하면, 요망되는 항원으로 면역화된 동물로부터의 비장 세포를 일반적으로 골수종 세포와 융합시킴으로써 불멸화시킨다 [Kohler, et al., Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1976)]. 또 다른 불멸화 방법에는 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus), 종양 유전자 또는 레트로바이러스에 의한 형질전환 또는 당분야에 널리 공지된 그 밖의 방법이 포함된다. 단일 불멸화된 세포로부터 유도되는 콜로니는 항원에 대해 요망되는 특이성 및 친화성을 지닌 항체의 생성을 위해 스크리닝되며, 이러한 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 수율은 척추동물 숙주의 복강내 주입을 포함한 다양한 기술에 의해 증진될 수 있다. 또한, 모노클로날 항체 또는 이의 결합 단편을 엔코딩하는 DNA 서열은 문헌[Huse, et al., Science, 246:1275-1281 (1989)]에 개괄된 일반적인 프로토콜에 따라 사람 B 세포로부터의 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다.
항체의 다양한 성분 또는 단편이 본 발명에 사용될 수 있다. 면역글로불린의 가변 영역은 항원 인식 특이성을 제공하는 부분이다. 특히, 특이성은 초가변 영역으로도 공지되어 있는 면역글로불린의 상보성 결정 영역(CDR)에 존재한다. 면역글로불린은, 예를 들어, Fv, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 그 밖의 단편 뿐만 아니라 단일 사슬을 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다 {[Huston, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883 (1988) and Bird, et al., Science 242:423-426 (1988)]; 일반적으로 [Hood, et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed. (1984), and Hunkapiller and Hood, Nature, 323:15-16 (1986)]}. 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자가 단일 코딩 서열로 결합되어 있는 단일사슬 항체가 또한 사용될 수 있다. 면역글로불린 폴리펩티드는 또한 절단된 면역글로불린사슬, 예를 들어, 천연 폴리펩티드에서 보다 적은 불변 영역 도메인을 함유하는 사슬을 포함한다. 이러한 절단된 폴리펩티드는 결실되는 도메인 서열의 유전자 서열 5'내로 정지 코돈을 도입시키는 것과 같은 표준방법으로 생성될 수 있다. 그런 다음 절단된 폴리펩티드는 절단된 항체로 조립될 수 있다. 또한 본원에 사용된 항체에는 하기 문헌에 기재된 방법에 의한 바와 같이 생성될 수 있는 이중 특이적(bispecific) 항체가 포함된다. 문헌[Glennie et al., J. Immunol., 139:2367-2375 (1987); Segal, et al., Biologic Therapy of Cancer Therapy of Cancer Updates, 2(4):1-12 (1992); and Shalaby, et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)]. 단일 특이적(monospecific) 및 이중 특이적 면역글로불린은 또한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다.
"키메라" 항체는 면역글로불린 유전자에 의해 엔코딩되며, 이러한 면역글로불린 유전자는 경쇄 및 중쇄 유전자가 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 절편으로 구성되도록 유전공학처리된다. 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체로부터의 유전자의 가변(V) 절편은 사람 불변(C) 절편에 결합될 수 있다. 이러한 키메라 항체는 마우스 가변 영역 뿐만 아니라 마우스 불변 영역을 지니는 항체 보다 사람에게 덜 항원성인 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 용어 키메라 항체는 또한 "인간화된" 면역글로불린이라 일컬어지는 사람 유사 프레임워크(framework)를 지니며 존재하는 불변영역이 사람 면역글로불린 불변영역과 약 85 내지 90% 이상, 바람직하게는 약 95%의 폴리펩티드 서열 동일성을 지니는 면역글로불린을 포함하는 항체를 의미한다. (참조예: PCT 공보 WO 90/07861호). 따라서, 가능하게는 상보성 결정 영역(CDR)을 제외한 이러한 "인간화된" 면역글로불린의 모든 부분은 하나 이상의 천연 사람 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하다. 필요한 경우, 프레임워크 잔기는 특히 특정의 프레임워크 잔기가 CDR의 구조에 영향을 주는 것으로 밝혀져 있는 경우에 동종 또는 다른 종의 프레임워크 잔기로 대체될 수 있다. 키메라 항체는 또한 절단된 가변영역 또는 불변영역을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "프레임워크 잔기"는 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunologic Interest, 4th Ed., US Dept. Health and Human Services (1987)]에 정의된 바와 같이 단일 종내의 상이한 면역글로불린중에서 비교적 보존된(즉, CDR이 아닌) 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변영역의 일부를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "사람 유사 프레임워크 영역"은 각각의 존재하는 사슬내에서 사람 면역글로불린중의 아미노산 잔기와 동일한 약 70개 이상의 아미노산 잔기, 전형적으로는 75개 내지 85개 또는 그 이상의 잔기를 포함하는 프레임워크 영역을 의미한다.
사람 불변영역 DNA 서열은 공지된 방법에 따라 다양한 사람 세포, 바람직하게는 불멸화된 B-세포로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 키메라 면역글로불린을 생성시키기 위한 가변 영역 또는 CDR은 유사하게 배아 헤모글로빈 또는 이들의 사슬에 결합할 수 있는 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있으며, 마우스, 래트, 토끼, 사람 세포주, 또는 항체를 생성시킬 수 있는 그 밖의 척추동물을 포함한 편리한 포유류 시스템에서 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 가변영역 또는 CDR은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함한 표준 재조합 방법 또는 파아지-디스플레이 라이브러리를 통해 합성적으로 생성될 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에 대해서는 하기 문헌을 참조할 수 있다. 문헌[McCafferty, et al., Nature, 348:552-554 (1990); Clackson, et al., Nature, 352:624-628; and Marks, et al., Biotechnology, 11:1145-1149(1993)]. 세균, 효모 및 파아지와 같은 적합한 원핵 시스템이 사용될 수 있다.
DNA 서열에 대한 적합한 공급원 세포와 면역글로불린 발현 및 분비에 대한 적합한 숙주세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)[문헌: "Catalogue of Cell Lines and Hybridomas," Fifth edition (1985) Rockville, Maryland, U.S.A.]과 같은 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다.
본원에 특정적으로 설명된 키메라 및 "인간화된" 면역글로불린 이외에도, 그 밖의 실질적으로 동일한 변형된 면역글로불린이 당업자에게 공지된 다양한 재조합 DNA 기술을 사용함으로써 용이하게 디자인되고 제조될 수 있다. 일반적으로, 유전자의 변형은 PCR 및 특정부위 돌연변이 유발과 같은 공지된 다양한 기술에 의해 용이하게 수행될 수 있다 [Gillman and Smith, Gene, 8:81-97 (1979) and Roberts, et al., Nature, 328:731-734 (1987)].
또한, 일차 면역글로불린 구조의 단지 일부를 포함하는 폴리펩티드 단편을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 항원인식에 추가로 또는 항원인식이 아닌 하나 이상의 면역글로불린 활성(예, 보체 고정)을 소유하는 면역글로불린 폴리펩티드 단편을 생성시키는 것이 바람직할 수 있다.
