CN1234117A - 用抗胚胎血红蛋白抗体鉴别胎儿细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种在活体外从血样中鉴别或分离胎儿细胞的方法。用一种胚胎血红蛋白或胚胎血红蛋白链的特异抗体或抗体碎片鉴别出了胎儿成核红血球细胞或有核红血球细胞。一旦鉴别出胎儿细胞,就可以对他们进行处理使胎儿核酸或蛋白质能被鉴别和放大。通过检测所选定的胎儿核酸或蛋白质出现或存在而获得了一种定性或定量的诊断或产前估计,包括确定胎儿的性别、染色体、单个基因或蛋白质畸形和确定特定基因、核酸序列或蛋白质的存在与否。

Description

用抗胚胎血红蛋白抗体鉴别胎儿细胞的方法
本发明涉及一种从血样中分离和鉴别胎儿细胞的方法。更具体地说，是涉及在孕妇的血样中，从母亲的细胞中分离和鉴别胎儿成核红血球细胞或有核红血球细胞。
背景技术
胎儿的组织，特别是胎儿的DNA和染色体通常用来做产前诊断及要求对胎儿的基因组进行精确估价时的其它医疗程序。目前，用羊膜穿刺术、绒毛膜取样(CVS)、胎儿镜或脐带穿刺术可以得到胎儿的组织。上述方法在Thompson和Thompson著的Genetics in Medicine,5th Edition,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,1991中进行了描述。
在羊膜穿刺术中，含胎儿细胞的羊水样品用针管和注射器穿过母亲的腹部取出。羊膜穿刺术有其固有的危险性。主要的危险是会引起流产，据估计，每200个用羊膜穿刺术的人中会有1个人流产。其他危险包括母亲感染及对胎儿肉体的损伤。在CVS中，通过贯穿子宫和贯穿腹部自绒毛膜区域吸出营养细胞组织，用这种方法造成胎儿死亡的几率高达1％。脐带穿刺术或经脐带血取样提供了一种在超声波引导下直接从脐带取出血样的方法。上述每一种进入的方法均同时给母亲和胎儿带来危险。
因此，理想的是发明一种不进入的方法得到胎儿的组织或胎儿的DNA。或者，为便于保护和在临床实验室中进行诊断，需要发明一种快速而且可靠的，从母亲的组织中分离和富集胎儿组织的方法。最近，发现了一种在母亲的末梢循环中鉴别胎儿细胞，并储存这些细胞用来作遗传分析的优选方法。
从母亲的血液中鉴别或分离胎儿细胞有赖于从较多的大量的母亲细胞中区别出很少的胎儿细胞。虽然各种胎儿细胞，如胎儿淋巴细胞和滋养层作为目标细胞已经用于胎儿DNA的鉴别，但是，更多的努力则集中于对胎儿的成核红细胞(nRBC)，也就是已知的成核红血球细胞的鉴别。参见Cheuh和Golbus,“The search for Fetal Cells in the MaternalCirculation”,J.Perinatol.Med.,19:411(1991)；Simpson等人,“NoninvasiveScreening for Prenatal Genetic Diagnosis”,Bull.WHO,73:799(1995)；及Cheuh和Golbus,“Prenatal Diagnosis Using Fetal Cells from MaternalCirculation”,West.J.Med.,159(3):308(1993)。
一般认为，胎儿的红细胞作为经胎盘出血而穿过胎盘。因为胎儿拥有大量成核红血球细胞，这些成核红血球细胞在成人的血液中很少被发现，因此，成核现象这种区别在从母亲的细胞中分离和鉴别胎儿细胞的过程中是非常有用的。
细胞表面抗原抗体，特别是成核红细胞抗体，如铁蛋白受体，已经被用于鉴别和富集这些胎儿细胞。请参见Bianchi等人“Isolation of FetalDNA from Nucleated Erythrocytes in Maternal Blood”,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:3279(1990)及Bianchi等人PCT国际申请号为PCT/US90/06623的国际申请(WO 91/07660)，其中描述了用与一种在胎儿细胞表面上的抗原相结合的抗体富集末梢血样中的胎儿成核红血球细胞方法。
Bresser等人在PCT国际申请号为PCT/US94/08342(WO 95/03431)的国际申请中描述了一种用胎儿血红蛋白抗体和mRNA探针富集母亲血液中胎儿细胞的方法。胎儿血红蛋白的存在也被Kleihauer-Betke反应所证明，该反应用酸淘析特性从成人血红蛋白中区分出胎儿血红蛋白。请参见Kleihauer等人“Demonstration von fetalem hamoglobin in denerythrocyten eines blutausstrichs”,Klin.Woschenschr,35:637(1957)及Saunders等人“Enrichment of fetal cells from maternal blood for geneticanalysis”,American Journal of Human Genetics,57:287(1995)。
对胎儿基因组的遗传分析已经通过在原位将染色体或基因特异性的DNA或RNA探针杂交的萤光法而完成，某些时候，通过自动读数和放大目标胎儿基因和DNA的方法完成。参见Lichter等人“Rapid detectionof human chromosome 21 aberration analysis using fluorescence in situhybridization”,Proc.Natl.Acad.Sci.,85:9664(1988)；O＇kelley等人“Instrumentaion for the genetic evaluation of fetal cells from maternalblood”,Am.J.Hum.Genet.,57:286(1995)及Lo等人“Prenatal SexDetermination,by DNA amplification from maternal peripheral blood”,Lancet,2:1363(1989)。
本发明概述
本发明提供了一种血样中胎儿红血球细胞，优选成核或有核红血球细胞的鉴别方法，该方法包括a)将血样与一种抗体或抗体碎片接触来指示血红蛋白中的胚胎球蛋白部分，其中，所述抗体或碎片将与胎儿细胞结合，并且b)将与抗体或碎片结合的细胞鉴别为胎儿成核红血球细胞或有核红血球细胞(血样一般取自妊娠期母亲的末梢循环血液)。
