HU216915B

HU216915B - Analizálóküvetta, eljárás és diagnosztikai tesztkészlet teljes vérből történő analízishez

Info

Publication number: HU216915B
Application number: HU9602298A
Authority: HU
Inventors: Raimo Majuri
Original assignee: Orion-Yhtymä Oy
Priority date: 1994-02-22
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 1999-10-28
Also published as: EP0746767B1; JP3451091B2; HU9602298D0; JPH09508975A; NO963477L; DK0746767T3; US5919419A; FI940823A0; HUT74513A; CZ293114B6; DE69524576T2; CZ237296A3; EP0746767A1; NO315845B1; WO1995022764A1; ATE210825T1; DE69524576D1; ES2164761T3; NO963477D0

Abstract

A találmány tárgya analitikai küvetta vagy cső, amely alkalmas teljesvérminta plazmafrakciójában található analitikűmők mérésére. A küvettavagy cső belső felülete szárítőtt reagenssel van bevőnva, vagy aküvetta vagy cső tartalmaz egy membránt, mely az említett reagensselvan bevőnva. A találmány szerinti eljárás sőrán a teljes vérmintát egyanalizálóküvettába vagy csőbe viszik, és az agglűtinált vérsejtekjelenlétében az analitikűmők mennyiségét meghatárőzzák. A találmányszerinti berendezést és eljárást a gyógyszerészetben alkalmazzák. ŕ

Description

A találmány tárgya

A találmány tárgya specifikus küvetta és tesztvizsgálati eljárás, valamint diagnosztikai tesztvizsgálati készlet, amelyben teljes vérmintákat vizsgálhatunk kvantitatív diagnosztikai tesztvizsgálatokban a centrifugálás igénye nélkül még akkor is, amennyiben az analizálandó vérkomponensek a plazmafrakcióban találhatók. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával a vérmintát plazmafrakcióra, valamint sejtfrakcióra választjuk szét úgy, hogy valamely küvettában rázatjuk adott agglutinálóreagens jelenlétében. Az eljárás kiküszöböli a zavaró hatást, amelyet a sejtfrakció okozna, amely szilárd fázist képez. A nyert plazmafrakció alkalmas arra, hogy diagnosztikai tesztvizsgálatokat végezzünk immunometriás vagy kolorimetriás eljárásokkal, vagy diagnosztikai analitikai szalagok alkalmazásával anélkül, hogy a mintából a vérsejteket fizikailag elválasztanánk.

A találmány háttere

A plazmakomponensek elválasztása a vérsejtektől

Számos diagnosztikai eljárás alapul azon, hogy meghatározzák a vérplazmában található analitikumvegyületek koncentrációját. Sok esetben a vérsejtek károsan befolyásolják a választott tesztvizsgálati eljárást, ezért szükséges, hogy a vérsejteket elválasszák a plazmától, mielőtt ezeket a tesztvizsgálatokat végrehajtják. A centrifugálás az egyik eljárás, amellyel ezt rutinszerűen elvégezhetik, és ehhez megfelelő centrifugacsövek szükségesek, amelyek meghatározzák az eljárás költségeit. A centrifugálás ezen túlmenően munkaigényes lépés. Végül az eltörött tesztvizsgálati centrifugacsövek, illetve a centrifugálás során keletkező aeroszol fertőzésveszélyt jelent a laboratóriumban dolgozó személyzet számára.

Kisebb mértékben szűrési eljárásokat is alkalmaznak. A szűrési eljárások térfogati kapacitása azonban igen alacsony, és ezeket csak speciális alkalmazások esetében, mint például immunokromatográfia alkalmazása során végezhetik.