표지
항체 또는 단편은 이들의 단리 및 동정을 위해 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 적합한 표지물에는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 플루오레서(fluorescer), 화학발광물질, 자성 입자, 합텐, 및 염료 등이 포함될 수 있다. (참조: 미국특허 제 3,817,837호; 제 3,850,752호; 제 3,939,350호; 제 3,996,345호; 제 4,277,437호; 제 4,275,149호; 및 제 4,366,241호). 또한, 스트렙타비딘 또는 아비딘과 같은 그룹에 결합하고, 이어서, 알칼리성 포스파타제 또는 호오스래디쉬 퍼옥시다제와 같은 효소에 직접 또는 간접적으로 결합하는 바이오틴과 같은 리포터 그룹이 포함된다. 플루오레서 또는 형광색소에는 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 피코에리트린, 및 설포로다민산 클로라이드 (텍사스 레드: Texas red) 등이 포함된다.
이러한 검출 가능한 표지물은 본 기술분야에서 잘 개발되어 있으며, 일반적으로 대부분의 표지물이 적용될 수 있다. 바람직하게는, 효소 또는 플루오레서가 사용된다.
혈액 샘플링
본 발명의 방법은 바람직하게는 임신중인 모체로부터의 혈액 샘플을 사용하지만; 모체의 순환혈액에서 단리되거나 동정되는 것들 이외의 그 밖의 태아 세포 공급원이 사용될 수 있다. 태아조직은 상기된 분석을 위한 양막천자, CVS, 태아경, 또는 제대 천자를 통해 얻을 수 있다.
모체 혈액이 태아 세포의 공급원인 예에서, 혈액 샘플은 전혈 또는 단핵세포층중의 선택된 태아 적혈구 또는 적아구 세포를 함유하는 혈액의 분별화된 성분일 수 있다. 전형적으로는, 혈액 공급원은 본 발명의 방법의 항배아 헤모글로빈 항체의 사용 전 및/또는 사용 후에 태아 세포의 농도를 높이도록 준비된다. 또한, 혈액 샘플은 항체와 접촉하기 전에 현탁되거나, 공기 건조되거나, 고형물 매트릭스상에 화학적으로 고정될 수 있다.
어떠한 모체 또는 태아 포유동물이 태아 조직의 공급원일 수 있지만, 바람직한 공급원은 사람이다. 개, 고양이, 소, 및 말 등과 같은 그 밖의 가축 포유동물이 또한 바람직하다.
밀도구배 고밀화 방법
혈액 분별화에 추가로, 메틸셀룰로오스, 이소파크™(Isopaque™), 덱스트란 및 피콜™(Ficoll™)과 같은 세포 응집 또는 포집 작용제를 함유하는 밀도구배를 사용하는 혈액 세포의 분리 또는 고밀화에 적합한 방법이 문헌에 기재되어 있다 [Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21 (Suppl. 97):31-50 (1968), and in Bhat, N. M. J. Immunol. Meth, 158:277-280 (1993)]. 이소파크™은 보이움 (Boyum)의 문헌에 기재된 바와 같이 나트륨 N-메틸-3,5-디아세트아미노-2,4,6-트리요오도벤조에이트이다. 피콜™(Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury NY)은 수크로오스와 에피클로로히드린의 공중합에 의해 제조된 합성 고분자(high polymer)이다. 분자는 수성 매질에서 용해성을 부여하는 히드록실기를 많이 함유한 분지된 구조를 지닌다. 많은 이러한 작용제는 자유롭게 확산가능하다. 이러한 작용제는 적혈구 응집을 유발시켜, 적혈구 세포로부터 백혈구를 단리하는 방법을 제공한다. 그러나, 이러한 세포 응집 조건하에서, 태아 유핵 적혈구 세포는 응집된 모체 적혈구 세포의 응괴내에 물리적으로 포집될 수 있으며, 이로 인해서, 모체 적혈구와 함께 침강되는데, 이는 응괴의 평균 밀도가 응괴의 침강 특성을 결정하기 때문이다.
페르콜(Percoll) 밀도 구배는 문헌[Rennie, et al., Clinica Chemica Acta, 98:119-125 (1979), and Vincent and Nadeau, Anal. Biochem., 141:322-328(1984)]에 기재되어 있다. 레니(Rennie)의 연구에 의하면, 등장성 페르콜 밀도 구배는 적혈구를 연령별로 분별하는데 사용되었다. 백혈구(백혈구 세포)는 원심분리 과정 전에 제거되는데, 이는 이러한 백혈구가 등장성 구배 조건에서 적혈구와 동시에 분별되기 때문이다.
문헌[Ganshert-Ahlert, et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 1350-1355 (1992)] 및 PCT 공보 WO 93/23754호에는 전체 모체 혈액에 대해 3배의 밀도 구배를 이용한 다음, 트랜스페린 수용체를 사용하여 태아 유핵 적혈구 세포를 고밀화시킴으로써 태아 적혈구를 고밀화시키는 방법이 기재되어 있다. 유동세포계측법 또는 자성 분리 단계가 표지된 세포를 고밀화시키는데 요구된다. 간셔트-알러트(Ganshert-Ahlert)의 문헌에 주지된 바와 같이, 트랜스페린 수용체를 사용하는 방법은 여전히 모체 순환 혈액 세포군중의 태아 세포를 신뢰할 수 있을 정도로 동정하지 못한다.
모체 세포군으로부터 태아 유핵 적혈구 세포를 단리하기 위한 바람직한 고밀화 방법은 제 1 원심분리 용기중의 혈액 샘플을 원심분리하여 적혈구 세포 분획을 얻고; 용융 가능한 겔중에 분산되어 있고 실질적으로 비응집된 상태로 적혈구 세포를 유지시킬 수 있는 콜로이드로 이루어진 밀도구배 매질을 함유하는 제 2 원심분리 용기의 상부에 적혈구 세포 분획을 옮기고; 적혈구 세포 분획중의 모체 적혈구를 용혈시켜 고밀화된 태아 적혈구 분획을 얻고; 겔을 용융시키며; 밀도 구배 매질을 통해 고밀화된 태아 적혈구 분획을 원심분리하여 태아 유핵 적혈구가 고밀화된 분획을 얻는 단계를 포함한다. (참조: 미국특허 제 5,432,054호).
제 1 원심분리 단계는 보다 조밀한 무핵 적혈구 세포, 혈청 및 혈청 단백질로부터 저밀도의 유핵 적혈구 세포 분획과 모든 백혈구 세포를 분리하는 초기 고밀화를 제공한다. 바람직하게는, 제 1 원심분리 튜브는 튜브를 통한 혈구의 이동이 용이하도록 연질의 플라스틱으로 제조된다. 적합한 튜브는 미국특허 제 5,422,018호에 기재되어 있다. 플라스틱 모래시계형의 튜브가 바람직하게는 원심분리기내에 지지되어 좁은 중심 채널 부분에서의 튜브의 과도한 변형 또는 파괴를 억제한다. 지지체는 적합한 수단으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 고형의 제거 가능한 지지 주조물은 튜브 주변을 둘러쌀 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이러한 튜브는 시험관과 같은 보다 큰 용기내의 액체 지지매질중에 지지된다. 액체의 수준은 적어도 튜브의 좁은 부위를 덮기에 충분히 높다. 바람직하게는, 샘플 튜브에 의해 치환되는 액체 지지 매질의 용적 중량은 샘플 튜브와 이의 함유물의 용적 중량과 거의 동일하다. 사용하기에 바람직한 액체 지지 매질은 물이다.
