MXPA99003697A - Uso de anticuerpos de hemoglobina, anti embriónicos, para identificar células fetales - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método in vitro para identificar o aislar las células fetales de una muestra de sangre. Se identifican eritrocitos o eritroblastos usando un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico para hemoglobina embriónica o una cadena de hemoglobina embriónica. Una vez que se identifican las células fetales,éstas se pueden tratar para hacer que losácidos nucleicos o las proteínas se utilicen para la identificación o amplificación. La detección de la presencia o existencia deácidos nucleicos o proteínas seleccionados permite un diagnóstico cuantitativo o de calidad, o una evaluación prenatal, incluyendo la determinación del sexo del feto, la determinación cromosómica, anormalidades en un gen o en la proteína y determinar la presencia o ausencia de genes particulares,ácidos nucleicos o proteínas.

Description

USO DE ANTICUERPOS DE HEMOGLOBINA, AN I EMBRIONICOS, PARA IDENTIFICAR CÉLULAS FETALES La presente invención se refiere a un método para separar y reconocer células fetales en una muestra de sangre. Más particularmente, se refiere al aislamiento y el reconocimiento de eritrocitos o eritoblástos nucleados, fetales en las células de la madre," en una muestra de sangre de una mujer embarazada. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En tejido del feto, y en particular los cromosomas y el ADN del feto, normalmente se usan para el diagnóstico prenatal y para otros procedimientos médicos, que requieren un diagnóstico preciso del genoma del feto. Normalmente, el tejido fetal se obtiene mediante el uso de amniocentesis, con una muestra de velo criónico (CVS) , por fetoscopia o cordocentesis, tal y como se describe en Thompson y Thompson Genética en la Medicina, 5° edición, W.B. Saunders Co . , Philadelphia, 1991. En la amniocentesis, la muestra de fluido amniótico, que contiene células del feto, se remueve transabdominalmente desde la madre con una aguja y una jeringa. La amniocentesis tiene un riesgo asociado inherente. El riesgo principal es la inducción a la pérdida del producto, lo que se estima que ocurre en 1 de 200 amniocentesis. Otro riesgo incluye la infección de la madre y el daño físico en el feto. En la CVS, el tejido del trofoblasto se aspira desde el área vitelina de corio transcervical o transabdominal . El promedio de la pérdida fetal por este método puede ser tan alto como 1 en 100. La toma de la muestra de sangre umbilical por cordecentesis o de forma percutánea, proporciona un método para obtener sangre del feto directamente desde el cordón umbilical con una guia ultrasónica. Cada uno de estos métodos invasivos tiene un riesgo tanto para la madre como para el hijo. De acuerdo con esto, se desearla tener un método no invasivo para obtener el tejido o el ADN fetal. También sería deseable tener un método que aislara rápida y confiablememte el tejido fetal del tejido materno, para así facilitar el análisis y el diagnóstico prenatal en laboratorios clínicos. Recientemente, la metodología preferida ha sido la identificación de las células fetales en la circulación materna periférica y luego reunir estas células para el análisis genético. La identificación y el aislamiento de las células fetales de la sangre de la madre ha dependido de distinguir una población rara de células fetales en las células maternas más prevalecientes. A pesar de que se han utilizado varios tipos de células fetales, como por ejemplo linfocitos y trofoblastos,~ el proceso de identificación de células objetivo del ADN fetal, se han dirigido más esfuerzos para identificar los glóbulos rojos nucleados del feto (nRBC) , que también se conocen como eritrocitos nucleados . Ver Cheuh y Golbus, "The search for fetal cells in the maternal circulation", J.. Perinatol. Med., 19:411 (1991); Simpson y colaboradores, "Noinvasive Screening for Prenatal Genetic Diagnosis" Bull. WHO, 73:799 (1995); Cheuh y Golbus, "Prenatal Diagnosis Using Fetal Cells from Maternal Circulation", West J. Med., 159 (3): 308 (1993). Los glóbulos rojos de la sangre cruzan la placenta como resultado de un sangrado transplacental . Ya que el feto tiene un gran número de eritrocitos nucleados, los cuales rara vez se encuentran en la sangre de un adulto, la diferencia en la nucleación se utiliza para la separación e identificación de las células del feto y de la madre. Los anticuerpos a los antígenos en la superficie de la célula particularmente a nRBC, como el receptor de transferina, se han utilizado para identificar y enriquecer las células del feto. Ver Bianchi y colaboradores "Isolation of fetal ADN from Nucleated Erythrocytes en Maternal Blood", Proc, Nati, Acad, sci, 87:3279 (1990) . También ver Bianchi y colaboradores, solicitud internacional de PCT No. PCT/US90/06623 (WO 91/07660), en la que se describe un método para enriquecer los glóbulos rojos de la sangre nucle dos, fetales, de una muestra de sangre periférica mediante el uso de un anticuerpo que se une al antígeno en la superficie de la célula fetal. Bresser y colaboradores, en