CN102483406A - 用于分离胎盘来源微粒的方法和试剂盒以及它们用于诊断胎儿疾病的应用 - Google Patents

用于分离胎盘来源微粒的方法和试剂盒以及它们用于诊断胎儿疾病的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产前分析胎儿的方法。所述方法包括：(a)分离胎盘来源微粒；和(b)分析所述胎盘来源微粒的内含物的至少一种成分，其中所述至少一种成分是胎儿特征的指示。

Description

用于分离胎盘来源微粒的方法和试剂盒以及它们用于诊断胎儿疾病的应用
技术领域
在一些实施方式中，本发明涉及从母体血液样品中分离胎盘来源微粒的方法和试剂盒以及它们用于描绘胎儿特征的应用。
背景技术
在怀孕期间通常要进行产前筛查以检测潜在的先天缺陷(如唐氏综合征、染色体异常、遗传病和其它状况)。优选地在怀孕的早期进行筛查。由多余的或缺失的染色体(非整倍体)引起的综合征是人类最广泛被识别的遗传病并且目前可以使用如羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样(CVS)的方法进行检查。但是，尽管能预测染色体畸变，所述羊膜穿刺术或CVS方法分别带来了0.5-1％或2-4％的方法相关的流产风险。
微囊泡(MV)包括微粒和外来体，其在正常生理状况的血液循环中出现并在多种疾病中增加。微粒(MP)是从多种细胞表面脱落的膜囊并包含少量的细胞质物质。细胞微粒由细胞骨架结构重排形成，其尺寸多样化(大约0.1至1μm)并且在磷脂和蛋白组合物中有差异。MP包含DNA和RNA(Reich CF等Exp Cell Res.(2009)10；315：760-8)并且暴露特异于它们源于的细胞的膜抗原(Diamant等，Eur J Clin Invest(2004)34：392-401)。例如，在循环中，有脱落自血小板、内皮细胞或白细胞的MP。在癌症患者中，可以检测到肿瘤细胞来源MP，在孕妇中可以发现胎盘来源MP。
在暴露于细胞因子或毒素之后及在多种病理学(如炎症、癌症、糖尿病和其它血管疾病)中，有两种导致微粒形成的机制——细胞凋亡或激活。在血液中，MP看来似乎是具有膜结构的RNA的主要来源，所述膜结构保护核酸不被血液核酸酶消化。此外，循环的微粒通过在细胞间转移蛋白和RNA(如微小RNA)调节靶细胞及促进细胞与细胞的交互作用，因此提高靶细胞膜上的蛋白表达并诱导细胞信号转导。
循环的核酸可以提供诊断和预后意义的标记物。血液中的MP可以包含来自它们起源细胞(如肿瘤)的mRNA，所述mRNA的形式是可以被基因组技术分析的形式。在妊娠中，细胞外mRNA提供了用于评估胎儿基因表达的材料来源(Ng EK等，Proc Natl Acad Sci U S A.(2003)15；100)。
滋养层细胞起始是作为早期胎儿胚细胞的外部覆盖层，其提供了母体子宫内膜和发育胚胎之间的营养途径。覆盖胎盘绒毛(vili)的人类绒毛膜滋养层细胞(HVT)提供了用于与母体循环交换氧气和营养物质的表面并且它们是暴露于母体循环的具有胚胎表型的唯一细胞。胎盘滋养层细胞分化通过细胞凋亡完成并且导致了合体滋养层细胞MP释放至母体循环中。
所述合体滋养层细胞来源MP与体外循环的胎儿核酸相关[DNA andmRNA，Gupta AK等，Clinical Chemistry(2004)50：2187-2190]。合体滋养层细胞来源MP可以在起始于怀孕中期的母体循环中被检测(即，使用ELISA和抗NDOG2抗体)，它们的数量在怀孕末期时增加且它们参与正常或先兆子痫怀孕中的系统炎症反应[Germain SJ等，J Immunol.(2007)178：5949-56]。用抗NDOG1抗体标记胎盘来源MP并用流式细胞术评估[Aharon A等.J ThrombHaemost.2009 Mar 13]。
之前的研究描述了通过从母体血液中分离胎儿有核细胞(如红细胞)并将它们用于遗传分析来进行胎儿分析(见如美国专利号5,750,339)。
美国专利申请号20080261822描述了通过滋养层细胞的原位染色用于产前诊断的方法。根据它们的技术，从怀孕个体收集经子宫的标本并将所述标本进行滋养层细胞特异的免疫染色，随后进行基于原位DNA的遗传分析以测定胎儿性别和/或鉴定胎儿中染色体和/或DNA的异常。
其它的文献包括Orozco AF等，American Journal of Pathology(2008)173：1595-1608。
发明内容
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供一种产前分析胎儿的方法，所述方法包括：(a)分离胎盘来源微粒；和(b)分析胎盘来源微粒的内含物的至少一种成分，其中所述至少一种成分是胎儿特征的指示。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供一种从怀孕个体获得的血液样品中分离胎盘来源微粒的方法，所述方法包括：(a)在使得至少一种试剂与胎盘来源微粒结合的条件下，用至少一种试剂接触所述血液样品，其中所述至少一种试剂与胎盘来源微粒特异结合而不与母体微粒结合；和(b)分离所述胎盘来源微粒，从而从血液样品中分离胎盘来源微粒。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供一种包含至少80～％胎盘来源微粒的分离微粒群，所述胎盘来源微粒根据权利要求3的方法获得。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供一种用于产前分析胎儿的试剂盒，所述试剂盒包括一种包裹材料和使用说明书，其中所述包裹材料包裹能够特异结合胎盘来源微粒的第一种试剂和用于分析所述胎盘来源微粒的内含物的至少一种成分的第二种试剂。
根据本发明的一些实施方式，所述方法进一步包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前，从所述胎盘来源微粒中分离所述成分。
根据本发明的一些实施方式，所述分离不通过FACS实现。
根据本发明的一些实施方式，所述分离通过免疫沉淀实现。
根据本发明的一些实施方式，所述方法进一步包括在所述接触之前离心所述血液样品以获得贫血小板血浆(PPP)。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂包括抗体。
根据本发明的一些实施方式，所述抗体结合胎盘来源微粒的膜多肽。
根据本发明的一些实施方式，所述抗体包括抗NDOG1抗体。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂结合多肽，所述多肽选自人绒毛膜促性腺激素(HCG)、人胎盘催乳激素(hPL)、NDOG1、NDOG2、NDOG5、Trop-1和Trop-2。
根据本发明的一些实施方式，所述分离根据权利要求3的方法实现。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种成分包括核酸。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种成分包括多肽。
根据本发明的一些实施方式，所述特征是胎儿疾病。
根据本发明的一些实施方式，所述胎儿疾病包括胎儿染色体畸变。
根据本发明的一些实施方式，所述染色体畸变包括非整倍体。
根据本发明的一些实施方式，所述胎儿疾病包括胎儿遗传突变。
根据本发明的一些实施方式，所述遗传突变包括5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的多态性。
根据本发明的一些实施方式，所述特征是胎儿性别。
根据本发明的一些实施方式，所述胎盘来源微粒是在从怀孕个体获得的血液样品中。
根据本发明的一些实施方式，所述第一种试剂包括抗体。
根据本发明的一些实施方式，所述抗体包括抗NDOG1抗体。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种成分选自核酸和多肽。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒进一步包括至少一种用于从胎盘来源微粒中分离核酸的试剂。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒进一步包括至少一种用于从胎盘来源微粒中分离多肽的试剂。
根据本发明的一些实施方式，所述第二种试剂选自寡核苷酸、探针、抗体和染料。
根据本发明的一些实施方式，所述血液样品选自全血、分馏的全血、稀释的血液样品、未稀释的血液样品、血浆、血清和微粒。
除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。示例性的方法和/或材料在下文中描述，但是与本文描述的那些相似或相当的方法和材料可以用在本发明实施方式的实践和测试中。如果有冲突，将以本发明的说明书，包括定义为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是示例性的，并不意味着必要的限定。
附图说明
