JP3017291B2 - 細胞分離用密度勾配媒体 - Google Patents
細胞分離用密度勾配媒体Info
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- G01N33/483—Physical analysis of biological material
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- G01N33/491—Blood by separating the blood components
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- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は細胞分離用、詳細には血球（blood cell）分
離用の密度勾配媒体に関する。さらに詳細には、妊娠し
た女性の血液試料中の母親の血球からの胎児の有核の赤
血球の分離に使用するための溶融し得るゲルに関する。
離用の密度勾配媒体に関する。さらに詳細には、妊娠し
た女性の血液試料中の母親の血球からの胎児の有核の赤
血球の分離に使用するための溶融し得るゲルに関する。
発明の背景 胎児の組織、特に胎児のDNAは、胎児のゲノムの正確
な判断を必要とする胎児期の診断及び他の医療の手順に
おいて用いられる。現在は、胎児の組織は、トンプソン
及びトンプソンの「医学における遺伝学（Genetics in
Medicine）」第５版（W.B.Saunders Co.,フィラデルフ
ィア1991年）に記載されているように羊水穿刺、絨毛膜
絨毛試料採取（CVS）、胎児内視鏡検査または脊髄穿刺
を用いることにより得られる。
な判断を必要とする胎児期の診断及び他の医療の手順に
おいて用いられる。現在は、胎児の組織は、トンプソン
及びトンプソンの「医学における遺伝学（Genetics in
Medicine）」第５版（W.B.Saunders Co.,フィラデルフ
ィア1991年）に記載されているように羊水穿刺、絨毛膜
絨毛試料採取（CVS）、胎児内視鏡検査または脊髄穿刺
を用いることにより得られる。
羊水穿刺では、胎児の細胞を含有している羊水の試料
を針と注射器で母親から腹部を通って取り除く。羊水穿
刺には固有の関連する危険がある。主な危険は、200の
羊水穿刺に一つ起こると推定される流産の誘発である。
他の危険は胎児への母親感染及び物理的損傷を含む。CV
Sでは胎児の栄養膜組織を絨毛膜の絨毛域から子宮頸管
を通ってまたは腹部を通って吸引する。この方法による
胎児の損失の割合は100に１の高さかもしれない。脊髄
穿刺は、超音波誘導で臍帯から直接胎児の血液を得る方
法を提供する。これらの侵入性の各方法は母親と胎児の
双方に危険をもたらす。
を針と注射器で母親から腹部を通って取り除く。羊水穿
刺には固有の関連する危険がある。主な危険は、200の
羊水穿刺に一つ起こると推定される流産の誘発である。
他の危険は胎児への母親感染及び物理的損傷を含む。CV
Sでは胎児の栄養膜組織を絨毛膜の絨毛域から子宮頸管
を通ってまたは腹部を通って吸引する。この方法による
胎児の損失の割合は100に１の高さかもしれない。脊髄
穿刺は、超音波誘導で臍帯から直接胎児の血液を得る方
法を提供する。これらの侵入性の各方法は母親と胎児の
双方に危険をもたらす。
母親の血液から胎児の有核の血球の単離及び濃厚化が
試みられたが、主に胎児の血球が循環する希薄性並びに
胎児の血球及び母親の血球の間の生化学上の及び生理学
上の類似により、この手順を最高に活用するのは非常に
困難であった。
試みられたが、主に胎児の血球が循環する希薄性並びに
胎児の血球及び母親の血球の間の生化学上の及び生理学
上の類似により、この手順を最高に活用するのは非常に
困難であった。
したがって、胎児の組織または胎児のDNAを単離及び
濃厚化するための非侵入性の方法を得ることが望ましい
だろう。血球の集団（population）から希薄な細胞を単
離及び濃厚化する急速で信頼できる方法を得ることも望
ましいだろう。したがって、胎児の有核の赤血球を含
む、希薄な細胞の単離及び濃厚化のために適当な遠心分
離媒体を得ることが望ましいだろう。驚くべきことに、
本発明はこれらのニーズ及び他の関連するニーズを達成
する。
濃厚化するための非侵入性の方法を得ることが望ましい
だろう。血球の集団（population）から希薄な細胞を単
離及び濃厚化する急速で信頼できる方法を得ることも望
ましいだろう。したがって、胎児の有核の赤血球を含
む、希薄な細胞の単離及び濃厚化のために適当な遠心分
離媒体を得ることが望ましいだろう。驚くべきことに、
本発明はこれらのニーズ及び他の関連するニーズを達成
する。
発明の概要 本発明は、細胞集団からの細胞の分離、特に他の血球
から胎児の有核の赤血球の分離のための密度勾配媒体を
提供する。
から胎児の有核の赤血球の分離のための密度勾配媒体を
提供する。
本発明によると、細胞集団の遠心分離用媒体であっ
て、該媒体は溶融し得るゲル中に分散されたコロイドを
含んでなり、該コロイドは実質的に集合していない状態
に細胞集団を維持することができる媒体を提供し得る。
て、該媒体は溶融し得るゲル中に分散されたコロイドを
含んでなり、該コロイドは実質的に集合していない状態
に細胞集団を維持することができる媒体を提供し得る。
本発明の他の面では、細胞集団中の細胞の密度分離の
ための密度勾配媒体を提供し、該密度勾配は、溶融可能
なゲル中に分散されたコロイドの複数の層を含み、該コ
ロイドは細胞集団を集合していない状態に維持すること
ができ、該層は頂部と底のある容器中に封入されていて
頂部には開口があって、層の密度は容器の頂部から、容
器の底に増大している。
ための密度勾配媒体を提供し、該密度勾配は、溶融可能
なゲル中に分散されたコロイドの複数の層を含み、該コ
ロイドは細胞集団を集合していない状態に維持すること
ができ、該層は頂部と底のある容器中に封入されていて
頂部には開口があって、層の密度は容器の頂部から、容
器の底に増大している。
図面の簡単な説明 図１は、赤血球部分の分離のための遠心分離管を示
す。
す。
図２は図2A及び2Bからなり、等張状態（図2A）及び低
張状態（図2B）の臍帯の血液及び母親の血液の平均細胞
容積及び平均ヘモグロビン濃度を示すヒストグラムであ
る。
張状態（図2B）の臍帯の血液及び母親の血液の平均細胞
容積及び平均ヘモグロビン濃度を示すヒストグラムであ
る。
具体的な態様の詳細な説明 特に指示がないならば、本明細書に用いられるすべて
の技術的及び科学的な用語は、当業界における通常の知
識を有する人によってよく知られたものと同じ意味を有
する。
の技術的及び科学的な用語は、当業界における通常の知
識を有する人によってよく知られたものと同じ意味を有
する。
本発明の実施または試験においては、本明細書に記載
されたものと同様または均等の任意の方法及び物質を用
いることができるが、好ましい方法及び物質を記載して
ある。本発明の目的のために次の用記を下記に定義して
いる。
されたものと同様または均等の任意の方法及び物質を用
いることができるが、好ましい方法及び物質を記載して
ある。本発明の目的のために次の用記を下記に定義して
いる。
本明細書に用いる時、「赤血球（erythrocytes）」ま
たは「赤血球（red blood cells）」または「RBC」は、
成人または胎児の赤血球を含み、核があっても、なくて
もよい。
たは「赤血球（red blood cells）」または「RBC」は、
成人または胎児の赤血球を含み、核があっても、なくて
もよい。
本明細書に用いる時、「ゼラチン」は、高平均分子量
の水溶性のタンパク質の異種の成分からなる混合物であ
って、一般にコラーゲンの加水分解作用により誘導され
たものである。ゼラチンの適当な型は、商業的に、たと
えばノックス（Knox）、シグマ化学会社（Sigma Chemic
al Company）及びアルドリッチ化学会社（Aldrich Chem
ical Company）から入手できる。
の水溶性のタンパク質の異種の成分からなる混合物であ
って、一般にコラーゲンの加水分解作用により誘導され
たものである。ゼラチンの適当な型は、商業的に、たと
えばノックス（Knox）、シグマ化学会社（Sigma Chemic
al Company）及びアルドリッチ化学会社（Aldrich Chem
ical Company）から入手できる。
本明細書で用いられる時、「張度（tonicity）」は、
細胞に関係する溶液の濃度の測定値である。たとえば、
等張溶液（血球に関して）は、その中では固体及び塩の
濃度が、該血球が浸透性によって相当量の水を得たり、
失なったりしていないような、天然に見い出されるもの
と同じである溶液である。低張媒体は、その中で、該血
球が浸透性により水を得るような、該血球よりも塩及び
固体が低濃度のものである。高張溶液は、その中で塩及
び固体が、該血球が浸透性により水を失うような該血球
よりも塩及び固体が高濃度のものである。