A korábbi szakirodalomban leírták a plazmaelválasztási eljárást a vér komponenseitől agglutinálás (DE 2038722 számú, DE 1498577 számú szabadalmi bejelentések) vagy agglutinációszűrés (EP-183991 Al számú, EP-045476 Al számú, EP-0194502 Bl számú szabadalmi bejelentések) segítségével. A fenti eljárások, illetve eszközök esetében egy megfelelő, szűk szegmens speciális alkalmazása végezhető el, amelynek során vagy egy elsődleges plazmaelválasztási módszert alkalmaznak, ahol az elválasztott plazmát fizikai úton másik csőbe viszik át, vagy küvettába viszik abból a célból, hogy az analízist végrehajtsák; vagy kapilláris erővel átviszik egy másik membránrétegre vagy valamely berendezéskamrába. A fent leírt eljárásokban alkalmazott módszerek célja eltér a jelen találmányban leírt eljárások céljától. Az agglutinálókomponens előállítási eljárása, valamint ennek alkalmazási eljárása is eltér a jelen találmány szerinti készítményben és eljárásban attól, amelyet a korábbi szakirodalomban leírtak.

A korábbi szakirodalomban a burgonyát (Solanum tuberosum), amely STA-lectin-tartalmú (Solanum tuberosum agglutinin), valamint különféle egyéb szénhidrátkötő proteineket alkalmaztak, amelyeket eddig még teljesen nem azonosítottak (Kilpatrick, D. C. Biochem. J. 1980, 191: 273-275.; Allén, A. K. és Neuberger, A., Biochem. J. 1973, 135: 307-314.; Matsumoto, I. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 1983, 258:2886-2891.; Millar, D. J. és munkatársai, Biochem. J. 1992, 283:813-821.). Az egyéb növényekből izolált szénhidrátkötő fehéijék, valamint rekombináns technológiával előállított fehérjék, illetve genetikus módszerekkel előállított fehéijék is alkalmazhatók. Alapvető jellemző, hogy attól függetlenül, hogy milyen előállítási eljárással nyerik a szénhidrátkötő fehéijét, minden esetben megkötik valamennyi vérsejtet, azonban nem kötik meg a plazma-glükoproteineket.

Különféle állatfajokban, az embert is beleértve, a vérsejtfelületi antigénekhez az STA-lectin kötődik. Az agglutinációs folyamat során a több vegyértékű lectin kötődik a vérsejtantigének felületi szénhidrátegységeihez. Az STA-lectin specifikusan kötődik az N-acetil-Dglükózamin-oligomerekhez, azonban kis kötődést mutat az N-acetil-D-glükózamin-monomerekhez vagy egyéb cukormonomerekhez vagy -polimerekhez.

A találmány összefoglalása

A találmány tárgya analitikai küvetta vagy cső, illetve eljárás teljes vérminta analitikai vizsgálatára, ahol az analizált mintát a fenti küvettában méijük. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy a teljes vérminta plazmaanalitikumát analizáljuk anélkül, hogy a sejtfrakció vagy a trombociták zavaró hatását észlelnénk. Az analitikai küvetta egyben első csőként is alkalmazható a kisméretű vérminták vételére.

A találmány szerinti eljárás során a vérsejteket egy olyan reagenssel csapjuk ki, amely burgonyából extrahált agglutinint tartalmaz, valamint további komponenseket tartalmaz, amelyeket a felhasználástól függően szigorúan meghatározott arányban elegyítünk. Ez a vérelválasztó reagens, a BSR-reagens, ezután az analizálóküvetta belső bevonataként szolgál vagy külön porózus membránra kerül, amely vagy mobil, vagy immobil része az analitikai küvettának vagy a vérmintavevő csőnek.

Az analitikai küvetta belső felületét úgy vonjuk be a fenti reagenssel, hogy azon a területen keletkezzék bevonat, amelyen a vérminta található, és a vérminta a bevont felülettel érintkezzen, amely minta ebből eredően ezután plazmafrakcióra és sejtfrakcióra válik szét. Az utóbbi frakció a küvetta bevont felületének hatására enyhe keverés során szilárd fázissá válik.

A találmány tárgya továbbá analitikai készlet vagy tesztvizsgálati egység, amely küvettákat vagy csöveket tartalmaz, amelyek szárított reagenssel, előnyösen BSR-reagenssel bevontak, és burgonyából extrahált agglutinint tartalmaz, továbbá amely készlet alkalmazható immunometriás és kolorimetriás, például turbidimetriás vagy nefelometriás analitikum meghatározására teljes vérminták esetében.