仅出于举例的目的，参考附图在本文中描述本发明的一些实施方式。现在详细参考附图，应当强调的是示出的具体内容是为了举例并出于例证性讨论本发明实施方式的目的。在这方面，与附图一起呈现的描述内容使本领域技术人员清楚地知道如何实施本发明的实施方式。
在图中：
图1A-B显示了滋养层细胞特异抗体NDOG1的特异性。从24周的孕妇获得胎盘的人绒毛膜滋养层细胞(HVT)，用同种型对照IgG-PE或抗NDOG1-PE标记，并通过FACS分析。图1A例示了用同种型对照IgG-PE标记的HVT；图1B例示了用抗NDOG1-PE标记的HVT。
图2显示了胎盘来源微粒(MP)。用抗NDOG1标记从未怀孕的女性(NP)、健康的孕妇(HP)和患有妊娠血管并发症(GVC)的女性的贫血小板血浆中分离的MP，并通过FACS评估。
图3A-E显示了在怀孕早期胎盘MP水平的评估。从未怀孕女性(NP)和怀孕不同阶段(怀孕11、13、15和19周)的健康孕妇的贫血小板血浆(PPP)分离MP。红色区域代表阴性对照IgG。黑色曲线代表用胎盘标记物抗NDOG1标记的MP的百分比。
图4A-D显示了从总MP分离胎盘MP。在免疫分离之前(图4A-B)和分离之后(图4C-D)用胎盘标记物NDOG1或母体胎盘标记物CD41标记15周孕妇的MP。
图5描述了微粒来源DNA浓度和质量。通过超速离心从19周孕妇的贫血小板血浆(PPP)分离MP。用纯化试剂盒提取DNA并通过Nanodrop评估DNA浓度和质量。
图6描述了使用QF-PCR的滋养层细胞来源微粒的遗传图解。滋养层细胞在体外生长，饥饿48小时并收集上清液。通过系列离心从上清液分离滋养层细胞MP。从滋养层细胞MP提取DNA并使用QF-PCR分析对13、18、21、X和Y染色体进行分子分析。
图7描述了通过Rotor-gene PCR评估的胎盘来源微粒中亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)多态性的遗传图解，所述胎盘来源微粒分离自三个不同孕妇的血浆。线1(蓝色线)是具有正常MTHFR基因表达的对照DNA样品；线2(黄色线)是具有MTHFR(C677T)突变的DNA样品-杂合子；线3(紫色线)是从1号孕妇的胎盘来源MP获得的DNA样品(怀孕21周)-发现所述胎儿的MTHFR基因表达是正常的；线4(兰绿色线)是从2号孕妇的胎盘来源MP获得的DNA样品(怀孕20周)-发现所述胎儿隐藏MTHFR突变(杂合子)；线5(黑色线)是从3号孕妇的胎盘来源MP获得的DNA样品(怀孕20周)-发现所述胎儿隐藏MTHFR突变(纯合子)；线6(红色线)是H2O样品。
图8是总结了胎儿基因诊断(如检测胎儿染色体非整倍性)的流程图。
具体实施方式
在一些实施方式中，本发明涉及从母体血液样品中分离胎盘来源微粒的方法和试剂盒以及它们用于描绘胎儿特征的应用。
参考附图和补充的描述将更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解，本发明并非必要地限制在该申请下述描述或由实施例所例举的详细内容中。本发明的能够进行其它实施方式或由多种方式实践或实现。同样，应当理解，本文中使用的措辞和术语是出于描述的目的，不应当认为是限定。
已知合体滋养层细胞来源微粒(MP)与体外循环的胎儿核酸相关[DNA andmRNA，Gupta AK等，Clinical Chemistry(2004)50：2187-2190]。但是，到目前为止，仍不知道胎盘来源微粒可能以何种方式从母体血液中分离，使得微粒可以用于胎儿的遗传评估。
如在下文和随后的实施例部分所显示的，本发明人已经揭示：使用特异结合滋养层细胞特异蛋白，NDOG1的抗体可以从母体血液样品中分离胎盘来源微粒(见实施例4)。所述胎盘来源微粒然后可以用于从其中提取核酸(见实施例5)和表现胎儿的遗传特征，所述遗传特征包括染色体畸变(见实施例6)和遗传突变(见实施例7)。此外，本发明人已经显示胎盘来源微粒在怀孕早期(如，从至少妊娠11周，见实施例3)的母体血液中是明显的，并因此可以用于怀孕早期的胎儿诊断。
因此，根据本发明的一个方面，提供一种产前分析胎儿的方法，所述方法包括：(a)分离胎盘来源微粒；和(b)分析胎盘来源微粒的内含物的至少一种成分，其中所述至少一种成分是胎儿特征的指示。
本文使用的术语“产前”指出现怀孕或在孩子出生前存在的任何时期。根据本发明教导，所述怀孕个体是人类女性。
本文中使用的术语“胎儿”指处于从受精开始直到出生的孕期的任何时期的未出生的孩子，包括胚胎或胎儿。
所述分析可以在怀孕的任何时期实现。根据一种实施方式，所述分析在妊娠的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21周或之后实现。
应当意识到，妇科学和产科学的普通技术人员完全能够确定准确的怀孕周数。
本文使用的术语胎儿指健康胎儿或患病胎儿(如，患有遗传病或遗传突变)。
本文使用的短语“胎盘来源微粒”指包含胎盘物质的非细胞微粒，所述微粒的直径是大约100nm至大约10μM或大约100nm至大约1.5μM。根据一种实施方式，所述微粒源自合体滋养层细胞(见Rusterholz等，Fetal Diagn Ther.(2007)22(4)：313-7.Epub 2007Mar 15)，或凋亡小体(见Hasselmann等，ClinChem(2001)47：1488-1489)。这些微粒通常是作为胎儿胎盘的脱离(如在细胞活化、补体活性之后)和/或细胞溶解(如由细胞凋亡产生)的结果而形成。
为了分析胎儿，首先从母体血液样品中分离胎盘来源微粒。所述血液样品可以包括全血、分馏的全血、稀释的血液样品、未稀释的血液样品、血浆、血清或微粒。
本文中使用的术语“分离”指从血液样品中物理分离胎盘来源微粒。本领域已知的任何分离方法可以用于分离胎盘来源微粒，所述方法在下文中进一步详细描述。根据一种实施方式，实施所述分离以使得含有所述微粒的样品中不存在完整细胞。
根据一种实施方式，在分离之前，使用方法以富集血液中的胎盘来源微粒。例如，可以处理血液以移除血小板和其它细胞以获得贫血小板血浆(PPP)。这可以使用如高旋转离心的技术实现，所述技术在下面的材料和方法部分详细描述。
应当意识到，母体微粒(如，血小板来源微粒、内皮细胞来源微粒、白细胞来源微粒和红细胞来源微粒)同样存在于血液样品中，因此，应当使用能够区分两者的试剂分离胎盘来源微粒。这样的试剂可以包括与在所述胎盘来源微粒的外部膜上表达的多肽特异结合的抗体。可选地，所述试剂可以包括小的可渗透剂(如抗体)，所述可渗透剂穿过微粒膜并与在胎盘来源微粒的内部表达的多肽结合。优选地，本发明的试剂与胎盘来源微粒结合的亲和力是与母体微粒结合的亲和力的至少2.5倍，更优选地至少5倍，更优选地至少10倍。
因此，所述抗体可以结合存在于所述胎盘来源微粒的表面或内部的胎盘或滋养层细胞特异的抗原标记物，如Trop-1、Trop-2、NDOG1、NDOG2、NDOG5、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、人胎盘催乳激素(hPL)。
根据本发明的一种具体实施方式，所述抗体是抗NDOG1抗体(例如，可购自Serotec，Abeam，GenWay Biotech，Inc.和Lifespan BioSciences)。
可以用于特异结合胎盘来源微粒的抗体的例子包括，但不限于：抗滋养层细胞特异抗原抗体，如HLA-G抗体，其针对于部分非经典I类主要组织相容性复合体(MHC)抗原，所述抗原特异于绒毛外滋养层细胞(Loke，Y.W.等，1997.Tissue Antigens 50：135-146)；特异于合体滋养层细胞和/或细胞滋养层细胞的抗人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)抗体(Leitner，K.等，2001，J.Histochemistry andCytochemistry，49：1155-1164)；抗黑色素瘤细胞粘附分子(MCAM)的CHL1(CD146)抗体(Higuchi T.，等，2003，Mol.Hum.Reprod.9：359-366)；抗laeverin的CHL2抗体，所述laeverin是一种新的蛋白，它属于膜结合的谷氨酸锌化金属肽酶并在滋养层细胞上表达(Fujiwara H.，等，2004，Biochem.Biophys.Res.313：962-968)；与胎儿细胞表面上存在的人滋养层细胞膜糖蛋白相互作用的H315抗体(Covone A E和Johnson P M，1986，Hum.Genet.72：172-173)；特异于合体滋养层细胞的FT1.41.1抗体和103抗体(Rodeck，C，等，1995.Prenat.Diag.15：933-942)；特异于绒毛外细胞滋养层细胞的NDOG5抗体(Miller D.，等1999，同上)；BC1抗体(Bulmer，J.N.等，Prenat.Diagn.1995，15：1143-1153)；分别特异于合体滋养层细胞和细胞滋养层细胞或合体滋养层细胞的AB-154抗体或AB-340抗体(Durrani L等，1994，Prenat.Diagn.14：131-140)；在孕期的第10周和12周特异于合体滋养层细胞和绒毛外滋养层细胞的葡萄糖转运蛋白(Glut)-12抗体(Gude N M等，2003.Placenta 24：566-570)；抗由绒毛外滋养层细胞表达的人胎盘催乳激素(hPLH)的Mab FDO202N(Latham S E，等，PrenatDiagn.1996；16(9)：813-21)。