各种抗胚胎血红蛋白抗体或其抗体碎片可以用于该方法，特别是那些指示血红蛋白中的胚胎ε球蛋白链和/或胚胎ζ球蛋白链的抗体或其抗体碎片。此外，第二种胎儿或成熟细胞标记物可以用来进一步鉴别或分离所期望的胎儿细胞。
一旦被选定的胎儿细胞被鉴别出来，一种胎儿的核酸或蛋白质就可以在用于遗传分析的细胞中被放大或检测。
本发明还提供了各种与上述方法协同使用的工具包。这些工具包包括一种直接或间接经过标记的抗胚胎血红细胞抗休及其使用说明。在这些工具包中还任意地包括用于提高胎儿细胞浓度、破坏红细胞的溶血试剂、消散药剂和核酸探针的密度梯度介质。具体实施例的详细描述
除非另有定义，这里所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员所理解的术语相同的含义。虽然任何与这里描述的方法和材料相近或等同的方法和材料也可以用来完成和试验本发明，但本发明还是描述了优选的方法和材料。为了达到本发明的目的，定义了下述术语。
这里所用的“红血球细胞”或“血红细胞”或“RBC”包括成人和胎儿的血红细胞，它可以是成核的或非成核的。成核红血球细胞是优选的。
这里所用的“有核红血球细胞”指一种成核细胞的前身物，从该前身物，一个网状红血球细胞发展成为一个红血球细胞。“正常红细胞”指一种成核血红细胞，它是一种血红细胞的中间前体。
这里所用的“胚胎”指怀孕经过二个月形成的一个或多个细胞。典型情况下，从胚胎阶段到出生前的阶段命名为胎儿。
在母亲血液中循环的胎儿血细胞是很少的，胎儿细胞被认为是通胎盘“渗透”到母亲血液中的。对这种极少情况发生的频率的估计有所变化，但有报道认为该频率为亿分之一到一千亿分之一。参见Holzgreve.W等人，Lancet(1990)i:1220。在怀孕的早期，胎儿血红细胞可能是成核的，也即，不像非成核胎儿红血球细胞那样，他们含有胎儿DNA，并且无需用进入的方法，这些胎儿血红细胞可以用来进行遗传分析。血红蛋白的个体发生
近似99％的成人血红蛋白由两个α链和两个β链组成，而约1％的成人血红蛋白含有两个α链和两个δ链。胎儿血红蛋白则含有两个α链和两个γ链。
三个早期的胚胎血红蛋白由ζ(与α类似)和ε(与β链类似)构成。胚胎Gower2由两个α链和两个ε链组成，而胚胎Gower1血红蛋白由两个ζ链和两个ε链组成，Portland型胚胎血红蛋白由两个ζ链和两个γ链所组成。参见Gale等人的“Nature”,280:162(1979)和Maniatis等人，Ann.Rev.Genetics,14:145(1980)。
通过本发明可以证明，怀孕最长到约22月经周时，在胎儿的血红细胞(RBCs)中，虽然信使RNA已不存在，但胚胎球蛋白链却仍然存在。优选情况下，这些链在约9-20月经周内可以被检测出。胎儿最终可以产生胎儿血红蛋白，在成人血红蛋白中可以发现近似1％这种胎儿血红蛋白，而在成人的血红细胞中没有胚胎血红蛋白。红蛋白抗体
血红细胞中的各种特异血红蛋白可以用抗体或抗体碎片与球蛋白链中抗原相结合的具体位置进行区别。成人球蛋白(α和β)、胎儿球蛋白(γ)和胚胎ε球蛋白抗体可以买到。Accurate Chemical and Scientific公司(Westbury,NY)和Cortex Biochem公司(San Leandro,CA)供应ε球蛋白抗体。
很多免疫原可以用来生产与血红蛋白链蛋白产生特异反应的抗体。再结合蛋白质是优选的用来生产单克隆或多克隆抗体的免疫原，天然纯或不纯的蛋白质也可以用作免疫原，用血红蛋白链蛋白氨基酸序列制备成的合成肽也可以用来制造蛋白质抗体的免疫原。再结合蛋白质可以用真核或原核生物细胞榨出并可以纯化，产物可以注入能产生抗体的动物体中。
制备多克隆抗体的方法为本领域技术人员所熟知，简单地说，是将一种免疫原，优选一种纯化的蛋白质与一种辅药混合使动物免疫，动物对免疫原制备过程的免疫反应用测试血液和确定反应滴定度来监控，当得到适当高的抗体对免疫原的滴定度时，将动物的血液收集起来，制备出抗血清。必要情况下分馏血清以浓缩对蛋白质有反应性的抗体。参见Harlow等人，Antibodies,A.Laboratory Manual,Cold Spring HarborPublications,New York(1988)。
单克隆抗体可以由本领域技术人员熟知的各种技术获得。简单地说，通常将一种所期望的抗原免疫后的动物的脾细胞与一种骨髓瘤细胞融合，使所述脾细胞不朽化。参见Kohler等人，Eur.J.Immunol.,6:511-519(1976)。另外的不朽化方法包括用EB病毒、致癌基因或逆病毒来转变，或者用现有技术中已知的方法。为生产对抗原有理想特异性和亲合力的抗体，由单个不朽化的细胞产生出来的菌落被保护起来。用各种技术，包括注射到脊椎动物寄主的腹膜腔中，可以提高用这种细胞生产的单克隆抗体的产率。根据Huse等人在Science,246:1275-1281(1989)中简述的总议定书，可以将DNA序列从人类B细胞中分离出来，通过扫描DNA库，该DNA序列将单克隆抗体或一个相结合的碎片译成密码。
各种组分或抗体碎片可以用于本发明。免疫球蛋白的不确定区域是提供抗原分子附着力特性的部分。特别是这种属于免疫球蛋白的互补的确定性区域，也就是已知的变异性过多的区域。免疫球蛋白可以以各种形式存在，包括，例如Fv、Fab、F(ab＇)、F(ab＇)2，及其它碎片以及单链。参见Huston等人Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883(1988)及Bird等人，Science 242:423-426(1988)。通常情况下参见Hood等人，Immunology,Benjamin,N.Y.,2nd ed.(1984)及Hunkapiller和Hood,Nature,323:15-16(1986)。也可以用单链抗体，在单链抗体中，一个重链和一个轻链的基因结合成一个单个的指定遗传密码序列。免疫球蛋白多肽还含有一个被截去末端的免疫球蛋白链，如一个含有比天然多肽更小的恒定区域范围的链。这种被截去末端的多肽可以采用标准的方法生产，如在预截去的范围序列的序列5＇中引入一个中断密码子，将被截去末端的多肽结合构成被截去末端的抗体。这里所用的抗体还包括双特性抗体，双特性抗体可以由下面参考文献中所描述的方法生产：Glennie等人J.Immunol.,139:2367-2375(1987)；Segal等人，Biologic Therapyof Cancer Therapy of Cancer Updates,2(4):1-12(1992)及Shalaby等人J.Exp.Med.,175:217-225(1992)。单特性和双特性免疫球蛋白也可以在真核或原核动物寄主细胞中采用再结合技术来生产。