Az ábrák rövid ismertetése

1. ábra', az ábrán bemutatjuk az SDS-PAGE futtatást 8-25% gélen (Laemmli). Minták: 1. STA2 lectin (Sigma, Lót. 38F-3964), 2. BSR (UA001), 3. HPLC FR1, 4. HPLC FR2, 5. HPLC FR3, 6. HPLC FR4, 7. HPLC FR5, 8. LMW (Pharmacia);

2. ábra: BSR-minta HPLC-analízise (Lót. UA001)

G3000SWxl oszlop alkalmazásával. A detektálást 280 nm hullámhossznál végeztük. A frakció aktív komponensét agglutinálási tesztvizsgálat segítségével mértük a frakcióban;

3. ábra: az ábrán egy specifikusan Quikread 3 analizátorban alkalmazható akril analitikai küvettát mutatunk be, amely egy 1 kimutatási vonallal és 2 BSR-reagenssel rendelkezik, amelyet a cső belső falára szárítottunk, és amely egyben alkalmas a jelen találmány szerinti felhasználásra;

4. ábra: az ábrán egy üveg vagy műanyag (akril, polisztirol, polipropén stb.) analitikai küvettát mutatunk be, amely 1 kapillárisból, 2 kupakból és 3 porózus membránlemezből áll, és alkalmas a jelen találmány szerinti alkalmazásban történő felhasználásra; és

5. ábra: az ábrán bemutatjuk az analitikai eljárások eredményeinek korrelációját, amennyiben CRB-meghatározásokat végeztünk vagy Quikread 3 berendezéssel (Orion Diagnostica; Xtengely) vagy Cobas Mira berendezéssel (Roche Diagnostic System).

A találmány részletes leírása

A találmány tárgya igen hatásos eljárás teljes vérmintákban analitikumok meghatározására anélkül, hogy a vérsejtek zavaró hatását észlelnénk. A meghatározást közvetlenül teljes vérmintán végezhetjük anélkül, hogy a korábbi szakirodalomban leírt eljárásokat előzetesen alkalmaznánk, amelyek során a teljes vérmintából adott műveletekkel plazma/szérum mintákat nyertek.

A jelen találmány szerinti eljárásban a vérsejtek csapadékként történő leválasztásában alkalmazott agglutinálóreagens előnyösen burgonyából extrahált agglutinin. Az elsődleges, nem tiszta burgonyából extrahált készítményt „vérelválasztó reagensnek” (BSR-reagens) nevezzük. A BSR-reagens a találmány szerinti eljárásban különféle tisztasági fokban alkalmazható attól függően, hogy milyen alkalmazási célt szolgál. A jelen találmány szerinti eljárás céljára a végső, tiszta terméket úgy állítjuk elő, hogy az elsődleges BSR-terméket alkalmas puffermátrixszal hígítjuk, amely mátrixot a későbbiekben leírunk, és ezt a reagenst „BSR-reagensnek” nevezzük.

A találmány szerinti eljárásban a BSR-reagenssel borított analitikai küvettát vagy csövet „BSR-reagens küvettának” vagy „BSR-reagens csőnek” nevezzük. A küvetták és a csövek, továbbá az eljárás különösen jól alkalmazhatók a kis térfogatú vér alkalmazása során. Az optimális vértérfogat 1 — 100 μΐ közötti.

A találmány szerinti eljárás során az agglutináló BSR-reagenst szigorúan meghatározott körülmények alkalmazásával a vérmintavevő cső/analitikai küvetta belső felületére szárítjuk, vagy az analitikai küvettában található mobil vagy immobil, porózus membránlemezre szárítjuk. A BSR-reagenst a felületről vagy a membránról a folyadékminta hatására oldjuk le. A szárított BSR-reagens igen stabil csapadékleválasztó reagens, és a vérsejtek gyors csapadékként történő leválását eredményezi. Az eljárás fontos jellemzője, hogy a BSR-reagens nem fejt ki hemolitikus hatást a sejtekre.