제 1 원심분리 단계 후에, 유핵 적혈구 세포를 함유하는 분획이 수득된다. 이러한 분획은 또한 백혈구 세포를 포함한다. 튜브의 상부는 혈장 분획을 함유한다. 혈장보다는 조밀하지만 다른 적혈구 세포 보다는 덜 조밀한 유핵 적혈구 세포는 혈장의 바로 아래에서 발견되는 적혈구 세포 스택(stack)의 상부에 분별화되며, 백혈구 세포와 가변적으로 혼합될 것이다. 미리 눈금을 형성시킨 제 1 원심분리 튜브를 사용하면 제 1 튜브의 좁은 부분으로부터의 관련된 분획의 추출을 용이하게 하여, 제 1 원심분리 단계로부터 혈청 및 혈장을 포함하는 그 밖의 혈액 분획의 포함을 최소화할 수 있다.
적혈구 세포와 백혈구 세포를 함유하는 분획을 용혈시켜 모체 적혈구 세포를 차별적으로 분해시킬 수 있다. 이러한 모체 적혈구 세포의 차별적인 용혈은 상당한 수의 잔류 모체 적혈구 세포를 파괴하면서 대부분의 태아 기원 세포를 보존시킨다 [Boyer, et al., Blood, 47(6):883-897 (1976)]. 차별적인 용혈은 어떠한 적합한 반응 용기에서 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 모체 적혈구 세포의 차별적인 용혈은 제 2 원심분리 용기의 상부에서 발생되며, 이로 인해서, 용혈 반응은 반응 생성물, 즉, 보존된 적혈구 세포를 밀도 구배 매질내로 원심분리시켜서, 용혈 시약으로부터 적혈구 세포를 제거함으로써 정지될 수 있다.
차별적인 용혈은 적혈구 세포가 암모늄(NH4 -) 및 중탄산(HCO3 -) 이온과 같은 용혈제를 함유한 용액에서 분해될 수 있다는 사실을 이용한다. 이러한 세포 분해는 탄산 안하이드라제의 억제제에 의해 감소될 수 있다. 탄산 안하이드라제 수준은 태아의 적혈구에서 보다 성체의 적혈구에서 5배 이상 높다. 따라서, NH4-HCO3 매개된 용혈속도는 성체의 적혈구 세포에 비해서, 특히 탄산 안하이드라제 억제제의 존재하에 태아 유핵 적혈구 세포를 포함하는 태아 적혈구 세포에서 더 느리다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 탄산 안하이드라제 억제제에는 아세타졸아미드, 에톡스졸아미드(6-에톡시졸아미드, Sigma Chemical Co.) 및 메톡스졸아미드가 포함된다.
차별적인 용혈은 태아 적혈구 세포가 고밀화된 적혈구 세포와 함께 백혈구 세포의 군을 생성시킨다. 고밀화된 태아 적혈구 세포 분획은 이어서 태아 유핵 적혈구 세포가 고밀화된 분획을 수집하고 용혈반응으로부터 생성된 적혈구 세포 분획과 대부분의 백혈구 세포를 제거하도록 밀도 구배 매질을 통해 원심분리된다. 최초 20ml의 말초 혈액 샘플에 존재하는 태아 유핵 적혈구 세포는 약 2마이크로리터 샘플로 감소되어서, 현미경 슬라이드상에서의 동정 및 분석, 또는 중합효소 연쇄 반응에 의한 동정 및 분석을 용이하게 한다.
제 2 원심분리 단계는 밀도 구배 매질을 사용한다. 용혈후에, PCT 국제출원 공보 WO 93/23754호에 기재된 바와 같이, 유핵 적혈구 세포는 과립구, 즉, 백혈구 세포 분획의 성분과 거의 동일한 밀도의 밀도구배에서 평형을 이루는 것으로 예측된다. 구배 매질의 장성(tonicity) 및 밀도는 샘플중의 백혈구 세포 성분으로부터의 태아 유핵 적혈구의 분리 및 고밀화를 가능하게 할 수 있다.
바람직한 밀도 구배 매질은 용융 가능한 겔에 분산된 콜로이드로 구성된다 (참조: 미국특허 제 5,489,386호). 콜로이드는 구배 매질에 요구되는 밀도를 부여한다. 따라서, 콜로이드의 농도를 변화시킴으로써, 매질의 밀도를 상응하게 변화시킬 수 있다. 콜로이드의 미립자 특성은 겔 상태를 유지하지만 하나의 층이 다른 층으로 확산되지 않게 하면서 개별적인 밀도층의 고정을 가능하게 한다. 또한, 콜로이드는 혈구를 실질적으로 응집되지 않은 상태로 유지시킬 수 있다. 매질에 밀도를 부여하는 바람직한 콜로이드는 폴리비닐-피롤리돈 피복된 실리카, 예를 들어, 파마시아(Pharmacia)에 의해 제조되고 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)로부터 시판되고 있는 페르콜™(Percoll™)이다.
태아 유핵 적혈구를 고밀화시키는데 사용되는 밀도구배 매질은 고장성(hypertonic)이다. 고장성 상태하에, 적혈구 세포는 수축하고, 이에 따라 보다 조밀하게 된다. 이러한 조건하에서, 백혈구 세포는 일정한 밀도를 유지한다. 따라서, 고장성 매질에서 적혈구를 선택적으로 수축시킴으로써, 이러한 세포의 밀도가 증가하며, 이러한 세포가 백혈구 세포와는 상이한 밀도의 구배내에서 평형을 이룬다.
고밀화 방법 - 유동세포계측법 및 그 밖의 방법
혈액 샘플의 고밀화는 세포 패닝, 광학현미경을 사용하는 미세분해, 유동세포계측법, 및/또는 자성 비드 또는 입자 분리와 같은 그 밖의 기술을 사용함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 모체 또는 성숙한 세포 마커에 대해 특이적인 항체, 및/또는 제 2 태아 마커에 대해 특이적인 항체를 본 발명의 방법을 수행하는데 첨가하여 태아 세포에 대한 샘플을 추가로 고밀화시킬 수 있다. 각각의 양성 또는 음성 선별 방법을 적용하여, 요망되는 태아 세포를 고밀화시키거나 원하지 않는 성숙 세포를 제거할 수 있다. 항체 결합된 컬럼이 단독으로 사용되거나 그 밖의 고밀화 기술과 함께 사용될 수 있다.
문헌[Mueller, et al., in Lancet, 336:197 (1990)]에는 자성 비드를 사용하여 임신 여성의 혈액중의 태반 유도된 영양 아세포를 단리하는 방법이 기재되어 있다. 비드에 항체를 컨쥬게이션시키는 방법에서의 다른 변형이 또한 존재한다 [Thomas, et al., J. Immunol., 120:221 (1989) and deKretser, et al., Tissue Antigens, 16:317 (1980)]. 또 다른 고밀화 방법이 문헌[Berenson, et al., J. Immunol. Methods, 91:11 (1986)]에 기재되어 있는데, 상기 문헌에서는 단백질 아비딘과 비타민 바이오틴 사이의 높은 친화성이 간접적인 면역흡착 과정을 발생시키는데 이용되었다.