“嵌合的”抗体被免疫球蛋白基因译成密码，该免疫球蛋白基因在遗传学上已被设计，使轻链和重链基因由属于不同物种的免疫球蛋白基因段所组成。例如，从一只老鼠的单克隆抗体而来的基因的变异(V)片段与人类恒定的(C)片段相结合。这种嵌合的抗体很可能比带有老鼠恒定区域及变异区域的抗体对人具有更低的抗原性。
如这里所用的那样，术语嵌合的抗体还可以指这样的抗体，该抗体含有一种类似人类构架组织的免疫球蛋白，该免疫球蛋白中任何存在的恒定区域有至少约85-90％，优选约95％的多肽序列与人类免疫球蛋白的恒定区域相同，该免疫球蛋白称为“人性化的”免疫球蛋白。参见，如PCT公开号WO 90/07861。因此，这种“人性化的”免疫球蛋白的所有部分，除可能的互补性确定的区域(CDRs)外，基本上与一种或多种固有人类免疫球蛋白序列的相应部分相同。必要时，特别是如果某种构架组织残基可以影响CDRs结构，构架组织残基可以被物种内或物种间的构架组织残基所代替。一种嵌合的抗体也可以含有被截去末端的变异或恒定区域。
如这里所用的那样，术语“构架组织区域”指在一个单一物种中的不同免疫球蛋白中被相对保全的免疫球蛋白轻和重链变异区的那些部分。如Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunologic Interest,4th Ed.,US Dept.Health and Human Services(1987)中所定义的那样。如这里所用的那样，一个“类似人类构架组织区域”指在每一个存在的链中含有至少约70个或更多的氨基酸残基，典型情况下含有75-85或更多的残基，这些氨基酸残基与在人类免疫球蛋白中的相同。
人类恒定区域DNA序列可以从各种人类细胞中按照已知的方法分离出来，但优选从不朽化的B细胞中分离出来。本发明中用来生产嵌合免疫球蛋白的变异区域或CDRs可以类似地从能与胚胎血红蛋白或它们的链相结合的单克隆抗体中衍生获得，并将在任何方便的哺乳动物系包括老鼠、兔、人类的细胞系，或其它能产生抗体的脊椎动物中，用已知的方法生产。变异区域或CDRs可以用包括聚合酶链反应(PCR)在内的标准再结合法或通过噬菌体显示数据库而合成生产。关于噬菌体显示法，参见McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)；Clackson等人，Nature,352:624-628及Marks等人，Biotechnology,11:1145-1149(1993)。合适的原核生物系如细菌、酵母和噬菌体可以被使用。
合适的DNA序列的源细胞和用来表示和分泌免疫球蛋白的寄主细胞可以从很多来源获得，如American Type Culture Collection(“Catalogueof Cell Lines and Hybridomas,”Fifth edition(1985)Rockville,Maryland,U.S.A.)。
除在这里特意描述的嵌合的和“人性化的”免疫球蛋白以外，还可以容易地设计并用本领域普通技术人员熟知的各种DNA重组技术制造基本上相同的改性免疫球蛋白。一般来说，基因的改性可以用各种已知技术完成。如PCR和位置指示诱变。参见Gillman和Smith,Gene,8:81-97(1979)及Roberts等人，Nature,328:731-734(1987)。
另外，只含有一部分初级免疫球蛋白结构的多肽碎片可以被生产出来。例如，生产除具抗体分子附着力(如补偿组织固定)以外，还具有一种或多种免疫球蛋白活性的免疫球蛋白多肽碎片是一种理想的情况。标记
为了进行分离和鉴别，抗体或碎片可以被直接或间接地标记。合适的标记物包括放射核素、酶、酶作用物、辅助剂、抑制剂、萤光剂、化学发光剂、磁性颗粒、半抗原、染色剂等。参见专利US3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。还可以包括的是已报道的各组，如与如链霉定或抗生物素蛋白相结合的组、依次直接或间接与酶相结合的组，如碱性磷酸酶或过氧化酶辣根。萤光剂或萤色物包括萤光素、香豆素、若丹明、藻红朊、氯化磺酸若丹明(得克萨斯红)等。
在本发明所属领域，这些可检测出的标记物已得到充分发展，一般情况下，任何一种标记物均可使用，其中，优选使用萤光酶或剂。血样的抽取
本发明提供的方法优选采用来自妊娠期母亲的血样；然而，除在母亲的血循环中已被分离或鉴别的外，其他胎儿细胞源也可以采用。为进行分析，可以采用前述的羊膜穿刺术、CVS、胎儿镜或脐带穿刺术来获得胎儿组织。
在上述例子中，其中母亲的血液是胎儿细胞源，所述血样可以是完整的血液，也可以是含有选自一个单核细胞层的胎儿红血球细胞或有核血球细胞的血的分馏组分。典型情况下，在使用所要求的方法所述的抗胚胎血红蛋白抗体之前和/或之后，处理血源，提高胎儿细胞的浓度。此外，在与抗体接触之前，可以将血样制成悬浮液，通过空气干燥或将其化学固定在一种固体基质上。
虽然任何母亲或胎儿哺乳动物均可以是胎儿的组织源，但是，优选的胎儿组织源是人。其它家养的哺乳动物也是优选的，如狗、猫、母牛、马等。富集方法密度梯度
除了对血液进行分馏以外，还描述了分离或富集血细胞的方法，该方法使用包括细胞聚集或凝聚试剂，如甲基纤维素、IsopaqueTM、葡聚糖和FicollTM的密度梯度，Boyum,Scaud.J.Clin.Lab.Invest.,21(Supp1.97):31-50(1968)和Bhat,N.M.J.Immunol.Meth,158:277-280(1993)对此进行了描述。IsopaqueTM，如Boyum描述的那样，是一种N-甲基-3,5-二乙酰胺基-2,4,6-三碘代苯甲酸钠。FicollTM(由AccurateClemical and Scientific Corporation,Westbury NY出品)是一种合成的高聚物。该高聚物是由蔗糖和表氯醇共聚而制备的。这些分子具有羟基含量很高的支链，使其在水介质中可溶。这些试剂中许多是可以自由扩散的。这些试剂可以引起红血球细胞凝集，据此可以给出从红细胞中分离出白血球细胞的方法。然而，在这种细胞聚集的条件下，胎儿成核血红细胞可以在一个母亲血红细胞聚集成的凝块中被捕集，因此，当以这种凝块的平均密度来确定它的沉淀特性时，胎儿血红细胞将与母亲的红血球细胞一同沉淀。
