ES2257797T3 - Procedimiento de separacion de plaquetas o de microparticulas de origen plaquetario a partir de una muestra que las contiene. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO DE SEPARACION DE PLAQUETAS O MICROPARTICULAS DE ORIGEN PLAQUETARIO A PARTIR DE UNA MUESTRA QUE LAS CONTIENE Y SE CARACTERIZA EN PARTICULAR PORQUE: A) SE CENTRIFUGA LA MENCIONADA MUESTRA EN UN RECIPIENTE QUE CONTIENE EN SU EXTREMO DISTAL UN GEL COMPACTO; DICHO GEL ES BASICAMENTE IMPERMEABLE A LA FASE LIQUIDA DE LA MUESTRA, PERO PUEDE SER PENETRADO EN LAS CONDICIONES DE CENTRIFUGACION POR LAS PLAQUETAS O LAS MICROPARTICULAS DE ORIGEN PLAQUETARIO; B) SE SEPARA EL SOBRENADANTE DE LA CENTRIFUGACION; Y C) SE RECUPERAN A CONTINUACION LAS PLAQUETAS O LAS MICROPARTICULAS DE ORIGEN PLAQUETARIO INCORPORADAS AL GEL.

Description

Procedimiento de separación de plaquetas o de micropartículas de origen plaquetario a partir de una muestra que las contiene.

La presente invención se refiere a la separación de plaquetas o de micropartículas de origen plaquetario a partir de una muestra biológica que las contiene.

La invención se aplica tanto a las plaquetas como a las micropartículas de origen plaquetario. Por micropartículas de origen plaquetario, se entiende una sub-unidad, o vesiculación de la célula obtenida a partir de cualquier tratamiento, mecánico o de otro tipo o incluso resultando de un estado de activación celular o de un estado fisiopatológico particular, tal como la apoptosis o la lisis celular o plaquetaria por ejemplo.

A continuación en la descripción, el término "células" se utilizará para designar indiferentemente, salvo indicación contraria, los diferentes productos que se desea separar, principalmente las plaquetas y las micropartículas de origen plaquetario.

La presente invención tiene como objetivo específico separar de una muestra las moléculas ligadas a unas células, las mismas moléculas no ligados presentes en la fase líquida, principalmente en forma soluble. Dichas moléculas pueden ser por ejemplo unos marcadores celulares o unos elementos ligados a la superficie de las células, tales como los anticuerpos, o unos ligandos. En determinados casos, puede resultar interesante dosificar a la vez el elemento ligado a unas células y el elemento no ligado presente en la fase líquida, principalmente en forma soluble, o incluso la relación entre los dos.

Cuando se efectúan las dosificaciones de marcadores celulares en las muestras sanguíneas, es necesario separar las células del medio que presentan dichos marcadores, de los propios marcadores presentes en estado soluble y por lo tanto son susceptibles de falsear las dosificaciones posteriores.

El procedimiento más comúnmente utilizado para separar las células consiste en centrifugar la muestra después de un tratamiento eventual previo.

Se obtiene de este modo un precipitado que contiene las células y sobre el que se fijan las moléculas ligadas, las moléculas no ligadas permanecen en el sobrenadante (que se puede eliminar mediante cualquier procedimiento, principalmente por aspiración/decantación).

Sin embargo, en el momento de la centrifugación, el precipitado celular tiende a aprisionar unas moléculas no ligadas, es por lo tanto necesario resuspender el precipitado en varias etapas con el fin de efectuar unos lavados para reducir significativamente la concentración residual de las moléculas no ligadas. De este modo, y de forma característica, es necesario efectuar por lo menos tres lavados a una dilución al 1/10 en cada etapa (100 \mul residuales diluidos hasta 1 ml) para reducir en 3 log (1000) veces la concentración residual de las moléculas no
ligadas.