抗其它蛋白抗体也可以与本发明一起使用，所述其它蛋白在滋养层细胞上表达。例子包括，但不限于：在正常滋养层细胞表面上表达的HLA-C(KingA，等，2000，Placenta 21：376-87；Hammer A，等，1997，Am.J.Reprod.Immunol.37：161-71)，在绒毛外滋养层细胞上表达的JunD和Fra2蛋白(API转录因子的成员)(BambergerAM，等，2004，Mol.Hum.Reprod.10：223-8)，由nm23-H1基因编码并在怀孕初期在绒毛外滋养层细胞中表达的二磷酸核苷酸激酶A(NDPK-A)蛋白(Okamoto T，等，2002，Arch.Gynecol.Obstet.266：1-4)，Tapasin(Copeman J，等，2000，Biol.Reprod.62：1543-50)，在侵蚀性滋养层细胞或绒毛外滋养层细胞中表达但不在绒毛膜滋养层细胞中表达的CAR蛋白(柯萨奇病毒和腺病毒受体)(Koi H，等，2001，Biol.Reprod.64：1001-9)，在绒毛外滋养层细胞中表达的人无刚毛盾片类似物(Achaete Scute Homologue)-2(HASH2)蛋白(Alders M，等，1997，Hum.MoI.Genet.6：859-67；Guillemot F，等，1995，Nat.Genet.9：235-42)，在滋养层细胞中表达的人绒毛膜促性腺激素α(α-HCG)(Schueler PA，等，2001，Placenta 22：702-15)，胰岛素样生长因子II(IGF-II)，与组织因子途径抑制剂2(TFPI-2)相同并由细胞滋养层细胞表达的胎盘蛋白5(PP5)(Hube F等，Biol Reprod.2003；68：1888-94)，以及仅由滋养层细胞系的细胞表达的胎盘特异基因(PLAC1、PLAC8和PLAC9)(Fant M等，MolReprod Dev.2002；63：430-6；Galaviz-Hernandez C等，2003，Gene 309：81-9；Cocchia M等，2000，Genomics 68：305-12)。
在试剂与胎盘来源微粒结合之后，可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法将所述粒子从血液样品和/或其它微粒中分离，如通过免疫沉淀反应、通过磁珠(如Bioadamt珠)或通过荧光激活的细胞分选(FACS)。
FACS分析能够检测在细胞或微粒膜上存在的抗原，如NDOG1。简要地，抗原特异抗体(如抗NDOG1抗体)与荧光团连接，并通过细胞分选仪进行检测，所述细胞分选仪读出每个细胞或微粒在穿过光束时发出的光的波长。所述方法可以同时使用两种或更多种抗体。所述FACS仪同样能够分选出与特异抗体特异结合的细胞或微粒。
多数的流式细胞仪可以商业购得，包括如Becton Dickinson FACScan和FACScalibur(BD Biosciences，Mountain View，CA)。可以用于FACS分析的抗体在Schlossman S，Boumell L等，[Leucocyte Typing V.New York：OxfordUniversity Press；1995]中有说明，并可以广泛地商业购得。
免疫沉淀反应(IP)能够检测在细胞或微粒膜上存在的抗原，如NDOG1。简要地，所述抗体(如抗NDOG1抗体)可以直接与样品(如血液样品、血浆样品等)相互作用，使用连接至珠子的二抗进一步检测形成的复合物(如，如果所述抗NDOG1抗体是鼠单克隆抗体，则二抗可以是连接至如琼脂糖珠或磁珠(如Bioadamt珠)的抗鼠抗体)。然后可以通过离心(对于琼脂糖株)将珠子沉淀并使用磁性柱(对于磁珠)或使用洗提液将珠子从所述样品中分离。
根据本发明的一种实施方式，所述分离的微粒群包括至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的胎盘来源微粒。
为了确定胎儿的特征，分析所述分离的胎盘来源微粒的内含物。所述内含物的具体成分包括例如：胎儿染色体、核酸、多肽、内体和外来体。
在本文中使用的术语“分析”指划分特征、疾病、紊乱或症状，确定疾病或综合征的倾向或疾病或综合征的严重度，或预测疾病或综合征的结果和/或恢复前景。术语“检测”同样可选地包括以上任意一种。
本文中使用的术语“特征”指胎儿的任何独特的性状，包括：如性别、毛色、肤色、眼睛颜色或可以通过胎儿遗传检测确定的任何其它遗传性状。此外，术语特征也可以指胎儿的父本检测以确定它的生物学双亲。
根据本发明的教导，可以实施胎儿分析以确定胎儿是否患有遗传病或遗传突变以及有先天缺陷的可能性。可以由根据本发明的教导分析的先天缺陷包括但不限于：神经管缺陷、脊柱裂、颚裂、代谢疾病、神经管缺陷、镰状细胞性贫血、血友病、地中海贫血病(如，β-地中海贫血病)、包括如常见易位(如罗伯逊易位)的染色体异常或畸变、染色体缺失和/或微缺失(如，天使综合征、迪乔治综合征)、染色体非整倍体(如，唐氏综合征)、单基因病(如，囊肿型纤维化、泰-萨二氏病、海绵状脑白质营养不良症、戈谢病、家族性自主神经机能异常、尼曼-匹克氏病、范科尼贫血、共济失调毛细管扩张、布鲁姆综合征、家族性地中海热(FMF)、X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良、因子XI、DNA-甲基化相关的疾病[如，印记疾病如天使综合征、帕-魏二氏综合征、贝-威综合征、肌阵挛-肌张力障碍综合征(MDS)]、以及由下文进一步详细描述的小染色体畸变引起的疾病(如，小三体镶嵌性、重复亚端粒区、间质缺失或重复)。
将意识到，本发明能够以非侵入方式分析胎儿。但是，本发明的教导可以与其它产前检查方法结合，所述其它产前方法包括：羊膜穿刺术、绒毛膜绒毛取样、超声波检查(如颈部半透明层超声)、血清标志物检查或遗传筛选。
根据本发明分析胎儿特征可以通过确定包含在胎盘来源微粒内部的成分的水平(量)而实现，其中所述水平与特征或疾病的倾向、存在或不存在，疾病分期等相关。
与在从健康胎儿获得的相似样品中发现的那些(即，对照数据)相比，这些成分的水平可以是上调或下调的。
根据本发明的教导，在一种成分中(如，在一种染色体中)的变化可能是胎儿特征(如，遗传病)的指示。因此，染色体异常或畸变可以指染色体数量异常(如21三体、X单染色体症)或指染色体结构异常(如缺失、易位等)。
例如，5号染色体短臂的部分缺失是猫叫综合征的指示；多一条21号染色体(21三体)是唐氏综合征的指示；18号染色体三体是爱德华兹综合征的指示；多15号染色体的遗传物质是具同形双着丝粒15(也被称为IDIC(15)、15号染色体倒转复制、特别标记、Inv dup 15、15号染色体部分三体)的指示；4号染色体短臂的部分缺失是沃-赫综合征的指示；11q末端缺失是雅克布逊综合征的指示；男性胎儿多一条X染色体(XXY)是克莱恩费尔特氏综合征的指示；女性胎儿多一条X染色体是三X综合征(XXX)的指示；13号染色体三体是帕陶氏综合征(也称为D综合征或13三体)的指示；缺失性染色体(X取代XX或XY)是特纳综合征的指示；男性胎儿多一条Y染色体是(XXY综合征)的指示；多出第47条常染色体导致多余的遗传物质(称为微小额外标记染色体(sSMC))可以是猫眼综合征、Idic15(如上所述)和帕-克综合征的指示，所述第47条常染色体来源于24种不同的人染色体中的任何一种
根据另一种实施方式，根据本发明分析胎儿特征可以通过分析包含在胎盘来源微粒中的多核苷酸或多肽序列而实现，所述胎盘来源微粒从母体血液样品中获得，其中所述序列与特征或疾病的倾向、存在或不存在，疾病分期等相关。
例如，通过对β-葡糖苷酶基因测序或通过分析引起高雪氏病的突变可以在胎儿中诊断高雪氏病，所述突变如I型(N370S纯合子)、II型(1或2个等位基因L444P)和III型(1-2个拷贝的L444P)；通过对11号染色体上的HBB基因测序可以在胎儿中诊断β-地中海贫血；通过对BLM基因中的突变进行测序可以在胎儿中诊断布卢姆综合征(BLM，也被认为是Bloom-Torre-Machacek综合征)；通过对17号染色体的BRCA1基因和13号染色体上的BRCA2基因两者之一进行测序可以在胎儿中诊断乳癌增加的倾向；通过检测天冬氨酸酰基水解酶缺乏或氨基酰化酶2缺乏在胎儿中诊断卡纳瓦病，也被称为Canavan-Van Bogaert-Bertrand病；通过分析(在第7号染色体上的)CFTR基因突变可以在胎儿中诊断囊肿性纤维化(也被认为是CF)；通过分析GLA基因的突变可以在胎儿中诊断法布瑞病(也被认为是法布瑞氏病、安德森-法布瑞氏病、弥漫性体部血管角皮瘤和α-半乳糖苷酶A缺乏)；通过分析以下基因的突变可以在胎儿中诊断范可尼贫血：FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM和FANCN；通过分析第9号染色体上的IKBKAP基因的突变可以在胎儿中诊断家族性植物神经功能障碍症(FD，也被称为戴-赖二氏综合征)；通过分析定位在第16号染色体短臂(16p13)上的MEFV基因的突变可以在胎儿中诊断家族性地中海热(FMF)；通过分析X染色体的Xq28带上的突变可以在胎儿中诊断葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏；通过分析以下基因中的突变可以在胎儿中诊断枫糖尿病：BCKDHA、BCKDHB、DBT和DLD；通过分析MCOLN1基因中的突变可以在胎儿中诊断IV型粘多糖症(ML IV)；通过分析SMPD1基因中的突变(诊断为A型和B型尼曼-匹克氏病)和NPC1和NPC2中的突变(诊断为C型尼曼-匹克氏病(NPC))可以在胎儿中诊断尼曼-匹克氏病；通过分析第15号染色体上的HEXA基因的遗传突变可以在胎儿中诊断泰-萨二氏病以及通过分析编码叶酸依赖酶5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因中C677T多态性的T等位基因的纯合性，可以在胎儿中诊断神经管缺陷。