Rennie等人，Clinica Chemica Acta,98:119-125(1979)和Vincent及Nadeau,Anal.Biochem.,141:322-328(1984)描述了叩诊密度梯度。在Rennie的研究中，一种等张叩诊密度梯度用来老化一分馏红血球细胞，因在等张梯度条件下，白血球细胞与红血球细胞共分馏。因此在离心沉淀前白血球细胞包被移出。
Ganshert-Ahlert等人，Am.J.Obstet.Gynecol.,1350-1355(1992)和PCT公开号WO 93/23754描述了一种富集胎儿成核红血球细胞的方法，该方法在整体母亲血液中采用了三级密度梯度，然后用铁蛋白受体富集胎儿成核血红细胞，一种流动血细胞计数法或磁性分离步骤被用于富集被标记的细胞。正如Ganshert-Ahlert参考文献中所记载的那样，铁蛋白受体的作用仍然不能在母亲循环血细胞群中准确地鉴别出胎儿细胞。
一种优选的从一种母亲细胞群中分离胎儿成核血红细胞的富集方法包括如下步骤：在第一步离心沉淀容器中离心沉淀血样，得到一种血红细胞组分；将该血红细胞组分转移到第二步离心沉淀容器的上部，在第二步离心沉淀容器中有一种密度梯度介质，该密度梯度介质由一种分散在混合凝胶中的胶质所组成。其中，所述胶质能使血红细胞基本上保持在非聚集状态；将血红细胞组分中的母亲的红血球细胞溶血，得到富集胎儿红血球细胞组分；软化所述凝胶；并且，通过所述密度梯度介质离心沉淀所述富集胎儿红血球组分，得到富集胎儿成核红血球细胞的组分。参见US5,432,054。
第一步离心沉淀提供一种初步富集。这种初步富集将低密度的成核血红细胞馏分和血白细胞与更重的非成核血红细胞、血清和血清蛋白分离开来。优选情况下，第一步离心沉淀管由软塑料制成。以便于血细胞在管中的移动。合适的离心沉淀管在US5,422,018中进行了描述。优选情况下，将塑料沙漏形状的离心沉淀管支撑于离心沉淀器中，以防止过度变形或在狭窄中心通道部分的管的破裂。可以用各种合适的方法支撑。例如，可以将一种固体的不可移动的支撑管状物包在管的周围。在一个优选的实施方案中，在一个较大的容器如一个试管中。用一种液体支撑介质支撑管，液面至少覆盖管的狭窄部分，优选情况下，被样品管置换的液体支撑介质的体积的重量近似等同于样品管体积及其内含物的重量。优选的液体支撑介质为水。
经过第一步离心沉淀步骤后，得到了一种成核血红细胞的组分。这个组分也含有血白细胞。管的顶部含有血聚组分。比血浆较重而较其它血红细胞较轻的成核红血球细胞分布在血红细胞堆的顶部，该血红细胞堆就位于血浆之下，并可变地与白血细胞混合在一起。在第一步离心沉淀中，用一种经过预先校准的离心沉淀管可以从第一个管的狭窄部分容易地分离出相关组分。也就是，使其它血液组分，如血清和血浆的含量在第一步离心过程中降至最低。
含血红细胞和白细胞的组分通过溶血可以不均匀地将母亲的血红细胞破坏。母亲血红细胞的不均匀溶血作用使保留下来的相当大量的母亲的血红细胞遭到破坏，而同时保护了大部分胎儿产生的细胞。参见Boyer等人Blood,47(6):883-897(1976)。所述不均匀溶血作用可以在任何合适的反应容器中进行。在一个优选实施方案中，母亲的血红细胞的不均匀溶血作用在第二步离心沉淀容器的上部进行，这样可以通过离心沉淀反应产物，即保留下来的血红细胞，使之进入密度梯度介质，也就是将血红细胞从溶血试剂中移出，来终止溶血反应。
不均匀溶血作用应用了这样一个事实，即在含有溶血试剂，如铵离子(NH4 +)和碳酸氢根离子(HCO3 -)的溶液中，血红细胞可以被破坏。细胞的破坏可以被碳无水化酶抑制剂所减速。成人红血球细胞中碳无水化酶的含量至少是胎儿红血球细胞中的5倍。因此，与成人血红细胞相比，NH4-HCO3调节胎儿血红细胞，包括胎儿成核血红细胞的溶血作用速度较慢，特别是碳无水化酶抑制剂存在的情况下。本发明所用的优选的碳无水化酶抑制剂包括乙酰唑磺胺、乙氧基唑磺胺(6-乙氧基唑磺胺，Sigma Chemical Co.)和甲氧基唑磺胺。
不均匀溶血作用导致了胎儿血红细胞中大量白细胞与血红细胞一起富集。然后富集胎儿血红细胞的组分通过密度梯度介质被离心沉淀以获得富集了胎儿成核血红细胞的组分，并移去由于溶血反应导致的血红细胞碎片及大部分白细胞。存在于20毫升末梢循环血最初样品中的胎儿血红细胞可能减少到2毫升样品，这样就可以很容易地在显微镜载玻片上或通过聚合酶链反应进行鉴别和分析。
第二步离心沉淀使用了一种密度梯度介质。溶血作用之后，期望密度梯度介质中成核血红细胞与粒性白细胞、白细胞组分中的一种成分以相同的密度达到平衡，如在PCT国际公开号WO 93/23754中所描述的那样。梯度介质的张力和密度可以使胎儿成核红血球细胞从血样的白细胞组分中分离和富集出来。
优选的密度梯度介质含有分散在一种混合凝胶中的一种胶质。参见US5,489,386。该胶质给予梯度介质所要求的密度。也即，通过改变胶质的浓度可以相应地改变介质的密度。在凝胶状态下，胶质固有的性质能固定各密度分离层，而不会在凝胶状态下从一层向另一层的扩散。此外，胶质可以使血细胞保持非聚集状态。一种优选的给予介质密度的胶质为聚乙烯-丙酮酸涂层的氧化硅，如Pharmacia生产，Sigma ChemicalCo.出售的PercollTM。
用于富集胎儿成核红血球细胞的密度梯度介质是高张力的。在高张力条件下，血红细胞收缩并变得更重，在这些条件下，白细胞保持恒定的密度。因此，通过在一种高张力介质中选择性地收缩红血球细胞，这些细胞的密度增大并且以和白细胞不同的密度在梯度中达到平衡。富集方法--流动血细胞计数法及其它
富集血样可用其它技术来完成，如细胞选淘、用光学显微镜进行微观剖析、流动血细胞计数法和/或磁珠或磁性颗粒分离。例如，对母亲或成熟细胞标记物有特异性的抗体和/或对第二种胎儿标记物有特效的抗体可以加入到本发明提供的方法中以进一步富集胎儿细胞。阳性或阴性选择法均可以被采用，也就是说，可以增加所期望的胎儿细胞或削减不需要的成熟细胞。一种与抗体相结合的塔可以单独使用或与其它富集技术联合使用。
Mueller等人在Lancet,336:197(1990)中描述了一种用磁珠在孕妇的血中分离胎盘产生的磁养层的方法。也存在将抗体和磁珠配合使用的方法的动向，参见Thomas等人J.Immunol.,120:221(1989)和Deretser等人Tissue Antigens,16:317(1980)。在Berenson等人J.Immunol.Methods,91:11(1986)中讨论了一种另外的富集方法，其中利用了抗生物素蛋白与维生素H之间的亲合力，创造了一种非直接的免疫吸附方法。
