CZ293114B6

CZ293114B6 - Kyveta analyzátoru, způsob stanovení a diagnostická souprava ke stanovení látek v plazmatické frakci krevních vzorků

Info

Publication number: CZ293114B6
Application number: CZ19962372A
Authority: CZ
Inventors: Raimo Majuri
Original assignee: Orion-Yhtymä Oy
Priority date: 1994-02-22
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 2004-02-18
Also published as: JP3451091B2; HUT74513A; HU216915B; CZ237296A3; ES2164761T3; DE69524576D1; FI940823A0; NO963477L; NO963477D0; HU9602298D0; DK0746767T3; EP0746767A1; DE69524576T2; ATE210825T1; US5919419A; WO1995022764A1; NO315845B1; JPH09508975A; EP0746767B1

Abstract

Kyveta obsahuje na vnitřní stěně nanesený povlak suchého činidla obsahujícího aglutinin extrahovaný z bramboru, nebo obsahuje porézní kotouček, který v sobě obsahuje uvedené suché činidlo. Způsob spočívá v tom, že se krevní vzorek aplikuje do uvedené kyvety k aglutinaci krevních buněk, čímž dojde k oddělení plazmatické frakce, ve které se stanoví analyt. Diagnostická souprava je tvořená kyvetou s povlakem suchého činidla obsahujícího aglutinin extrahovaný z bramboru nebo porézním kotoučkem s tímto činidlem, dále odběrovou kapilárou s heparinem, reakčním pufrem a instrukcí pro použití.ŕ

Description

Kyveta analyzátoru, způsob stanovení a diagnostická souprava ke stanovení látek v plazmatické frakci krevních vzorků

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká kyvety, způsobu stanovení a diagnostické soupravy, použitelných ke kvantitativním diagnostickým testům bez nutnosti testovanou krev odstřeďovat, a to dokonce i v takovém případě, kdy analyzovaná složka krve je v plazmatické frakci. Podle způsobu popsaném v tomto vynálezu se vzorek krve rozdělí na plazmatickou a buněčnou frakci třepáním v kyvetě za přítomnosti zvláštního aglutinačního činidla. Tento postup vede k tomu, že buněčná frakce vytváří pevnou fázi, a tím se vyloučí její rušivý vliv. Plasmatická frakce získaní uvedeným způsobem je vhodná pro další diagnostické testy užívající imunometrické nebo kolorimetrické techniky nebo proužkové diagnostické testy, aniž by bylo nutné ze vzorku fyzicky odstranit krevní buňky.

Dosavadní stav techniky

Oddělení plazmy od krevních buněk

Různé diagnostické metody jsou založeny na tom, že se stanovuje koncentrace specifických látek v krevní plazmě. Velmi často však krevní buňky závažným způsobem narušují testovací postup a je proto nezbytné oddělit krevní plazmu od buněk před měřením. Ve většině případů se plazma odděluje odstředěním. Ačkoliv odstřeďování lze považovat za rutinní postup, náklady na přístroje a zkumavky nepříznivě ovlivňují cenu testu. Kromě toho je odstřeďování pracný a časově náročný krok. Navíc aerosol vznikající při odstřeďování, případně rozbití zkumavky, vytváří značné riziko infekce pro personál laboratoře. Do určité míry se používají také postupy založené na filtraci. Ale jejich objemová kapacita je velmi nízká a užívají se přednostně pouze ve zvláštních případech jako je imunochromatografie.

Způsoby pro oddělení plazmy od krevních buněk užívají aglutinaci (DE 2038722, DE 1498577) nebo aglutinaci s filtrací (EP—183991 Al, EP-045476 Al, EP-0194502 Bl) byly objeveny již dříve. Tyto způsoby a přístroje mají omezené možnosti využití jako primární způsoby pro oddělení plazmy ve zvláštních případech. V takovém případě je plazma oddělena a fyzicky přemístěna do jiné zkumavky nebo kyvety pro další analýzu, neboje plazma přemístěna působením kapilárních sil do jiné membránové vrstvy či komory oddělovacího přístroje (separátoru). Účel těchto způsobů je však odlišný od účelu předkládaného vynálezu, jak způsob přípravy aglutinačních složek, tak i způsob jejího použití se liší od způsobu nově popsaného v tomto vynálezu.