Dichas centrifugaciones repetidas adolecen, por supuesto, de numerosos inconvenientes de entre los cuales:

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pérdida de células;

-

fragilización de las células;

-

formación de agregados entre las células que son a veces difícilmente reversibles, se trata en particular de las células que tienen tendencia principalmente a adherirse entre ellas y en particular las plaquetas;

-

la longitud del procedimiento y la pesadez de la manipulación. En efecto, tres lavados incluso con una centrifugación corta (5 min) necesitan en total aproximadamente 30 min. de tratamiento;

-

los enlaces son inestables; las enlaces de tipo ligando/receptor, anticuerpo/antígeno, enzima/sustrato son reversibles y la disociación de las moléculas ligadas es más marcada cuanto más se alarga el tiempo de lavado. Los tiempos de lavado largos representan por lo tanto un defecto más marcado del procedimiento cuanto más débil es la afinidad del par del enlace (velocidad de disociación rápida). En dicho caso resulta indispensable:

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acortar el tiempo de lavado;

-

reducir el volumen de la fase líquida residual en contacto con las moléculas ligadas a las células, pero es lo que también reduce la eficacia del lavado.

-

Por último, se indica en el caso de las manipulaciones de materiales infecciosos, la formación de aerosoles que es por supuesto deseable evitar, si es posible.

En el caso particular de las plaquetas, las centrifugaciones repetidas inducen además unos problemas citados anteriormente, una agregación y una activación que son siempre muy perjudiciales para las dosificaciones posteriores y que, en cualquier caso modifican las propiedades biológicas de las plaquetas después de las diferentes etapas de centrifugación.

Es la razón por la, desde hace mucho tiempo se ha intentado aportar unas modificaciones al procedimiento conocido con el fin de resolver algunos de los inconvenientes citados anteriormente.

Se ha propuesto en particular realizar unas centrifugaciones sobre un lecho de suero, que son menos traumáticas para las células pero que de hecho son evidentemente mucho más caras y sobre todo más delicadas de utilizar, lo que hace que dicho procedimiento no se haya utilizado.

Se han previsto asimismo las centrifugaciones a través de una fase oleosa hidrófoba (ver principalmente P. Poncelet and P. Carayon, J. Immunol. Methods (1985), 85, 65-74 y Titus JA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 519). Dicha estrategia, que se utiliza sobre todo para las mediciones de radio-inmunología, presenta un determinado número de ventajas. Resulta extremadamente eficaz para separar las moléculas libres que quedan en la fase acuosa y las moléculas ligadas que son arrastradas en la fase hidrófoba con las células; la separación es rápida, del orden de 2 min. y la concentración residual de moléculas no ligadas, menos del 1%. Además existe poca disociación de las moléculas ligadas en el tiempo después de la separación.

Sin embargo hay que destacar que cuando se desea someter a las células preparadas de este modo a una citometría de flujo, a microscopia o a unos ensayos de actividad biológica o incluso a unas pasadas en cultivo, dicha técnica evidentemente hace que las células, una vez pasadas en el aceite, no se puedan utilizar más. Además, en el caso de las plaquetas, el contacto con un aceite mineral genera una activación/agregación que por supuesto las hace totalmente inadecuadas para cualquier tratamiento posterior.

Asimismo se han previsto unos lavados sobre soportes filtrantes, por ejemplo por depresión. La ventaja es que en dicho caso hay menos manipulación. Se pueden tratar las grandes series y esto es fácilmente adaptable a las "selecciones", los lavados son eficaces y rápidos, lo que es ventajoso, el principal defecto es la no disponibilidad de las células (excluida la recuperación) para unos análisis tales como los citados anteriormente.

Se han descrito en la técnica anterior, unos procedimientos bastante generales que se refieren al lavado de las células por centrifugación. Por ejemplo, el documento EP 0 176 080 y Gadol N. et al (Diagnostic Immunology, 1985 3 (3) 145-154) describen unos procedimientos de lavado de las poblaciones celulares mononucleares gracias a un gel que parece menos traumático para las células. Se han descrito otras técnicas a base de gel hidrófobo en el documento EP 176 080, Poncelet et al., Journal of Immunological Methods, 1985, Vol. 85, Nº 1 páginas 65-74 y Titus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, Vol. 78, Nº 1, páginas 519-523. La patente US nº 3.997.442 describe un procedimiento para separar dos fases de densidades diferentes a partir de un fluido a partir de un material tixotrópico depositado en el fondo del tubo de centrifugación.