在流动血细胞计数法中，根据细胞的性质，对细胞进行分析和分类在一种分类器上进行，不同性质的细胞光线向前或向侧边分散。每次实验中都考虑到向前或向侧边分散的性质，各种参数完全凭经验建立。一般情况下，用来检测向前分散光和向侧边分散光的成相放大器管上的腰槽都要在不同方向上进行调节以分布来自穿过用来作分析的线路的细胞的信号排列，调节的方法是本领域技术人员熟知的。在这种环境下，可以观测到一种特征的图案或分散图。对血样的表明在散射图中有三种主要的细胞型，即单核白血球、淋巴细胞和粒性白细胞，它们中的每一种都有可区别的光散射特性。控制散射图中单核白血球细胞区域、粒性白细胞区域和淋巴细胞区域，使被分类成单核白血球、粒性白细胞或淋巴细胞的细胞能进一步被分析或用流动分类法收集。
通过将细胞用萤光-偶合的单克隆抗体染色或者用萤光偶合的低聚核苷酸或核酸探针与细胞进行杂交，可以进行进一步的分析。在这种条件下，因萤光的存在，具有特定光散射性质的细胞也可以被分析出来。当采用萤光偶合的抗体时，用同型匹配的控制单克隆抗体来完成控制实验。当采用萤光偶合的低聚核苷酸探针时，控制由与哺乳动物序列不相关的低聚核苷酸序列组成。
将收集到的样品放到一个或多个载玻片上，在一个载玻片上放置不能超过2-3,000,000个细胞，注意使放置上去的细胞形成一个单层，使在载玻片上的细胞浓度足够低，以致细胞不与另一个细胞重叠。在另外的时候，将细胞收集到微观驱除管中并固定在悬浮液中，如在另外的地方所描述的那样。
一种Coulter,ProfileⅡ型流动计数器(Coulter,Haileah,FL)可以用于检测胎儿细胞中的核酸。一种Epics Elite(Coulter Haileah,FL)系统可以用来从母亲血样中分类出胎儿细胞。
优选情况下，用一种萤光活化的细胞分类器来完成流动血细胞计数，并且鉴别胎儿细胞。在这种方法中，采用萤光素作为标记物或染料，该标记物或染料直接或间接地与抗体相结合。其它标记物
第二种胎儿标记物可以用来确定细胞为胎儿细胞。例如，可以采用代表胎儿细胞标记物的抗体。对于胎儿血红细胞来说，一种胎儿血红蛋白标记物，如一种胎儿血红蛋白γ链的抗体是优选的。
胎儿细胞特异RNA序列也可用作胎儿细胞标记物，这种序列如可以是胎儿血红蛋白基因的转录产物，这些基因和其它基因序列可以从基因序列数据库、基因库69.0版中得到。作为一种寡聚脱氧核苷酸，含有任何这些序列的一个DNA探针或多个探针可以采用一种商购的DNA合成器，如Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA公司的380B型DNA合成器来合成。这些探针可以含有天然核苷酸碱基或已知的天然核苷酸碱基的类似物，包括那些经改性成为结合标记的部分。
对于阴性选择法，可以采用一种成熟细胞的标记物，如一种抗anti-CD45、anti-CD13和/或anti-CD34的抗体，这些抗体选择性地与白细胞结合。也可以包括anti-CD44抗体以去除对母亲血红细胞的污染。加入anti-CD31抗体可以特定地去除对血小板的污染。优选情况下，采用指示成人血红蛋白β链的抗体。胎儿核酸和蛋白质
一旦从母亲的血液中分离出来胎儿细胞，这些细胞可以被培养，以增加用于诊断的细胞的数量。参见Fibach等人，Blood,73:100(1989)。
特别是可以按下述方法选择或分离出特定的胎儿蛋白质和/或核酸。将细胞溶解，从而使核酸或蛋白质能用于分析。在一些例子中，如可以采用加热的方法将胎儿DNA从其它的复合体中分离出来，使它能与核酸探针杂交。在分析之前，可以采用如聚合酶链反应(PCR)或连拉酶链反应(LCR)的方法将胎儿DNA放大。
如果要进行放大，被分类的样品以合适的变性和退火循环周期的数量(如近似25-60)被放大。控制取样可以包括一个不加DNA的管以监控假阳性放大。对PCR条件进行适当地改变后可以同时放大多于一个的独立的胎儿基因。以“多元”放大为人所知的这种技术已经以6套引物用于DMD的诊断中。参见Chamberlin等人，Prenat.Diagn.9:349-355(1989)。当进行放大时，得到的放大产物是一种混合物，该混合物含有我们所关心的被放大的胎儿DNA，也就是其出现将被检测和/或定量的DNA。
用已知的技术可以将放大的胎儿DNA和其它DNA序列分离。随后的对放大的DNA的分析也可以用已知的技术进行，如与限定的内核酸酶一起浸煮，用3,8-二胺-5-乙基-6-苯基菲啶鎓溴化物染色的琼脂糖凝胶的紫外光检测，DNA排序或与特异的寡聚核苷酸探针等位基因杂交。参见Saiki等人，Am.J.Hum.Genet.,43(Suppl.):A35(1988)。这种分析将确定被放大的“母亲”和“胎儿”样品之间是否存在多形态区别。以大小为基准可以将放大混合物分离，并且，将得到以大小分离出来的胎儿DNA与一种或多种合适的选定的DNA探针接触(这种选定的DNA与我们关心的胎儿DNA充分互补，以致在所用的条件下，与我们关心的胎儿DNA杂交)。一般情况下，DNA探针用如上所述的标记物进行标记。
以大小分离出来的胎儿DNA和选定的DNA探针在合适的条件下保持足够的时间之后，用已知的方法检测得到的复合物，所述合适的条件使互补DNA序列的杂交发生，生成胎儿DNA/DNA探针复合物。例如，如果探针是经过标记的，则胎儿DNA/标记过的DNA探针复合物就被检测出来和/或被定量测出(例如用自动放射照相术，萤光标记物的检测)。通过与一种标准曲线(即一种预先测定的检测到的标记的量与给定读数之间的关系)进行比较，标记的复合物(也即胎儿DNA)的量就可以被测定出来。基因畸形的测定