細胞に関係する溶液の濃度の測定値である。たとえば、
等張溶液（血球に関して）は、その中では固体及び塩の
濃度が、該血球が浸透性によって相当量の水を得たり、
失なったりしていないような、天然に見い出されるもの
と同じである溶液である。低張媒体は、その中で、該血
球が浸透性により水を得るような、該血球よりも塩及び
固体が低濃度のものである。高張溶液は、その中で塩及
び固体が、該血球が浸透性により水を失うような該血球
よりも塩及び固体が高濃度のものである。
成人の赤血球の平均寿命は120日である。120日の間
に、赤血球はたとえばヘモグロビンのグリコシル化にお
ける、不可逆的な変化を蓄積する。固体のかさにおける
変化を伴なわない、水の低下は、米国特許第4835097及
びボラン（Borun）の「臨床研究雑誌（J.Clin.Inves
t.）」36:第676〜679頁（1957年）に記載されているよ
うに、RBCの加令とともに一貫して、密度を増加させ
る。
に、赤血球はたとえばヘモグロビンのグリコシル化にお
ける、不可逆的な変化を蓄積する。固体のかさにおける
変化を伴なわない、水の低下は、米国特許第4835097及
びボラン（Borun）の「臨床研究雑誌（J.Clin.Inves
t.）」36:第676〜679頁（1957年）に記載されているよ
うに、RBCの加令とともに一貫して、密度を増加させ
る。
胎児の血球は、母親の血流において循環している希薄
な血球である。胎児の血球は胎盤を通って母親の血流に
漏れて入ってくると考えられている。この希少な出来事
の頻度の推定は変化するものであるが、約108血球に１
個から1011血球に１個と報告されている。ホルツグレー
ブ（Holzgreve）、Ｗ他の「ランセット（Lancet）」i:1
220頁（1990年）。懐胎期間の初期の間、胎児の赤血球
は有核であり得る。したがって、核のない胎児の赤血球
とは異なり、それらは胎児のDNAを含み、侵入性の手順
の必要なしに胎児の遺伝子分析に用いることができる。
な血球である。胎児の血球は胎盤を通って母親の血流に
漏れて入ってくると考えられている。この希少な出来事
の頻度の推定は変化するものであるが、約108血球に１
個から1011血球に１個と報告されている。ホルツグレー
ブ（Holzgreve）、Ｗ他の「ランセット（Lancet）」i:1
220頁（1990年）。懐胎期間の初期の間、胎児の赤血球
は有核であり得る。したがって、核のない胎児の赤血球
とは異なり、それらは胎児のDNAを含み、侵入性の手順
の必要なしに胎児の遺伝子分析に用いることができる。
ボユム（Boyum）、「スカンジナビア臨床実験研究雑
誌（Scand.J.Clin.Lab.Invest.）」21（付録97）p.31〜
50（1968年）及びバート（Bhart）「N.M.免疫学的方法
雑誌（N.M.J.Immunol.Meth）158:p.277〜280（1993年）
に記載されているように、血球の単離方法が記載されて
おり、それは細胞凝集剤または細胞集合剤、たとえばメ
チルセルロース、Isopaque（商標）、デキストラン及び
Ficoll（商標）、を含有する密度勾配を用いる。Isopaq
ue（商標）は、Ｎ−メチル−3,5−ジアセタミノ−2,4,6
−トリヨード安息香酸ナトリウムであって、前記ボユム
に記載されている。Ficoll（商標、Accurate Chemical
and Scientifrc Corporation、ウェストバリー、NY）
は、ショ糖とエピクロルヒドリンとの共重合により作ら
れる合成高分子である。該分子は水性媒体に溶解性を与
える高含有量の水酸基を持つ側鎖構造を有している。こ
れらの試薬は赤血球を凝集させ、したがって赤血球から
白血球を単離する方法を提供する。しかしながら、これ
らの血球凝集条件のもとでは、胎児の赤血球は、物理的
に凝集した母親の赤血球のかたまりの中に閉じ込められ
て、そのかたまりの平均密度が沈降特性を決定するの
で、したがって、母親の赤血球とともに沈降するだろ
う。
誌（Scand.J.Clin.Lab.Invest.）」21（付録97）p.31〜
50（1968年）及びバート（Bhart）「N.M.免疫学的方法
雑誌（N.M.J.Immunol.Meth）158:p.277〜280（1993年）
に記載されているように、血球の単離方法が記載されて
おり、それは細胞凝集剤または細胞集合剤、たとえばメ
チルセルロース、Isopaque（商標）、デキストラン及び
Ficoll（商標）、を含有する密度勾配を用いる。Isopaq
ue（商標）は、Ｎ−メチル−3,5−ジアセタミノ−2,4,6
−トリヨード安息香酸ナトリウムであって、前記ボユム
に記載されている。Ficoll（商標、Accurate Chemical
and Scientifrc Corporation、ウェストバリー、NY）
は、ショ糖とエピクロルヒドリンとの共重合により作ら
れる合成高分子である。該分子は水性媒体に溶解性を与
える高含有量の水酸基を持つ側鎖構造を有している。こ
れらの試薬は赤血球を凝集させ、したがって赤血球から
白血球を単離する方法を提供する。しかしながら、これ
らの血球凝集条件のもとでは、胎児の赤血球は、物理的
に凝集した母親の赤血球のかたまりの中に閉じ込められ
て、そのかたまりの平均密度が沈降特性を決定するの
で、したがって、母親の赤血球とともに沈降するだろ
う。
パ−コール密度勾配は、レニー他「Clinica Chemica
Acta」98:p.119〜125（1979年）及びビンセント及びナ
ビ（Nadeaw）「分析生化学（Anal.Biochem.）」141:p.3
22〜328（1984年）に記載されている。レニーの研究で
は、等張パ−コール密度勾配は、赤血球を加令−分画
（age−fractionate）するのに用いられた。等張勾配条
件では白血球は赤血球と共に分画するので、遠心分離の
前に白血球を除去した。したがってレニーの方法を用い
るための白血球の除去は追加の時間のかかる段階を必要
とした。
Acta」98:p.119〜125（1979年）及びビンセント及びナ
ビ（Nadeaw）「分析生化学（Anal.Biochem.）」141:p.3
22〜328（1984年）に記載されている。レニーの研究で
は、等張パ−コール密度勾配は、赤血球を加令−分画
（age−fractionate）するのに用いられた。等張勾配条
件では白血球は赤血球と共に分画するので、遠心分離の
前に白血球を除去した。したがってレニーの方法を用い
るための白血球の除去は追加の時間のかかる段階を必要
とした。
胎児の細胞を特徴づける最初の試みは、母親の細胞が
Ｙ染色体を含まない、したがって、Ｙ−特異的DNAを含
有する細胞は胎児起源であるという事実を利用した。し
かしながら、この技術は胎児が女である場合は利用でき
ず、したがって実用性が限られる。
Ｙ染色体を含まない、したがって、Ｙ−特異的DNAを含
有する細胞は胎児起源であるという事実を利用した。し
かしながら、この技術は胎児が女である場合は利用でき
ず、したがって実用性が限られる。
胎児のRBCと母親のRBCとは、含有されたヘモグロビン
の化学的構造、カルボニックアンヒドラーゼのような種
々の酵素の存在及び活性並びにそれらの表面抗原を含
む、種々の点で異っている。胎児の血球及び母親の血球
の一般的な大きさ及びヘモグロビンの含有量も異なって
いる。したがって、RBCが年をとり、水を失いそして、
濃密になった時、母親の血球の中で最も若いもの及び胎
児の血球の中で最も若いもの、すなわち、有核の胎児の
RBCは、非常に異った密度を持つかもしれない、Saunder
s A.M「臨床化学（Clinical Chemistry）」157:p.1531
（1991年）。
の化学的構造、カルボニックアンヒドラーゼのような種
々の酵素の存在及び活性並びにそれらの表面抗原を含
む、種々の点で異っている。胎児の血球及び母親の血球
の一般的な大きさ及びヘモグロビンの含有量も異なって
いる。したがって、RBCが年をとり、水を失いそして、
濃密になった時、母親の血球の中で最も若いもの及び胎
児の血球の中で最も若いもの、すなわち、有核の胎児の
RBCは、非常に異った密度を持つかもしれない、Saunder
s A.M「臨床化学（Clinical Chemistry）」157:p.1531
（1991年）。
母親の血液から胎児の赤血球を分離する試みは米国特
許第4,416,778号に記載されている。これらの技術は扱
いにくく、時間のかかり、高価で、そして、大規模スク
リーニングまたは臨床試験の応用に適合させるのは難か
しい。
許第4,416,778号に記載されている。これらの技術は扱
いにくく、時間のかかり、高価で、そして、大規模スク
リーニングまたは臨床試験の応用に適合させるのは難か
しい。
より最近の技術は母親の細胞と胎児の細胞の生化学的
な差、たとえば細胞表面抗原に集中した。ビアンチ（Bi
anchi）他（PCT国際公開WO91/07660は、胎児の血球の血
球の表面に存在する抗原に結合する抗体の使用により、
末梢血液試料から、胎児の有核の赤血球を濃厚にする方
法を記載している。抗体を適当に標識化することによ