Por último, se ha propuesto con anterioridad la secuencia de centrifugación sobre un lecho o gradiente de albúmina + cromatografía sobre un gel de cribado molecular para eliminar las moléculas plasmáticas no ligadas a las plaquetas. Sin embargo, dicha técnica de laboratorio que se ha utilizado para eliminar en algunos casos las proteínas plasmáticas no ligadas a plaquetas y susceptibles de interaccionar con unos ensayos funcionales, es muy larga y compleja de llevar a cabo.

Es la razón por la que la presente invención propone un procedimiento de separación de las plaquetas o de las micropartículas a partir de una muestra que las contiene caracterizada porque:

a) se centrifuga dicha muestra en un recipiente que contiene en su extremo distal un gel compacto, siendo dicho gel sustancialmente impermeable a la fase líquida de la muestra pero que puede ser atravesado en las condiciones de centrifugación por las plaquetas o micropartículas de origen plaquetario a separar;

b) se separa eventualmente el sobrenadante de centrifugación; y

c) se recuperan a continuación las plaquetas o micropartículas de origen plaquetario incorporadas en el gel; estando dicho gel constituido por partículas hidrófilas que en el estado hinchado presentan un diámetro comprendido entre 30 y 500 \mum y preferentemente, comprendido entre 90 y 350 \mum.

Las plaquetas o micropartículas de origen plaquetario incorporadas en el gel se recuperan a continuación por suspensión del gel en un medio adecuado tal como por ejemplo un medio tampón y/o de fuerza iónica particular. Después se separan las plaquetas o micropartículas de origen plaquetario del gel por ejemplo por filtración. Esto permite obtener una suspensión plaquetaria que puede de este modo ser concentrada en relación con la muestra de partida; el procedimiento de la presente invención puede por lo tanto ser también un procedimiento de concentración.

Dicho procedimiento reside en el hecho que cuando se lleva a cabo una centrifugación, la capacidad de penetración de los elementos sólidos contenidos en una solución es directamente proporcional a su masa, de este modo, las partículas más pesadas pueden ser capaces de penetrar en el gel o incluso eventualmente de atravesarlo, mientras que las moléculas solubles así como el medio líquido, no serán en la mayoría de los casos, capaces de penetrar el gel correspondiente.

Por supuesto, el procedimiento según la presente invención deberá ser adaptado a la naturaleza de los productos para cada separación, en particular a las plaquetas, que se desean separar actuando sobre su naturaleza y las propiedades físicas del gel así como sobre las velocidades de centrifugación con el fin de asegurar una separación de fases tal como se desea.

Dicho procedimiento está particularmente adaptado a la separación, a partir de una muestra que las contiene, de las moléculas ligadas a unas células, de las mismas células no ligadas, presentes en la fase líquida, principalmente en forma soluble.

El gel utilizado en el procedimiento según la presente invención es preferentemente un gel hidrófilo constituido por partículas que en el estado hinchado, presentan un diámetro comprendido entre 30 y 500 \mum, y preferentemente comprendido entre 90 y 350 \mum.

Asimismo, cuando se coloca, el gel hinchado presenta unas características tales que la concentración en peso seco de partículas está comprendida entre 0,04 y 0,2 g/ml.

Por supuesto, el gel en cuestión puede estar preparado para su utilización, es decir ya colocado en el fondo del recipiente de centrifugación o bien ser colocado de forma extemporánea, es decir a partir de un gel diluido que será sedimentado por centrifugación.

Dicho gel se seleccionará preferentemente de entre la gamma Sephadex®, principalmente los geles comercializados bajo la denominación G25, G100, G200 o equivalente, utilizados habitualmente para la cromatografía de cribado molecular.

La velocidad de centrifugación será preferentemente tal que la fuerza de centrifugación esté comprendida entre 200 g y 5.000 g.

De este modo, de forma esquemática, el procedimiento comprende:

1) la introducción de una muestra líquida que contiene principalmente las plaquetas o las micropartículas de origen plaquetario en un tubo de centrifugación encima de un sistema gelificado;

2) una centrifugación a una velocidad adecuada;

3) el lavado por eliminación, principalmente aspiración o decantación de la fase líquida;

4) la recuperación de las plaquetas o de las micropartículas de origen plaquetario en el gel o como se verá a continuación eventualmente debajo del gel.