Jak vyplývá z odborné literatury, brambor (Solárním tuberosuní) obsahuje STA-lektin (Solanum tuberosum aglutinin) a řadu dalších bílkovin vázajících sacharidy, které však dosud nebyly plně charakterizovány (Kilpatrick, D.C., Biochem. J. 1980. 191:273-275, Allen, A.K. a Neuberger, A., Biochem. J. 1973, 135: 307-314, Matsumoto, I., et al., J. Biol. Chem. 1983,258: 2886-2891, Millar, D. J. et al., Biochem. J. 1992, 283: 813-821). Bílkoviny vázající sacharidy izolované z jiných druhů rostlin nebo připravené technologií rekombinantní DNA a genetickým inženýrstvím jsou také použitelné. Důležité však je, aby tyto bílkoviny, bez ohledu na způsob přípravy, vázaly všechny krevní buňky aniž by reagovaly (vázaly se) s glykoproteiny obsaženými v plazmě.

STA-lektin se váže na povrchové antigeny krevních buněk různých druhů zvířat a také člověk. Aglutinační pochod je založen na tom, že polyvalentní lektin se váže na skupiny sacharidů, které na povrchu buňky tvoří antigeny krevních skupin. STA-lektin je specifický pro oligo-N-acetyl-D-glukosaminy, ale vykazuje určitou malou afinitu také kmonomemímu N-acetyl-D-glukosaminu nebo jiným monosacharidům a polysacharidům.

-1 CZ 293114 B6

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká kyvety analyzátoru nebo zkumavky a způsobu, při kterém vzorek krve odebraný pro test je dále zpracováván ve výše zmíněné kyvetě. Zde uvedený způsob umožňuje stanovit ve vzorku celé krve látky obsažené v plazmě aniž by přitom stanovení bylo rušivě ovlivněno přítomností krvinek nebo krevních destiček. Kyveta analyzátoru se může využít současně jako primární zkumavka přímo k odběru malých vzorků krve.

Podle předkládaného vynálezu se krevní buňky precipitují činidlem tvořeným aglutininem extrahovaným z bramboru, který se kombinuje ještě s dalšími složkami v přesně definované koncentraci v závislosti na způsobu použití. Toto krev oddělující činidlo (Blood Separating Reagent, BSR-činidlo) je naneseno na vnitřní povrch kyvety analyzátoru nebo na samostatnou porézní membránu, která je buď pohyblivou, nebo pevnou součástí kyvety analyzátoru nebo zkumavky pro odběr krevních vzorků.

Vnitřní povrch kyvety analyzátoru je pokryt BSR činidlem tak, že krevní vzorek se rozdělí, poté co se dostane do kontaktu s pokrytým povrchem, na plazmatickou a buněčnou frakci. Buněčná frakce přitom vytváří pevnou fázi působením povrchu pokrytého BSR-činidlem za současného jemného třepání.

Předkládaný vynález se kromě toho také týká testovací diagnostické soupravy, která používá kyvety nebo zkumavky, jejichž vnitřní povrchy jsou pokryty suchým činidlem, výhodně BSR-činidlem, které obsahuje aglutinin extrahovaný z bramboru. Taková diagnostická souprava je použitelná pro imunometrické nebo kolorimetrické, tj. turbidimetrické nebo nefelometrické stanovení látek ve vzorcích celé krve.

Předkládaný vynález se týká velmi účinného způsobu pro stanovení látek ve vzorcích celé krve, při kterém je odstraněn rušivý vliv krevních buněk. Stanovení se provádí přímo ve vzorcích celé krve místo použití plazmy nebo séra po předchozí úpravě vzorku celé krve, což bylo běžné u dřívějších způsobů. Aglutinační činidlo, jehož se týká předkládaný vynález, tvoří výhodně aglutinin extrahovaný z bramboru. Primární hrubý extrakt z bramboru byl nazván „krev oddělující činidlo“ (Blood Separating Reagent, BSR). BSR je použitelné v různém stupni čistoty podle způsobu využití. Pro účely tohoto vynálezu je konečný Čistý produkt, který byl připraven ředěním prvotního BSR vhodným pufrem, jak se popisuje dále, nazýván „BSR-činidlo“.