り、胎児の血球／抗体複合体を、フローサイトメトリ
ー、たとえば、蛍光−活性化細胞選別（FACS）を用いる
か、または磁気活性細胞分離（MACS）を用いることによ
って、母親の血球から選別し得る。
な差、たとえば細胞表面抗原に集中した。ビアンチ（Bi
anchi）他（PCT国際公開WO91/07660は、胎児の血球の血
球の表面に存在する抗原に結合する抗体の使用により、
末梢血液試料から、胎児の有核の赤血球を濃厚にする方
法を記載している。抗体を適当に標識化することによ
り、胎児の血球／抗体複合体を、フローサイトメトリ
ー、たとえば、蛍光−活性化細胞選別（FACS）を用いる
か、または磁気活性細胞分離（MACS）を用いることによ
って、母親の血球から選別し得る。
同様にガンシャート−アーラート（Ganshert−Ahler
t）他「米国産科婦人科雑誌（Am.J.Obstet.Gyneco
l.）」p.1350〜1355（1992年）及びPCT公報WO9323754号
は、母親の全血に三部分からなる密度勾配を用いて胎児
の有核の赤血球を濃厚化し、続いて胎児の有核の赤血球
を濃厚化するのにトランスフェリン受容体を使用すると
いう複雑な方法を記載している。次いで標識した細胞の
同定にフローサイトメトリーまたは磁気分離工程を必要
とする。ガンシャート−アーラートの参考文献に言及し
たように、トランスフェリン受容体はいまだに循環して
いる母親の細胞集団中の胎児の細胞の信頼できる同定を
提供しない。さらに、この濃厚化の実施要綱は高価な試
薬と長い実験室の手順を要し、したがって、多くの商業
的または大規模スクリーニング及び診断の応用には受け
入れられない。
t）他「米国産科婦人科雑誌（Am.J.Obstet.Gyneco
l.）」p.1350〜1355（1992年）及びPCT公報WO9323754号
は、母親の全血に三部分からなる密度勾配を用いて胎児
の有核の赤血球を濃厚化し、続いて胎児の有核の赤血球
を濃厚化するのにトランスフェリン受容体を使用すると
いう複雑な方法を記載している。次いで標識した細胞の
同定にフローサイトメトリーまたは磁気分離工程を必要
とする。ガンシャート−アーラートの参考文献に言及し
たように、トランスフェリン受容体はいまだに循環して
いる母親の細胞集団中の胎児の細胞の信頼できる同定を
提供しない。さらに、この濃厚化の実施要綱は高価な試
薬と長い実験室の手順を要し、したがって、多くの商業
的または大規模スクリーニング及び診断の応用には受け
入れられない。
本発明は、細胞試料の遠心分離で用いるための及び特
に血球の集団から希薄な細胞の濃厚化に用いるための、
そして、さらに特に母親の血球集団から胎児の有核の赤
血球を濃厚化するために有用な経済的な密度勾配媒体を
提供する。
に血球の集団から希薄な細胞の濃厚化に用いるための、
そして、さらに特に母親の血球集団から胎児の有核の赤
血球を濃厚化するために有用な経済的な密度勾配媒体を
提供する。
本発明の一態様では、引用により組み入れられる継続
中の出願番号08/190,327号（代理人番号16249−１）に
記載されているように母親の末梢の血液試料から胎児の
有核の赤血球を単離及び濃厚化するのに用い得る。第１
の遠心分離段階は、低密度赤血球部分及びすべての白血
球を、より濃い赤血球並びに血清または血清タンパク質
から分離する初期の濃厚化を提供する。好ましくは、本
発明の第１の遠心分離管は、管を通過する血球の動きを
容易にするために、軟いプラスチック製である。適当な
管は米国特許第5,422,018号に記載されている。プラス
チックの砂時計型の管は、過度の変形または狭い中央の
導管（channel）の部分での管の破壊を防ぐために、好
ましくは遠心分離機の内に支持されている。支持は任意
の適当な手段により提供され得る。たとえば、固体の取
りはずし可能な注型物が管の囲りを取り巻く。本発明の
好ましい態様では、米国特許第5422018号に記載されて
いるように、管は大きな容器、たとえば試験管の内の液
体支持媒体中に支持されている。液体のレベルは少くと
も管の狭い部分を覆うのに十分な高さである。好ましく
は、この液体支持媒体の試料によって置換された容積の
重量は、試料管及びその内容物の容積の重量とほぼ等し
い。本発明で用いるための好ましい液体支持媒体は水で
ある。
中の出願番号08/190,327号（代理人番号16249−１）に
記載されているように母親の末梢の血液試料から胎児の
有核の赤血球を単離及び濃厚化するのに用い得る。第１
の遠心分離段階は、低密度赤血球部分及びすべての白血
球を、より濃い赤血球並びに血清または血清タンパク質
から分離する初期の濃厚化を提供する。好ましくは、本
発明の第１の遠心分離管は、管を通過する血球の動きを
容易にするために、軟いプラスチック製である。適当な
管は米国特許第5,422,018号に記載されている。プラス
チックの砂時計型の管は、過度の変形または狭い中央の
導管（channel）の部分での管の破壊を防ぐために、好
ましくは遠心分離機の内に支持されている。支持は任意
の適当な手段により提供され得る。たとえば、固体の取
りはずし可能な注型物が管の囲りを取り巻く。本発明の
好ましい態様では、米国特許第5422018号に記載されて
いるように、管は大きな容器、たとえば試験管の内の液
体支持媒体中に支持されている。液体のレベルは少くと
も管の狭い部分を覆うのに十分な高さである。好ましく
は、この液体支持媒体の試料によって置換された容積の
重量は、試料管及びその内容物の容積の重量とほぼ等し
い。本発明で用いるための好ましい液体支持媒体は水で
ある。
本発明の好ましい遠心分離管を図１に示す。図１の管
（２）は砂時計形で、狭くなった中央の導管（４）と共
にそれより大きい上部（６）室及び下部（８）室を含ん
でいる。管は、外側容器（10）に収容されており、該容
器は液体支持媒体（12）、たとえば水を砂時計型の管の
狭い部分を浸すのに十分なレベルで、好ましくは、遠心
分離の間の試料のレベルと等しいレベルで含有してい
る。管は与えられた容積の血液サンプル（13）のための
ように、目盛をあらかじめ決めることができ、決められ
た遠心分離機の回転速度及び時間で、管の狭い導管の中
に所望の部分を単離するとそれが帯を広くし、したがっ
て所望の赤血球部分の収集を容易にする。
（２）は砂時計形で、狭くなった中央の導管（４）と共
にそれより大きい上部（６）室及び下部（８）室を含ん
でいる。管は、外側容器（10）に収容されており、該容
器は液体支持媒体（12）、たとえば水を砂時計型の管の
狭い部分を浸すのに十分なレベルで、好ましくは、遠心
分離の間の試料のレベルと等しいレベルで含有してい
る。管は与えられた容積の血液サンプル（13）のための
ように、目盛をあらかじめ決めることができ、決められ
た遠心分離機の回転速度及び時間で、管の狭い導管の中
に所望の部分を単離するとそれが帯を広くし、したがっ
て所望の赤血球部分の収集を容易にする。
第１遠心分離段階の遠心分離媒体は好ましくは、胎児
及び母親の赤血球の相対的密度を増加させ、血球同士の
相対的な動きを増加させるのに十分な量であるが、細胞
の溶解を引き起こすには十分でない量の水の添加により
少し低張にする。好ましくは、水を全血液の容積の20〜
30％の間の量で加える。さらに好ましくは、水を全血液
の容積の25％にほぼ等しい量で加える。いくつかの応用
では、抗凝集剤を存在させるか、第１の遠心分離に先き
立って加えてもよい。いくつかの応用で、遠心分離に先
き立ってのさらなる添加は、血漿の密度を1.025〜1.035
g m/mlに上げるために計算された小量の高密度水溶性
媒体である。本発明の一態様では、付加的な細胞の変形
と細胞同士の相対的な動きの増加を提供するために、赤
血球の変形を可能とさせる化合物を第１の遠心分離管中
の血液試料に加える。適当な赤血球変形化合物は当業者
に公知である。好ましい赤血球変形化合物は、ハートマ
ン（Hartman）とグレーサー（Glaser）の「生物科学報
告（Bioscience Reports）」11:4 p.213〜221（1991
年）に記載されている。クロルプロマジン（２−クロロ
−N,N−ジメチル−10H−フェノチアジン−10−プロパナ
ミン）である。
及び母親の赤血球の相対的密度を増加させ、血球同士の
相対的な動きを増加させるのに十分な量であるが、細胞
の溶解を引き起こすには十分でない量の水の添加により
少し低張にする。好ましくは、水を全血液の容積の20〜
30％の間の量で加える。さらに好ましくは、水を全血液
の容積の25％にほぼ等しい量で加える。いくつかの応用
では、抗凝集剤を存在させるか、第１の遠心分離に先き
立って加えてもよい。いくつかの応用で、遠心分離に先
き立ってのさらなる添加は、血漿の密度を1.025〜1.035
g m/mlに上げるために計算された小量の高密度水溶性
媒体である。本発明の一態様では、付加的な細胞の変形
と細胞同士の相対的な動きの増加を提供するために、赤
血球の変形を可能とさせる化合物を第１の遠心分離管中
の血液試料に加える。適当な赤血球変形化合物は当業者
に公知である。好ましい赤血球変形化合物は、ハートマ