A találmány szerinti eljárás új megközelítése, hogy a vérmintát két fázisra választja szét: egy szilárd sejtfázisra és egy folyékony plazmafázisra az analitikai küvettában anélkül, hogy centrifugálást alkalmaznánk. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy a csövek eltörését kiküszöböljük, valamint hogy a centrifügálás során aeroszolképződést hozzunk létre, amely fertőzésveszélyt jelentene. A fáziselválasztási eljárás, amely a vérminták elválasztására szolgál, igen egyszerűen végrehajtható. Az eljáráshoz nem szükséges semmilyen specifikus eszköz, és lehetővé teszi a teljes vérminta alkalmazását. A jelen találmány szerinti eljárás jellemzője, hogy a szilárd fázisban található vérsejtek nem lépnek kölcsönhatásba a tesztvizsgálati eljárással, és így ezek fizikai elválasztása nem szükséges. A kapott sejtlabdacs a küvettában a tesztvizsgálat alatt szabad állapotban marad. Ez lehetővé teszi a plazmakomponensek gyors diffúzióját, mivel igen rövid diffúziós távolság áll fenn (<0,l mm). A találmány szerinti eljárás egyik elsődleges előnye a mintát kezelő ember biztonsága. Az analitikai meghatározás elvégzése után valamennyi fertőző mintakomponens az analitikai küvettában marad. A mérés elvégzése után a küvettát kupakkal szorosan lezárhatjuk, és így valamennyi fertőző komponens, amely a mintában található, könnyen eldobható anélkül, hogy bármely fertőzésveszély fennállna. Az eljárás másik elsődleges előnye a korábbi eljárásokhoz hasonlítva az, hogy új analitikumkomponensek meghatározása is lehetségessé válik, különösen az ujjhegyből vett, mikroméretű vérminták esetében. A találmány szerinti eljárásnak megfelelően a plazmát nem kell újabb edénybe, kamrába vagy küvettába átvinni, és így az analitikai küvetta működtetése könnyebb.

A találmány tárgya továbbá az agglutininvegyületek kapacitásának kihasználása arra a célra, hogy vérsejteket agglutináljanak, és eljárás, valamint analitikai készlet, amely egyszerű és gyors teljesvérmintaanalitikummeghatározásra alkalmas anélkül, hogy a vérsejtek zavaró hatása fellépne.

A találmány szerinti eljárást, berendezést az alábbiakban részletesen bemutatjuk a mellékelt ábrák alkalmazásával. A 3. és 4. példákban leírt CRP-tesztvizsgálatokat csak példaként tekintjük, és ezek a találmány szerinti küvettákban végezhető eljárást illusztrálják, és a találmány tárgyát nem korlátozzák.

A BSR előállítása és jellemzése

A burgonyából a BSR-anyagot olyan eljárással extraháljuk, amelynek során a vízben oldható komponenseket a burgonya préselésével és lé előállításával elválasztjuk, majd az aktív komponenseket 60%-os ammónium-szulfát segítségével bepároljuk (BSR). Ezt követően a BSR-anyagot vízzel szemben dializáljuk, majd fagyasztva szárítjuk.

A vizsgálat során a vérsejtek csapadékként leváltak a

BSR-reagens bevonat révén, amely a küvetta belső falán található, majd ezt követően 1 ml puffért adagoltunk az elegyhez. Az abszorpcióértékeket Quikread 3 analizálóberendezés segítségével mértük.

Ezt követően a BSR-anyagot határozott és pontos koncentrációjú puffermátrixszal hígítjuk, amely TrisHCl, Tris-bázis, nátrium-klorid, nátrium-azid és BSAtartalmú, így a BSR-reagenst állítjuk elő úgy, hogy a fenti anyagok koncentrációértéke a különféle alkalmazásoktól függően változhat, és természetesen a szárított reagens és a szárított reagens térfogatának is függvénye. Ezután a reagenst valamely analizálóküvetta belső falára szárítjuk, vagy porózus membránra szárítjuk. Az aktív reagens ugyanakkor nem rögzített, és ezt a folyékony minta hatása oldatba viszi.