V tomto popisu vynálezu se kyveta analyzátoru nebo zkumavka pokrytá BSR-činidlem nazývá „kyveta s BSR-činidlem“ nebo „zkumavka s BSR-činidlem“. Jak kyvety, tak zkumavky, stejně jako i způsob jejich použití jsou zvláště výhodné pro práci s malými objemy krve. Optimální objem krve je od 1 do 100 μΐ.

Podle použitého způsobu se aglutinační BSR-činidlo nanáší a suší za přesně definovaných podmínek na vnitřním povrchu kyvety nebo zkumavky pro analýzu krevních vzorků nebo se činidlem napouští pohyblivý nebo pevný kotouček porézní membrány uvnitř kyvety analyzátoru. BSR-činidlo se smyje z povrchu zkumavky či membrány a rozpustí působením tekutiny obsažené ve vzorku. Suché BSR-činidlo je vysoce stálé precipitační činidlo, které vyvolává rychlou precipitaci krevních buněk. Důležité přitom je, že BSR-činidlo nezpůsobuje hemolýzu buněk.

Novost předkládaného způsobu spočívá v tom, že krevní vzorek se rozdělí na dvě fáze, pevnou buněčnou fázi a tekutou plazmatickou fázi, aniž by se krev odstřeďovala. Způsob popsaný v tomto vynálezu umožňuje analyzovat krev bez nebezpečí rozbití zkumavky a vzniku aerosolů v průběhu odstřeďování, tedy bez zvýšeného rizika infekce. Nově objevený způsob oddělení fází v krevních vzorcích je velmi jednoduchý. Nevyžaduje žádné speciální přístrojové vybavení a umožňuje analyzovat vzorky celé krve. Rysem předkládaného vynálezu je to, že krevní buňky vytvářejí pevnou fázi, která nikterak nebrání stanovení látek v krvi a tudíž není nutno fyzické oddělení fází. Shluk buněk získaný precipitaci zůstává volný v kyvetě během následujících

-2CZ 293114 B6 měření. Tím je umožněno, že složky plazmy mohou rychle difundovat díky krátké vzdálenosti difúze (menší než 0,1 mm). Význačnou vlastností popisovaného způsobuje zvýšená bezpečnost osob, které s krevními vzorky zacházejí. Všechny infekční složky krve zůstávají vkyvetě analyzátoru a poté, co bylo provedeno stanovení. Po ukončení měření se kyveta uzavře těsným víčkem, čímž se odstraní všechny infekční složky současně a riziko infekce se tak sníží. Další vynikající výhodou vynálezu, srovnáme-li ho s dosud užívaným způsobem, je možnost analyzovat krevní mikrovzorky odebírané ze špičky prstu. Při zpracování krevních vzorků podle způsobu popsaném v tomto vynálezu se krevní plazma nemusí přenášet do jiné kyvety, komory či zkumavky, čímž se funkce kyvety analyzátoru zjednodušuje.

Předmětem předkládaného vynálezu je také další využití schopnosti aglutininů způsobovat aglutinaci krve a na této vlastnosti založený způsob a diagnostická souprava pro jednoduché a rychlé stanovení látek ve vzorcích celé krve bez rušivého vlivu krevních buněk.

Předkládaný vynález je dále podrobněji ilustrován v přiložených výkresech. Test ke stanovení C-reaktivního proteinu (CRP) popsaný v příkladech č. 3 a 4 slouží pouze jako příklad testu, při čemž se užívá taková kyveta, jaká je předmětem vynálezu.

Příprava a charakterizace činidla pro oddělení krve (Bood Separation Reagent, BSR)

BSR se extrahuje z bramboru tak, že se z bramboru vylisuje šťáva, ve které se aktivní složka, tj. BSR, koncentruje užitím 60% síranu amonného. BSR se pak rozředí v základním pufru, který obsahuje Tris-HCl, Tris-bázi, chlorid sodný, azid sodný a BSA v přesně definovaných koncentracích, a tím se získá BSR-činidlo. Přitom koncentrace se mění v závislosti na způsobu použití a také závisí na objemu suchého činidla. Činidlo se pak nanáší na vnitřní stěnu kyvety analyzátoru, kde se nechává zaschnout, nebo se nechává vsáknout do porézní membrány. Avšak aktivní činidlo tím není trvale vázáno, po přidání krevního vzorku se rozpustí působením tekutiny obsažené v analyzovaném vzorku.