El procedimiento según la presente invención permite por lo tanto obtener dos fases diferentes:

- un sobrenadante encima del gel que contiene el conjunto de las moléculas que han quedado en solución, en algunos casos el exceso de reactivos, pero en otros casos las proteínas celulares solubles que no han quedado fijadas sobre las células y;

- un gel que contiene principalmente las plaquetas así como las moléculas que se han fijado a dichas plaquetas.

Preferentemente, se preferirá utilizar a título de recipiente de centrifugación un tubo cuyo extremo distal presenta un diámetro más pequeño, situándose el gel en dicha parte distal de diámetro más pequeño. Por "parte distal" o "extremo distal" se entiende por supuesto la parte más alejada de la apertura del tubo. El tubo de centrifugación que presenta de este modo un estrechamiento en su parte inferior, permite concentrar las células por una parte y por otra parte que cuando el gel se prepara un tiempo determinado antes de su utilización, se asegura una mejor conservación. Es la razón por la que en general, el diámetro de la zona del gel, es decir el diámetro de la parte inferior del tubo estará preferentemente comprendido entre 2 y 7 mm, y preferentemente inferior a 5 mm. De forma general, la relación de volúmenes de la cámara superior, es decir la muestra o el sobrenadante y la cámara de recolección, es preferentemente superior a 10, permitiendo en dichas condiciones una mejor concentración.

Resulta asimismo posible prever en una forma de realización preferida, que la parte distal del tubo en la que se coloca el gel esté abierta en su extremo, estando dicha apertura obturada por un filtro susceptible de retener el gel. En tal caso, dicho extremo abierto desemboca en un recipiente que debe ser acoplado de forma amovible al tubo de forma que recibe los elementos figurados de la muestra que han atravesado el gel.

Conviene recordar que las células migran en función de su masa y que en principio quedan aprisionadas en el gel. En dicho caso, se pueden recuperar las células contenidas en el gel poniendo el gel de nuevo en suspensión, después se filtra la suspensión con un filtro que retiene las partículas de gel y permite el paso de los elementos figurados. Sin embargo, en el caso en el que se aumenta la fuerza de centrifugación o bien cuando se aumenta la duración de la centrifugación, o por la utilización de un gel adecuado, es posible hacer migrar dichas células a través del gel. En dicho caso, son susceptibles de pasar directamente al recipiente inferior. Por supuesto en el caso en el que se utiliza dicho dispositivo, conviene rellenar el recipiente inferior con un líquido antes de la centrifugación.

El recipiente de la parte inferior puede ser principalmente un tubo atornillado en la parte inferior del tubo de centrifugación propiamente dicho o bien acoplado por cualquier medio adecuado. En dicha forma de realización, es por lo tanto posible prever en el recipiente inferior, el establecimiento de un gradiente correspondiente a dos o más densidades, lo que permitirá al mismo tiempo en el momento la centrifugación, la separación de las diferentes especies celulares en función de su densidad. El procedimiento que permite producir los gradientes de densidad es conocido y no será descrito de nuevo con detalle en la presente memoria. La mayoría de veces, será suficiente con un gradiente a dos densidades que permitirá por ejemplo separar las plaquetas de los otros elementos figurados de la sangre.

De entre las muestras que pueden ser tratadas según el procedimiento según la presente invención, hay que citar más particularmente:

-

un plasma rico en plaquetas;

-

la sangre total, preferentemente tratada previamente con una solución de tipo lisis de los eritrocitos;

-

una suspensión de células en una solución equivalente al tampón de recuperación o diferente; como por ejemplo:

-

una solución de fijación (paraformaldehído, formol, glutaraldehído, etanol);

-

una solución de lisis diferencial (lisis de los eritrocitos);

-

una solución de tratamiento enzimático (fosfolipasa, tripsina, proteasa,...), química (ácido fórmico, cítrico, acético...), soluciones preferidas si las células deben ser imperativamente separadas de la solución después de la parada/neutralización por dilución;

-

una solución que contiene un reactivo inmunológico (anticuerpo, antígeno) o no (ligando), sustrato de una enzima, un elemento de un par de fijación (tal como biotina, X-biotina, avidina,...)

