JP5822913B2 - 2色発色性インサイツハイブリダイゼーション - Google Patents
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Description
この発明は、その全内容を出典明示によりここに援用する2010年4月20日出願の米国仮特許出願第61/326037号及び2010年6月2日出願の米国仮特許出願第61/350560号の優先権を主張するものである。
本発明は、発色性インサイツハイブリダイゼーションのためのシステム及び方法、特に単一アッセイで2以上の呈色検出系の間の干渉を防止する方法に関し、さらにはブレイクアパートプローブを利用するスコア化アッセイ方法にも関する。
本発明は、一又は複数の標的核酸配列にハイブリダイズする核酸プローブを利用する。核酸プローブは、好ましくはハイブリダイゼーションに適した条件下、例えばインサイツハイブリダイゼーション、サウザンブロット、又はノーザンブロットに適した条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズする。好ましくは、検出プローブ部分は、任意の適切な核酸、例えばRNA、DNA、LNA、PNA、又はその組合せを含み、双方の標準的なヌクレオチド、例えばリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド、並びにヌクレオチド類似体を含むこともできる。LNA及びPNAは、DNAとDNA、又はDNAとRNAの間に形成されるものよりも安定した(すなわち、増加したTmを有する)ハイブリダイゼーション複合体を形成する、2つの核酸類似体の例である。LNAとPNA類似体は、化学合成中に、伝統的なDNA及びRNAヌクレオシドと組合せられ、プローブとして使用可能なハイブリッド核酸分子が提供される。LNA及びPNA類似体の使用により、ハイブリダイゼーションパラメーター、例えばハイブリダイゼーション複合体のTmを変更することができる。これにより、標的核酸配列への標的プローブ部分のハイブリダイゼーションに必要な条件と同様又は類似した条件下で、標的核酸プローブの検出標的配列にハイブリダイズする検出プローブの設計が可能になる。
本発明の方法は発色性検出試薬を利用する。発色性検出試薬は、酵素と、酵素の発色性基質を含有する。酵素は、発色性基質において作用し、有色の検出可能なシグナルを生成する。適切な酵素の例には、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ又はβ-ラクタマーゼが含まれる。発色性検出アッセイに有用な酵素基質及び酵素基質系の特定の例には、限定されるものではないが、ジアミノベンジジン(DAB)、4-ニトロフェニルホスフェート(pNPP)、ナフトールホスフェート、ナフトールホスフェート/ファーストレッド(例えば、4-クロロ-2-メチルベンゼンジアゾニウム塩及びその変形、例えばファーストレッドKL/ナフトールAS-TR、ナフトールホスフェート/フクシン、ファーストブルーBB(4-(ベンゾイルアミノ)-2,5-ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート)/ ナフトールホスフェート(例えば、ナフトールAS-TRホスフェート(N-4-クロロ-2-メチルフェニル)3-(ホスホノキシ)ナフタレン-2-カルボキシアミド)、ブロモクロロインドリルホスフェート(BCIP)、BCIP/NBT(ニトロブルーテトラゾリウム)、BCIP/INT(p-ヨードニトロテトラゾリウム)、テトラメチルベンジジン(TMB)、2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンゾチアゾリンスルホネート](ABTS)、o-ジアニシジン、4-クロロナフトール(4-CN)、ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPG)、o-フェニレンジアミン(OPD)、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-ガラクトピラノシド(X-Gal)、メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトピラノシド(MU-Gal)、p-ニトロフェニル-α-D-ガラクトピラノシド(PNP)、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニド(X-Gluc)、及び3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)が含まれる。