Bílkovinné složení BSR bylo zkoumáno užitím HPLC. Obr. 1 ukazuje SDS-PAGE elektroforetogram za použití 25% gelu (podle Laemmliho). Jednotlivé vzorky na gelu jsou: 1. STA-lektin (Sigma, série 38F-3964), 2. vzorek. BSR (UA001). 3. HPLC FR1, 4. HPLC FR2, 5. HPLC FR3, 6. HPLC FR4, 7. HPLC FR5, 8. LMW (Pharmacia). Obr. 2 ukazuje výsledek analýzy vzorku BSR (série UA001) pomocí HPLC při použití kolony G3E000SWxl a detekci při vlnové délce 280 nm. Aktivní složka frakce se měřila aglutinačním testem. Molekulová hmotnost aktivní složky (180 kD) BSR je vyšší než molekulová hmotnost hlavní složky (160 kD) STA-lektinu (Sigma, L-4266, série 38F-3864). Pohyblivost STA-lektinu na SDS-PAGE gelu se lišila, odpovídala molekulové hmotnosti 120 kDa, zatímco pro aktivní složku BSR byla 180 kDa. BSR tvoří z 98 % malé bílkoviny s molekulovou hmotností 15 a 32 kDa.

Tabulka 1 Kompetitivní inhibice BSR-činidla Ν,Ν',Ν''-triacetylchiototriozou.

CHITOTRIOZA (pg)__________AGREGACE____________PRECIPITACE_____ ++++ +++

100+

150+/200

250

K provedení zkoušky jsme použili kyvety s BSR původně určené pro analyzátor Quikread 3, do kterých se naneslo 350 pg BSR-činidla. Potom se do kyvety naneslo pipetou 50 pl chitotriozy a20pl krve sEDTA. Aglutinace se hodnotila pouze vizuálně. Výsledky ukazují, že chování BSR-činidla je shodné s chováním STA-lektinu.

-3CZ 293114 B6

Stabilita

Tabulka 2 shrnuje údaje o stabilitě kyvet s naneseným BSR-činidlem při různých teplotách.

Doba, po kterou je možné uchovávat kyvety na pracovním stole bez zvláštních opatření (shelf life) se zkoumala na kyvetách určených pro CRP test na analyzátoru Quikread 3. Aglutinace se ověřovala nanesením vzorku krve s EDTA o objemu 20 μΐ do kyvety pokryté BSR-činidlem. BSR-činidlo, kterým byla pokryta vnitřní stěna kyvety, způsobilo precipitaci krevních buněk poté, co se přidal 1 ml pufru. Pak se změřila absorbance pomocí analyzátoru Quikread 3.

Tabulka 2

TEPLOTA (°C)	ČAS	AKTIVITA
+ 4	> 12 měsíců	+++
teplota místnosti	> 12 měsíců	+++
+ 37	> 12 měsíců	+++
+ 50	> 7 hodin	+++
+ 75	> 7 hodin	+++
+ 100	>30 minut	+++

Kyvety s BSR-činidlem určené pro analyzátor Quikread 3.

BSR-činidlo vzniklo rozpuštěním 500 mg lyofilizovaného BSR (UA001) v 87,5 ml destilované vody a 12,5 ml pufru. 50 μΐ tohoto činidla se pak naneslo do akrylátových kyvet s kulatým dnem určených pro analyzátor Quikread 3 a nechalo vyschnout při teplotě místnosti. Obr. 3 ukazuje 20 kyvetu užívanou v analyzátoru Quikread 3 s projekční čarou 1 a BSR-činidlem naneseným na stěnu kyvety 2.

Kyveta analyzátoru Quikread 3 obsahující membránový kotouček pokiyty BSR-činidlem.