可以从文献或通过分析已知是健康胎儿(使用其它诊断技术，如上文所述的那些确定)的胎盘微粒获得对照数据，
因此，根据本发明的教导，实现分析胎盘来源微粒的内含物首先需要从微粒中分离所述内含物。
分离DNA或RNA的方法是本领域已知的，如在下文所描述的那些。
例如，通过包括以下方法实现DNA纯化：细胞溶解、蛋白提取、使用2-3倍体积的100％乙醇沉淀DNA、用70％乙醇清洗、粒化、干燥并在水或其它任何合适溶液(如Tris-EDTA)中悬浮。优选地，之后进行一种方法以确定DNA浓度，如通过测量样品在260nm处的光学密度(OD)(其中1单位OD＝50μg/mlDNA)。可选地，可以通过加入蛋白消化酶(如，蛋白酶K)，然后变性(如在95℃时加热5-10分钟)以获得DNA。
可以通过例如使用TRI试剂、TRIzol或Trisure(可购自如Sigma-Aldrich、Invitrogen或Bioline)的苯酚-氯仿提取法纯化RNA。同样可以纯化短RNA(少于200个核苷酸)种类(如siRNA、miRNA和tRNA)以用于胎儿分析。
将意识到，本发明教导预期纯化和分析成片段的核酸序列或完整的核酸序列。
可以使用分离的多核苷酸(如，多核苷酸探针、寡核苷酸探针/引物)来确定具体核酸序列的存在和/或水平，所述多核苷酸能与胎儿核酸序列或其一部分杂交。这样的多核苷酸可以是任何大小，如短多核苷酸(如15-200个碱基)和中间的多核苷酸(如200-2000个碱基)或大于2000个碱基的长多核苷酸。
本发明使用的分离的多核苷酸探针可以是特异于本发明胎儿转录本的任何直接或间接标记的RNA分子(如，RNA寡核苷酸，一种体外转录的RNA分子)、DNA分子(如，寡核苷酸、cDNA分子、基因组分子)和/或它们的类似物(如肽核酸(PNA))。
术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的单链或双链寡聚物或多聚物或其类似物。该术语包括由天然存在的碱基、糖和核苷内共价连接键(如，骨架)组成的寡核苷酸，以及具有非天然存在部分的寡核苷酸，所述非天然存在部分与各自天然存在部分的功能相似。
根据本发明教导设计的寡核苷酸可以根据本领域已知的任何寡核苷酸合成方法(如酶催化合成法或固相合成法)产生。用于完成固相合成法的仪器和试剂可购自如Applied Biosystems。同样可以使用用于这种合成的任何其它方法；本领域技术人员完全能够实现寡核苷酸的实际合成，并且使用固相化学如氰乙基亚磷酰胺，接着脱保护、脱盐和通过如自动的trityl-on方法或HPLC的纯化，通过以下具体描述的确定方法学完成：“Molecular Cloning：A laboratoryManual”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”卷I-IIIAusubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide toMolecular Cloning”，John Wiley&Sons，New York(1988)以及“OligonucleotideSynthesis”Gait，M.J.，ed.(1984)。
本发明的寡核苷酸有至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少22个、至少25个、至少30个或至少40个碱基与上文描述的序列变化特异杂交。
本发明使用的分离的多核苷酸可以使用标签或标记分子直接或间接地标记。这样的标记可以是如荧光素分子(如荧光素或德克萨斯红)、放射性分子(如32P-γ-ATP或32P-α-ATP)和显色底物(如坚固红、BCIP/INT，购自(ABCAM，剑桥，MA)。直接标记可以通过将标记分子与多核苷酸共价连接(如，使用固相合成)或通过聚合合并(如，使用体外转录反应或随机引物标记)而完成。间接标记可以通过将多核苷酸与非标记的标签分子(如异羟基洋地黄毒甙元或生物素)共价连接或合并，随后将所述多核苷酸与标记的分子(如抗异羟基洋地黄毒甙元抗体或链霉亲和素)作用而完成，所述标记的分子能够特异识别非标记的标签。
上述的多核苷酸可以用在多种RNA检测方法中，如RNA印迹分析、反转录PCR(RT-PCR)(如，使用如Light CyclerTM(Roche)的半定量RT-PCR、定量RT-PCR)、RNA原位杂交(RNA-ISH)、原位RT-PCR染色(如在NuovoGJ，等1993，Intracellular localization of polymerase chain reaction(PCR)-amplifiedhepatitis C cDNA.Am J Surg Pathol.17：683-90，和Komminoth P，等.1994，Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies.Comparison of histology，immunohistochemistry，in situ hybridization，reversetranscriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)and in situ RT-PCR.Pathol ResPract.，190：1017-25中所描述的)，和寡核苷酸微阵列分析(如，使用Affymetrix微阵列(Affymetrix
Figure BPA00001515216600141
Santa Clara，CA))。
对于检测基因扩增，本发明可以使用多种DNA检测方法，如DNA印迹分析、PCR、定量PCR、实时PCR、QS-PCR和限制性片段长度多态性(RELP)。
根据本发明的教导，使用多种适于鉴定序列变化的方法同样可以在胎盘来源微粒中鉴定单核苷酸多态性(SNP)。一种选择是确定PCR反应产物的全部基因序列。可选地，可以在几个其它水平上描述给出的核酸片段。在最低分辨率中，可以通过与已知的标准物在同一块凝胶上进行电泳比较以确定所述分子的大小。在电泳之前用限制性酶组合物进行分解以构建规整的图谱，从而获得所述分子的更详细的图片。通过与标记的探针杂交可以检测所述片段内特异序列的存在，或者通过部分化学降解或存在链末端核苷类似物时通过引物延伸以确定精确的核苷酸序列。
使用涉及寡核苷酸应用的方法代表性地确定胎儿基因中序列变化(如SNP)的存在，所述寡核苷酸与如上文所述的那些胎儿基因中的核酸序列变化特异杂交。
根据本发明的教导，可以使用任何已知的SNP检测方法，如限制性片段长度多态性(RELP)、测序分析、微量测序分析、固相微量测序、MALDI-TOF质谱法、基于聚合酶和连接酶的错配检测分析、LCR(连接酶链式反应)、GapLCR(GLCR)、连接酶/聚合酶介导的遗传分析TM、杂交分析方法、与寡核苷酸阵列杂交、等位基因特异的寡核苷酸(ASO)、变性/温度梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、单链构象多态性(SSCP)、双脱氧指纹法(ddF)、焦磷酸测序TM分析、AcycloprimeTM分析和反向斑点印迹技术。此外，整合的系统(如多成分整合的系统)和微流体系统可以用于分析序列变化。
美国专利号5,451,503提供几个能够用于检测模板DNA或RNA中SNP的寡核苷酸结构的例子。
如上所述，同样可以通过测量胎盘来源微粒中多肽的水平来实现胎儿特征的分析。
因此，一旦分离了胎盘来源微粒，使用本领域公知的方法(如，细胞溶解技术)提取多肽，使用例如特异抗体通过免疫复合物(即，在胎盘来源微粒中存在的胎儿氨基酸序列和所述抗体之间形成的复合物)的形成确定具体多肽的存在和/或水平。
本发明的免疫复合物可以在多种温度、盐浓度和pH值下形成，且本领域技术人员能够调整适于每一种免疫复合物形成的条件。