Tal como se ha mencionado anteriormente, resulta particularmente interesante utilizar unas suspensiones en las que las células se han tratado con un reactivo. En efecto, en dicho caso, el reactivo en exceso podrá ser separado por el procedimiento según la presente invención y será posible prever la revelación del reactivo o incluso entonces del marcador de las células cuando esto sea posible por introducción de un elemento revelador en el gel.

De este modo es posible prever la incorporación en el gel de un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado, por ejemplo, fluorescente, con la ayuda de productos tales como DDAF (fragmento F (ab')_{2} de un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado al FITC comercializado por la compañía Eurobio), y después introducir en la parte superior del tubo un medio que contiene unas células así como un anticuerpo monoclonal de ratón reactivo con dichas células. Con el fin de que la reacción sea completa, el anticuerpo monoclonal estará por supuesto en exceso y en dichas condiciones, una parte de los anticuerpos se fijará sobre las células, quedando los otros en la solución. Después del tratamiento con la ayuda del procedimiento según la presente invención, las células marcadas con los anticuerpos monoclonales penetrarán en el gel, y a nivel de dicho gel serán reconocidas por los anticuerpos anti-IgG de ratón fluorescentes y por lo tanto serán reveladas.

Una de las ventajas de dicho procedimiento, es que es posible prever unos tubos pre-tratados que contienen el gel y el anticuerpo anti-IgG de ratón fluorescente, el manipulador no tiene más que llevar a cabo la etapa de fijación de los anticuerpos monoclonales y después la centrifugación, la revelación aparecerá indirectamente a nivel del gel.

Además, la separación de las moléculas no ligadas permite utilizar un reactivo de segunda capa en cantidad muy baja, lo que evidentemente elimina el ruido de fondo a nivel del inmuno-marcaje y por lo tanto mejora la sensibili-
dad.

Se puede asimismo en el mismo enfoque, prever la utilización, por ejemplo de un marcador de superficie celular principalmente cuando se trata de enzimas. Dicha enzima debe presentarse tanto en el estado ligado como en el no ligado. Si el gel contiene el sustrato de dicha enzima con un cromógeno o un fluorógeno después de la centrifugación, se podrá visualizar inmediatamente en el gel la presencia de células portadoras del marcador enzimático.

De entre las enzimas utilizables, hay que citar principalmente las ecto-enzimas celulares y solubles así como las enzimas de la cadena de coagulación presentadas por unos leucocitos, unas plaquetas o unas micropartículas obtenidas de las plaquetas, (por ejemplo los factores Xa, XIa, IXa y la proteína C). Se puede asimismo tratar de enzimas puramente celulares pero en las que un inhibidor o un sustrato que interfiere en el ensayo, está presente en forma soluble en el plasma.

Por último, puede tratarse de enzimas acopladas a un reactivo, por ejemplo un anticuerpo, un ligando, una avidina conjugada con peroxidasa, \beta-galactosidasa, acetilcolinesterasa.

En todas estas operaciones, la centrifugación permite eliminar las especies solubles no ligadas a las células.

Numerosas características y ventajas de la presente invención se pondrán más claramente de manifiesto tras la lectura de los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 Medición de las Ig asociadas a las plaquetas

Las inmunoglobulinas (Ig) están normalmente presentes en el plasma a 10-20 mg/ml. La presencia de dicha cantidad tan elevada obliga, previo inmuno-marcaje con un anticuerpo anti-Ig, al lavado exhaustivo de las plaquetas presentes en el plasma rico en plaquetas (PRP), es decir 2 a 4 lavados, por centrifugación.

Dichas centrifugaciones repetidas implican:

- unas pérdidas importantes que necesitan unas muestras de partida de gran tamaño (hasta 5-10 ml de sangre), incompatibles con unos ensayos en pediatría neonatal;

- las plaquetas no se pueden lavar por centrifugación en presencia de los glóbulos rojos y glóbulos blancos, lo que obliga a trabajar en un PRP (una centrifugación inicial suplementaria);

- unos riesgos importantes de desenganche y pérdida de la totalidad o parte (por lo tanto sesgo de selección) de las Ig anticuerpos anti-plaquetas, conocidas por presentar poca afinidad (auto-anticuerpos);

- una carga de trabajo y de tiempo de ocupación de las centrifugas no despreciables (cada lavado requiere una centrifuga rápida durante 15 min.).