A BSR fehéije-összetételét nagynyomású folyadékkromatográfía (HPLC) segítségével határoztuk meg. Az 1. ábrán bemutatjuk az SDS-PAGE futtatást 8-25%-os gélen (Laemmli). A minták az alábbiak: 1. STA-lectin (Sigma, Lót. 38F-3964), 2. BSR-minta (UA001), 3. HPLC FR1, 4. HPLC FR2, 5. HPLC FR3,

6. HPLC FR4, 7. HPLC FR5, 8. LMW (Pharmacia). A 2. ábrán bemutatjuk valamely BSR-minta HPLCfuttatását (Lót. UA001) G3000SWxl oszlop alkalmazásával. A detektálást 280 nm hullámhossz mellett végeztük. A frakció aktív komponensét agglitunálási tesztvizsgálattal vizsgáltuk.

A BSR aktív komponensének molekulatömege (180 kd) nagyobb volt mint az STA-lectin (Sigma, L-4266, lót. 38F-3864) főkomponensének molekulatömege (160 kd). Az STA-lectin (Sigma) mobilitása SDSPAGE gélen eltérő volt és 120 kd molekulatömegnek felelt meg, míg a BSR aktív komponense esetében ez 180 kd érték volt. A BSR-fehérje elegy 98%-a 15 kd és 32 kd proteint tartalmazott.

1. táblázat

Ν,Ν’,Ν’’-triacetil-kitotrióz által mért BSR-reagens kompetitív inhibiálóképessége

Kitotrióz (pg)	Aggregáció	Csapadékleválás
0	+ + +	+
50	+	+
100	+	-
150	±	-
200	-	-
250	-	-

A teszvizsgálat végrehajtása során Quikread 3 analizátorba illő BSR-reagens küvettákat alkalmaztunk, amelyekben 350 μg BSR-reagenst szárítottunk. Ezt követően a küvettákba 50 μΐ kitotriózt, majd ezt követően 20 μΐ EDTA-vérmintát pipettáztunk. A sejtek agglutinációját vizuálisan követtük. Az eredmények a BSRreagens viselkedését mutatják, és ezek megegyeznek az STE-lectin viselkedésével.

Stabilitás

A 2. táblázatban bemutatjuk a BSR-reagens küvetták stabilitását különféle hőmérsékletértékeken. A tárolási időtartamot BSR-reagens küvettákon vizsgáltuk, amelyeket Quikread 3 CRP-tesztvizsgálatban kívántunk alkalmazni. Az agglutinálást úgy vizsgáltuk, hogy a BSRreagens küvettákba 20 μΐ EDTA-vérmintát pipettáztunk.

2. táblázat

Hőmérséklet (°C)	Időtartam	Aktivitás
+4	>12 hónap	+ + +
R. T.	>12 hónap	+ + +
+37	> 12 hónap	+ + +
+50	>7 óra	+ + +
+75	>7 óra	+ + +
+ 100	>30 perc	+ + +

BSR-reagens küvetták Quikread 3 analizátorban való felhasználásra

A BSR-reagenst úgy állítjuk elő, hogy 500 mg liofilizált BSR (UA001), 87,5 ml desztillált víz és 12,5 ml puffer elegyét készítjük. Ezután a Quikread 3 analizátor gömbaljú akrilküvettáiba 50 μΐ reagenst adagolunk, majd ezt szobahőmérsékleten megszárítjuk.

A 3. ábrán bemutatjuk a Quikread 3 analizátorban alkalmazott csövet, amely egy kimutatóvonalat (1) és a cső falára szárított BSR-reagenst (2) tartalmazza.

Quikread 3 analizátorban alkalmazható BSR-reagens küvetták, amelyek membránlemezt tartalmaznak

Ahelyett, hogy a BSR-reagenst a küvetta falára szárítanánk, a reagens valamely porózus membránlemezre is impregnálható és szárítható a küvetta alján. A Quikread 3 berendezésben alkalmazott membrán lemezfelülete 50 mm². 10 μΐ BSR-reagenst, amely 21 mg/ml BSR- (Lót. UA001) tartalmú, impregnálunk és szárítunk a porózus membránt vagy szűrőt tartalmazó küvettákba. A 4. ábrán bemutatjuk a küvettát vagy a csövet, amely heparinnal kezelt mintavevő kapilárriscsövet (1), amely stacionárius térfogat bebocsátását biztosítja, tartalmaz, továbbá (2) kapillárisfedelet hordoz.