在本发明中使用的术语“抗体”包括完整分子以及它们的功能性片段，如Fab、F(ab’)2、Fv或抗一种抗原表位的单域分子如VH和VL。这些功能性抗体片段定义如下：(1)Fab，包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可以由用木瓜蛋白酶消化完整抗体以形成完整的轻链和部分重链而产生；(2)Fab’，抗体分子的片段，通过用胃蛋白酶处理完整抗体，然后还原，以产生完整轻链和部分重链而获得；每个抗体分子可以获得两个Fab’片段；(3)(Fab’)2，抗体的片段，通过用胃蛋白酶处理完整抗体但没有后续的还原步骤而获得；F(ab′)2是两个Fab’片段通过两个二硫键连接的二聚物；(4)Fv，被定义为表达成两条链的包含轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；(5)单链抗体(“SCA”)，包含轻链可变区和重链可变区的基因工程分子，通过合适的多肽连接物连接成基因融合的单链分子；和(6)由单一VH或多个VL域组成的单域抗体，其表现出对抗原充分的亲和力。
生产多克隆和单克隆抗体以及其片段的方法是本领域公知的(见，例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1988，通过引用的方式结合至本文)。
根据本发明该方面所述的方法，免疫复合物的检测是胎盘来源微粒中存在多肽的指示。这样的多肽的存在可能是胎儿特征或遗传突变的暗示，可选地，缺少这样的多肽可能暗示胎儿特征或遗传突变。可以使用多种方法检测本发明的免疫复合物的形成，且本领域技术人员能够确定哪种方法适于分析(在下文中详细描述)。
可以使用本领域已知的方法标记本发明的免疫复合物中使用的抗体。将意识到，所述标记的抗体可以是一抗(与特异多肽结合)或与一抗结合的二抗(如，标记的山羊抗兔抗体、标记的鼠抗人抗体)。所述抗体可直接与标记物连接，或可以与酶连接。
本发明的抗体可以是荧光素标记的(使用与抗体连接的荧光素染料)、放射性标记的(使用如125I放射性标记的抗体)，或与酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)连接并与显色底物一起使用以产生比色反应。本发明的酶连接的抗体使用的显色底物包括，但不限于：用于碱性磷酸酶的AEC、坚固红、ELF-97底物[2-(5′-氯-2-磷酰基羟苯基)-6-氯-4(3H)-喹唑啉酮]、对硝基苯基磷酸酯(PNPP)、酚酞二磷酸、和ELF 39-磷酸酯、BCIP/INT、Vector红(VR)、鲑鱼和洋红磷酸盐(Avivi C等，1994，J Histochem.Cytochem.1994；42：551-4)，和用于过氧化物酶的Nova红、二氨基联苯胺(DAB)、Vector(R)SG底物、基于发光氯的化学发光底物。这些酶底物可购自Sigma(St Louis，MO，美国)、MolecularProbes Inc.(Eugene，OR，美国)、Vector Laboratories Inc.(Burlingame，CA，美国)、Zymed Laboratories Inc.(San Francisco，CA，美国)、Dako Cytomation(丹麦)。
可以使用荧光激活的细胞分选(FACS)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印记和放射免疫测定(RIA)分析、免疫沉淀(IP)或基于分子量的方法检测免疫复合物。
本发明也可以被用于在蛋白水平分析序列变化。
简要地，从胎盘来源微粒中提取蛋白(如上文所述)并检测所述蛋白具体多晶型的存在。虽然色谱法和电泳法是用于检测分子量大的变化(如检测由序列变化产生的截短的蛋白)的优选方法，但是使用特异于序列变化的抗体而实现的免疫检测方法如ELISA和蛋白质印记分析、免疫组织化学法等优选用于检测点突变和分子量的微妙变化。
如所提到的，可以对分离自胎盘来源微粒的遗传物质进行胎儿染色体畸变的分析。因此，本发明的教导可以用于检测染色体异常，如染色体非整倍体(即，完全的和/或部分的三体和/或单体)，以及染色体易位、亚端粒重排、缺失、微缺失、倒位和/或重复(即，完全的和/或部分的染色体重复)。
根据一种具体实施方式，所述染色体包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X或Y染色体，或其部分序列。
可以如上文描述地从胎盘来源微粒分离染色体，所述染色体可以包括成片段的染色体或完整的染色体。
可以用本领域已知的方法分析胎儿染色体，例如，通过荧光素原位杂交(FISH)、引物原位标记(PRINS)、定量FISH(Q-FISH)、多色带(MCB)、染色体染料如地衣红或单荧光素染料(如之前在美国专利号5418169中所描述的)、QF-PCR(如使用购自Elucigene的QST*R plus试剂盒)和/或PCR(如实时PCR)。
根据本发明的一种具体实施方式，本发明方法可以用于使用特异于所述突变的引物或探针(如特异于缺失的FISH探针)检测具体基因突变。
因此，本发明教导可以用于检测染色体三体。可以通过本发明检测的染色体三体的例子包括但不限于：21三体(使用如LSI 21q22橙色标记的探针(Abbott目录号5J13-02))，18三体(使用如CEP 18绿色标记的探针(Abbott目录号5J10-18)、CEP.RTM.18(D18Z1，α-卫星)Spectrum Orange TM探针(Abbott目录号5J08-18))，16三体(使用如CEP16探针(Abbott目录号6J37-17))，13三体(使用如LSI.RTM 13SpectrumGreen.TM探针(Abbott目录号5J14-18))和可以使用如CEP X绿色和Y橙色探针(Abbott目录号5J10-51)和/或CEP.RTM.X SpectrumGreen.TM./CEP.RTM.Y(μ卫星)SpectrumOrange.TM探针(Abbott目录号5J10-51)检测的XXY、XYY或XXX三体。
根据本发明的教导可以在胎盘来源微粒中检测多种其它三体和部分三体。这些包括，但不限于：部分三体lq32-44(Kimya Y等，Prenat Diagn.2002，22：957-61)，9p三体和10p三体(Hengstschlager M等，Fetal Diagn Ther.2002，17：243-6)，三体4嵌合性(Zaslav A L等，Am J Med Genet.2000，95：381-4)，三体17p(De Pater J M等，Genet Couns.2000，11：241-7)，部分三体4q26-qter(Petek E等，Prenat Diagn.2000，20：349-52)，9三体(Van den Berg C等，Prenat.Diagn.1997，17：933-40)，部分2p三体(Siffroi J P等，Prenat Diagn.1994，14：1097-9)，部分三体1q(DuPont B R等，Am J Med Genet.1994，50：21-7)和/或部分三体6p/单体性6q(Wauters J G等，Clin Genet.1993，44：262-9)。
本发明的教导可以用于检测几种染色体单体性，如X单体、21单体、22单体(使用如LSI 22(BCR)探针(Abbott，目录号5J17-24))、16单体(使用如CEP 16(D16Z3)Abbott，目录号6J36-17)和15单体(使用如CEP 15(D15Z4)探针(Abbott，目录号6J36-15))。
本发明同样可以用于检测当父母一方已知携带有某种异常时的染色体异常。本发明同样可以用于检测在携带的亲本中无症状而能够引起后代重大遗传病的染色体异常(如易位和微缺失)。这些包括，但不限于：微小额外标记染色体(SMC)的镶嵌(Giardino D等，Am J Med Genet.2002，111：319-23)，t(11；14)(p15；p13)易位(Benzacken B等，Prenat Diagn.2001，21：96-8)，不平衡易位t(8；11)(p23.2；p15.5)(Fert-Ferrer S等，Prenat Diagn.2000，20：511-5)，11q23微缺失(Matsubara K，Yura K.Rinsho Ketsueki.2004，45：61-5)，史密斯-马吉利症候群17p11.2缺失(Potocki L等，Genet Med.2003，5：430-4)，22q13.3缺失(Chen C P等，Prenat Diagn.2003，23：504-8)，Xp22.3微缺失(Enright F等，Pediatr Dermatol.2003，20：153-7)，10p14缺失(Bartsch O，等，Am J Med Genet.2003，117A：1-5)，20p微缺失(Laufer-Cahana A，Am J Med Genet.2002，112：190-3.)，迪乔治综合征(del(22)(q11.2q11.23))，威廉斯综合征(7q11.23和7q36缺失，Wouters C H，等，Am J Med Genet.2001，102：261-5.)