En la técnica de tubo-gel, según la presente invención, la muestra puede ser indiferentemente sangre total o PRP.

Se decanta el sobrenadante por inversión simple (operación repetida 3 veces = 3 lavados). El gel, que contiene las células (plaquetas +/- glóbulos rojos y glóbulos blancos) se pone de nuevo en suspensión en un volumen pequeño de tampón de inmuno-marcaje.

El gel es retenido sobre unas redes de un filtro (rejilla de nylon de apertura de 35 \mum) tal como, por ejemplo la "Cell Strainer" de Falcon/Becton Dickinson y las células recuperadas después de una centrifugación corta (3 min, 800 rpm) en vista del inmuno-marcaje.

Se dispone entonces de una suspensión de plaquetas (+/- glóbulos rojos y glóbulos blancos), desprovista de plasma y en particular de Ig plasmáticas, que conservan sus características morfológicas permitiendo el análisis por citometría de flujo, su fenotipo inmunológico inicial, que no han perdido los anticuerpos asociados a lo largo de las operaciones de lavado, y que no se han activado mediante el procedimiento de separación.

La eficacia del "lavado" realizado mediante la transferencia en el gel se ha ensayado utilizando una Ig trazadora fluorescente, que se dosifica en la muestra de partida y en la suspensión final. Se ha medido el factor de dilución \geq a 1000 entre la centrifugación inicial y la final del trazador. Esto corresponde, para un plasma que contiene 10 mg/ml de Ig a una concentración residual \leq a 10 \mug/ml de Ig en la suspensión de células. Una concentración residual tal necesitaría un mínimo de 2 a 3 lavados de las plaquetas en las condiciones citadas anteriormente.

Ejemplo 2 Fijación de las plaquetas por inmuno-marcaje diferido

Para la medición de las Ig asociadas a las plaquetas como para otros antígenos de superficie plaquetarios, un protocolo de estabilización de las células que permite mantener los antígenos de interés a su nivel de expresión inicial resulta un problema mayor y delicado.

La resolución de dicho problema en las plaquetas permitiría diferenciar el análisis de citometría de flujo (operación que requiere una técnica particular) del tratamiento de la muestra (operación a realizar sobre el sitio en un plazo
corto).

Una fijación, a la vez suave pero eficaz y estandarizada, requiere un tratamiento de la muestra celular con el fijador soluble de una duración limitada, con la sustitución del fijador por un medio de conservación desprovisto de fijador.

El sistema tubo-gel ofrece dicha posibilidad.

La muestra (PRP, 500 \mul) se diluye de este modo en el fijador (PFA, 0,2%, 500 \mul) y la incubación se sigue durante 10 min.

El análisis cuantitativo del fenotipo inmunológico de las plaquetas fijadas de este modo e inmediatamente desprovistas del fijador después de 10 minutos ha demostrado la fiabilidad de dicho protocolo para una conservación de una semana de los principales antígenos plaquetarios indicados en los protocolos de estudios farmacológicos multi-céntricos/multi-nacionales.

El procedimiento según la presente invención se puede asimismo utilizar a una escala más grande con el fin de efectuar una preparación rápida de las plaquetas lavadas, lo que constituye una alternativa al método de Mustard (Methods in Enzymology, 1989, Vol. 169, 3-21.) Por otra parte, se han descrito determinados tratamientos químicos sobre las plaquetas y los leucocitos (por ejemplo un tratamiento con ácido cítrico pH 4) para decapar los antígenos HLA y detectar específicamente los anticuerpos dirigidos contra los antígenos diferentes a HLA. Tales tratamientos requieren evidentemente una neutralización con la eliminación de determinadas moléculas químicas en contacto con las células y es cierto que el procedimiento según la presente invención que es particularmente rápido y simple debería permitir la utilización facilitada de dicho tipo de proceso.