ン（Hartman）とグレーサー（Glaser）の「生物科学報
告（Bioscience Reports）」11:4 p.213〜221（1991
年）に記載されている。クロルプロマジン（２−クロロ
−N,N−ジメチル−10H−フェノチアジン−10−プロパナ
ミン）である。
本発明の第１遠心分離段階は一連の回転速度の増加を
含む。速度は遠心分離段階の間に手動で調節するか、ま
たは適当な自動遠心分離機に前もってプログラムするこ
とができる。
含む。速度は遠心分離段階の間に手動で調節するか、ま
たは適当な自動遠心分離機に前もってプログラムするこ
とができる。
第１の遠心分離は、単一の高速回転よりもむしろ、多
数の増加する速度で処理するのが好ましい。この漸進的
な取り組み方は、単一の高速容積分離段階で達成される
密度よりも細かい分離を提供する。
数の増加する速度で処理するのが好ましい。この漸進的
な取り組み方は、単一の高速容積分離段階で達成される
密度よりも細かい分離を提供する。
第１の遠心分離段階では、全血液部分は最初は低速で
回転して、血漿から血球を取り出し、したがって血球分
離への最初の助力をもたらす。次いで管を１またはそれ
よりも多い中間の速度で血球の相互に関連する動きを可
能とさせ、血球の相互に関連する平衡密度を達成する。
最高の速度で、血球もその平衡密度の位置に充填され
て、血球の積み重ねをつくり、遠心分離後赤血球層の回
収を容易とする。
回転して、血漿から血球を取り出し、したがって血球分
離への最初の助力をもたらす。次いで管を１またはそれ
よりも多い中間の速度で血球の相互に関連する動きを可
能とさせ、血球の相互に関連する平衡密度を達成する。
最高の速度で、血球もその平衡密度の位置に充填され
て、血球の積み重ねをつくり、遠心分離後赤血球層の回
収を容易とする。
本発明の好ましい態様では、最初の回転は200gより少
く、５分間行ない、2500〜3000gの範囲で15分間の回
転、14,000gの高速回転で５分間と続く。当業者は、遠
心分離の速度及び持続の最高の活用は血液試料の容積、
型、形及び遠心分離管の巾に対する高さの比、媒体及び
密度修飾血漿の低張並びに血球変形化合物の存在もしく
は不存在を含む因子に依存することを認識するだろう。
これらの状態の最高の活用は熟練者の範囲内である。
く、５分間行ない、2500〜3000gの範囲で15分間の回
転、14,000gの高速回転で５分間と続く。当業者は、遠
心分離の速度及び持続の最高の活用は血液試料の容積、
型、形及び遠心分離管の巾に対する高さの比、媒体及び
密度修飾血漿の低張並びに血球変形化合物の存在もしく
は不存在を含む因子に依存することを認識するだろう。
これらの状態の最高の活用は熟練者の範囲内である。
第１遠心分離段階後、赤血球を含有する部分が得られ
る。この部分は白血球も含む。管の頂部は血漿部分を含
んでいる。血漿よりは濃いが他の赤血球よりは濃くな
い、有核の赤血球は、血漿のすぐ下に見い出される赤血
球の積み重ねの頂部に分画されそして、白血球と可変的
に混ざり合うであろう。前もって目盛りを決めた第１の
遠心分離管の使用は第１の管の狭い部分から関連する部
分の容易に抜き取り可能とし、したがって、第１の遠心
分離段階からの血清及び血漿を含む、他の血液部分の包
含を最小とする。
る。この部分は白血球も含む。管の頂部は血漿部分を含
んでいる。血漿よりは濃いが他の赤血球よりは濃くな
い、有核の赤血球は、血漿のすぐ下に見い出される赤血
球の積み重ねの頂部に分画されそして、白血球と可変的
に混ざり合うであろう。前もって目盛りを決めた第１の
遠心分離管の使用は第１の管の狭い部分から関連する部
分の容易に抜き取り可能とし、したがって、第１の遠心
分離段階からの血清及び血漿を含む、他の血液部分の包
含を最小とする。
赤血球及び白血球を含有する部分は、溶血させて母親
の赤血球を差別的に破裂させることができる。母親の赤
血球の差別的な溶血は、残存する母親の赤血球のかなり
の量の破壊を可能とするのに対し、大多数の胎児−起源
の血球は保存される（Boyer S.H.他「血液（Blood）」4
7（６）p.883〜897（1976年）。差別的な溶血は、任意
の反応容器で生じ得る。好ましい態様では、母親の赤血
球の差別的な溶血は、第２の遠心分離容器の上部で起こ
り、溶血反応は、反応生成物、すなわち保存された赤血
球を密度勾配媒体中に遠心分離することによって停止さ
れ、したがって、赤血球を溶血試薬から除去することが
できる。
の赤血球を差別的に破裂させることができる。母親の赤
血球の差別的な溶血は、残存する母親の赤血球のかなり
の量の破壊を可能とするのに対し、大多数の胎児−起源
の血球は保存される（Boyer S.H.他「血液（Blood）」4
7（６）p.883〜897（1976年）。差別的な溶血は、任意
の反応容器で生じ得る。好ましい態様では、母親の赤血
球の差別的な溶血は、第２の遠心分離容器の上部で起こ
り、溶血反応は、反応生成物、すなわち保存された赤血
球を密度勾配媒体中に遠心分離することによって停止さ
れ、したがって、赤血球を溶血試薬から除去することが
できる。
本発明による差別的な溶血は、赤血球はNH4−及びHCO
3−イオンを含有する溶液中で破壊されるという事実を
利用する。血球の破裂は、カルボニックアンヒドラーゼ
酵素の阻害剤により減速し得る。カルボニックアンヒド
ラーゼの程度は胎児の赤血球中よりも成人の赤血球中で
少くとも５倍高い。したがって、NH4−HCO3仲介の溶血
速度は、特にカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤の存在
下２は、成人の赤血球よりも、胎児の有核の赤血球を含
む、胎児の赤血球では遅い。本発明において用いる好ま
しいカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤は、アセタゾー
ルアミド、エトキシゾールアミド（６−エトキシゾール
アミド、Sigma Chemical Co.）及びメトキシゾールアミ
ド（methoxzolamide）である。
3−イオンを含有する溶液中で破壊されるという事実を
利用する。血球の破裂は、カルボニックアンヒドラーゼ
酵素の阻害剤により減速し得る。カルボニックアンヒド
ラーゼの程度は胎児の赤血球中よりも成人の赤血球中で
少くとも５倍高い。したがって、NH4−HCO3仲介の溶血
速度は、特にカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤の存在
下２は、成人の赤血球よりも、胎児の有核の赤血球を含
む、胎児の赤血球では遅い。本発明において用いる好ま
しいカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤は、アセタゾー
ルアミド、エトキシゾールアミド（６−エトキシゾール
アミド、Sigma Chemical Co.）及びメトキシゾールアミ
ド（methoxzolamide）である。
差別的な溶血は、白血球とともに、胎児の赤血球につ
いて濃厚な赤血球の集団をもたらす。本発明によると、
溶血後の胎児の血球の濃厚化の程度は少くとも1000倍で
ある。濃厚化された胎児の赤血球部分を、胎児の有核の
赤血球の濃厚化された部分を収集し、溶血反応に起因す
る赤血球断片及び大部分の白血球を除去するために、次
いで密度勾配媒体を通して遠心分離する。本発明によ
り、20mlの末梢の血液の最初の試料中に存在する胎児の
有核の赤血球を20μｌに減少でき、したがって、顕微鏡
のスライド上でのまたはポリメラーゼ連鎖反応による同
定及び分析を容易とする。
いて濃厚な赤血球の集団をもたらす。本発明によると、
溶血後の胎児の血球の濃厚化の程度は少くとも1000倍で
ある。濃厚化された胎児の赤血球部分を、胎児の有核の
赤血球の濃厚化された部分を収集し、溶血反応に起因す
る赤血球断片及び大部分の白血球を除去するために、次
いで密度勾配媒体を通して遠心分離する。本発明によ
り、20mlの末梢の血液の最初の試料中に存在する胎児の
有核の赤血球を20μｌに減少でき、したがって、顕微鏡
のスライド上でのまたはポリメラーゼ連鎖反応による同
定及び分析を容易とする。
本発明の第２の遠心分離段階は密度勾配媒体を利用す
る。溶血後、有核の赤血球はPCT出願WO9323754号に記載
されているように、白血球部分の成分である顆粒球とほ
ぼ同じ密度で密度勾配中で平衡すると予想される。しか
しながら、本発明においては勾配媒体の低張及び密度
が、試料の白血球成分から胎児の有核の赤血球の分離及
び濃厚化を可能にする。
る。溶血後、有核の赤血球はPCT出願WO9323754号に記載
されているように、白血球部分の成分である顆粒球とほ
ぼ同じ密度で密度勾配中で平衡すると予想される。しか
しながら、本発明においては勾配媒体の低張及び密度
が、試料の白血球成分から胎児の有核の赤血球の分離及
び濃厚化を可能にする。
本発明で用いる密度勾配媒体は溶融し得るゲル中に分
散したコロイドを含む。コロイドは勾配媒体に必要な密
度を与える。したがって、コロイドの濃度を変更するこ