유동세포계측법에서, 광을 전방과 측방으로 산란시키는 세포의 특성을 근거로 하여 세포를 분석하여 흐름 분류기상에 분류할 수 있다. 각각의 구체예에서, 파라미터는 전방 및 측방 산란 특성에 관하여 경험적으로 설정된다. 일반적으로, 전방 산란광과 측방 산란광을 검출하는 포토멀티플라이어 튜브상의 게인(gain)은 당업자에게 공지된 방식으로 분석에 이용할 수 있는 채널을 가로지르는 세포로부터 시그널의 어레이를 분배하도록 각각의 치수로 조정된다. 이러한 환경하에, 특징적인 패턴 또는 분산도(scattergram)가 관찰된다. 혈액샘플을 분석하면 분산도에서 세가지의 주요 세포 타입, 즉, 단핵구, 림프구 및 과립구가 있다는 것을 알 수 있는데, 이들 세포 각각은 구분 가능한 광산란 특징을 지니고 있다. 분산도의 단핵구 세포 영역, 과립구 세포 영역 및 림프구 세포 영역은 단핵구, 과립구 또는 림프구로 분류되는 세포가 흐름 분류에 의해 추가로 분석되거나 수집될 수 있도록 구분된다.
추가의 분석은 세포를 형광물질이 커플링된 모노클로날 항체로 염색시킴으로써 수행되거나, 세포를 형광물질이 커플링된 올리고누클레오티드 또는 핵산 프로브로 인 시튜 하이브리드화시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 조건하에서, 특정의 광산란특성을 지니는 세포가 또한 형광물질의 존재에 대해서 분석된다. 형광물질이 커플링된 항체가 사용되는 경우, 대조 실험은 이소타입 형태로 매칭시킨 대조 모노클로날 항체를 사용함으로써 수행된다. 형광물질이 커플링된 올리고누클레오티드 프로브가 사용되는 경우, 대조표준은 포유류 서열과 관련이 없는 올리고누클레오티드 서열로 구성된다.
수집된 샘플을 하나 이상의 슬라이드상에 침착시키는데, 단지 2 내지 3,000,000개의 세포가 하나의 슬라이드상에 침착되며, 세포가 서로 중첩되지 않도록 슬라이드상의 세포의 농도를 충분히 낮게 하여, 침착된 세포를 단일층으로 형성시키는 주의가 요구된다. 한편, 세포는 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube)내로 수집되고, 본원에 기재된 바와 같이 현탁 상태로 고정된다.
코울터, 프로필 II, 유동세포계측기(Coulter, Profile II, flow cytometer; Coulter, Haileah, FL)가 태아 세포내의 핵산을 검출하는데 사용될 수 있다. 에픽스 엘라이트(Epics Elite; Coulter, Haileah, Fl) 시스템이 모체 혈액의 표본으로부터 태아 세포를 분류하는데 사용될 수 있다.
바람직하게는, 형광물질 활성화된 세포 분류기(FACS)가 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 표지물 또는 염료로서 플루오레세인을 사용함으로써 유동세포계측법을 수행하고 태아 세포를 동정하는데 사용될 수 있다.
그 밖의 마커
제 2 태아 마커가 태아 세포로서 세포를 밝혀내는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대표적인 태아 세포 마커에 대한 항체가 사용될 수 있다. 태아 적혈구 세포에 대해서는, 태아 헤모글로빈의 감마 사슬에 대한 항체와 같은 태아 헤모글로빈 마커가 바람직하다.
태아-세포-특이적 RNA 서열이 또한 태아 세포 마커로서 사용될 수 있다. 이러한 서열은, 예를 들어, 태아 헤모글로빈 유전자의 전사체이다. 이러한 유전자 및 그 밖의 유전자의 서열은 유전자 서열 데이타 뱅크, 진뱅크, 버젼 69.0(Genetic Sequence Data Bank, GenBank, version 69.0)으로부터 얻을 수 있다. 이러한 서열중의 어느 하나를 구체화하는 DNA 프로브 또는 프로브의 군집이 어플라이드 바이오시스템스, 인코포레이티드(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)로부터의 모델 380B(Model 380B)와 같은 시판중인 DNA 합성기를 사용함으로써 올리고데옥시누클레오티드로서 합성된다. 프로브는 표지화 부분과 결합하도록 변형된 누클레오티드 염기를 포함하여 천연 누클레오티드 염기 또는 천연 누클레오티드 염기의 공지된 유사체로 구성될 수 있다.
네가티브 선별법에 있어서, 백혈구 세포에 선택적으로 결합하는 항-CD45, 항-CD13 및/또는 항-CD34에 대한 항체와 같은 성숙세포 마커가 사용될 수 있다. 항-CD44항체는 오염성 모체 적혈구 세포를 제거하도록 포함될 수 있다. 항-CD31 항체를 가하면 오염성 혈소판을 특이적으로 제거할 수 있다. 바람직하게는, 성체 헤모글로빈의 베타 사슬에 대해 유도된 항체가 사용될 수 있다.
태아 핵산 및 단백질
태아 세포를 모체 혈액에서 단리한 경우, 이들을 배양하여 진단에 사용될 수 있는 세포의 수를 증가시킬 수 있다 [Fibach, et al., Blood, 73,:100 (1989)].
특정한 태아 단백질 및/또는 핵산은 다음과 같이 선별되거나 단리될 수 있다. 세포를 용해시켜, 핵산 또는 단백질이 분석에 이용될 수 있게 한다. 일부 예에서, 태아 DNA를, 예를들어, 가열하여 다른 복합체로부터 추출하여, 핵산 프로브와 하이브리드화가 될 수 있게 한다. 분석전에, 태아 DNA는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 리가아제 연쇄반응(LCR)과 같은 방법을 통해 증폭될 수 있다.
증폭이 수행되는 경우에, 분류된 샘플을 적절한 사이클 수의 변성 및 어닐링(예, 약 25 내지 60)으로 증폭시킨다. 대조 샘플은 DNA가 첨가되지 않은 튜브를 포함하여 거짓 포지티브 증폭에 대해서 모니터링될 수 있다. PCR 조건의 적절한 변형에 있어서, 하나 이상의 별도의 태아 유전자가 동시에 증폭될 수 있다. "다중" 증폭으로 공지된 이러한 기술은 DMD의 진단에서 6개의 프라이머 세트와 함께 사용되었다 [Chamberlin, et al., Prenat. Diagn., 9:349-355 (1989)]. 증폭이 수행되는 경우에, 생성되는 증폭 생성물은 관심있는 증폭된 태아 DNA, 즉, 발생이 검출되고/거나 정량된 DNA를 함유하는 혼합물이다.
관심있는 증폭된 태아 DNA 및 그 밖의 DNA 서열은 공지된 기술로 분리된다. 이어지는 증폭된 DNA의 분석은 또한 제한 엔도누클레아제에 의한 분해, 에티디움 브로마이드 염색된 아가로오스 겔의 자외선 가시화, DNA 서열분석, 또는 대립 유전자 특이적 올리고누클레오티드 프로브와의 하이브리드화와 같은 공지된 기술로 수행될 수 있다 [Saiki, et al., Am. J. Hum. Genet., 43 (Suppl.):A35 (1988)]. 이러한 분석은 다형성 차이가 증폭된 "모체" 샘플과 "태아" 샘플 사이에 존재하는지를 결정한다. 증폭 혼합물은 크기를 기준으로 분리될 수 있으며, 생성되는 크기-분리된 태아 DNA는 적절하게 선택된 DNA 프로브 또는 프로브들(사용된 조건하에 관심있는 태아 DNA에 하이브리드화되는 관심있는 태아 DNA에 충분히 상보적인 DNA)과 접촉된다. 일반적으로, DNA 프로브는 상기된 바와 같은 표지물을 사용함으로써 표지된다.