Asimismo, los tratamientos enzimáticos pueden reclamar una separación rápida de los elementos celulares (por ejemplo, tripsina, PIPLC o Proteasa K). Una centrifugación estándar deja las células en contacto durante más de 5 minutos con el sobrenadante que contiene la enzima activa, mientras que gracias al procedimiento según la presente invención, se puede prever limitar la duración del tiempo de contacto.

Asimismo, es posible prever la utilización del procedimiento según la invención en el método QIFI de cuantificación de moléculas celulares por citometría que está basada en los marcajes indirectos (en dos capas de anticuerpos monoclonales 1 + anti Ig Fluorescente). Dicho procedimiento está descrito en Poncelet et al., J. of Inmunol. Methods, 85 (1985), 65-74, cuyo contenido está incorporado en la presente memoria como referencia. Es un principio difícil de aplicar con un contra marcaje (anticuerpo monoclonal 2 portador de otro fluorocromo). El procedimiento de separación que elimina el exceso de reactivo anticuerpo monoclonal 1 y anti Ig permite enfocar un contra marcaje que se puede utilizar de forma simple.

Asimismo es posible descartar rápidamente determinados reactivos no deseados, como por ejemplo unos activadores, unas citoquinas, unos mensajeros, unos productos tóxicos a corto plazo (agua destilada para la lisis de los eritrocitos o el ácido fórmico), unos agentes complejantes tales como el EDTA o el citrato o unos iones que desencadenan unas reacciones tales como el calcio o el magnesio.

Ejemplo 3 Protocolo de separación \bullet Preparación de un plasma rico en plaquetas

La sangre total se centrifuga durante 15 minutos a 170 g. Se extrae la fase superior correspondiente al PRP (Plasma rico en plaquetas).

\bullet Separación plaquetaria

-

se añaden 200 \mul del PRP a 2 ml de tampón en el interior del tubo gel,

-

centrifugación 5 minutos - 1200 g,

-

eliminación de la fase líquida superior por inversión,

-

2 lavados en un tampón adecuado del gel que contiene las plaquetas (adición de 2 ml de tampón en el tubo, encima del gel y eliminación por inversión),

-

suspensión del gel y de las plaquetas mediante una pipeta,

-

transferencia de la suspensión sobre un filtro en un tapón del tubo,

-

centrifugación del tubo cerrado, las partículas del gel son retenidas por el filtro mientras que las plaquetas "caen" al fondo del tubo,

-

eliminación del tapón filtro y recogida del filtrado.

Ejemplo 4 Características del gel \bullet Rendimiento: 51% (ver tabla 1 y figura 1, a continuación)

-

numeración de las plaquetas en el filtrado, numeración a llevar al microlitro,

-

comparación de dicha numeración con la del PRP de partida,

-

establecimiento de una relación numeración filtrado/numeración PRP expresada en porcentaje.

\bullet Respeto de la integridad plaquetaria

Ausencia de activación de las plaquetas a lo largo del proceso de separación (ver Tabla 1). El nivel de activación plaquetaria se objetiviza por la medición de los marcadores de superficie específicos.

Las plaquetas se consideran no activadas cuando la GMP140 es inferior a 500 copias por plaqueta.

Respeto de la reactividad plaquetaria (tabla 1). El mantenimiento de la reactividad plaquetaria se define mediante las modificaciones cuantitativas de determinados marcadores de superficie después de una activación in vitro. Se han seleccionado:

-

la GMP140 que sólo se expresa sobre las plaquetas activadas,

-

la GpII/IIIa cuyo valor aumenta en el momento de la activación,

-

la GpIb cuyo valor decae en el momento de la activación por internalización.

La reactividad de las plaquetas se conserva para el activador TRAP.

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TABLA 1 Características de las plaquetas separadas en tubo gel

	Estado basal	TRAP
GpIIbIIIa	76 355	112 206
GpIb	37 438	17 452
GpIIIa	66 796	98 452
GMP140	370	13 525

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Ejemplo 5 Utilización del tubo de gel en el marco de las trombopenias

El rendimiento es reproducible sea cual sea la numeración plaquetaria. De este modo, el procedimiento de separación está validado para una numeración plaquetaria normal (150 a 400 x 10^{9} plaquetas/litro). Para recuperar un número de plaquetas más importante se puede realizar una extensión del volumen de la toma de ensayo hasta 500 \mul para las muestras trombopénicas (10 x 10^{9} a 150 x 10^{9} plaquetas por litro de sangre), ver tabla 2 siguiente.