A kapillárist vérrel megtöltjük úgy, hogy a küvettát vízszintes helyzetben tartjuk. Amikor a kapilláris megtelik, a küvettát függőleges állásba helyezzük. Ezt követően a kapilláriserő következtében a (3) porózus membránlemez kiüríti a kapillárist. A membránlemezre a vérsejtek a BSR-reagens hatására csapadékként leválnak. Ezt követően a plazmát pufferküvettába történő adagolásával a lemezről leöblíthetjük.

A BSR-reagens alkalmazásának példái

1. példa

Különféle BSR-reagens alkalmazás mellett a csapadékleválasztás hatásossága A vérsejtek csapadékként történő leválasztásának hatásosságát három különféle alkalmazás összehasonlításával vizsgáltuk, amelyek az alábbiak: 1. alkalmazás: oldható BSR-reagens alkalmazása; 2. alkalmazás: a küvetta falára szárított BSR-reagens alkalmazása és 3. alkalmazás: porózus membránba impregnált, majd szá4 sa megtörténik. A fenti eljárással történő csapadékleválasztás még csak az örvénykeverés alkalmazását sem igényli.

rított BSR-reagens alkalmazása. Valamennyi alkalmazás esetében optimális koncentrációjú BSR-reagenst alkalmazunk. A csapadékleválasztási hatásosságot úgy mértük, hogy a csapadékleválasztásnak alávetett vérmintát körülbelül 1000 μΐ-re kiegészítő mennyiségű pufferrel hígítottuk, majd meghatároztuk A 520 nm hullámhossz mellett Quikread 3 analizátor segítségével az abszorpció értékét.

3. táblázat

Az azonos háttérrel mért BSR-reagens csapadékleválasztási kapacitása, illetve hatásossága

Idő (másodperc)	1. alkalmazás	2. alkalmazás	3. alkalmazás
0	0,117	0,011	0,024
20	0,117	0,011	0,021
40	0,112	0,011	0,022
60	0,109	0,012	0,023
80	0,109	0,010	0,024
100	0,110	0,010	0,024
120	0,107	0,011	0,024
140	0,105	0,011	0,024
160	0,107	0,011	0,023
180	0,106	0,012	0,023

A 2. alkalmazású szárított BSR-reagens és a 3. alkalmazású membrán-BSR-reagens a sejteket nagyobb mértékben csapadékként leválasztja, mint az 1. alkalmazású, oldható BSR-reagens. A 2. alkalmazás és a 3. alkalmazás esetében az abszorpcióértékek 5-10-szer alacsonyabbak. Az abszorpcióérték gyorsabban stabillá válik (20 másodpercen belül), amennyiben száraz BSRreagenst alkalmazunk a csapadékleválasztására. Amennyiben a csapadékleválasztást oldható BSR-reagenssel végezzük, az abszorpció néhány percen belül is változhat.

2. példa

A BSR-reagens csapadékleválasztási hatásosságának hisztológiai vizsgálata

Miután 20 μΐ vérmintából csapadékként a sejteket leválasztottuk, majd a mintát 1000 μΐ pufferrel hígítottuk, a mintát eltávolítjuk és kristályos violával színezzük, majd Bürker-kamrával mikroszkóp alatt számláljuk. A leukocitákat és a vörösvértesteket külön számoljuk ugyanazon mintatérfogat esetében. Az 1. alkalmazás esetében az oldható BSR-reagens a sejteket kevésbé hatásosan választja le, mint a 2. alkalmazás esetében alkalmazott száraz BSR-reagens vagy a 3. alkalmazás esetében alkalmazott membrán BRS-reagens. A leukociták relatív aránya 200-szoros mértékben növekedett. A 2. alkalmazás esetében a száraz BSR-reagens valamennyi leukocitát leválasztotta, azonban a felúszóban kis mennyiségű vörösvértest található. A leghatásosabb csapadékleválasztás a 3. alkalmazás esetében a membrán-BSR-reagens alkalmazásakor tapasztalható, amely esetben valamennyi sejt leválasztá4. táblázat