いくつかの好ましい実施態様では、酵素がアルカリホスファターゼである場合、発色性基質系はナフトールホスフェート/ファーストレッド(及びその変形、例えばファーストレッドKL/ナフトールAS-TR)、ナフトールホスフェート/フクシン、ナフトールホスフェート/ファーストブルーBB(4-(ベンゾイルアミノ)-2,5-ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート)、5-ブロモ,4-クロロ,3-インドリルホスフェート(BCIP)/ナフトールスルファート、BCIP/ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、及びBCIP/p-ヨードニトロテトラゾリウム(INT)からなる群から選択される。他の適切なアルカリホスファターゼ基質は当該技術分野で知られており、限定されるものではないが、WarpRedTM、バルカンファーストレッド、フェランギ(Ferangi)ブルー、及びベクター(登録商標)ブルー、ブラック及びレッドが含まれる。特に好ましい実施態様では、ナフトールホスフェートのジアゾニウム塩は、発色性赤色検出システムに利用される。最も好ましい実施態様では、ファーストブルーBB及びナフトールホスフェート/ファーストレッド発色性検出システムが、同様の組織で利用され、よって、組織サンプルにおいて、2つの標的分子を検出する2色発色性アッセイが提供される。
標的核酸分子は、任意の選択された核酸、例えばDNA又はRNAとすることができる。いくつかの実施態様では、標的核酸はスライドに固定された細胞において検出される。いくつかの実施態様では、標的核酸はスライドに固定された組織において検出される。
ある種の例では、標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)は、癌遺伝子ウイルス、例えばエプスタイン-バーウイルス(EBV)又はヒトパピローマウイルス(HPV、例えば、HPV16、HPV18)からのものである。他の例では、標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)は病原体ウイルス、例えば呼吸器多核体ウイルス、肝炎ウイルス(例えば、C型肝炎ウイルス)、コロナウイルス(例えば、SARSウイルス)、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、又は単純ヘルペスウイルス(HSV)からのものである。
いくつかの実施態様では、本発明は、サンプルの分析、ハイブリダイゼーション及びシグナルプロセシング及び検出のための方法を提供する。これらの方法は、特にサンプルに適用され、ここでブレイクアパートプローブセットが、サンプル中の遺伝子の再構成、例えばALK遺伝子の再構成を検出するために使用される。ブレイクアパートプローブセットは、一般的に、再構成に関連インサイツ例えばブレイクポイントに対してそれぞれ5'及び3'である、標的配列領域を指向する、少なくとも5'及び3'プローブセットを含む。いくつかの好ましい実施態様では、プローブは、それらが異なる色調の色素原、例えば青色及び赤色色素原又は色素原(例えば、青色又は赤色色素原)と銀(例えば、銀ISHを用いる)の組合せで検出されるように標識される。例として、非小細胞肺癌(NSCLC)においてALK再構成を使用すると、再構成されていない配列ALK遺伝子は、紫色のシグナル、又は場合によってはわずかに分離した赤色と青色のシグナルとして可視化される、赤色と青色の色素原の「融合シグナル」を示す。ALK遺伝子が再構成されている場合、赤色及び青色のシグナルは分離している。
この実施例は、アルカリホスファターゼを変性させ、続く第1の発色性検出反応に必要な時間に関するデータを提供する。
* 抗DIG抗体+抗マウスAP抗体+ブロック+赤色検出