とによって、媒体の密度は相応して変更し得る。コロイ
ドの微粒子の性質がゲル状態の間には、一層から他層へ
の拡散なしに密度の異なった層の固定を可能とする。さ
らに、コロイドは、血球を実質的に集合していない状態
に保持することができる。本明細書において、実質的に
集合していないは、血球はその密度及び張度にしたがっ
て相互に関連して動くことができ、それらの密度にした
がって密度勾配媒体を通って、とらえられた血球が自由
に移動できないような仕方で血球をとらえる塊を生成し
ないことを意味する、本発明で用いる媒体に密度を与え
る好ましいコロイドはポリビニルピロリドンを被覆した
シリカであり、たとえば、ファルマシア（Pharmacia）
により製造され、シグマ化学会社（Sigma Chemical C
o.）から入手できるパ−コール（Percoll:商標）であ
る。
散したコロイドを含む。コロイドは勾配媒体に必要な密
度を与える。したがって、コロイドの濃度を変更するこ
とによって、媒体の密度は相応して変更し得る。コロイ
ドの微粒子の性質がゲル状態の間には、一層から他層へ
の拡散なしに密度の異なった層の固定を可能とする。さ
らに、コロイドは、血球を実質的に集合していない状態
に保持することができる。本明細書において、実質的に
集合していないは、血球はその密度及び張度にしたがっ
て相互に関連して動くことができ、それらの密度にした
がって密度勾配媒体を通って、とらえられた血球が自由
に移動できないような仕方で血球をとらえる塊を生成し
ないことを意味する、本発明で用いる媒体に密度を与え
る好ましいコロイドはポリビニルピロリドンを被覆した
シリカであり、たとえば、ファルマシア（Pharmacia）
により製造され、シグマ化学会社（Sigma Chemical C
o.）から入手できるパ−コール（Percoll:商標）であ
る。
本発明による胎児の有核の赤血球の濃厚化に用いられ
る密度勾配媒体は高張である。高張状態下では、赤血球
は縮み、したがって、もっと濃厚になる。これらの条件
下で、白血球は一定の密度を維持する。したがって、高
張媒体中の赤血球の選択的な縮みにより、これらの血球
の密度は増加し、それらは白血球とは異なった密度で勾
配中で平衡化する。
る密度勾配媒体は高張である。高張状態下では、赤血球
は縮み、したがって、もっと濃厚になる。これらの条件
下で、白血球は一定の密度を維持する。したがって、高
張媒体中の赤血球の選択的な縮みにより、これらの血球
の密度は増加し、それらは白血球とは異なった密度で勾
配中で平衡化する。
媒体は遠心分離混合物への塩の添加により高張にする
ことができる。本発明で用いるのに適当な塩は塩化ナト
リウム、塩化カリウムもしくは塩化リチウムまたはそれ
らの任意の混合物である。商業的に入手できる平衡塩溶
液、たとえばダルベッコのリン酸塩緩衝塩類塩（PB
S）、ハンクの緩衝塩溶液、アール（Earl）の緩衝塩溶
液及び同種のものも用い得る。
ことができる。本発明で用いるのに適当な塩は塩化ナト
リウム、塩化カリウムもしくは塩化リチウムまたはそれ
らの任意の混合物である。商業的に入手できる平衡塩溶
液、たとえばダルベッコのリン酸塩緩衝塩類塩（PB
S）、ハンクの緩衝塩溶液、アール（Earl）の緩衝塩溶
液及び同種のものも用い得る。
本発明で用いるゲルは溶融し得るゲルである。本明細
書では、「溶融し得る」はゲル状態からゾル状態の間を
遷移することができる任意のゲルを含む。本明細書で
は、「溶融」は、ゲル状態からゾル状態への遷移をい
い、それは、熱、光、電流、磁性または物理的破裂、化
学物質及びその同種のものの適用を含む任意の適当な手
段によって達成することができる。本発明の好ましい態
様では、溶融し得るゲルは、ゲル状態からゾル状態に熱
の適用によって変換する。この態様では、ゲルは好まし
くは室温でゲル状態であるが、ゲルといっしょの任意の
細胞成分の完全な状態を維持するのに十分な低温でゾル
状態に変換できるものである。
書では、「溶融し得る」はゲル状態からゾル状態の間を
遷移することができる任意のゲルを含む。本明細書で
は、「溶融」は、ゲル状態からゾル状態への遷移をい
い、それは、熱、光、電流、磁性または物理的破裂、化
学物質及びその同種のものの適用を含む任意の適当な手
段によって達成することができる。本発明の好ましい態
様では、溶融し得るゲルは、ゲル状態からゾル状態に熱
の適用によって変換する。この態様では、ゲルは好まし
くは室温でゲル状態であるが、ゲルといっしょの任意の
細胞成分の完全な状態を維持するのに十分な低温でゾル
状態に変換できるものである。
最も好ましい態様では、溶融し得るゲルを含む密度勾
配媒体は室温ではゲル状態であり、37℃でゲル状態から
ゾル状態に変換することができ、その後、本発明の方法
を実施するのに十分な持続期間、ゾル状態を維持する。
配媒体は室温ではゲル状態であり、37℃でゲル状態から
ゾル状態に変換することができ、その後、本発明の方法
を実施するのに十分な持続期間、ゾル状態を維持する。
本発明の他の態様では、溶融し得るゲルは化学物質の
適用によりゲル状態からゾル状態に変換し得る。たとえ
ば、カラギーニン（Sigma Chemical Company,St.Louis
Mo）またはアルギン酸（Kelco,San Diego,CA）は多価カ
チオンで架橋したゲルを生成する。EDTAのようなキレー
ト化剤の適用はゲルの架橋を破壊し、ゲルをゾル状態に
溶融する。化学的キレート化剤は当業者に既知であり、
たとえばメルクインデックス11版に記載されている。
適用によりゲル状態からゾル状態に変換し得る。たとえ
ば、カラギーニン（Sigma Chemical Company,St.Louis
Mo）またはアルギン酸（Kelco,San Diego,CA）は多価カ
チオンで架橋したゲルを生成する。EDTAのようなキレー
ト化剤の適用はゲルの架橋を破壊し、ゲルをゾル状態に
溶融する。化学的キレート化剤は当業者に既知であり、
たとえばメルクインデックス11版に記載されている。
本発明において用いる溶融し得るゲルの非−限定例
は、寒天、アガロース、低融点アガロース、アルギン
酸、カラギーナン、ペクチンまたはゼラチンである。本
発明で用いる好ましいゲルはゼラチンである。当業者
は、これらのゲルの組み合せも用い得ることがわかるで
あろう。好ましくは、ゾル型の時、ゲルは分離された部
分を収集のためにみることができるように、適度に透明
である。
は、寒天、アガロース、低融点アガロース、アルギン
酸、カラギーナン、ペクチンまたはゼラチンである。本
発明で用いる好ましいゲルはゼラチンである。当業者
は、これらのゲルの組み合せも用い得ることがわかるで
あろう。好ましくは、ゾル型の時、ゲルは分離された部
分を収集のためにみることができるように、適度に透明
である。
コロイド／ゲル密度勾配媒体の調製方法は、勾配が貯
蔵される時間、分離される血球の性質及びゲルが溶融す
る温度に依存して変化し得る。たとえば、比較的に高融
点を有するゲルは、一般的に低融点のゲルよりも低い濃
度で調製される。
蔵される時間、分離される血球の性質及びゲルが溶融す
る温度に依存して変化し得る。たとえば、比較的に高融
点を有するゲルは、一般的に低融点のゲルよりも低い濃
度で調製される。
本発明の好ましい態様では、密度勾配媒体は、前もっ
て充填されたユニットとして、第２遠心分離管に供給さ
れる。したがって、密度勾配は長い期間貯蔵することが
でき、それは実験室での調製段階を除く。使用にあた
り、第１遠心分離段階から得られた濃厚化された赤血球
部分を直接に第２遠心分離管の上部に移し、その位置で
溶血反応を行うことができる。次いで該ゲルを溶融し、
溶血反応の反応生成物、すなわち、保存された血球を溶
融されたゲル中に追いやるように遠心分離する。密度勾
配媒体の高張は溶血反応を減速するのに役立つ。
て充填されたユニットとして、第２遠心分離管に供給さ
れる。したがって、密度勾配は長い期間貯蔵することが
でき、それは実験室での調製段階を除く。使用にあた
り、第１遠心分離段階から得られた濃厚化された赤血球
部分を直接に第２遠心分離管の上部に移し、その位置で
溶血反応を行うことができる。次いで該ゲルを溶融し、
溶血反応の反応生成物、すなわち、保存された血球を溶
融されたゲル中に追いやるように遠心分離する。密度勾
配媒体の高張は溶血反応を減速するのに役立つ。
本発明のこの態様では、前もって充填された密度勾配
媒体は下記のいずれか１またはそれよりも多い追加の化
合物といっしょにキット型で供給され得る：すなわち、
溶血試薬、クロルプロマジンのような赤血球変形化合
物、前もって目盛を決めた第１段階遠心分離管及び実験
を制御するための試薬である。
媒体は下記のいずれか１またはそれよりも多い追加の化
合物といっしょにキット型で供給され得る：すなわち、
溶血試薬、クロルプロマジンのような赤血球変形化合
物、前もって目盛を決めた第１段階遠心分離管及び実験
を制御するための試薬である。
本発明の他の態様では、溶血反応は、別の反応容器で
生じ、溶血反応は、上記のように、化学物質の適用によ
り停止し得る。
生じ、溶血反応は、上記のように、化学物質の適用によ