与疾病或条件相关的胎儿DNA的出现可以用现有方法测定和/或定量出来。在每一种情况下，一种合适的探针可用于测定所关心的序列。例如，从St14(Oberle等人，New.Engl.J.Med.,312:682-686(1985))探针、49a(Geurin等人，Nucleic Acids Res.16:7759(1988))探针、KM-19(Gasparini等人，Prenat.Diagnosis,9:349-355(1989))探针而来的序列或来自杜兴肌肉营养不良(DMD)基因的缺失俯伏外显子序列(Chamberlain等人，Nucleic Acids Res.,16:11141-11156(1988))可用作探针。St14是一种从X染色体的长臂上分离出来的高度多形态序列，所述X染色体在从母亲的DNA中区分出雌性DNA中有潜在的用途。St14在染色体图谱中位于第八因子Ⅷ:C附近，也可用于产前血友病A的诊断。与DMD基因中6个最常缺失的外显子侧面相接的序列相应引物也可以使用，这些引物已经成功地用于通过PCR对DMD的诊断。参见Chamberlain等人，Nucleic Acids Res.,16:11141-11156(1988)。能被本发明诊断的其它疾病包括Down氏麻痹性眩晕综合症、β-地中海贫血症(Cai等人，Blood,73:372-374(1989)；Cai等人，Am.J.Hum.Genet.,45:112-114(1989)；Saiki等人，New Engl.J.Med.,319:537-541(1988))、镰刀细胞贫血症(Saiki等人，New.Engl.J.Med.,319:537-541(1988))、苯基酮尿症(Dilella等人，Lancet,1:497-499(1988))和Gaucher氏疾病(Theophilus等人，Am.J.Hum.Genet.,45:212-215(1989))。
用本发明方法检测出来的基因畸形可以是缺少、增加、放大、换位或重排。
例如，通过检测不存在探针与目标序列的杂交结合可以鉴定出缺少。为检测基因序列的缺少，一组探针被制备出来，这些探针与核酸序列是互补的，这种序列存在于正常胎儿细胞中而不存在于异常的胎儿细胞中。如果探针与该序列的杂交被检测出，则该序列被检测出，就该序列来说，这个细胞是正常的。如果探针不能同细胞的核酸杂交，则该序列在那个细胞中没有被检测出，那么那个细胞就被标记为不正常的，假设一种控制序列，如X染色体，在相同的细胞中被检测出的话。
一种增加可以用检测一种被标记的探针与一种染色体上多核苷酸重复片段的结合而被鉴定出来。为了检测出基因序列的增加，如一种染色体或染色体组畸形(如表示Down氏麻痹性眩晕综合症的21号三倍染色体)的嵌入一组探针被制备出来，这些探针与有问题的基因序列是互补的。继续以Down氏麻痹性眩晕综合症举例，如果这些与21号染色体互补的探针与细胞中具有三种外观的21号染色体序列杂交，21号染色体的三种表现形式就被检测出来，并且表明了Down氏麻痹性率晕综合症的三倍染色体疾病的存在。如果检测方法是萤光染色，例如每个细胞中的三个可见的独特的萤光点表明了三倍染色体疾病。
如果存在特异DNA碎片的放大，被放大的序列的标记过的探针信号强度会增强。用任何数量的影像分析系统，将这种信号用数量表示并与正常控制相比较就可以确定是否存在特定的放大异变。
用几种不同的方法可以鉴定出换位或重排。例如，可以将第一种标记过的探针与没有发生换位的染色体中的标记区域相结合，然后将第二种探针与同一染色体(对于重排)或第二染色体(对于换位)的第二个区域相结合，接着检测第一和第二探针的结合。另外，通常在分裂中期，通过第一次将标记过的探针与发生换位或重排的染色体的多核苷酸区的标记区域相结合可以鉴定出换位。接着，标记过的探针的结合被检测。
例如，为检测换位，鉴别出有问题的染色体一个标记物，并且制备出一组选择性地与该标记物杂交的探针，他们用一种可检测出的标记物来标记，可检测出的标记物如可以是有特定波长萤光的染料。被检测的畸形中的换位或重排的序列也被鉴别出来，并且，第二组探针被制备出来以鉴别它。第二组探针中成员用一种可区别的不同的标记物标记，如一种与第一组具有不同波长萤光的染料。用两组探针进行原位杂交，并且，比较用每一组探针的杂交结果。如果在所有样上第一种和第二种标记是重合的，没有换位发生。如果在样品的相当一部分上没有发现第一种标记与第二种标记重合，那么发生了换位或重排。参见Spleman,Clinical Genetics,41(4):169-174(1992)和Gray,Progress in Clinical andBiol Res,372:399-411(1991)。核酸杂交
“核酸”这个术语，如这里所用的那样，指DNA或RNA。“核酸序列”或“多核苷酸序列”指从5＇端到3＇端的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的单链或双链多聚体，它既包括半复制的质粒、有感染性的DNA或RNA多聚体也包括非功能性的DNA或RNA。
“核酸探针”可以是DNA或RNA碎片，例如DNA碎片可以通过溶解质粒DNA或用PCR制备，或者用Beaucage和Carruthers,Tetrahedron Lett.,22:1859-1862(1981)描述的磷酸氨基方法合成，或者按照Matteucci等人，J.Am.Chem.Soc.,103:3185(1981)所述三脂法合成。如果希望的话，一个双链DNA碎片可以将化学合成的单链在合适的条件下一起退火或者通过合成互补链而获得，该互补链用DNA聚合酶和合适的引物序列合成。一旦给出了一个核酸探针的特定序列的位置，互补链也被鉴别和包括是可以理解的。在目标是一个双链核酸的位置，互补链将起同样好的作用。
术语“选择性杂交”指当目标序列存在于全部细胞DNA或RNA制品中时，一个核酸探针只与一个特定的目标DNA或RNA序列杂交、复合或结合。“互补”或“目标”核酸序列指的是选择性地与一个核酸探针杂交的那些核酸序列。例如，退火条件依一个探针的长度、碱基组成和不匹配的数量及它们在探针中的位置而定，并且，经常必须根据经验来确定。对核酸探针的设计和退火条件的讨论参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(2nd ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,(1989)和Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology,ed.Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1987)。
用作探针的核酸按照磷酸胺基三脂法用化学法合成，该方法由Beaucage和Carruthers在Tetrahedron Lett.,22(20):1859-1862(1981)中首次做了描述，该方法采用了一种自动合成器，正如Needham-VanDevanter等人在Nucleic Acids Res.,12:6159-6168(1984)中所描述的那样。寡聚核苷酸的纯化采用丙烯酰胺凝胶电泳法或阴离子交换HPLC法，该方法在Pearson和Regnier,J.Chrom.,255:137-149(1983)中做了描述。合成的寡聚核苷酸序列的检验用化学降解法，该方法在Maxam和Gilbert在Grossman and Moldave,eds.Academic Press,New York,Methods inEnzymology,65:499-560(1980)中做了说明。