BSR-reagens csapadékleválasztási hatásossága

	1. alkalmazás	2. alkalmazás	3. alkalmazás
Örvénykeverés ideje	30 másodperc	10 másodperc	0
Inkubálás ideje	210 másodperc	30 másodperc	0
Vörösvértest χ 10'³/ml	206	7	0
Leukocitax 10 ³/ml	40	0	0

3. példa

Teljes vérminta CRP-meghatározása Quikread 3 analizátor segítségével

Anyagok:

- BSR-reagens küvetták

- Anti-CRP-latex

- QR-CRP reakciópuffer (Orion Diagnostica)

Mérés alkalmazása:

μΐ EDTA/heparin kezelt vérmintát pipettázunk gömb alakú aljzattal rendelkező BSR-reagens küvettába. A sejteket vagy örvénykeveréssel, vagy a cső forgatásával csapadékként leválasztjuk. A csapadékleválasztása után a BSR-reagens küvettába 1000 μΐ reakciópuffert adagolunk. A mintát enyhén keverjük a küvettában, majd 3 percen át 40 °C hőmérsékleten inkubálóedényben inkubáljuk, amely inkubálóedény a Quikread 3 analizátor része. Az inkubálás után a küvettát a leolvasóüregbe helyezzük a háttérabszorpciómérés céljából. Ezután 50 μΐ anti-CRP-reagenst adagolunk a mintához, majd a mintát örvénykeverésnek vetjük alá, és ezután 3 percen át inkubáljuk. Ezt követően turbidimetriás végpontmérést végzünk.

Az 5. ábrán bemutatjuk az összehasonlító eredmények értékeit, amelyeket úgy nyertünk, hogy a CRP-meghatározást vagy Quikread 3 berendezéssel (X-tengely), vagy Cobas Mira berendezéssel végeztük. A Quikread 3 meghatározások esetében teljes vérmintákat és BSR-reagens csöveket alkalmaztunk. A CobasMira meghatározások esetében a fenti betegektől származó vérmintákat alkalmaztunk és olyan tesztvizsgálati körülményeket, amelyek alkalmasak az Orion Diagnostica immunoturbidimetriás (IT) eljárásában történő felhasználásra.

4. példa

Turbox analizálóval végzett teljes vérminta CRPmérés

Anyagok:

- BSR-reagens küvetták

- CRP-antiszérum (Orion Diagnostica)

- CRP Turbox kalibrátor (Orion Diagnostica)

- Turbox CRP reakcióelegy-puffer (Orion Diagnostica)

A mérés alkalmazása:

μΐ EDTA/heparin kezelt vérmintát pipettázunk két BSR-reagens küvettába, amelyeket a Turbox leolvasóüregbe illesztettünk. A sejteket vagy a minták örvénykeverésével, vagy a csövek rotációjával csapadékként leválasztjuk. Ezt követően az egyik csőbe 500 μΐ reakciópuffert adagolunk abból a célból, hogy a minta háttérértékét meghatározzuk. Ugyanilyen mennyiségű, azaz 500 μΐ antiszérumoldatot adagolunk a másik csőbe. A csöveket 30 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd mindkét csőben a CRP-koncentrációt Turbox analizátorban meghatározzuk. A berendezéssel a CRP-koncentrációt mérhetjük standard görbére vonatkoztatva, amelyet mágneses lemez rögzít.

Az 5. táblázatban bemutatjuk a Turbox CRP (Orion Diagnostica) meghatározások eredményeit 50 μΐ teljes vérminta alkalmazása esetében, amely mintákat BSRreagens küvettákban alkalmaztunk, illetve 30 μΐ plazmaminták alkalmazásával Turbox küvetták esetében. A csapadékként leválasztott teljes vérminta hatóanyag nélküli mérés (BL)-LSU (fénytörésegység) értékek azonos mértékűek voltak, mint amelyeket ugyanezen betegek esetében nyert plazmaminták mérésekor tapasztaltunk. A teljes vérmintában (50 μΐ) a plazma aránya átlagosan 30 μΐ érték. Ezután a nyert CRP-eredményeket korrelációs vizsgálatban vizsgáltuk, összehasonlítva a teljes vérminta és a plazmamintaértékeket, és ez az eredmény jó korrelációt mutatott.