，1p36缺失(Zenker M，等，ClinDysmorphol.2002，11：43-8)，2p微缺失(Dee S L等，J Med Genet.2001，38：E32)，1型神经纤维瘤(17q11.2微缺失，Jenne D E，等，Am J Hum Genet.2001，69：516-27)，Yq缺失(Toth A，等，Prenat Diagn.2001，21：253-5)，沃-赫综合征(WHS，4p16.3微缺失，Rauch A等，Am J Med Genet.2001，99：338-42)，1p36.2微缺失(Finelli P，Am J Med Genet.2001，99：308-13)，11q14缺失(Coupry I等，J MedGenet.2001，38：35-8)，19q13.2微缺失(Tentler D等，J Med Genet.2000，37：128-31)，Rubinstein-Taybi综合征(16p13.3微缺失，Blough R I，等，Am J MedGenet.2000，90：29-34)，7p21微缺失(Johnson D等，Am J Hum Genet.1998，63：1282-93)，Miller-Dieker综合征(17p13.3)，17p11.2缺失(Juyal R C等，Am JHum Genet.1996，58：998-1007)，2q37微缺失(Wilson L C等，Am J Hum Genet.1995，56：400-7)。
本发明同样可以用于检测倒位(如反向染色体X(Lepretre，F.等，Cytogenet.Genome Res.2003.101：124-129；Xu，W.等，Am.J.Med.Genet.2003.120A：434-436)，反向染色体10(Helszer，Z.，等，2003.J.Appl.Genet.44：225-229))，隐藏的亚端粒区染色体重排(Engels，H.，等，2003.Eur.J.Hum.Genet.11：643-651；Bocian，E.，等，2004.Med.Sci.Monit.10：CR143-CR151)和/或重复(Soler，A.，等，Prenat.Diagn.2003.23：319-322))。
上文描述的本发明的试剂可以优选地与合适的使用说明和表明FDA批准用于胎儿的产前检查的标签一起包括在诊断试剂盒中。因此，所述试剂盒可以包括能够特异结合胎盘来源微粒的第一种试剂(如，抗体，如抗NDOG1抗体)和用于分析所述胎盘来源微粒的内含物的至少一种成分(如，多核苷酸、染色体或多肽)的另一种试剂(如寡核苷酸、探针、染料或抗体)。可选地，所述试剂盒还可以包括用于从胎盘来源微粒中分离核酸或多肽的其它试剂。所述试剂盒还可以包括合适的缓冲液和用于提高试剂盒保存期的防腐剂。
本文使用的术语“大约”表示±10％。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”及其变化形式表示“包括但不限于”。
术语“由……组成”表示“包括但不限于”。
术语“基本由……组成”表示所述组合物、方法或结构可能包括其它成分、步骤和/或部分，但这仅限于其它成分、步骤和/或部分没有实质上改变要求保护的组合物、方法或结构的基本的和新的特征。
如在本文中所使用的，除非上下文有清楚的说明，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多数化合物，包括它们的混合物。
贯穿本申请，本发明的多种实施方式可以以范围的形式表述。应当理解，以范围形式的描述仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本发明范围的机械限定。因此，范围的描述应当被认为是具有具体公开的所有可能的子范围以及范围内的个别数值。例如，从1至6的范围描述应当被认为是具有具体公开的子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等等，以及所述范围内的个别数值，如1、2、3、4、5和6。这个应用不考虑所述范围的宽度。
当本文中显示数字范围时，它意味着包括所述显示范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语在第一个显示数字和第二个显示数字“之间的范围”和从第一个显示数字“至”第二个显示数字的“范围”在本文可互换使用，意思是包括第一个和第二个显示的数字和它们之间所有的分数和整数。
本文使用的术语“方法”指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于：化学、药学、生物学、生物化学和医学领域的技术人员已知的那些方式、手段、技术和程序或从已知的方式、手段、技术和程序容易地开发的那些方式、手段、技术和程序。
应当意识到，出于清楚目的在分开的实施方式中描述的本发明一些特征可以在单一实施方式中组合提供。相反地，出于简洁目的在单一实施方式中描述的本发明不同实施方式也可以单独地或以任何合适的子组合或适于本发明任何其它已描述的实施方式的形式提供。在不同实施方式中描述的一些特征不能被认为是那些实施方式的必要特征，除非没有那些元素时所述实施方式没有效力。
下面的实施例为上文所描述的以及下面权利要求部分所要求保护的本发明的多个实施方式和方面提供实验支持。
实施例
现在参考下述实施例，所述实施例与上面的描述共同以无限制的方式阐述本发明。
一般地，本文使用的术语和本发明使用的实验方法包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中彻底解释。见，如“MolecularCloning：A laboratory Manual”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols inMolecular Biology”卷I-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel等，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等.(eds)“Genome Analysis：A Laboratory Manual Series”，卷1-4，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；在美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中所列出的方法；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”，卷I-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；“Current Protocols inImmunology”卷I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites等(eds)，“Basic and ClinicalImmunology”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(eds)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman和Co.，NewYork(1980)；在专利和科学文献中广泛描述的可利用的免疫测定，见，如美国专利号3,791,932；3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，eds.(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，Eds.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.L，ed.(1986)；“Immobilized Cells andEnzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”卷1-317，Academic Press；“PCR Protocols：AGuide To Methods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual”CSHL Press(1996)；全部通过引用的方式结合至本文，一如在本文中完全阐述。其它常规参考文献贯穿该文件提供。那其中的方法被认为是本领域公知的并出于方便性提供给读者。其中所包含的信息都通过引用的方式结合至本文。
常规材料和方法
血液收集和准备
从孕妇收集血液样品(20ml)并放置在含有柠檬酸钠(1∶10)的血液收集管中。将所述管子在1500×g下离心15分钟，两次，以获得贫血小板血浆(PPP)。
人绒毛膜滋养层细胞(HVT)表征
使用鼠抗人滋养层细胞膜NDOG1(其代表胎盘滋养层细胞(Serotec，NC，美国))抗体标记人绒毛膜滋养层细胞(HVT)。室温下孵育样品30分钟，清洗，用二抗(PE抗鼠抗体，Jackson ImmunoResearch Europe)标记30分钟并再次清洗。通过FACS分析样品。
胎盘微粒(MP)表征