Místo toho, aby se BSR-činidlo nanášelo na vnitřní stěnu kyvety, umístí se na dno kyvety membránový kotouček, který je napuštěn BSR-činidlem a poté usušen. Plocha membránového kotoučku vhodného pro kyvety analyzátoru Wuikread 3 je 50 mm“. BSR-činidla, které obsahuje 21 mg/1 vlastního BSR (série UA001) se nechalo vsáknout do porézní membrány nebo filtru a poté vyschnout uvnitř kyvet. Obr. 4 ukazuje kyvetu nebo zkumavku obsahující odběrovou 30 kapiláru 1 s heparinem o stálém objemu procházející uzávěrem 2 kyvety. Kapilára 1 se naplní krví, přičemž se kyveta drží ve vodorovné poloze. Když je kapilára plná, kyveta se otáčí do obrácené polohy (dnem nahoru). Kapilární síly porézního membránového kotoučku 3 nasávají krev z kapiláry, až ji vyprázdní. Působením BSR-činidla krevní buňky precipitují na membránovém kotoučku. Plazma se potom smyje z kotoučku přidáním pufru do kyvety.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 Výsledky SDS-PAGE elektroforézy na gradientovém gelu 8 až 25 % (podle Laemmoli40 ho). Jednotlivé vzorky představují:

1. STA-lektin (Sigma, série 38F-3964). 2. vzorek BSR (UA001), 3. HPLC FR1, 4. HPLC FR2, 5. HPLC FR3, 6. HPLC FR4, 7. HPLC FR5, 8. LMW (Pharmacia).

Obr. 2. Výsledek HPLC analýzy vzorku BSR (série UA001) HPLC na koloně G3000SWxl a detekce při vlnové délce 280 nm. Aktivní složka frakce se měřila aglutinačním testem.

-4CZ 293114 B6

I

Obr. 3 Akrylátová kyveta analyzátoru určena pro analyzátor Quikread. 3.1 je projekční čára a je BSR-činidlo nanesené na vnitřní stěnu kyvety.

Obr. 4 Skleněná nebo plastová z akrylátu, polystyrénu, polypropylénu nebo jiného plastu) 5 kyveta analyzátoru s kapilárou 1, víčkem 2 a kotoučkem porézní membrány 3.

Obr. 5 Korelace mezi hladinami CRP stanovenými pomocí analyzátoru Quikread 3 (Orion Diagnostica, osa x) a Cobas Míra (Roche Diagnostic Systém).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Účinnost precipitace při různých způsobem využití BSR-činidla.

Precipitace krevních buněk se testovala porovnáním tří odlišných způsobů využití BSR-činidla, tj. užitím tekutého BSR-činidla (Způsob 1), užitím BSR-činidla naneseného na stěnu kyvety 20 (Způsob 2) a užitím BSR-činidla nasáklého do porézní membrány (Způsob 3). Při každém způsobu se užilo optimální koncentrace BSR-činidla. Účinnost precipitace krevních buněk se hodnotila tak, že se vzorek precipitované krve naředil pufrem do 1000 μΐ a pak se měřila absorbance při vlnové délce 520 nm na analyzátoru Quikread 3.

Suché BSR-činidlo (Zp. 1) a BSR-činidlo v membráně (Zp. 2) precipitují buňky účinněji než tekuté BSR-činidlo (Zp. 3). Hodnoty absorbance jsou 5 až 10-krát nižší než Zp. 2 a 3. Avšak hodnoty absorbance se ustálí rychleji (za dobu kratší než 20 s) při precipitaci suchým BSR-činidlem. Když se precipituje tekutým BSR-činidlem, hodnoty absorbance několik minut kolísají, než se ustálí.

Tabulka 3 Účinnost precipitace při různých způsobech použití BSR-činidla vyjádřená jako hodnota absorbance při 520 nm.

ČAS	Zp. 1	Zp. 2	Zp. 3
0	0,117	0,011	0,024
20	0,117	0,011	0,021
40	0,112	0,011	0,022
60	0,109	0,012	0,023
80	0,109	0,010	0,024
100	0,110	0,010	0,024
120	0,107	0,011	0,024
140	0,105	0,011	0,024
160	0,107	0,011	0,023
180	0,106	0,012	0,023

Příklad 2

Histologické studie precipitační BSR-činidla.