り停止し得る。
密度勾配は任意に防腐剤を含むことができ、それは、
密度勾配に導入するのに適切な任意の形で、たとえば固
体または液体防腐剤であり得る。適切な防腐剤の非−限
定的な例は、アジド、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル
及びｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルである。
密度勾配に導入するのに適切な任意の形で、たとえば固
体または液体防腐剤であり得る。適切な防腐剤の非−限
定的な例は、アジド、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル
及びｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルである。
密度勾配は、その中に遠心分離される血球に作用する
さらなる試薬も任意に含むことができ、たとえば高濃度
のカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤を、溶血を引き起
こす反応を完全に停止させるために含むことができる。
さらなる試薬も任意に含むことができ、たとえば高濃度
のカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤を、溶血を引き起
こす反応を完全に停止させるために含むことができる。
遠心分離された試料の成功した分離及び胎児の有核の
赤血球の濃厚化を示す方法は、当業者に既知であり、有
核の赤血球の実際の収集、調製されたスライドまたは血
球計数器のような固体支持体上で、その場でのハイブリ
ダイズでの蛍光を算定し、各赤血球または各赤血球部分
の密度の代用物を測定することを含む。
赤血球の濃厚化を示す方法は、当業者に既知であり、有
核の赤血球の実際の収集、調製されたスライドまたは血
球計数器のような固体支持体上で、その場でのハイブリ
ダイズでの蛍光を算定し、各赤血球または各赤血球部分
の密度の代用物を測定することを含む。
最初の方法では、濃厚化された血球集団を固体支持体
上に移し、胎児または有核の物質に特異的な染料で着色
する。これらの方法は当業者に既知である。たとえば、
クライハウアーE.（Kleihouer）他「Clinicia Wochensc
hr.」35:P.637（1957年）及びベッケ（Betke）、Ｋ「Bi
bl.Haem.」29:p.1085（1968年）に記載されている、ク
ライハウアー−ベッケ（Betke）成人ヘモグロビン抽出
は、任意の残存母親赤血球からヘモグロビンを抽出し、
したがって、胎児のヘモグロビンを保存するのに用いる
ことができる。次いで、該血球をヘモグロビンについて
検査し得る。あるいは、該血球を当業者に既知の核染料
を用いて核の存在を検査し得る。核染料はクロマチン、
核タンパク質、DNAまたは他の核成分を認識し得る。核
染料の非−限定的例はメチレン−ブルー、ヘマトキシリ
ン、沃化プロピジニウム及びチオニンを含む。
上に移し、胎児または有核の物質に特異的な染料で着色
する。これらの方法は当業者に既知である。たとえば、
クライハウアーE.（Kleihouer）他「Clinicia Wochensc
hr.」35:P.637（1957年）及びベッケ（Betke）、Ｋ「Bi
bl.Haem.」29:p.1085（1968年）に記載されている、ク
ライハウアー−ベッケ（Betke）成人ヘモグロビン抽出
は、任意の残存母親赤血球からヘモグロビンを抽出し、
したがって、胎児のヘモグロビンを保存するのに用いる
ことができる。次いで、該血球をヘモグロビンについて
検査し得る。あるいは、該血球を当業者に既知の核染料
を用いて核の存在を検査し得る。核染料はクロマチン、
核タンパク質、DNAまたは他の核成分を認識し得る。核
染料の非−限定的例はメチレン−ブルー、ヘマトキシリ
ン、沃化プロピジニウム及びチオニンを含む。
後の方法ではサブ試料または全赤血球の部分中の赤血
球の平均血球容積（MCV）はこのような代理物（surroga
te）である。同様に、平均血球ヘモグロビン濃度（MCH
C）は、赤血球の密度を測定するための他の代用物であ
る。両測定は血液の（hemalogs）または日常の自動血液
学器具、たとえばMiles−TechniconのＨ・１（商標）、
Ｈ・２（商標）及びＨ・３（商標）を含む「Ｈ」シリー
ズを利用できる。
球の平均血球容積（MCV）はこのような代理物（surroga
te）である。同様に、平均血球ヘモグロビン濃度（MCH
C）は、赤血球の密度を測定するための他の代用物であ
る。両測定は血液の（hemalogs）または日常の自動血液
学器具、たとえばMiles−TechniconのＨ・１（商標）、
Ｈ・２（商標）及びＨ・３（商標）を含む「Ｈ」シリー
ズを利用できる。
本発明の方法と組成物を用いることにより、胎児の有
核の赤血球の集団は、1000倍またはそれよりも多い因子
で、表１に例示するように出発容積の20mlから濃厚化し
得る。表１では、母親の末梢血液の20ml試料中に見い出
されると予期された胎児の有核の赤血球の出発数は、10
8血球に１及び1011血球に１の間という推測「もれ（lea
k）」値に基づいて計算された。
核の赤血球の集団は、1000倍またはそれよりも多い因子
で、表１に例示するように出発容積の20mlから濃厚化し
得る。表１では、母親の末梢血液の20ml試料中に見い出
されると予期された胎児の有核の赤血球の出発数は、10
8血球に１及び1011血球に１の間という推測「もれ（lea
k）」値に基づいて計算された。
本発明の他の態様では、血球集団から希薄な血球を分
離し得る。希薄な血球の存在または不在の検出は、希薄
な血球が存在している病気の状態の診断または差別的な
診断に用い得る。あるいは、希薄な血球は、診断または
治療に用いる本発明の方法にしたがって単離し得る。
離し得る。希薄な血球の存在または不在の検出は、希薄
な血球が存在している病気の状態の診断または差別的な
診断に用い得る。あるいは、希薄な血球は、診断または
治療に用いる本発明の方法にしたがって単離し得る。
本発明の態様では、該方法は、第１遠心分離容器中の
血液試料を遠心分離して、希薄な血球を含有する部分を
得る段階、希薄な血球部分を第２遠心分離容器の上部に
移す段階、第２遠心分離容器は溶融し得るゲル中に分散
されたコロイドからなる密度勾配媒体を含んでおり、該
コロイドは、希薄な血球を実質的に集合していない状態
に維持することが可能である、ゲルを溶融する段階、そ
して、密度勾配媒体を通して、希薄な血球を遠心分離し
て、希薄な血球に富んだ部分を得る段階を含む。
血液試料を遠心分離して、希薄な血球を含有する部分を
得る段階、希薄な血球部分を第２遠心分離容器の上部に
移す段階、第２遠心分離容器は溶融し得るゲル中に分散
されたコロイドからなる密度勾配媒体を含んでおり、該
コロイドは、希薄な血球を実質的に集合していない状態
に維持することが可能である、ゲルを溶融する段階、そ
して、密度勾配媒体を通して、希薄な血球を遠心分離し
て、希薄な血球に富んだ部分を得る段階を含む。
希薄な血球は、増加もしくは減少した密度または変更
された形のような差別的な密度勾配特性を示すか、示す
ことができるようにされたいかなる血球であってもよ
い。したがって、希薄な血球のこれらの特性は、周囲の
モル浸透圧または細胞の量を変えることにより操作でき
る。
された形のような差別的な密度勾配特性を示すか、示す
ことができるようにされたいかなる血球であってもよ
い。したがって、希薄な血球のこれらの特性は、周囲の
モル浸透圧または細胞の量を変えることにより操作でき
る。
本発明により単離し得る希薄な血球の非−限定例は、
ウイルスまたは他の感染性作因で感染された赤血球、寄
生的なインフェステーション及びトリパノゾーマを含む
赤血球のインフェステーション、がんの血球または異常
な形の血球、たとえば鎌状血球を含む。既知の赤血球イ
ンフェステーションは、イハラムラ（Iharamulla）R.L.
他が「Trans.Royal.Soc.of Tropical Medicine and Hyg
iene」81:p.25〜28（1987年）に記載されているように
マラリア原虫プラスモジウム ビバックス（Plasmodium
vivax）及びプラスモジウム ファルシパルム（Plasmo
dium falciparum）に伴うものを含む。希薄な血球は変
型の血球、たとえばサラセミア、鎌状赤血球性貧血症及
び他の多くの血液学の障害に見い出される血球を含み得
る。希薄な血球は成人の有核赤血球も含み、それはいく
つかの病気の状態、たとえば、骨髄線維症のような骨随
増殖性疾患及び一次性赤血球増加症（バーケズ（Vaque
z′）病）で生じ得る。
ウイルスまたは他の感染性作因で感染された赤血球、寄
生的なインフェステーション及びトリパノゾーマを含む
赤血球のインフェステーション、がんの血球または異常
な形の血球、たとえば鎌状血球を含む。既知の赤血球イ
ンフェステーションは、イハラムラ（Iharamulla）R.L.