从怀孕25周的孕妇获得血液样品。通过离心从血浆分离血细胞。
为特异标记所述胎盘微粒(滋养层细胞微粒)，通过在室温孵育30分钟用NDOG1-PE或PE鼠IgG同种型对照(Serotec，NC，美国)标记PPP。通过荧光激活的细胞分选(FACS)分析标记的MP。使用标准的0.75μm珠(BDBiosciences)校准MP尺寸。
胎盘微粒的分离
通过高速离心从PPP(大约10ml样品)分离总微粒(MP)。然后，通过免疫沉淀从总MP小球中分离胎盘特异MP。首先，用抗NDOG1抗体标记MP，然后用抗鼠磁珠(Bioadamt珠)分离NDOG1-MP复合物。所述胎盘MP球然后用于DNA、miRNA或mRNA纯化。
MP核酸提取
根据使用者指南使用DNA纯化试剂盒(EPICENTER)分离DNA。通过Nanodrop定性和定量DNA。
体外滋养层细胞培养和/MP分离
从怀孕20-24周的孕妇中获得的人绒毛膜滋养层细胞(HVT)购自ScienCell(Carlsbad，CA，美国)。在改良的培养基中体外培养细胞，所述培养基中包含50％的含有补充物的滋养层细胞培养基(由ScienCell提供)、22％的DMEM、22％的F12、4％的胎牛血清(FCS)、1％的抗生素(10,000单位/ml的青霉素、10mg/ml的链霉素、250单位/ml的制霉菌素)、0.0001％的两性霉素B、3.5U/ml的肝磷脂。细胞放置在Nonclone培养板或培养瓶中，在37℃、5％CO2下孵育，并在4-15代用于实验。
为获取微粒，使细胞饥饿48小时(所述细胞在不含有血清的M-199培养基中生长)并收集细胞上清液。通过系列离心从上清液分离胎盘MP。通过DNA纯化试剂盒(EPICENTER)从胎盘MP提取DNA。
分子QF-PCR分析
使用QST*R plus试剂盒(Elucigene)进行分子分析，这是一种基于荧光素的高多重DNA测定。该测定包含用于13、18、21、X和Y染色体的标记物并同时在单一管子中检测最常见的常染色体三体性和性染色体非整倍体。
分子基因表达-PCR分析
检测编码叶酸依赖酶5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)的基因中C677T多态性的T等位基因纯合性。该突变是神经管缺陷的已知风险因素(如之前在BMJ 2004；328：1535-1536中所描述的)。
通过实时PCR(Rotore-gene)检测从20周孕妇的胎盘MP获得的DNA中MTHFR基因上的677C--＞T突变。
实施例1
抗体NDOG1特异结合滋养层细胞
为了证明NDOG1与滋养层细胞的特异性，从24周孕妇获得血液样品并使用抗NDOG1-PE特异标记存在于样品中的胎盘的人绒毛膜滋养层细胞(HVT)。如在图1A-B中所显示的，大约90％的HVT表达NDOG1抗原。
实施例2
孕妇中NDOG1特异微粒的检测
用抗NDOG1分别标记从未怀孕的女性(NP)、健康的孕妇和患有妊娠血管并发症(GVC)的女性的贫血小板血浆中分离的微粒，并通过FACS评估。如在图2中所例示的，与未怀孕组的女性相比，两组怀孕组均具有可检测水平的胎盘MP(p＜0.0038)。
实施例3
胎盘MP水平在怀孕早期的提高
从未怀孕女性(NP)和孕期不同周(怀孕11、13、15和19周)的健康孕妇的贫血小板血浆分离MP。如在图3中所例示的，随着怀孕进行，在健康孕妇的样品中显现更多的胎盘来源MP。
实施例4
从总MP有效分离胎盘MP
使用NDOG1标记和免疫沉淀反应(如在上文进一步详细描述的)从总MP有效分离15周孕妇的胎盘MP。如在图4A-D中所例示的，在分离之前，总MP包括胎盘特异MP(用抗NDOG1标记，图4A)和母体MP(用抗血小板标记物CD41标记，图4B)，但是分离胎盘MP之后，所述MP样品仅由胎盘MP组成(图4C)，并没有MP由母体血小板标记物抗CD-41标记(图4D)。
实施例5
测定微粒来源DNA浓度和质量
从怀孕19周的女性的贫血小板血浆(PPP)分离胎盘MP(如上文详细说明的)。然后，使用纯化试剂盒(EPICENTER)提取DNA并评估浓度和质量。如图5中所例示的，从(来自于大约6ml PPP的)微粒中获得大约24ng/μl DNA。
实施例6
使用QF-PCR的滋养层细胞来源微粒的遗传图解
从体外生长的滋养层细胞的上清液分离滋养层细胞微粒(如在上文详细说明的)。从滋养层细胞提取DNA并进行遗传图解。如在图6中所例示的，检测13、18、21、X和Y染色体。
实施例7
从孕妇的贫血小板血浆(PPP)分离胎盘来源微粒。从胎盘MP提取DNA并对5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)多态性进行遗传图解。如在图7中所例示的，检测MTHFR突变(在2号女性的胎盘MP中是杂合子，在3号女性的胎盘MP中是纯合子)以及MTHFR正常基因表达(在1号女性的胎盘MP中)。
综合考虑，该结果证明了胎盘MP可以特异地分离自母体血液，分离自MP的DNA具有良好的质量和数量且可以进一步用于遗传评估，如通过PCR(对本发明的概要见图8)。
尽管已经结合具体实施方式描述了本发明，显然地，本领域技术人员可以进行许多选择、修饰和变化。因此，将包含落入所附权利要求的精神和范围内的所有这样的选择、修饰和变化。
在本说明书中提及的所有公开物、专利和专利申请通过引用的方式全文结合至本文，如同每一个单独的公开物、专利或专利申请特异地且单独地通过引用的方式结合至本文。此外，在该说明书中的任何参考文献的引用或鉴定不应当被解释为承认该参考文献可作为本发明现有技术。在使用段落标题方面，它们不应当被解释为必要限定。

Claims (29)

1.一种产前分析胎儿的方法，所述方法包括：
(a)分离胎盘来源微粒；和
(b)分析所述胎盘来源微粒的内含物的至少一种成分，其中所述至少一种成分是胎儿特征的指示。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：在步骤(a)之后和步骤(b)之前从所述胎盘来源微粒中分离所述成分。
3.一种从怀孕个体获得的血液样品中分离胎盘来源微粒的方法，所述方法包括：
(a)在使得至少一种试剂与胎盘来源微粒结合的条件下，用至少一种试剂接触所述血液样品，其中所述至少一种试剂与胎盘来源微粒特异结合而不与母体微粒结合；和
(b)分离所述胎盘来源微粒，从而从血液样品中分离胎盘来源微粒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分离不通过FACS实现。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分离通过免疫沉淀实现。
6.根据权利要求3所述的方法，进一步包括在所述接触之前，离心所述血液样品以获得贫血小板血浆(PPP)。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述试剂包括抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗体与所述胎盘来源微粒的膜多肽结合。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗体包括抗NDOG1抗体。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述试剂与选自人绒毛膜促性腺激素(HCG)、人胎盘催乳激素(hPL)、NDOG1、NDOG2、NDOG5、Trop-1和Trop-2的多肽结合。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离根据权利要求3所述的方法实现。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种成分包括核酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种成分包括多肽。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征是胎儿疾病。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述胎儿疾病包括胎儿染色体畸变。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述染色体畸变包括非整倍体。
17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述胎儿疾病包括胎儿遗传突变。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述遗传突变包括5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的多态性。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征是胎儿性别。
20.一种分离的微粒群，包括至少80％的胎盘来源微粒，所述胎盘来源微粒根据权利要求3所述的方法获得。