크기별 분리된 태아 DNA와 선택된 DNA 프로브를 상보적 DNA 서열의 하이브리드화가 일어나는 적절한 조건하에 충분한 시간동안 유지시켜, 태아 DNA/DNA 프로브 복합체를 생성시킨 후에, 공지된 방법으로 복합체의 검출을 수행한다. 예를 들어, 프로브가 표지되면, 태아 DNA/표지된 DNA 프로브 복합체가 검출되고/거나 정량된다(예컨대, 자동방사선사진술, 형광 표지물의 검출에 의함). 태아 DNA의 표지된 복합체의 양은 표준 곡선과 비교함으로써 결정될 수 있다(즉, 검출된 표지물의 양과 주어진 판독 사이의 소정의 관계).
유전자 비정상의 검출
질병 또는 질환과 관련된 태아 DNA의 발생을 본 발명의 방법으로 검출하고/거나 정량할 수 있다. 각각의 경우에, 적절한 프로브를 사용하여 관심있는 서열을 검출한다. 예를 들어, 프로브 St14[문헌: Oberle, et al., New Engl. J. Med., 312:682-686 (1985)], 49a[문헌: Geurin, et al., Nucleic Acids Res., 16:7759 (1988)], KM-19[문헌: Gasparini, et al., Prenat. Diagnosis, 9:349-355 (1989)], 또는 뒤스엔느근이영양증(DMD) 유전자에 대한 결실-경향성 엑손[문헌: Chamberlain, et al., Nucleic Acids Res., 16:11141-11156 (1988)]로부터의 서열이 프로브로 사용된다. St14는 모체 DNA로부터 여성 DNA를 구별하는데 잠재적인 유용성을 지니는 X 염색체의 긴 아암으로부터 단리된 고도로 다형성인 서열이다. 이러한 서열은 인자 VIII:C에 대한 유전자에 가까운 지도를 형성하여, 헤모필리아 A(Hemophilia A)의 산전 진단에 사용될 수 있다. PCR로 DMD를 진단하는데 성공적으로 사용되어온 DMD 유전자에서의 6개의 가장 일반적으로 결실된 엑손을 플랭킹하는 서열에 상응하는 프라이머가 또한 사용될 수 있다 [Chamberlain, et al., Nucleic Acids Res., 16:11141-11156 (1988)]. 본 발명의 방법으로 진단될 수 있는 그 밖의 질환에는 다운 증후군, β-탈라세미아(β-thalassemia)[문헌: Cai, et al., Blood, 73:372-374 (1989); Cai, et al., Am. J. Hum. Genet., 45:112-114 (1989); Saiki, et al., New Engl. J. Med., 319:537-541 (1988], 겸상 적혈구 빈혈증[문헌: Saiki, et al., New. Engl. J. Med., 319:537-541 (1988)], 페닐케톤뇨증[문헌: DiLella, et al., Lancet, 1:497-499 (1988)] 및 가우쳐 질환(Gaucher's disease)[문헌: Theophilus, et al., Am. J. Hum. Genet., 45:212-215 (1989)]이 포함된다.
본 발명에 의해 검출된 유전자 비정상은 결실, 첨가, 증폭, 전좌 또는 재배열일 수 있다.
예를 들어, 결실은 표적 서열에 대한 프로브의 하이브리드화 결합의 부재를 검출함으로써 동정될 수 있다. 유전자 서열의 결실을 검출하기 위해서, 정상적인 태아 세포에는 존재하지만 비정상적인 세포에는 존재하지 않는 핵산 서열에 상보적인 프로브의 군을 제조한다. 프로브가 시험되는 세포내의 서열에 하이브리드화되는 경우, 서열이 검출되며, 세포는 그 서열에 대해 정상이다. 프로브가 세포성 핵산에 하이브리드화되지 못하는 경우에, 서열은 그 세포에서 검출되지 않으며, 세포는 비정상으로 일컬어진다. 단, X 염색체와 같은 대조 서열은 동일한 세포에서 검출된다.
첨가는 표지된 프로브가 염색체의 폴리누클레오티드 반복 절편에 결합하는 것을 검출함으로써 동정될 수 있다. 다운 증후군을 나타내는 21번 염색체의 삼염색체형과 같은 핵형 비정상 또는 염색체 삽입과 같은 유전자 서열의 첨가를 검출하기 위해서, 목적하는 유전자 서열에 상보적인 프로브의 군을 제조한다. 다운 증후군의 예를 계속 설명하면, 21번 염색체에 대해 상보적인 프로브가 세포중의 21번 염색체 서열의 세 가지의 존재 형태에 하이브리드화되는 경우에, 세 가지의 21번 염색체 서열의 존재가 검출되며 다운 증후군 삼염색체형 상태를 나타낸다. 검출 수단이 형광 염료인 경우, 예를 들어, 각각의 세포에서 가시화 가능한 세 가지의 독특한 형광점이 삼염색체형 상태를 나타낼 것이다.
특정의 DNA 단편 증폭이 존재하는 경우에, 증폭되는 서열에 대한 표지된 프로브로부터의 시그널의 강도가 증가한다. 임의의 개수의 영상 분석 시스템을 사용함으로써, 이러한 시그널을 정량하고 정상의 대조표준과 비교하여, 특정의 증폭 돌연변이가 존재하는지를 측정한다.
전좌 또는 재배열은 몇 가지의 방법으로 동정될 수 있다. 예를 들어, 표지된 제 1 프로브는 전좌되지 않은 염색체의 마커 영역에 결합될 수 있다. 그런 다음 표지된 제 2 프로브는 동일한 염색체(재배열에 대해서)의 제 2 영역 또는 제 2 염색체(전좌에 대해서)에 결합한 후에, 제 1 및 제 2 프로브의 결합이 검출된다. 또한, 전좌는 표지된 프로브를 일반적으로 중기 동안에 전좌 또는 재배열되는 염색체의 폴리누클레오티드 부분의 마커 영역에 먼저 결합시킴으로써 동정될 수 있다. 이어서, 표지된 프로브의 결합을 검출한다.
예를 들어, 전좌를 검출하기 위해서, 목적하는 염색체에 대한 마커를 동정하고, 그것과 선택적으로 하이브리드화되는 프로브의 군을 제조한다. 이들은 특정의 파장에서 형광을 나타내는 염료와 같은 검출가능한 표지로 마킹된다. 시험되는 비정상에서 전좌 또는 재배열되는 서열이 또한 동정되며, 이를 동정하는 제 2 프로브 군을 제조한다. 제 2 프로브 군의 구성원은 일련의 제 1 표지된 프로브와 상이한 파장에서 형광을 내는 염료와 같은 구별이 가능한 상이한 표지로 마킹된다. 두 가지 모두의 프로브 군을 사용함으로써 인 시튜 하이브리드화가 수행되며, 각각의 프로브 군에 의한 하이브리드화의 결과를 비교하였다. 제 1 및 제 2 표지가 실질적으로 모든 세포 샘플에 동시에 존재하는 경우에, 전좌는 일어나지 않는다. 제 1 표지물이 대부분의 샘플 분획상에서의 제 2 표지와 동시에 존재하지 않는 경우, 전좌 또는 재배열이 일어난다 [Speleman, Clinical Genetics, 41(4):169-174 (1992); and Gray, Progress in Clinical and Biol. Res., 372:399-411 (1991)].
핵산 하이브리드화
본원에 사용된 용어 "핵산"은 DNA 또는 RNA중 어느 하나를 나타낸다. "핵산 서열" 또는 "폴리누클레오티드 서열"은 5' 말단에서부터 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보누클레오티드 또는 리보누클레오티드 염기의 단일 또는 이중 가닥 중합체를 의미한다. 이러한 서열은 자기 복제 플라스미드, 즉, DNA 또는 RNA의 감염성 중합체와 비기능성 DNA 또는 RNA 두가지 모두를 포함한다.