Krev (20 μΐ) se po precipitaci naředila 1000 μΐ pufru a odebral se vzorek, ve kterém se po obarvení krystalovou violetí počítaly krvinky pod mikroskopem v Bůrkerově sčítací komůrce. Bílé a červené krvinky se počítaly zvlášť vtémže objemu vzorku. Tekuté BSR-činidlo (Zp. 1) precipitovalo buňky méně účinné než suché BSR-činidlo (Zp. 2) nebo BSR-činidlo v membráně (Zp. 3). Relativní zastoupení bílých krvinek vzrostlo 200krát. Suché BSR-činidlo (Zp. 2) precipitovalo všechno bílé krvinky, ale v supematantu zůstaly ojedinělé červené krvinky. Nejúčinnější precipitace se dosáhlo při užití BSR-činidla v membráně (Zp. 3), kdy došlo k úplné precipitací všech buněk. Při tomto způsobu precipitace nebylo třeba vzorek ani třepat.

Tabulka 4 Precipitační účinnost BSR-činidla při různých způsobem použití

Zp.l Zp.2 Zp.3

doba třepání (vortex)	30 s	10 s	0 s
doba inkubace	210s	30 s	30 s
červené krvinky (xl0’³/ml)	206	7	0
bílé krvinky (xl0’³/ml)	40	0	0

Příklad 3

Stanovení C-reaktivního proteinu (CRP) ve vzorku celé krve na analyzátoru Quikread 3.

Materiál:

kyvety analyzátoru s BSR-činidlem anti-CRP latexový test

QR-CRP reakční pufr (Orion Diagnostica)

Způsob použití:

Dvacet (20) μΐ krve s EDTA a heparinem se napipetuje do kyvety s kulatým dnem, která je předem pokryta BSR-činidlem. Krevní buňky se precipitují buďto protřepáním (na vortexu), nebo otáčením kyvety. Poté, co proběhla precipitace, se do téže kyvety přidá 1000 μΐ reakčního pufru. Po jemném promíchání vzorku se kyveta inkubuje po 3 minuty v inkubační šachtě (40 °C) analyzátoru Quikread 3. Po inkubaci se kyveta přemístí do měřicí šachty a změří se absorbance pozadí. Pak se přidá 50 μΐ anti-CRP latexového činidla, kyveta se protřepe (vortex) a po 3 minutách inkubace se provede turbidimetrické měření.

Obr. 5 ukazuje korelace mezi výsledky získanými při stanovení CRP na analyzátoru Quikread 3 (osa x) nebo na analyzátoru Cobas Mira. Pro měření na analyzátoru Quikread 3 se užily vzorky celé krve a kyvety s BSR-činidlem. Pro měření na Cobas Mira se užily vzorky plazmy stejných pacientů a soupravy pro imunoturbidimerické testy (IT) firmy Orion Diagnostica.

Příklad 4

Měření C-reaktivního proteinu (CRP) ve vzorku celé krve na analyzátoru Turbox.

Materiál:

Kyvety s BSR-činidlem antisérum proti CRP (Orion Diagnostica) kalibrátor CRP pro Turbox (Orion Diagnostica) Reakční pufr pro stanovení CRP (Orion Diagnostica)

Způsob použití:

μΐ krve s EDTA a heparinem se napipetuje do dvou kyvet s BSR-činidlem, vhodných pro analyzátoru Turbox. Do jedné z kyvet se přidá 500 μΐ reakčního pufru a stanoví se hodnota pozadí vzorku. Do druhé kyvety se přidá stejný objem 500 μΙ roztoku antiséra. Po 30 minutové inkubaci za teploty místnosti se stanoví koncentrace CRP měřením obou kyvet v analyzátoru Turbox. Koncentrace CRP udaná přístrojem je založena na standardním křivce, která je zakódována na magnetické kartě. Tabulka 5 ukazuje výsledky stanovení RP (antisérum Orion Diagnostica) ve vzorcích celé krve (50 μΐ) v kyvetách s BSR-činidlem nebo v původních kyvetách na analyzátoru Turbox (Orion Diagostica). Hodnoty turbidimetrických měření (uváděné jako relativní jednotky rozptylu světla korigované hodnotou slepého vzorku, BL-LSU) jsou stejného řádu jak pro měření precipitované krve, tak pro měření samotné plazmy u shodných pacientů. U vzorků celé krve (50 μΐ) činil objem plazmy v průměru 30 μΐ. Korelace mezi hladinami CRP měřenými v celé krvi nebo vzorcích plazmy byla velmi dobrá.