他が「Trans.Royal.Soc.of Tropical Medicine and Hyg
iene」81:p.25〜28（1987年）に記載されているように
マラリア原虫プラスモジウム ビバックス（Plasmodium
vivax）及びプラスモジウム ファルシパルム（Plasmo
dium falciparum）に伴うものを含む。希薄な血球は変
型の血球、たとえばサラセミア、鎌状赤血球性貧血症及
び他の多くの血液学の障害に見い出される血球を含み得
る。希薄な血球は成人の有核赤血球も含み、それはいく
つかの病気の状態、たとえば、骨髄線維症のような骨随
増殖性疾患及び一次性赤血球増加症（バーケズ（Vaque
z′）病）で生じ得る。
胎児の有核赤血球を含む、濃厚化された希薄血球は、
熟練者に明らかである種々の方法に用い得る。たとえ
ば、胎児の有核赤血球は、適当なプライマーとのポリメ
ラーゼ連鎖反応において、医療の条件、たとえば特定の
病気の対立遺伝子の存在または不在を検出するのに用い
得る。該血球は、第２のまたは安定な細胞系を創造する
のに用い得る。
熟練者に明らかである種々の方法に用い得る。たとえ
ば、胎児の有核赤血球は、適当なプライマーとのポリメ
ラーゼ連鎖反応において、医療の条件、たとえば特定の
病気の対立遺伝子の存在または不在を検出するのに用い
得る。該血球は、第２のまたは安定な細胞系を創造する
のに用い得る。
本発明をさらに例１〜５を用いて説明するが、それは
例示であって、範囲を制限するつもりではない。
例示であって、範囲を制限するつもりではない。
実験例 例１−第１遠心分離段階のための試料の調製 第１遠心分離管を次のように調製した。狭い（1mm）
柄を有するポリエチレン（PE）移動ピペット、Ｅ＆Ｋ＃
50020（Ｅ＆K Scientific Saratoga,CA）のバルブから
最も離れた端部を口が閉鎖されるまでポリエチレンを熱
溶融することによりシールした。バルブを横に切って巾
の広い口を提供した。
柄を有するポリエチレン（PE）移動ピペット、Ｅ＆Ｋ＃
50020（Ｅ＆K Scientific Saratoga,CA）のバルブから
最も離れた端部を口が閉鎖されるまでポリエチレンを熱
溶融することによりシールした。バルブを横に切って巾
の広い口を提供した。
試料を管に充填するために、試料を柄にいまだに結合
している切られたバルブの残部に入れた。充填された毛
細管PEを9.5mlの水を含有している10mlの試験管中に入
れ、次いでCentra IEC遠心分離機型７に入れた。全集成
体を低ｇ力（138g）で５分間遠心分離した。これは、血
球分離の工程を開始し毛細管中の空気のブロックを除去
した。
している切られたバルブの残部に入れた。充填された毛
細管PEを9.5mlの水を含有している10mlの試験管中に入
れ、次いでCentra IEC遠心分離機型７に入れた。全集成
体を低ｇ力（138g）で５分間遠心分離した。これは、血
球分離の工程を開始し毛細管中の空気のブロックを除去
した。
138gで５分間の最初の遠心分離後、赤血球を低末端に
ゆるく充填した。管をさらに2800Gで15分間、7000Gで15
分間、14,000Gで５分間遠心分離した。毛細管中の赤血
球の積み重ねを次いでメスで各々が赤血球を含有してい
る10の等しい断片に切った。各断片からの血球を血漿に
似せて塩及びタンパク質を含有する媒体（0.9％のNaCl,
6％のウシ血清アルブミン（BSA））に再懸濁した。血球
を胎児の有核赤血球を同定するために顕微鏡スライド試
験のために準備するか、MCV及びMCHCを分析した。
ゆるく充填した。管をさらに2800Gで15分間、7000Gで15
分間、14,000Gで５分間遠心分離した。毛細管中の赤血
球の積み重ねを次いでメスで各々が赤血球を含有してい
る10の等しい断片に切った。各断片からの血球を血漿に
似せて塩及びタンパク質を含有する媒体（0.9％のNaCl,
6％のウシ血清アルブミン（BSA））に再懸濁した。血球
を胎児の有核赤血球を同定するために顕微鏡スライド試
験のために準備するか、MCV及びMCHCを分析した。
例２−コロイド／ゲル密度勾配媒体の調製 10gのKnox（商標）ゼラチンを50mlの脱イオン水上に
置き、浸して、膨潤を可能とした。次いで、ゼラチンの
膨潤した粒子を溶解して溶融するまで55℃に加熱した。
これは20％のゼラチンの貯蔵溶液として用いた。この貯
蔵溶液は直ちに用いるか、または、４℃でゲルとして貯
蔵し、使用の前に溶融することができる。
置き、浸して、膨潤を可能とした。次いで、ゼラチンの
膨潤した粒子を溶解して溶融するまで55℃に加熱した。
これは20％のゼラチンの貯蔵溶液として用いた。この貯
蔵溶液は直ちに用いるか、または、４℃でゲルとして貯
蔵し、使用の前に溶融することができる。
貯蔵塩類溶液は、50mlの脱イオン水中のNaCl（4.96
g）,KCl（0.76g）,LiCl（0.21g）,Na2HPO4（0.67g）及
びKH2PO4（0.25g）から調製した。貯蔵塩類溶液はpH6.
8、密度1.085g/ml及びモル浸透圧4389.2mOmsを有してい
た。
g）,KCl（0.76g）,LiCl（0.21g）,Na2HPO4（0.67g）及
びKH2PO4（0.25g）から調製した。貯蔵塩類溶液はpH6.
8、密度1.085g/ml及びモル浸透圧4389.2mOmsを有してい
た。
パ−コールの変化する密度勾配媒体溶液を式： に従って作った。
式中、Ｄ＝所望の密度 Vo＝添加パ−コールの容積 Ｖ＝作業溶液の最終容積 Do＝パ−コール貯蔵溶液の密度 MS＝添加された貯蔵塩類液の割合 TN/TSから計算した TN＝所望の最終溶液の張度 TS＝貯蔵塩混合物の測定された張度 DS＝貯蔵塩類溶液の密度 CG＝所望のゼラチンの倍数としての貯蔵ゼラチン
の濃度 MG＝添加された貯蔵ゼラチンの割合 1/CGから計算した DG＝貯蔵ゼラチンの密度 及び 式中、Do＝1.129g/ml,DS＝1.047g/ml,TS＝4389mOsm,DG
＝1.052g/ml及びCGは10×最終の２％である。
の濃度 MG＝添加された貯蔵ゼラチンの割合 1/CGから計算した DG＝貯蔵ゼラチンの密度 及び 式中、Do＝1.129g/ml,DS＝1.047g/ml,TS＝4389mOsm,DG
＝1.052g/ml及びCGは10×最終の２％である。
密度1.110,1.095,1.080及び1.065g/ml及び張度300
（等張）、360（少し高張）及び500（強く高張）mOsmを
有する密度勾配媒体（Ｖ＝100ml）を上述の関係式に従
って、次のように調製した。
（等張）、360（少し高張）及び500（強く高張）mOsmを
有する密度勾配媒体（Ｖ＝100ml）を上述の関係式に従
って、次のように調製した。
溶液は室温で約１時間安定で、その後ゲル化し始め
る。
る。
勾配をガラス製の13×100mm試験管（全溶積9.5ml）中
に、1mlの各300mOsm密度勾配溶液の一層を一度に加え、
最も濃いものから始めて、続いて下っていく順で作っ
た。
に、1mlの各300mOsm密度勾配溶液の一層を一度に加え、
最も濃いものから始めて、続いて下っていく順で作っ
た。
各層を加えた後、管を氷水で冷却した。溶液は15〜20
分置き、その時間に次の溶液を加えて非常に鋭い境界面
を生産した。各管をシールし、使用時まで４℃で貯蔵し
た。
分置き、その時間に次の溶液を加えて非常に鋭い境界面
を生産した。各管をシールし、使用時まで４℃で貯蔵し
た。
例３ 全血のみを用い、13試料の平均血球容積及び平均血球
ヘモグロビン濃度を、各試料への25％の容積の水の標準
的な添加の前後に検査した。結果を図２のヒストグラム
に示す。図２において、各「×」は臍帯の血液試料を表
わし、各「○」は懐胎12〜19週の母親の末梢血液試料を
表わし及び「●」は出産（40週）で得られた母親の末梢
血液を表わす、図２の上のパネル（図2A）は等張全血試
料の分布を示すのに対し、下のパネル（図2B）は低張に
作られた試料における分布を示す。
ヘモグロビン濃度を、各試料への25％の容積の水の標準
的な添加の前後に検査した。結果を図２のヒストグラム
に示す。図２において、各「×」は臍帯の血液試料を表
わし、各「○」は懐胎12〜19週の母親の末梢血液試料を
表わし及び「●」は出産（40週）で得られた母親の末梢
血液を表わす、図２の上のパネル（図2A）は等張全血試
料の分布を示すのに対し、下のパネル（図2B）は低張に
作られた試料における分布を示す。
図２から、臍帯の試料の平均血球容積は母親の血液試
料の平均血球容積から、試料を低張に下げる前、後の両
方で良く分離された。付加的に、試料を低張に下げた後
にMCHC測定における母親の血球及び臍帯の血球の間の分
離に著しい改良がある。したがって、MCHCによって観察
すると、血球の密度はMCV中での差と同様に大きい。し
かしながら、非−等張条件では、各血球中のヘモグロビ
ンは変化しないが、より小さい母親の血球よりもより大
きい胎児の血球はもっと膨潤するか、または縮む。した
がって、よりよいコントラストはMCHC中で、臍帯の血液
試料及び母親の試料の間で、媒体が非−等張の時に観察
され、密度勾配中の胎児の有核赤血球の濃厚化及び単離
を容易にする。
料の平均血球容積から、試料を低張に下げる前、後の両
方で良く分離された。付加的に、試料を低張に下げた後
にMCHC測定における母親の血球及び臍帯の血球の間の分
離に著しい改良がある。したがって、MCHCによって観察
すると、血球の密度はMCV中での差と同様に大きい。し
かしながら、非−等張条件では、各血球中のヘモグロビ
ンは変化しないが、より小さい母親の血球よりもより大
きい胎児の血球はもっと膨潤するか、または縮む。した
がって、よりよいコントラストはMCHC中で、臍帯の血液
試料及び母親の試料の間で、媒体が非−等張の時に観察
され、密度勾配中の胎児の有核赤血球の濃厚化及び単離
を容易にする。
例４ 約300mモル浸透圧の塩強度で塩化アンモニウム及び重
炭酸ナトリウムの溶血を起こす混合物を調製した。母親
（ｍ）の血液試料及び臍帯（ｃ）の血液試料を希釈剤と
しての生理的塩類溶液または溶血を起こす混合物のいず
れかに、20μｌのカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤ア
セタゾールアミド（1mMの最終濃度で）、フッ化ナトリ
ウム（最終濃度150μｍで）またはアジド（１％）の存
在または不存在でさらす。溶解混合物中で15倍に希釈し
た血液の最終容積中で完全な血球の数を７分及び17分後
に定量した。結果を表３及び４に示す。
炭酸ナトリウムの溶血を起こす混合物を調製した。母親
（ｍ）の血液試料及び臍帯（ｃ）の血液試料を希釈剤と
しての生理的塩類溶液または溶血を起こす混合物のいず
れかに、20μｌのカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤ア
セタゾールアミド（1mMの最終濃度で）、フッ化ナトリ
ウム（最終濃度150μｍで）またはアジド（１％）の存
在または不存在でさらす。溶解混合物中で15倍に希釈し
た血液の最終容積中で完全な血球の数を７分及び17分後