"핵산 프로브"는 DNA 또는 RNA 단편일 수 있다. DNA 단편은, 예를 들어, 플라스미드 DNA를 분해시키거나 PCR을 이용함으로써 제조되거나, 문헌[Beaucage and Carruthers, Tetrahedron Lett., 22:1859-1862 (1981)]에 기재된 포스포르아미디트 방법, 또는 문헌[Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981)]에 따른 트리에스테르 방법으로 합성될 수 있다. 이어서, 이중 가닥 단편은, 요망되는 경우, 적절한 조건하에 화학적으로 합성된 단일 가닥을 함께 어닐링하거나, 적절한 프라이머 서열과 함께 DNA 중합효소를 사용하여 상보적 가닥을 합성함으로써 얻을 수 있다. 핵산 프로브에 대한 특이적 서열이 제공되는 경우에, 상보적 가닥이 동정되고 포함되는 것으로 이해된다. 상보적 가닥은 표적이 이중 가닥 핵산인 상황에서 동일하게 잘 작용한다.
용어 "선택적으로 하이브리드화되는"은 표적 서열이 전체 세포 DNA 또는 RNA의 프레퍼레이션에 존재하는 경우에 단지 특정의 표적 DNA 또는 RNA 서열에 하이브리드화되거나, 듀플렉스를 이루거나, 결합되는 핵산 프로브를 나타낸다. "상보적" 또는 "표적" 핵산 서열은 핵산 프로브에 선택적으로 하이브리드화되는 핵산 서열을 의미한다. 적절한 어닐링 조건은, 예를 들어, 프로브의 길이, 염기 조성, 및 미스매치 수 및 프로브상의 이들의 위치에 좌우되며, 종종 경험적으로 결정될 수 있다. 핵산 프로브 디자인 및 어닐링 조건에 대해서는 하기 문헌을 참조할 수 있다 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) and Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)].
프로브로 사용하기 위한 핵산은 문헌[Beaucage and Carruthers, Tetrahedron Lett., 22(20):1859-1862 (1981)]에 기재된 고상 포스포르아미디트 트리에스테르 방법에 따라, 문헌[Needham-VanDevanter, et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984)]에 기재된 자동화 합성기를 사용함으로써 화학적으로 합성된다. 올리고누클레오티드는 문헌[Pearson and Regnier, J. Chrom., 255:137-149 (1983)]에 기재된 음이온 교환 HPLC에 의하거나 천연 아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 정제된다. 합성 올리고누클레오티드의 서열은 문헌[Maxam and Gilbert, in Grossman and Moldave, eds. Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499-560 (1980)]에 기재된 화학적 분해 방법으로 확인할 수 있다.
핵산 하이브리드화 기술을 사용하여 특이적 DNA 및 RNA를 측정하는 다양한 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 샘플중의 DNA의 존재 또는 부재를 평가하는 한가지 방법은 서던 트랜스퍼(Southern transfer)와 관련이 있다. 요약하면, 분해된 게놈 DNA를 완충액중의 아가로오스 슬래브 겔상에서 런닝시키고, 막으로 옮긴다. 핵산 프로브를 사용하여 하이브리드화를 수행한다. 바람직하게는 핵산 프로브는 길이가 20 염기 이상이다. 참조(Sambrook등의 문헌: 핵산 하이브리드화에 사용되는 핵산 프로브 서열을 선택하는 방법). 하이브리드화된 부분의 가시화는 DNA의 존재 또는 부재의 정량적인 측정을 가능하게 한다.
유사하게, 노던 트랜스퍼(Northern transfer)가 mRNA의 검출에 이용될 수 있다. 요약하면, mRNA는 산 구아니디늄-페놀-클로로포름 추출 방법을 사용함으로써 주어진 세포 샘플로부터 단리될 수 있다. 이어서 mRNA를 전기영동시켜 mRNA 종을 분리하고, mRNA를 겔로부터 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴다. 서던 블롯에서와 마찬가지로, 표지된 프로브를 사용하여 적절한 mRNA의 존재 또는 부재를 동정한다.
다양한 핵산 하이브리드화 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 일반적인 방법으로는 샌드위치 검정법 및 경쟁 또는 대체 검정법이 포함된다. 하이브리드화 기술은 일반적으로 문헌["Nucleic Acad Hybridization, A Practical Approach," Ed. Hames, and Higgins, IRL Press, 1985; Gall and Pardue, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 63:378-383 (1969); and John, Burnsteil and Jones, Nature, 223:582-587 (1969)]에 기재되어 있다.
에탄올, 예를 들어, 80%에탄올/물(v/v)이 인 시튜 하이브리드화를 위한 세포의 프레퍼레이션 동안 고정제로서 바람직하게 사용된다. 그 밖의 유용한 침전 고정제에는 아세트산, 메탄올, 아세톤, 및 이의 조합물, 예를 들어, 3:1의 에탄올/메탄올 혼합물이 포함된다. 그 밖의 유용한 고정제는 본 기술분야에 공지되어 있다. 고정제와 고정된 세포의 하이브리드화는 일반적으로 미국특허 제 5,225,326호에 기재되어 있다. 고정제는 세포의 형태를 양호하게 보존시켜야 하며, 항원의 접촉성을 보존 및 유지시켜야 하고, 높은 하이브리드화 효율을 촉진시켜야 한다. 몇몇 염과 극한 온도, 예컨대, 불꽃상에서의 슬라이드의 웨이빙(waving)이 또한 고정제로 작용할 수 있다.
고정제는, 예를 들어, 파라포름알데히드, 글루타르알데히드 또는 포름알데히드와 같은 물질들을 서로 가교 결합시킴으로써 세포 성분을 고정시키는 화합물을 함유할 수 있다. 가교 결합제는 초미세구조가 보존되기는 하지만 핵산과 항원을 트랩핑하는 네트워크를 형성시키고 이러한 네트워크가 프로브와 항체에 접근불가능하게 함으로써 하이브리드화 효율을 종종 감소시킨다. 몇몇 가교결합제가 또한 핵산을 공유결합적으로 변형시켜, 이후의 하이브리드 형성을 억제한다.
하이브리드화 용액은 전형적으로 포름아미드, 우레아, 티오시안템 구아니딘, 트리클로로아세테이트, 테트라메티아민, 퍼클로레이트 및 나트륨 요오디드를 포함한 카오트로픽 변성화제(chaotropic denaturing agents)를 포함한다. pH를 약 6.0 내지 약 8.0, 바람직하게는 7.0 내지 8.0으로 유지시키는 임의의 완충액이 사용될 수 있다.
기타
다양한 형태의 고형 지지체가 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 지지체에는 글래스, 나이론, 및 니트로셀룰로오스 등이 포함된다. 가장 바람직하게는, 글래스 또는 플라스틱 현미경 슬라이드가 사용된다. 이러한 지지체의 사용 및 지지체상에 표본을 침착시키는 과정은 본 기술분야에 공지되어 있다. 지지체 재료의 선택은 세포의 가시화 과정 및 사용된 정량 과정에 좌우될 것이다.
또한, 핵 염색제을 사용하여 염색질, 핵 단백질, 핵 성분, 및 DNA 등을 식별할 수 있다. 이러한 염색제에는 메틸렌 블루, 헤마톡실린, DAP 1, 프로피디늄 요오디드, 및 티오닌 등이 포함된다.