Tabulka 5

Celá krev Plazma

Vzorek	BL-LSU	CRP (mg/1)	BL-LSU	CRP (mg/1)
1	61	50	43	50
2	75	<10	75	<10
3	78	65	285	50
4	153	<10	195	<10
5	71	<10	111	<10
6	65	51	61	54

Průmyslová využitelnost

Kyveta analyzátoru nebo zkumavka upravená dle předkládaného vynálezu, je použitelná pro kvantitativní stanovení látek obsažených v plazmě, aniž by se vzorek krve musel rozdělovat (např. odstřeďováním nebo filtrací) na buněčnou a plazmatickou frakci. Kyveta pro analýzu je také využitelná přímo jako primární zkumavka pro odběr malých vzorků krve. Kyveta nebo zkumavka dle vynálezu je výhodně využitelná jako součást diagnostických souprav určených ke stanovení látek v plazmě.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Kyveta analyzátoru nebo zkumavka ke stanovení látek obsažených v plazmatické frakci vzorku krve, vyznačující se tím, že obsahuje na vnitřní stěně nanesený povlak suchého činidla obsahujícího aglutinin extrahovaný z bramboru, nebo obsahuje porézní membránový kotouček, který v sobě obsahuje uvedené suché činidlo.

2. Kyveta analyzátoru nebo zkumavka podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že porézní membránový kotouček je pohyblivý nebo nepohyblivý.

3. Kyveta analyzátoru nebo zkumavka podle nároku 1,vyznačující se tím, že dále obsahuje heparinizovanou kapiláru pro nabírání krevního vzorku do kyvety nebo zkumavky.

-7<

4. Kyveta analyzátoru nebo zkumavka podle nároku 1, vyznačující se tím, že má rozměry vhodné k odběru vzorku krve o objemu od 1 do 100 μΐ.

5. Kyveta analyzátoru nebo zkumavka podle nároku 1, vyznačující se tím, že suchým činidlem obsahujícím aglutinin extrahovaný z bramboru je termostabilní aglutinin.

6. Kyveta analyzátoru nebo zkumavka podle nároku 1, vyznačující se tím, že aglutinin extrahovaný z bramboru je specifický pro oligomemí N-acetyl-D-glukosaminy a způsobuje aglutinaci červených krvinek, bílých krvinek a krevních destiček.

7. Kyveta analyzátoru nebo zkumavka podle nároku 1, vyznačující se tím, že aglutinin je nečištěný bramborový aglutinin, čistý STA-lektin nebo jiný lektin, který způsobuje aglutinaci buněk, aniž váže složky analyzované plazmy.

8. Kyveta analyzátoru nebo zkumavka podle nároku 1, vyznačující se tím, že aglutinin extrahovaný z bramboru je specifické krev oddělující BSR-činidlo.

9. Způsob stanovení látek v plazmatické frakci krevních vzorků, vyznačující se tím, že krevní vzorek se aplikuje do kyvety analyzátoru nebo zkumavky podle jednoho z nároků 1 až 8 k aglutinaci krevních buněk a k získání plazmatické frakce vhodné pro použití v diagnostickém testování, načež se získaná plazmatická frakce oddělí a v plazmatické frakci se v přítomnosti aglutinovaných buněk stanoví analyt.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že krevní vzorek, který se aplikuje do kyvety analyzátoru nebo zkumavky dále obsahuje antikoagulační činidlo.

11. Způsob podle nároku 10, v y z n a č u j i c í se tím, že se jako antikoagulační činidlo v krevním vzorku použije EDTA, heparin nebo podobné činidlo.

12. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, žek diagnostickému testu se použije plazmatická frakce.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že se použije diagnostický test, který je vybrán ze skupiny zahrnující test imunometrický, kolorimerický a test proužkovaný.

14. Diagnostická souprava ke stanovení látek v plazmatické frakci krevních vzorků, vyznačující se tím, že součást jejího balení je instrukce pro použití, odběrová kapilára s heparinem, reakční pufr, a alespoň jedna kyveta analyzátoru nebo zkumavka, přičemž kyveta analyzátoru nebo zkumavka má vnitřní stěnu potaženou povlakem suchého činidla obsahujícího aglutinin extrahovaný z brambor, nebo kyveta analyzátoru nebo zkumavka obsahující porézní membránový kotouček, který v sobě obsahuje uvedené suché činidlo.