に定量した。結果を表３及び４に示す。
表３から分かるように、混合物中にアセタゾールアミ
ドが存在するとき、臍帯の血はより耐溶血性であるのに
対し、フッ化物及びアジドは防御効果が少ない。
ドが存在するとき、臍帯の血はより耐溶血性であるのに
対し、フッ化物及びアジドは防御効果が少ない。
試料15及び16から分かるように、溶血は高張媒体（試
料15及び16）中で妨げられる（または血球の算定は維持
される）。これは、カルボニックアンヒドラーゼ仲介溶
血反応によって駆動された、血球外の塩の濃度及び血球
内の塩の濃度の間の均等化に起因する。したがって、血
球内及び血球外の塩の濃度は相互に関連して安定性を維
持し、よって溶血を防ぐ。
料15及び16）中で妨げられる（または血球の算定は維持
される）。これは、カルボニックアンヒドラーゼ仲介溶
血反応によって駆動された、血球外の塩の濃度及び血球
内の塩の濃度の間の均等化に起因する。したがって、血
球内及び血球外の塩の濃度は相互に関連して安定性を維
持し、よって溶血を防ぐ。
表４から分かるように、400mOsmを超える塩濃度は、
成人及び臍帯の血液試料の両方の溶解を防ぐだろう。
成人及び臍帯の血液試料の両方の溶解を防ぐだろう。
例５ 妊娠していない成人個体から採取した血液試料に、臍
帯の血液を25％,12.5％,8.3％及び6.25％の量で追加し
た。胎児の有核赤血球を例１及び例２の方法にしたがっ
て単離した。遠心分離段階の後で得られた最終容積は20
μｌであった。20μｌの容積を3.5μｌのアリコートに
分割した。各アリコートについて、有核赤血球の数を、
試験片のライト（Wright）の染色した顕微鏡スライド上
で標準の一定の通路にわたって定量した。各20μｌ容積
から回収されたNRBCの全体の数を表５に示す。
帯の血液を25％,12.5％,8.3％及び6.25％の量で追加し
た。胎児の有核赤血球を例１及び例２の方法にしたがっ
て単離した。遠心分離段階の後で得られた最終容積は20
μｌであった。20μｌの容積を3.5μｌのアリコートに
分割した。各アリコートについて、有核赤血球の数を、
試験片のライト（Wright）の染色した顕微鏡スライド上
で標準の一定の通路にわたって定量した。各20μｌ容積
から回収されたNRBCの全体の数を表５に示す。
表５のデータは、通常の血液試料に加えた臍帯の％と
試料から回収された有核赤血球の量の間は直線状の関係
を示し、本発明の方法による希薄な血球の成功した濃厚
化及び同定を示している。
試料から回収された有核赤血球の量の間は直線状の関係
を示し、本発明の方法による希薄な血球の成功した濃厚
化及び同定を示している。
本明細書のすべての刊行物、特許及び特許出願は、各
個々の刊行物または特許出願が引用により、特定的に及
び個別に組み入れられることを示したのと同じ程度で、
引用により組み入れられる。
個々の刊行物または特許出願が引用により、特定的に及
び個別に組み入れられることを示したのと同じ程度で、
引用により組み入れられる。
本発明の好ましい態様の前述の記載は、説明と記載の
目的で提示されている。
目的で提示されている。
それらは余すところがないことまたは開示されたその
通りの形に本発明を制限することを意図するものではな
く、上記教示を考慮すると多くの修正または変更が可能
であり、本発明の範囲内であることを意図している。
通りの形に本発明を制限することを意図するものではな
く、上記教示を考慮すると多くの修正または変更が可能
であり、本発明の範囲内であることを意図している。
前述の発明は説明及び例をもって少々詳しく記載した
が、それは理解を明瞭にする目的であって、ある程度の
変更及び修正は添付した請求の範囲内で、実施すること
ができることは明らかであろう。
が、それは理解を明瞭にする目的であって、ある程度の
変更及び修正は添付した請求の範囲内で、実施すること
ができることは明らかであろう。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−84557（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−83654（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−62560（ＪＰ，Ａ) 特公 昭59−11863（ＪＰ，Ｂ２) 特公 平３−5550（ＪＰ，Ｂ２) 特公 平３−63023（ＪＰ，Ｂ２) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48,1/10 B01D 21/26
Claims (3)
- 【請求項１】細胞集団の遠心分離のための媒体であっ
て、該媒体は、溶融し得るゲル中に分散されたコロイド
を含み、該コロイドは該細胞集団を実質的に集合してい
ない状態に維持できるものであって、該媒体は複数の層
を含み、各層が異った密度を有する前記媒体。 - 【請求項２】該溶融し得るゲルが、寒天、アガロース、
低融点アガロース、アルギン酸、カラギーニン、ペクチ
ン及びゼラチンからなる群より選択される、請求項１に
記載の媒体。 - 【請求項３】細胞集団中の細胞の密度分離のための密度
勾配媒体であって、該密度勾配媒体は、溶融し得るゲル
中に分散されたコロイドの複数の層を含んでなり、該コ
ロイドは細胞集団を実質的に集合していない状態に維持
することができるものであって、該層は、頂部と底を有
し、頂部は開口を有している容器内に封入されており、
該層の密度は容器の頂部から容器の底に増加するもので
ある、前記媒体。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/189,509 US5489386A (en) | 1994-01-31 | 1994-01-31 | Density gradient medium for the separation of cells |
| US189,509 | 1994-01-31 | ||
| US08/189,509 | 1994-01-31 | ||
| PCT/US1995/000956 WO1995020429A1 (en) | 1994-01-31 | 1995-01-23 | Density gradient medium for separating cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09508971A JPH09508971A (ja) | 1997-09-09 |
| JP3017291B2 true JP3017291B2 (ja) | 2000-03-06 |
Family
ID=22697630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7520133A Expired - Lifetime JP3017291B2 (ja) | 1994-01-31 | 1995-01-23 | 細胞分離用密度勾配媒体 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5489386A (ja) |
| EP (1) | EP0739229B1 (ja) |
| JP (1) | JP3017291B2 (ja) |
| AT (1) | ATE207777T1 (ja) |
| AU (1) | AU680738B2 (ja) |
| CA (1) | CA2182367C (ja) |
| DE (1) | DE69523566T2 (ja) |
| DK (1) | DK0739229T3 (ja) |
| WO (1) | WO1995020429A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR200492521Y1 (ko) * | 2019-02-11 | 2020-10-30 | 주식회사 이리농수산자재 | 농산물 랩핑용 결속부재 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI940823A0 (fi) * | 1994-02-22 | 1994-02-22 | Orion Yhtymae Oy | Analysatorkyvett foer turbidimetriska och nefelometriska bestaemningar av helblodsprov |
| WO1996027420A1 (en) * | 1995-03-08 | 1996-09-12 | Bioseparations, Inc. | Method for enriching rare cell population |
| US5639669A (en) * | 1995-06-07 | 1997-06-17 | Ledley; Robert | Separation of fetal cells from maternal blood |
| AUPN883396A0 (en) * | 1996-03-21 | 1996-04-18 | Australian Red Cross Society (Western Australian Division) | Centrifugation support |
| US6210889B1 (en) | 1998-01-28 | 2001-04-03 | The Universite Laval | Method for enrichment of fetal cells from maternal blood and use of same in determination of fetal sex and detection of chromosomal abnormalities |
| US6535393B2 (en) * | 1998-12-04 | 2003-03-18 | Micron Technology, Inc. | Electrical device allowing for increased device densities |
| IT1311989B1 (it) * | 1999-03-30 | 2002-03-22 | Giammaria Sitar | Procedimento per isolare cellule fetali presenti nel sangue perifericomaterno. |
| US7135335B2 (en) * | 1999-05-28 | 2006-11-14 | Stemcell Technologies Inc. | Method for separating cells using immunorosettes |
| US7947236B2 (en) | 1999-12-03 | 2011-05-24 | Becton, Dickinson And Company | Device for separating components of a fluid sample |
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