** ブロック+抗DNP抗体+抗ウサギAP抗体+赤色検出
この実施例は、いくつかの異なる2色CISHプロトコルからのデータを提供する。データには、ブロック工程後、青色発色性沈殿物が残存していることが示されており(プロトコル1に対してプロトコル2を比較、参照)、37℃での付加的なブロック工程は、第1の検出システムからの有色沈積物に悪影響を及ぼさなかった。ブロック工程が使用される場合、青色及び赤色のISHシグナルの双方がはっきりと生成され(プロトコル6に対してプロトコル7を比較、参照)、近接近しているプローブは、紫色の組合せた色調を生じせしめた。
* DIG標識5'ALKプローブ及びDNP標識3'ALKプローブの同時ハイブリダイゼーション
ホルムアミドを用いた変性工程を、2色検出プロトコルにおいて、いくつかのプローブセットを使用した。図2は、ブロック工程が2つの異なる色調検出システム(紫色のISHシグナル中)で使用されない場合の、明視野ブレイクアパートインサイツハイブリダイゼーションの色調概略図(赤及び青)を示す写真を提供する。図3は、APベースの2色インサイツハイブリダイゼーションシグナルにおける、ブロック工程(すなわち、ホルムアミドを用いた処理)の影響を示す、例示的写真を提供する。図3は、ブロックが色調検出システム間で使用される場合に、バックグランド染色が大きく低下することをさらに例証する。
ALK及びMALT1プローブの設計。ブレイクアパートアッセイを、ALK遺伝子座の配列を評価するように設計した。2つの無反復プローブを生成させ、ALK遺伝子の隣接セントロメア領域(770kb)及びテロメア領域(683kb)にハイブリダイズさせた。生物情報学的ツール(Human Genome Browser and Repeat Masker)を使用し、反復エレメントを除去した。プライマー3プログラム(http://primer3.sourceforge.net)を使用し、領域を横切る唯一の配列に対してプライマーを設計した。設計されたPCR断片及びプライマーを、ヒトゲノムに対する類似性について分析し、ヒトBLAT及びBlastntプログラムにより転写した(ワールドワイドウェブのgenome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)。他の領域に対する高度な類似性を示す断片を除外し、全てのPCR断片を、配列決定により検証した。5'ALKプローブ(全サイズ113kb)に対するPCR断片をライゲーションし、ランダム増幅させ、ジゴキシゲニン(DIG)にコンジュゲートしたdUTPを使用するニックトランスレーションにより標識した(Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)。同様に、3'ALKプローブ(全サイズ154kb)を、2,4 ジニトロフェニル(DNP)にコンジュゲートしたdCTPを使用するニックトランスレーションにより標識した(Ventana Medical Systems, Inc. Tucson, AZ)。
ALK及びMALTプローブ特異性
5'及び3'ALKのDNAプローブの染色体2への局在化。スペクトルグリーン(5'ALK緑色プローブと3'ALK緑色プローブ)、及びVysis CEP2 スペクトルオレンジ(CEP2オレンジ色プローブ)でニックトランスレーションされた5'又は3'ALKのDNAプローブの同時ハイブリダイゼーションを、正常なリンパ球中期展伸において実施した(図6A及びB)。5'ALK緑色プローブとVysis CEP 2オレンジ色プローブを同じ染色体に局在化させると、予期するように、5'ALKプローブが染色体2の短(p)腕に検出された(図6A)。3'ALK緑色プローブ、及びVysis CEP 2オレンジ色プローブも、同じ染色体に局在化させると、3'ALKプローブが染色体2の短(p)腕にハイブリダイズした(図6B)。5'ALK緑色プローブ又は3'ALK緑色プローブのいずれかと、他の染色体とのクロス-ハイブリダイゼーションは、観察されなかった。よって、5'及び3'ALKプローブの、正常なリンパ球中期展伸における、標的配列に対する独立した特異性が示された。