采用核酸杂交技术测定特异DNA和RNA的各种方法为本领域技术人员所知。例如，测定样品中是否存在DNA的一种方法包括一个南极转录。简单地说，溶解的基因组的DNA融化在缓冲剂中的琼脂糖序凝胶上并转录到膜上，用核酸探针进行杂交。优选的核酸探针为有20个碱基或长度更长(参见Sambrook等人，for methods of selecting nucleicacid probe sequences for use in nucleic acid hybridization)。目测杂交的部分可以给出是否存在DNA的定性测定结果。
相似地，在检测mRNA时可以用北极转录。简而言之，用酸性鈲盐-苯酚-氯仿萃取法可以从一个给定的样品中分离出mRNA，然后将mRNA电泳以分离出各种mRNA，并且将mRNA从凝胶转录到一个硝化纤维薄膜上。正像南极转录那样，用标记过的探针鉴别是否存在合适的mRNA。
各种核酸杂交的形式为本领域技术人员所知。例如，常用的形式包括夹心测定和竞争或置换测定。一般情况下，各种杂交技术在“NucleicAcid Hybridization,A Practical Approach,”Ed.Hames,and Higgins,IRLPress,1985；Gall和Pardue,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,63:378-383(1969)和John.Burnsteil及Jones,Nature,223:582-587(1969)中进行了描述。
在用于原位杂交的细胞的制备过程中，乙醇，如80％乙醇/水(体积/体积)是一种理想的固定剂。其它沉淀固定剂包括乙酸、甲醇、丙酮及其混合物，如乙醇/甲醇为3∶1的混合物。其它有用的固定剂为本领域的技术人员所熟知。大体上，各种固定剂及固定后细脆的杂交在US5,225,326中进行了讨论。固定剂应该提供好的对细胞形态保护，应该保护和保持抗原的易接近性，应该促进高的杂交的效率。一些盐类和极端的温度，如在火焰上挥动，也可以起到固定剂的作用。
固定剂可以含有一种化合物，该化合物通过将细胞组分交联在一起而固定细胞组分，例如，多聚甲醛、戊二醛或甲醛。当交联剂保护亚显微结构时，常常通过形成捕集核酸和抗原的网络而降低杂交的效率，使得它们不能与探针和抗体接近。一些交联剂还常常共价地改性核酸，阻止后面的杂合体生成。
典型的杂交溶液含有离液序列高的变性试剂，这些试剂包括甲酰胺、尿素、氰硫基胍、三氯乙酸盐、四甲基胺、高氯酸盐和碘化钠。可以用pH值至少约6.0-8.0，优选7.0-8.0的任何缓冲溶液。互不相关的主题的处理
各种固体载体可以用来实现本发明。载体包括玻璃、尼龙、硝化纤维等。最为优选情况下采用玻璃或塑料显微镜载玻片。载体的使用和将样品放置在载体上的方法为本领域技术人员所知。载体材料的选择根据所用的细胞目测方法和定量方法而定。
此外，核染色剂可以用来确认染色质、核蛋白、核组分、DNA等。这些染色剂包括亚甲基蓝、苏木精、DAP-1、Propidinium iodide、硫堇等。
本发明还包含了各种染色体的染色技术。染色体的染色大体上在专利US5,447,841中做了描述。典型情况下，被标记的核酸碎片或探针的不均匀性混合物不在重复序列中，整个基因组、单一染色体、染色体的亚区等均可以被染色，染色的时间为细胞分裂中期。工具包
在实现本发明方法时，在母亲的血样中分离和鉴别我们关心的胎儿DNA，如与一种或另外一种疾病相关的染色体畸形时，就产生了一套工具包。例如，选自所需的盛反应物的容器，反应物和任一用于从其它样品组分中分离出胎儿成核细胞/特异抗体复合物的固体载体或与一种特异抗体复合的母亲细胞的移除所用的固体载体。
优选情况下，本发明提供的是含有被标记的抗胚胎血红蛋白抗体的胎儿成核红血球细胞或有核红细胞的鉴别所用的工具包，其中的标记物是萤光染色剂、酶或维生素H。此外，所述抗胚胎血红蛋白抗体与一种半抗原偶合，并且，指示该半抗原或血红蛋白抗体的被标记的第二种抗体用来捕获。工具包中的其它成分可以进一步地是这样的组分，例如，血液分馏管、溶血试剂、密度梯度介质、消散剂、被标记的核酸探针及使用说明等。
例如，用于采用PCR放大胎儿DNA后的用来检测所关心的胎儿DNA的试剂可以包括1)对胚胎血红蛋白或链有特异性的至少一种抗体、用PCR放大胎儿DNA所用的选定的DNA引物、与被检测的胎儿DNA互补的至少一种DNA探针。正如所指出的那样，工具包还可以包括一种固体载体，该载体用于从其它的样品组分中分离出形成的复合物。这种固体载体可以是，例如，一种玻璃载玻片、硝化纤维过滤器或免疫磁珠，这种载体上可以具有一种用来选择存在于胎儿成核红血球/特异抗体复合物中的抗体的抗体附着物。其它工具包还包括一种含一种固定/杂交混合物和一种或多种被标记的探针的溶液。工具包还提供了完成杂交反应的方法和说明。工具包还包括用于记录本发明的测定结果的摄影胶卷或感光乳剂。
另一方面，本发明还包括一种用来富集和检测血样，如母亲或脐带血液中的胎儿细胞的工具包。这种工具包可以包括一种或多种用来制备一种密度梯度的试剂，这种密度梯度用来富集胎儿细胞。工具包中还可以包括用来检测胎儿细胞的经过标记的抗体和/或对胎儿细胞的mRNA和/或DNA有特异性的探针、以及用来完成胎儿细胞富集的方法和说明。
另一种工具包可以包括一种或多种抗体，理想地与一种固体载体结合，在样品中阳性或阴性地富集胎儿细胞，对染色体特定的DNA序列有特异性的探针，采用密度梯度离心沉淀法或流动血细胞计数法完成胎儿细胞富集的方法和说明以及任选的一种或多种富集胎儿细胞用的密度梯度的制备所用的试剂。
这种工具包任选地提供了完成本发明的任何方法所用的自动系统中的各种试剂和材料。
实施例
下面的实施例仅仅是为了解释本发明，而不能解释成以任何形式来限制本发明的范围。本领域的技术人员会承认，在本发明的范围内可以进行一定的变化或改变。
分别用14周怀孕后流产胎儿的脐带血、母亲的全血(流产后)和上述脐带血与母亲血样的比例为1∶25的混合物制备楔形涂片。在室温下将涂片风干约半小时，在-20℃的100％甲醇中固定10分钟，然后在-20℃的100％丙酮中固定10分钟。