21.一种用于产前分析胎儿的试剂盒，所述试剂盒包括一种包裹材料和使用说明书，其中所述包裹材料包裹能够特异结合胎盘来源微粒的第一种试剂和用于分析所述胎盘来源微粒的内含物的至少一种成分的第二种试剂。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述胎盘来源微粒在从怀孕个体获得的血液样品中。
23.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述第一种试剂包括抗体。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体包括抗NDOG1抗体。
25.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一种成分选自核酸和多肽。
26.根据权利要求21所述的试剂盒，进一步包括至少一种用于从所述胎盘来源微粒分离核酸的试剂。
27.根据权利要求21所述的试剂盒，进一步包括至少一种用于从所述胎盘来源微粒分离多肽的试剂。
28.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述第二种试剂选自寡核苷酸、探针、抗体和染料。
29.根据权利要求3所述的方法或权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述血液样品选自全血、分馏的全血、稀释的血液样品、未稀释的血液样品、血浆、血清和微粒。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2670868A4 (en) * 2011-01-31 2015-05-06 Esoterix Genetic Lab Llc PROCESS FOR ENRICHING MICROPARTICLES OR NUCLEIC ACIDS BY MEANS OF BONDING MOLECULES
CA2826111A1 (en) * 2011-01-31 2012-08-09 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Methods for enriching microparticles or nucleic acids in a complex mixture using size exclusion filtration
EP3027198A4 (en) * 2013-07-31 2017-04-05 Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences Trophoblast derived microparticles for treating ischemic tissue and wounds
CN112710851A (zh) * 2020-12-29 2021-04-27 苏州百志生物科技有限公司 一种检测人体液中胎盘生长因子含量的试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1043788A (zh) * 1988-12-06 1990-07-11 南澳大利亚·弗林德斯大学 由母体血液中分离胎儿细胞的方法来实现产前诊断
CN1234117A (zh) * 1996-10-21 1999-11-03 应用成像公司 用抗胚胎血红蛋白抗体鉴别胎儿细胞的方法
CN101137760A (zh) * 2005-03-18 2008-03-05 香港中文大学 检测染色体非整倍性的方法
CN101245376A (zh) * 2003-01-17 2008-08-20 香港中文大学 作为妊娠相关病症的诊断标志物的循环mRNA

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
US5418169A (en) 1994-03-25 1995-05-23 The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer Chromosome characterization using single fluorescent dye
US5750339A (en) 1994-11-30 1998-05-12 Thomas Jefferson University Methods for identifying fetal cells
US20020045196A1 (en) * 2000-05-12 2002-04-18 Walt Mahoney Methods of isolating trophoblast cells from maternal blood
US20050181429A1 (en) 2003-04-03 2005-08-18 Monaliza Medical Ltd. Non-invasive prenatal genetic diagnosis using transcervical cells
US20040197832A1 (en) * 2003-04-03 2004-10-07 Mor Research Applications Ltd. Non-invasive prenatal genetic diagnosis using transcervical cells
AU2003263660A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-16 Pantarhei Bioscience B.V. Prenatal diagnosis of down syndrome by detection of fetal rna markers in maternal blood
US8158410B2 (en) * 2005-01-18 2012-04-17 Biocept, Inc. Recovery of rare cells using a microchannel apparatus with patterned posts
ITTO20070307A1 (it) * 2007-05-04 2008-11-05 Silicon Biosystems Spa Metodo e dispositivo per la diagnosi prenatale non-invasiva

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1043788A (zh) * 1988-12-06 1990-07-11 南澳大利亚·弗林德斯大学 由母体血液中分离胎儿细胞的方法来实现产前诊断
CN1234117A (zh) * 1996-10-21 1999-11-03 应用成像公司 用抗胚胎血红蛋白抗体鉴别胎儿细胞的方法
CN101245376A (zh) * 2003-01-17 2008-08-20 香港中文大学 作为妊娠相关病症的诊断标志物的循环mRNA
CN101137760A (zh) * 2005-03-18 2008-03-05 香港中文大学 检测染色体非整倍性的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. A. SUNDERLAND等: "Monoclonal antibodies to human syncytiotrophoblast", 《IMMUNOLOGY》, vol. 43, no. 3, 31 July 1981 (1981-07-31) *
D. GOSWAMI等: "Excess Syncytiotrophoblast Microparticle Shedding is a Feature of Early-onset Pre-eclampsia, but not Normotensive Intrauterine Growth Restriction", 《PLACENTA》, vol. 27, no. 1, 1 January 2006 (2006-01-01), XP005176986, DOI: doi:10.1016/j.placenta.2004.11.007 *
MARIAN KNIGHT等: "Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies", 《BRITISH JOURNAL OF OBSTETRICS AND GYNAECOLOGY》, vol. 105, no. 6, 30 June 1998 (1998-06-30), XP002608054 *
叶太阳: "微颗粒及外来体在子痫前期发病机制中的作用", 《中国实用妇科与产科杂志》, vol. 25, no. 4, 30 April 2009 (2009-04-30) *

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Publication number Publication date
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