TABLA 2

Muestra	Toma para el ensayo	Cantidad de plaquetas	Cantidad de plaquetas	Rendimiento (%)
	de PRP (\mul)	inicial	separadas/lavadas
Normal	200	10^{8}	4x10^{7}	40
(200 x 10^{9} plt/l)
Trombopenia a	200	4x10^{6}	1,6 x 10^{6}	42
10 x 10^{9} plt/l
Trombopenia a	500	10^{7}	4,2 x 10^{6}	42
10 x 10^{9} plt/l

Ejemplo 6 Aplicación específica

Medición de las inmunoglobulinas asociadas a las plaquetas (PAlg). Comparación de las técnicas de lavado/separa-
ción en tubo de gel y mediante centrifugaciones múltiples (ver tabla 3 siguiente).

El procedimiento de separación/lavado de las plaquetas por centrifugación es susceptible de activar dichas células conduciendo a una extensión de las Ig internas responsables de los resultados por exceso. Las mediciones de las PAlg se han realizado en una muestra normal cuyas plaquetas se han lavado mediante tubo gel o mediante 3 centrifugaciones. Existe en efecto un número de PAlg medido superior para el procedimiento de separación/lavado mediante centrifugación (tabla 3).

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TABLA 3 Comparación de las técnicas de lavado

	Lavados gel Separación	Lavados centrifugación
Cuantificación PAlg	1387 PAlg por plaqueta	2407 PAlg por plaqueta

Claims (12)

1. Procedimiento de separación de plaquetas o de micropartículas de origen plaquetario, a partir de una muestra que las contiene seleccionada de entre un plasma rico en plaquetas y una muestra que contiene unas moléculas ligadas a unas plaquetas o unas micropartículas de origen plaquetario y las mismas moléculas no ligadas presentes en la fase líquida, principalmente en forma soluble, que comprende las etapas siguientes:

a)

se centrifuga dicha muestra en un recipiente que contiene en su extremo distal un gel compacto, siendo dicho gel sustancialmente impermeable a la fase líquida de la muestra pero que puede ser atravesado en las condiciones de centrifugación por las plaquetas o las micropartículas de origen plaquetario;

b)

se separa eventualmente el sobrenadante de centrifugación, y;

c)

se recuperan a continuación las plaquetas o micropartículas de origen plaquetario incorporadas en el gel;

caracterizado porque dicho gel está constituido por partículas hidrófilas que en el estado hinchado presentan un diámetro comprendido entre 30 y 500 \mum y preferentemente, comprendido entre 90 y 350 \mum.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las moléculas son inmunoglobulinas.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el gel está presente a una concentración en peso seco de partículas de 0,04 g/ml a 0,2 g/ml con respecto al gel.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la velocidad de centrifugación está comprendida entre 200 y 5000 g.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el recipiente de centrifugación es un tubo cuya parte distal presenta un diámetro más pequeño, estando el gel dispuesto en dicha parte distal de diámetro más pequeño.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque el diámetro más pequeño es del orden de 2 a 7 mm.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque que la parte distal del tubo en el que se coloca el gel está abierta en su extremo inferior, estando dicha apertura obturada por un filtro susceptible de retener el gel, desembocando dicho extremo abierto en un recipiente acoplado de forma amovible al tubo de forma que recibe las células de la muestra que ha atravesado el gel.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el recipiente contiene un gradiente de densidad.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en la etapa c) se recupera el gel poniéndolo de nuevo en suspensión y se filtra dicha suspensión con un filtro que retiene las partículas de gel y permite el paso de las plaquetas o de las micropartículas de origen plaquetario.

10. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra está constituida por una suspensión en la que se han tratado las plaquetas o las micropartículas de origen plaquetario con un reactivo.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque las plaquetas o las micropartículas de origen plaquetario se han tratado con un anticuerpo en exceso que reconoce un antígeno plaquetario a título de reactivo.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el gel contiene un componente que asegura la revelación del reactivo o del marcador de las plaquetas.