다양한 염색체 염색 기술이 또한 본 발명에 포함된다. 염색체 페인팅은 일반적으로 미국특허 제 5,447,841호에 기재되어 있다. 전형적으로 표지된 핵산 단편또는 프로브의 불균일 혼합물은 반복성 서열을 포함하지 않는다. 전체 게놈, 단일 염색체, 및 염색체의 서브 영역 등은 일반적으로 세포의 중기 동안에 염색될 수 있다.
키트
모체의 혈액 샘플에서 질병 또는 그 밖의 질환과 관련된 염색체의 비정상과 같은 관심있는 태아 DNA를 단리하고 검출하는 본 발명의 방법을 수행하는데 사용되는 키트가 제조될 수 있다. 이러한 키트는, 예를 들어, 필요로 하는 시약을 담는 용기; 그 밖의 샘플 성분으로부터 태아 유핵 세포/특이적 항체 복합체를 분리하는데 사용되거나, 특정의 항체와 복합된 모체 세포를 제거하는데 사용되는 고형의 지지체 및 시약을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 표지물이 형광색소, 효소 또는 바이오틴이고, 표지된 항배아 헤모글로빈 항체를 포함하는 태아 유핵 적혈구 또는 적아구 세포를 동정하는 키트를 제공한다. 또한, 항배아 헤모글로빈 항체는 항원 합텐과 컨쥬게이션되며, 합텐 또는 헤모글로빈 항체에 대해 유도된 표지된 제 2 항체가 포획을 위해 사용된다. 키트에서의 추가 성분일 수 있는 그 밖의 구성요소로는 사용 설명서와 함께 혈액 분별 튜브, 용혈시약, 밀도구배 매질, 용해제, 및 표지된 핵산 프로브 등일 수 있다.
예를 들어, PCR에 의한 태아 DNA의 증폭후에 관심있는 태아 DNA를 검출하는데 사용되는 키트중의 시약은 1)배아 헤모글로빈 또는 사슬에 대해 특이적인 하나 이상의 항체; PCR에 의해 태아 DNA를 증폭시키는데 사용되는 선택된 DNA 프라이머; 및 검출되는 태아 DNA(관심있는 태아 DNA)에 상보적인 하나 이상의 DNA 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 그 밖의 샘플 성분으로부터 형성된 복합체를 분리하는데 사용되는 고형 지지체를 포함할 수 있다. 이러한 고형의 지지체는, 예를 들어, 글래스 슬라이드, 니트로셀룰로오스 필터, 또는 면역자성 비드일 수 있으며, 태아 유핵 세포/특이적 항체 복합체에 존재하는 항체에 선택적인 항체를 고정시킬 수 있다. 그 밖의 키트는 고정/하이브리드화 칵테일 및 하나 이상의 표지된 프로브를 함유하는 용액을 포함할 수 있다. 키트는 또한 하이브리드화 반응을 수행하기 위한 수단 및 설명서를 제공할 수 있다. 이러한 키트는 또한 사진용 필름 또는 에멀션을 포함할 수 있는데 이들은 본 발명으로 수행된 검정의 결과를 기록하는 작용을 한다.
본 발명의 또 다른 관점은 혈액 표본, 예를 들어, 모체 또는 탯줄 혈액내의 태아 세포를 고밀화시키고 검출하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 태아 세포를 농축시키는 밀도 구배 매질을 제조하기 위한 하나 이상의 시약을 함유할 수 있다. 태아 세포 mRNA 및/또는 DNA에 대해 특이적인 프로브 및/또는 태아 세포를 검출하도록 표지된 항체, 및 태아 세포 고밀화를 수행하기 위한 수단 및 설명서가 또한 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 키트는 표본내에 태아 세포를 포지티브하게 또는 네가티브하게 농축시키기 위한 하나 이상의 항체, 바람직하게는 고형 지지체에 결합된 하나 이상의 항체, 염색체 특이적 DNA 서열에 대해 특이적인 프로브, 밀도 구배 원심분리 또는 유량세포계측법을 이용함으로써 태아 세포 고밀화를 수행하기 위한 수단 및 설명서, 및 임의로 태아 세포를 농축시키는 밀도 구배 매질을 제조하기 위한 하나 이상의 시약을 함유할 수 있다.
그러한 키트는 임의로 본 발명의 방법 중 어느 하나를 수행하기 위한 자동화 시스템에 사용되는 시약 및 재료를 제공한다.
하기 실시예는 본 발명을 단지 예시하기 위한 것이고 이로써 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특정의 변형 및 변화가 본 발명의 범위내에서 가능하다는 것을 인지할 수 있을 것이다.
임신한지 14주된 낙태 탯줄 혈액, 모체(낙태후)로부터의 전체 혈액, 및 상기 탯줄 혈액과 모체 혈액 샘플의 1:25 혼합물로부터 쐐기형 도말표본을 제조하였다. 도말표본을 실온에서 약 30분 동안 팬 건조시키고, -20℃의 100% 메탄올중에 10분 동안 고정시킨 다음, -20℃의 100% 아세톤중에 10분 동안 고정시켰다.
이어서 슬라이드를 온화하게 교반시키면서 실온에서 5분 동안 PBS(10mM 인산염 완충된 염수; pH7.4)로 세척하고, 온화하게 교반시키면서 실온에서 10분 동안 2% 포름알데히드/PBS중에 고정시켰다. 슬라이드를 온화하게 교반시키면서 실온에서 5분 동안 PBS로 2회 세척한 후에, 슬라이드를 온화하게 교반시키면서 실온에서 5분 동안 TBS(100mM 트리스-HCl pH 7.6)으로 2회 세척하였다.
24x60 커버슬립상에 200㎛의 TNBB(100mM TBS중의 0.5% 차단제(Boehringer Mannheim)와 1% BSA)를 침착시킴으로써 표본을 차단제로 처리하여 각각의 면을 염색시켰다. 이어서 도말 표본을 TNBB 스폿상에 샘플 하측에 위치시켰다. 슬라이드 커버슬립을 플라스틱 슬라이드 저장 박스내에 커버슬립을 아래로 하여 위치시키고, 이어서 물기가 축축한 페이퍼 타올을 함유한 개방된 습식 챔버에 위치시켰다. 최종적으로, 습식 챔버를 데시케이터내에 위치시키고, 실온에서 15분 동안 전체 구조물에 진공을 적용하였다. 슬라이드를 데시케이터로부터 분리하고 면역염색시켰다.
커버슬립을 서서히 제거하고, TNBB/0.75% 트윈 20중의 마우스 항-HbE(배아 엡실론 헤모글로빈)(모노클로날) 1:250 희석액 및 토끼 항-HbF(태아 감마 글로빈)(폴리클로날) 비오티닐화된 항체 1:10 희석액을 함유하는 100㎕의 칵테일을 각각의 슬라이드에 가하였다. 도말 표본을 새로운 커버슬립으로 덮고, 상기된 바와 같이, 슬라이드를 진공하의 데시케이터중의 습식 개방 챔버내에 있는 플라스틱 슬라이드 저장 박스에서 15분 동안 커버슬립을 아래로 하여 인큐베이션하였다.