在缓合振动下，于室温下将涂片在PBS(pH值为7.4的10mM碱金属磷酸盐缓冲液)中洗涤5分钟，并在缓合振动下和室温下用2％甲醛/PBS固定10分钟。将载玻片在缓合振动和室温温度下在PBS中洗涤两次每次5分钟后，在缓合振动和室温温度下再在TBS(pH为7.6的100mM三盐酸)中洗涤5分钟共洗涤两次。
用封闭剂处理标本，处理的方法是在每一面均要染色的24×60的载玻片上沉积上200微米的TNBB(0.5％封闭剂(Boehringer Mannheim)和在100mM TBS中的1％BSA)。然后将涂片的样品面向下放置在TNBB点上。将盖玻片向下放置在一个塑料载玻片储藏箱中，然后将储藏箱放在一个装有潮湿纸巾的敞开的潮湿的箱中，最后，将潮湿的箱放入一个干燥器中，在室温下对整个装置抽真空(DD20型精密真空泵)15分钟。将载玻片从干燥器中移出并染色。
小心地移开盖玻片，在每个面上加入100微升混合物，该混合物含有在TNBB/0.75％的吐温20中的老鼠的抗-HbE的1∶250稀释液(胚胎ε血红蛋白)(单克隆的)和野兔抗HbF(胎儿γ球蛋白)(多克隆的)生物素化钠抗体的1∶10稀释液。涂片用一个新盖玻片盖上，然后如上所述将载玻片向下置于一个真空干燥器中的潮湿敞开箱中的塑料载玻片储藏箱中培育15分钟。
小心地移开盖玻片，在缓合振动和室温温度下在TBS中洗涤载玻片10分钟，然后再洗涤两次每次5分钟。在每个面上加入100微升第二种混合物，第二种混合物含有在TNBB/0.75％吐温20中的与FITC偶合的山羊抗鼠抗体的1∶100稀释液和与得克萨斯红偶合的马的抗野鼠抗体的1∶100稀释液。采用如上的方法在真空中进行培育。
小心地移开盖玻片，然后在缓和振动和室温温度下在TBS中洗涤载玻片10分钟，然后再洗涤两次每次5分钟。将载玻片风干放置在Vectrashield/DAPI中。结果
上述系统用绿FITC萤光将胚胎血红蛋白(hBE,ε血红蛋白)染色，用得克萨斯红萤光将胎儿血红蛋白(HbF,γ血红蛋白)染色。此外，用DAPI对比染色将成核细胞的细胞核染成蓝色。
抗HbE抗体(胚胎血红蛋白)很特异。FITC萤光(胚胎血红蛋白)只在从脐带和脐带与母亲混合的涂片的血红细胞中被观测到。成核的和成熟的HbE阳性血红细胞均被观测到。在任一种涂片上均没有发现FITC染色的白细胞。
得克萨斯红萤光(γ血红蛋白)在所有三种涂片类型中即脐带、母亲和混合的涂片上的成熟血红细胞中都被观测到。得克萨斯红萤光在脐带和脐带-母亲混合物涂片的成核血红细胞中也被观测到。染上色的或别的方式的成核血红细胞没有在母亲血涂片中发现。在脐带血和母亲血涂片中的一些粒性白细胞的细胞质中已观测到了得克萨斯红萤光。尚不清楚粒性白细胞中的这种红色萤光是代表被粒性白细胞吸收的血红蛋白，还是抗体的多克隆orgins引起的外来物质。
脐带血和混合血涂片还含有成核的和成熟的血红细胞，这些血红细胞中的γ和胚胎血红蛋白都被阳性地染色。
这里所有与本发明内容相同的公开文献÷授权专利和专利申请并入本发明申请供参考，每一个特别和单独指出的独立的公开文献或专利申请也并入本发明申请供参考。
上述对本发明优选实施方案的描述用来说明和描述本发明，并不意味着是本发明的全部或用来精确地限制本发明及公开的形式。并且，在上述描述的指示下，很多改变和变化是可能的，这些改变和变化均应属于本发明的范围。
虽然前面的说明和实施例对本发明做了较详细的描述，然而很明显，为了更清楚地理解本发明，在权利要求的范围内，可有一定的变化和改变。

Claims (23)

1．一种在血样中鉴别胎儿红血球细胞或有核红血球细胞的方法，该方法包括：
a)将该血样与一种指示血红蛋白中胚胎球蛋白部分的一种抗体或其抗体碎片接触，其中，抗体或碎片将与胎儿细胞结合；和
b)鉴别与抗体或碎片结合的细胞为胎儿红血球细胞或有核红血球细胞。
2．根据权利要求1的方法，其中的血样为人类母亲的血液，并且，其中的胎儿红血球细胞是一种成核红血球细胞。
3．根据权利要求1的方法，其中的抗体指示血红蛋白的胚胎ε球蛋白链或胚胎ζ球蛋白链。
4．根据权利要求1的方法，其中的抗体为多克隆抗体。
5．根据权利要求1的方法，其中的抗体为单克隆抗体。
6．根据权利要求1的方法，其中的抗体被直接或间接地标记。
7．根据权利要求1的方法，该方法还进一步包括将血样与第二种胎儿标记物接触。
8．根据权利要求7的方法，其中的第二种胎儿标记物是指示血红蛋白的胎儿γ球蛋白链的一种抗体或其抗体碎片。
9．根据权利要求1的方法，该方法进一步包括将血样与成熟细胞的标记物接触。
10．根据权利要求9的方法，其中的成熟细胞标记物是指示血红蛋白的成人β球蛋白链的抗体或其抗体碎片。
11．根据权利要求1的方法，其中的血细胞是在悬浮液中。
12．根据权利要求1的方法，其中在与抗体或碎片接触之前或之后，血样是经过空气干燥的或者是被化学固定在固体基质上的。
13．根据权利要求1的方法，该方法进一步包括为鉴别胎儿细胞，在与抗体或碎片接触之前，将血样中的胎儿细胞的浓度进行浓缩。
14．根据权利要求13的方法，其中，通过流动血细胞计数法、血液分馏法、密度梯度分离法或磁珠分离法来富集胎儿细胞。
15．根据权利要求1的方法，该方法进一步包括选择或分离胎儿细胞所含的核酸或蛋白质。
16．根据权利要求15的方法，其中的核酸或蛋白质被放大或检测。
17．一种鉴别胎儿成核红血球细胞或有核红血球细胞的工具包，包括：
a)标记过的抗胚胎血红蛋白抗体，和
b)使用说明。
18．根据权利要求17的工具包，其中的抗体用萤光染色剂或酶标记。
19．一种鉴别胎儿成核红血球细胞或有核红血球细胞的工具包，包括：
a)用半抗原标记的抗胚胎血红蛋白抗体；
b)指示所述半抗原或抗胚胎血红蛋白抗体的被标记过的第二种抗体；和
c)使用说明。
20．一种用于鉴别胎儿成核红血球细胞或有核红血球细胞的工具包，包括：
a)与维生素H偶合的抗胚胎血红蛋白抗体；
b)经标记过的抗生物素蛋白或链球抗生物素蛋白分子；和
c)使用说明。
21．根据权利要求20的工具包，该工具包进一步包括：
d)血液分馏管；
e)溶血试剂；和
f)密度梯度介质。
22．一种用于选择或分离胎儿成核红血球细胞或有核红血球细胞中的核酸序列的工具包，该工具包包括：
a)经标记过的抗胚胎血红蛋白抗体；
b)密度梯度介质；
c)消散胎儿细胞的试剂；
d)一种对被选择或被分离的核酸序列有特异性的经过标记的核酸探针；和
e)使用说明。
23．根据权利要求22的工具包，其中经过标记的核酸探针是DNA或RNA探针。
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