5. táblázat

Minta	Teljes vérminta	Plazma
BL-LSU	CRPmg/1	BL-LSU	CRP mg/1
1	61	50	43	50
2	75	<10	75	<10
3	78	65	285	50
4	153	<10	195	<10
5	71	<10	111	<10
6	65	51	61	54

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

1. Analitikai küvetta vagy cső, amely alkalmas teljes vérminta plazmafrakciójában lévő analitikumok mérésére, melynek során a vérkomponensek agglutinációját használjuk fel a plazma elkülönítésére, azzal jellemezve, hogy a küvetta vagy cső belső felülete burgonyából extrahált agglutinint tartalmazó, szárított reagenssel van bevonva, vagy a küvetta vagy cső belsejében lévő porózus membránlemez van a fenti reagenssel bevonva.

2. Az 1. igénypont szerinti analizálóküvetta vagy -cső, azzal jellemezve, hogy a küvettában vagy csőben található membránlemez mobilis vagy immobilis.

3. Az 1. igénypont szerinti analizálóküvetta vagy -cső, azzal jellemezve, hogy egy heparinnal kezelt kapillárist tartalmaz, amelyen keresztül a vérminta a fenti küvettába vagy csőbe szívható.

4. Az 1. igénypont szerinti analizálóküvetta vagy -cső, azzal jellemezve, hogy méretei alkalmasak kis mennyiségű vérminta vételére, amely mennyiség 1 μ1-100 μΐ közötti.

5. Az 1, igénypont szerinti analizálóküvetta vagy -cső, azzal jellemezve, hogy a burgonyából extrahált agglutinin egy termikusán stabilis agglutinin.

6. Az 1. igénypont szerinti analizálóküvetta vagy -cső, azzal jellemezve, hogy a burgonyából extrahált agglutinin az N-acetil-D-glükózamin-oligomerekre specifikus hatású, így az eritrociták, leukociták és trombociták agglutinációját okozza.

7. Az 1. igénypont szerinti analizálóküvetta vagy -cső, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott agglutinin tisztítatlan burgonyaagglutinin (BSR) vagy tiszta STAlectin, vagy bármely más lectin, amely sejteket agglutinál, azonban nem kötődik az analizálandó plazmakomponensekhez.

8. Az 1. igénypont szerinti analizálóküvetta vagy -cső, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott agglutinin egy specifikus BSR-reagens.

9. Eljárás teljes vérminta plazmafrakciójában lévő analitikumok meghatározására, azzal jellemezve, hogy

-a teljes vérmintát egy 1-8. igénypontok bármelyike szerinti analizálóküvettába vagy -csőbe visszük, majd

- az agglutinált vérsejtek jelenlétében az analitikumok mennyiségét meghatározzuk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vérmintát alkalmazunk, amely antikoaguláns szert tartalmaz.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antikoaguláns szerként EDTA-t, heparint vagy hasonló anyagot alkalmazunk.

12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a plazmafrakciót diagnosztikai tesztvizsgálatokban alkalmazzuk.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy diagnosztikai tesztvizsgálatként immunometriás és kolorimetriás tesztvizsgálatot, valamint gyors tesztvizsgálatot, a tesztvizsgálati szalagok alkalmazásával végzett vizsgálatokat is beleértve, alkalmazunk.

14. Tesztvizsgálati készlet teljes vérminta plazmafrakciójában lévő analitikumok meghatározására, azzal jellemezve, hogy csomagolt formában legalább egy analitikai küvettát vagy csövet tartalmaz, amely küvetta (küvetták) vagy cső (csövek) belső felülete burgonyából extrahált agglutinint tartalmazó szárított reagenssel van bevonva, vagy amely küvetta (küvetták) vagy cső (csövek) belsejében lévő porózus membránlemez van a fenti reagenssel bevonva.