커버슬립을 서서히 제거하고, 슬라이드를 실온에서 온화하게 교반시키면서 TBS로 10분 동안 세척한 다음, 5분 동안 2회 세척하였다. TNBB/0.75% 트윈 20중의 FITC 컨쥬게이션된 염소 항마우스 항체 1:100 희석액과 텍사스 레드 컨쥬게이션된 말 항토끼 항체 1:100 희석액을 함유하는 100㎕의 제 2 칵테일을 각각의 슬라이드에 가하고, 상기된 바와 같이 진공하에 인큐베이션하였다.
커버슬립을 서서히 제거하고, 슬라이드를 실온에서 온화하게 교반시키면서 TBS로 10분 동안 세척하고, 이어서 5분 동안 2회 세척하였다. 슬라이드를 이어서 공기 건조시키고 벡트라쉴드/DAPI(Vectrashield/DAPI)내에 장착하였다.
결과:
상기 시스템은 배아 헤모글로빈(hBE, 엡실론 헤모글로빈)을 그린(green) FITC 형광으로 염색시키고, 태아 헤모글로빈(HbF, 감마 헤모글로빈)을 텍사스 레드 형광으로 염색시켰다. 또한, 유핵 세포의 핵을 DAPI 카운터스테인으로 블루 염색시켰다.
항-HbE 항체(배아 헤모글로빈)은 매우 특이적이었다. FITC 형광(배아 헤모글로빈)은 탯줄 및 탯줄:모체 혼합 도말 표본으로부터의 적혈구 세포에서만 관찰되었다. 유핵 및 성숙한 HbE-포지티브 적혈구 세포 모두가 관찰되었다. FITC-염색된 백혈구 세포는 모든 도말표본에서 관찰되었다.
텍사스 레드 형광(감마 헤모글로빈)은 세가지의 모든 도말 표본형중, 즉 탯줄, 모체 및 이의 혼합 도말 표본중의 성숙 적혈구 세포에서 관찰되었다. 텍사스 레드 형광은 또한 탯줄 및 탯줄:모체 혼합 도말표본으로부터의 유핵 적혈구 세포에서 관찰되었다. 염색되거나 그 밖의 다른 방법으로 처리된 유핵 적혈구 세포는 모체 도말표본에서 관찰되지 않았다. 텍사스 레드 형광은 또한 탯줄 및 모체 도말 표본으로부터의 몇몇 과립구의 세포질에서 관찰된다. 과립구에서의 이러한 레드 형광이 과립구에 의한 헤모글로빈의 흡수를 나타내는 것인지 또는 항체의 폴리클로날 기원물의 합성체인 지는 밝혀지지 않았다.
탯줄과 혼합 도말표본은 또한 감마 및 배아 헤모글로빈 둘 모두에 대해 포지티브로 염색된 유핵 및 성숙한 적혈구 세포를 함유하였다.
본원에 인용된 모든 공개문헌, 특허, 및 특허원은 각각의 공보 또는 특허원이 참고로 인용되는 것으로 설명되고 있는 범위와 동일한 범위로 참고로 인용되고 있는 것이다.
상기된 본 발명의 바람직한 구체예에 대한 설명은 본 발명을 예시하고 설명하고자 하는 것이다. 이러한 구체예는 설명되고 있는 바로서 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니며, 많은 변형 및 변화가 상기된 설명으로부터 가능할 것이며, 이러한 변형도 또한 본 발명의 범위내에 있는 것이다.
본 발명을 이해를 명백하게 하기 위해서 예시 및 실시예를 통해 상세하게 설명하고 있지만, 어떠한 변화 및 변형도 본 발명의 범위내에서 실시될 수 있다는 것이 자명할 것이다.
Claims (23)
- a) 혈액 샘플을, 배아 헤모글로빈의 엡실론 글로빈 사슬에 대해 유도되고 태아 세포와 결합하는 항체 또는 이의 단편인 제 1 태아 마커와 접촉시키고,b) 항체 또는 단편에 결합하는 세포를 태아 적혈구 또는 적아구 세포로서 동정하는 것을 포함하여, 9주 내지 22주째의 임신부로부터의 혈액 샘플중의 태아 적혈구 또는 적아구 세포를 동정하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 혈액 샘플이 사람 모체의 혈액이며, 태아 적혈구가 유핵 적혈구임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 항체가 폴리클로날 항체임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 항체가 직접 표지되거나 간접 표지됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 혈액 샘플을 제 2 태아 마커와 접촉시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 제 2 태아 마커가 태아 헤모글로빈의 감마 글로빈 사슬에 대해 유도된 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 혈액 샘플을 성숙한 세포 마커와 접촉시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 8항에 있어서, 성숙한 세포 마커가 성체 헤모글로빈의 베타 글로빈 사슬에 대해 유도된 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 혈액 세포가 현탁 상태로 존재함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 혈액 샘플이 항체 또는 단편과 접촉되기 전 또는 접촉된 후에 고형 매트릭스상에 화학적으로 고정되거나 공기 건조됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 태아 세포의 동정을 위해 항체 또는 단편과 접촉되기 전에 혈액 샘플중의 태아 세포의 농도를 높이는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 12항에 있어서, 태아 세포가 유동 세포계측법, 혈액 분별법, 밀도구배 분리법, 또는 자성 비드 분리법을 통해 고밀화됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 태아 세포가 동정된 후에 태아 세포내에 함유된 핵산 또는 단백질을 선별하거나 단리하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 핵산 또는 단백질이 증폭되거나 검출됨을 특징으로 하는 방법.
- a) 표지된 항배아 헤모글로빈의 엡실론 글로빈 사슬 항체; 및 b) 사용 설명서를 포함하는, 9주 내지 22주째의 임신부로부터의 혈액 샘플중의 태아 유핵 적혈구 또는 적아구 세포를 동정하기 위한 키트.
- 제 16항에 있어서, 항체가 형광색소 또는 효소로 표지됨을 특징으로 하는 키트.
- a) 항원성 합텐으로 표지된 항배아 헤모글로빈의 엡실론 글로빈 사슬 항체; b) 합텐 또는 항배아 헤모글로빈의 엡실론 글로빈 사슬 항체에 대해 유도된 표지된 제 2 항체; 및 c) 사용 설명서를 포함하는, 9주 내지 22주째의 임신부로부터의 혈액 샘플중의 태아 유핵 적혈구 또는 적아구 세포를 동정하기 위한 키트.
- a) 바이오틴에 컨쥬게이션된 항배아 헤모글로빈의 엡실론 글로빈 사슬 항체; b) 표지된 아비딘 또는 스트렙타비딘 분자; 및 c) 사용 설명서를 포함하는, 9주 내지 22주째의 임신부로부터의 혈액 샘플중의 태아 유핵 적혈구 또는 적아구 세포를 동정하기 위한 키트.
- 제 19항에 있어서, d) 혈액 분별 튜브; e) 용혈 시약; 및 f) 밀도 구배 매질을 추가로 포함함을 특징으로 하는 키트.
- a) 태아 세포를 동정하는데 사용되는 표지된 항배아 헤모글로빈의 엡실론 글로빈 사슬 항체; b) 밀도 구배 매질; c) 세포가 동정된 후에 태아 세포를 용해시키기 위한 작용제; d) 선별되거나 단리된 핵산 서열에 대해 특이적인 표지된 핵산 프로브; 및 e) 사용 설명서를 포함하는, 태아 유핵 적혈구 또는 적아구 세포내의 핵산 서열을 선별하거나 단리하기 위한 키트.
- 제 21항에 있어서, 표지된 핵산 프로브가 DNA 또는 RNA 프로브임을 특징으로 하는 키트.
- 삭제
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