扁桃腺における正常なALK及びMALT1遺伝子。ホルマリン固定され、パラフィン包埋された扁桃腺切片における各プローブの性能を確認するために、5'ALKプローブの青色検出(図8A)及び3'ALKプローブの赤色検出(図7B)を別々に実施した。1-2の青色又は赤色ドットは、正常の扁桃腺細胞において観察されるため、我々は、5'ALK及び3'ALKプローブが正しくDNA標的にハイブリダイズしており、APベースのISH検出を使用し、各標的に対して適切な感度が達成されていることを確認した。ALK ba-ISHが正常な扁桃腺切片で実施されている場合、5'ALKプローブ及び3'ALKプローブは同時局在化しており、紫色ドットとして、青色及び赤色ドットの重複が生じた(図7C)。よって、この観察により、5'及び3'ALKプローブの双方が、標的DNA配列に成功裏にハイブリダイズしていることが確認された。正常な扁桃腺細胞において、青色又は赤色のみのドットを示す、いくつかの細胞が存在することを記しておくべきである。全細胞におけるISHアッセイとは異なり、組織切片でのDNA ISHにおいて、多くの細胞は、組織切片内に部分的に現れるのみである。また、3'MALT1プローブに対する青色検出(図7D)及び5'MALT1プローブに対する赤色検出(図8E)を、正常な扁桃腺切片における各プローブのアッセイ性能を試験するために、別々に実施した。ALKプローブを用いて見られるように、正常な扁桃腺細胞の核には、1-2の青色又は赤色MALT1 ISHシグナルが存在した。よって、我々は、5'及び3'MALT1プローブが、自動化されたISHプロトコルを用いて正しい標的配列と認識し、各MALT1プローブハイブリダイゼーションに対する感度が十分であることを確認した。3'MALT1及び5'MALT1プローブは、ba-ISHにおいて共に試験され、アッセイでは、扁桃腺切片において青色と赤色とが重複した結果として、紫色ドットのシグナルが生じた(図8F)。ALK ba-ISHアッセイにおいては、青色又は赤色のISHシグナルのみを含む、正常な扁桃腺細胞が存在した。上述したように、この現象は、スライスされた組織切片における部分的細胞の故である。このことは、FISHベースの融合シグナル及びブレイクアパート/スプリット-シグナルアッセイ(Van Dongenら. 2005)における問題点である。融合シグナルISH及びブレイクアパートISHアッセイには、「擬陽性」及び「擬陰性」のバックグランドが常に存在するであろう。APベースのシグナルの組合せは、種々のブロック法を使用することにより、免疫組織化学適用において多重化しており(van der Loos and Teeling, 2008; Patersonら, 2008; Piriciら, 2009)、2つのISHアッセイ間の熱処理が効果的である。しかしながら、2つのプローブの混合物を使用する、明視野2色ISH適用について、2つのAP検出間の熱ブロック工程により、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションが変性する。よって、我々は、別のブロック法を見つける必要がある。我々は、プローブとDNA標的との間の特異的ハイブリダイゼーションを保存しつつ、ハイブリダイゼーション用バッファーが、AP酵素用のブロック/変性試薬として有用であることを観察した。
まず、赤色検出を実施し、続いて青色検出を実施することを除き、実施例2の手順を繰り返した。結果を図9に与える。
青色及び赤色検出工程の間に、変性のためのSDSを使用することを除き、実施例2の手順を繰り返した。結果は示さないが、不満足なものであった。
この実施例は、ALK座位の5'-及び3'-領域にハイブリダイズする1対のプローブを使用して、NSCLCを煩っている患者からの、固定され包埋された肺腫瘍組織における、2色CISH及びSISH/CISHインサイツハイブリダイゼーションの評価を記載する。ALKの発現の増加に至るALK遺伝子再構成を検出するために、プローブを使用し、ALKインヒビター治療に対する反応性が高い可能性が示されている。2色CISH(青-赤)及びSISH/CISH(黒-赤)を、複製物に20の肺腫瘍組織が入った組織マイクロアレイにおいて実施し、そのうちの10は、ALK発現に対してポジティブであると予定しており、10は、IHC及び逆転写酵素PCR(RT-PCR)により、ALK発現に対してネガティブであると予定している。得られた染色された試料を明視野条件で評価し、5'-及び3'-ALKシグナルの数及び相対的位置について、試料毎に50の細胞を列挙した。2色CISHで染色されたアレイは、単一リーダーにより列挙され、複製物毎に1つの組織試料を評価し、次のISHパラメーターを測定した:
P1. 融合した5'-及び3'-ALKシグナルのみを有する細胞パーセント
P2. 融合及び分割した5'-及び3'-ALKシグナルの双方を有する細胞パーセント
P3. 分割した5'-及び3'-ALKシグナルのみを有する細胞パーセント
P4. 融合した5'-及び3'-ALKシグナル及び孤立した5'-シグナルの双方を有する細胞パーセント
P5. 融合した5'-及び3'-ALKシグナル及び孤立した3'-シグナルの双方を有する細胞パーセント
P6. 孤立した5'-ALKシグナルのみを有する細胞パーセント
P7. 孤立した3'-ALKシグナルのみを有する細胞パーセント
P8. 任意の非融合の5'-及び3'-ALKシグナルを有する細胞パーセント
P9. 任意の分割した5'-及び3'-ALKシグナル又は孤立した3'-シグナルを有する細胞パーセント
P10. 任意の分割した5'-及び3'-ALKシグナル又は孤立した5'-シグナルを有する細胞パーセント
P11. 任意の分割した5'-及び3'-ALKシグナルを有する細胞パーセント
P2: 任意の非融合シグナルを有する細胞%
P3: 対になった分割シグナルのみを有する(融合又は非対シグナルを有さない)細胞%
P4: 融合し対になった分割シグナルを有する(非対シグナルを有さない)細胞%
P5: 対になった分割シグナルを有し、融合シグナルを有する又は有さない(非対シグナルを有さない)細胞%
P6: 他の融合又は非対シグナルにかかわらず、対になった分割シグナルを有する細胞%
P7: 任意の非対5'-ALKシグナル(類)を有する細胞%
P8: 融合シグナル及び任意の非対5'-ALKシグナル(類)を有する細胞%
P9: 任意の非対3'-ALKシグナル(類)を有する細胞%
P10: 融合シグナル及び任意の非対3'-ALKシグナル(類)を有する細胞%
P11: >2の全5'-ALKシグナルを有する細胞%
P12: >2の全3'-ALKシグナルを有する細胞%
P13: >2の融合シグナルを有する細胞%
P14: >2の対になった分割シグナルを有する細胞%
P15: >1の非対5'-ALKシグナルを有する細胞%
P16: >1の非対3'-ALKシグナルを有する細胞%
P17: 対になった分割シグナル又は非対の5'-ALKシグナル(類)のみを有する(融合又は孤立した3'-ALKシグナルを有さない)細胞%
P18: 融合シグナル(類)及び対になった分割シグナル又は非対の5'シグナル(類)を有する(非対の3'シグナル(類)を有さない)細胞%
P19: 任意の対になった分割又は非対の5'シグナル(類)を有する(非対の3'シグナル(類)を有さない)細胞%
P20: 対になった分割シグナル又は非対の3'-ALKシグナル(類)のみを有する(融合又は孤立した5'-ALKシグナルを有さない)細胞%
P21: 融合シグナル(類)及び対になった分割シグナル又は非対の3'シグナル(類)を有する(非対の5'シグナル(類)を有さない)細胞%
P22: 任意の対になった分割シグナル又は非対の3'シグナル(類)を有する(非対の5'シグナル(類)を有さない)細胞%
P23: 平均の全5-ALKシグナル/細胞
P24: 平均の全3'-ALKシグナル/細胞
P25: 平均の融合シグナル/細胞
P26: 平均の対になった分割シグナル/細胞
P27: 平均の非対5'-ALKシグナル/細胞
P28: 平均の非対3'-ALKシグナル/細胞
P29: 平均の非融合5'-ALK/細胞
P30: 平均の非融合3'-ALK/細胞
P31: 平均の対になった分割+過度の5'-又は3'-ALK/細胞
Claims (14)
- サンプル中の核酸の検出方法であって、
少なくとも第1及び第2核酸プローブを前記サンプル中の第1及び第2標的核酸にハイブリダイズさせ;
酵素と第1発色性基質系を含み前記第1核酸プローブに特異的な第1発色性検出試薬に前記サンプルを接触させ、ここで、該接触は、前記酵素が前記第1発色性基質系に作用して検出可能な第1色素原を生じる条件下でなされ;
ホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素又は尿素系変性剤、チオ尿素、及び塩酸グアニジンからなる群から選択される変性剤を含む溶液で前記サンプルを処理し;
酵素と第2発色性基質系を含み前記第2核酸プローブに特異的な第2発色性検出試薬に前記サンプルを接触させ、ここで、該接触は、前記酵素が前記第2発色性基質系に作用して検出可能な第2色素原を生じる条件下でなされ;及び
第1及び第2の検出可能な色素原を検出する
ことを含む方法。 - 前記第1核酸プローブが第1ハプテンを含み、前記第2核酸プローブが第2ハプテンを含み、場合によっては、前記第1ハプテンがDIGとDNPの一方であり、第2ハプテンがDIGとDNPの他方である請求項1に記載の方法。
- 前記第1発色性基質系が、ファーストブルーBB又はナフトールホスフェート/ファーストレッドの一方であり、前記第2発色性基質系が、ファーストブルーBB/ナフトールホスフェート及びナフトールホスフェート/ファーストレッドの他方から選択される請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルがスライドに固定された組織サンプルを含む請求項1に記載の方法。
- 前記第1及び第2の検出可能な色素原が明視野顕微鏡によって検出される請求項1に記載の方法。
- 前記第1核酸プローブに特異的な前記第1発色性検出試薬が、前記第1ハプテンに特異的な第1抗体と該第1ハプテンに特異的な該第1抗体に特異的な第2抗体をさらに含み、ここで前記第1ハプテンに特異的な前記第1抗体に特異的な前記第2抗体が酵素にコンジュゲートし、前記第2核酸プローブに特異的な前記第2発色性検出試薬が、前記第2ハプテンに特異的な第1抗体と前記第2ハプテンに特異的な前記第1抗体に特異的な第2抗体を更に含み、前記2ハプテンに特異的な前記第1抗体に特異的な前記第2抗体が酵素にコンジュゲートしている請求項2に記載の方法。
- 前記第1核酸プローブに特異的な前記第1発色性検出試薬が、前記第1ハプテンに特異的であり、酵素にコンジュゲートしている第1抗体と、前記第2ハプテンに特異的であり、酵素にコンジュゲートしている第2抗体をさらに含む請求項2に記載の方法。
- 前記酵素が、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ及びβ-ラクタマーゼからなる群から選択される請求項6又は7に記載の方法。
- ハイブリダイズ工程及び接触工程が自動化されている請求項1に記載の方法。
- 酵素と第1発色性基質系を含み第1核酸プローブに特異的な第1発色性検出試薬と;
酵素と第2発色性基質系を含み第2核酸プローブに特異的な第2発色性検出試薬と;
ホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素又は尿素系変性剤、チオ尿素、及び塩酸グアニジンからなる群から選択される変性剤
を含んでなる、請求項1〜9の何れか1項に記載の方法のためのキット。 - 前記第1及び第2発色性検出試薬中の前記酵素が同じ酵素である請求項1〜9の何れか1項に記載の方法。
- 前記酵素がアルカリホスファターゼである請求項11に記載の方法。
- 前記基質がアルカリホスファターゼ基質である請求項11又は12に記載の方法。
- 前記アルカリホスファターゼ基質が、ナフトールホスフェート/ファーストレッド、ファーストレッドKL/ナフトールAS-TR、ナフトールホスフェート/フクシン、ナフトールホスフェート/ファーストブルーBB(4-(ベンゾイルアミノ)-2,5-ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート)、5-ブロモ,4-クロロ,3-インドリルホスフェート(BCIP)/ナフトールホスフェート、BCIP/ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、及びBCIP/p-ヨードニトロテトラゾリウム(INT)からなる群から選択される系である請求項13に記載の方法。
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