la Solicitud Internacional de PCT No. PCT/US94/08342 (WO 95/03431) describe el uso de anticuerpos de hemoglobina fetal y probetas de mARN para enriquecer las células en la sangre de la madre. La presencia de hemoglobina fetal ha sido demostrada mediante la reacción Kleihauer-Bet e, la cual diferencia la hemoglobina de un feto de la de un adulto mediante las características de elusión acida. Ver Kleihauer y colaboradores, "Demostration von fatale hamoglobin en den erythrocyten eines blutausstrichs", Klin, Woschenschr, 35:637 (1957) y Saunders y colaboradores, "Enrichment of fetal cells from maternal blood for genetic analysis" American Journal of Human Genetics, 57:287 (1995). El análisis genético del genoma fetal se ha logrado mediante la hibridación fluorescente in situ (FISH correspondiendo a sus siglas en inglés) de probetas con un cromosoma o gene específico de ADN o 7ARN, algunas veces con lectura automática, y por la amplificación de genes o ADN fetal. Ver Lichter y colaboradores "Rapid detection of human chromosome 21 aberration analysis using fluorescence in situ hybridization", Proc. Nati. Acad. Sci, 85:9664 (1988); O'Kelley y colaboradores., "Instru entation for genetic evaluation of fetal cells from material blood", Am. J. Hum. Genet, 57:286 (1995); y Lo y col boradores, "Prenatal Sex Determination by DNA amplification from maternal peripheral blood", Lancer, 2:1363 (1989). SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para identificar eritrocitos fetales, preferiblemente nucleados, o una célula eritoblasto en una muestra de sangre, el método comprende : a) poner en contacto la muestra de sangre con un anticuerpo, o con un fragmento de anticuerpo, directo en una porción de hemoglobina del embrión, en donde el anticuerpo o su fragmento se enlazará con la célula fetal; y b) identificar las células que se unen al anticuerpo o al fragmento como eritrocitos nucleados fetales o células eritroblastos . (Típicamente, la muestra de sangre se toma de sangre materna que circula en la periferia durante la gestación) . Por lo tanto, en este método se pueden usar varios anticuerpos de hemoglobina, anti embriónicos, o fragmentos de anticuerpo, preferiblemente aquellos dirigidos a la cadena de globina épsilon del embrión y/o a la cadena globina zeta embriónica de, hemoglobina. Además, se pueden utilizar marcadores secundarios de células maduras o fetales para identificar o aislar las células fetales deseadas. Una vez que se identifican las células fetales seleccionadas, el ácido nucleico fetal o proteína se puede amplificar o detectar dentro de la célula para el análisis genético . La invención también proporciona varios equipos para usarlos junto con los métodos que se describen a continuación. Estos equipos comprende anticuerpos de hemoglobina, anti embriónicos, etiquetados directa o indirectamente y las instrucciones para su uso. También, opcionalmente, incluido en el equipo, hay medios de gradiente de densidad para enriquecer la concentración de las células fetales, reagentes de hemolisis para romper las células de glóbulos rojos, agentes de lisian y probetas de ácido nucleico . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN ESPECÍFICAS A menos que se especifique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se emplean en el presente tienen el mismo significado que el conocido por los expertos en la técnica, a la cual pertenece la invención. A pesar de que se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en la presente, para la práctica y la prueba de la invención, se mencionan los métodos y materiales preferidos. Para el propósito de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos . De acuerdo con el uso en la presente, "eritrocito" o "glóbulos rojos de la sangre" o "RBC" incluye los glóbulos rojos de la sangre y pueden ser nucleares o no nucleares. Se prefieren los eritrocitos nucleares. De acuerdo con el uso en la presente, "eritroblasto" significa una célula precursora nucleada a partir de la cual se desarrolla un reticulocito en un eritrocito. "Normoblasto" se refiere a un glóbulo rojo de la sangre, nucleado, el precursor . inmediato de un eritrocito. Según se utiliza en la presente, "embrionario" se refiere a las células desde la concepción hasta el segundo mes de gestación. Típicamente, las etapas de desarrollo después de la etapa embrionaria hasta el nacimiento se define como fetal. Las células de la sangre del feto son células raras que circulan_ en el torrente sanguíneo materno. Se cree que las células fetales se "cuelan" hacia el flujo sanguíneo materno a través de la placenta. Los estimados de la frecuencia de este raro evento varía, pero se ha reportado que es de aproximadamente 1 en 108 células; Holzgreve W. y sus colaboradores, Lancer (1990) i: 220. Durante la etapa temprana del período de gestación, los glóbulos rojos de la sangre del feto pueden ser nucleados. Así, a diferencia de los eritrocitos fetales que no son nucleados, estos contienen ADN fetal y se pueden usar para el análisis genético del feto sin la necesidad de procedimientos invasivos. Ontogenia de la hemoglobina Aproximadamente el 99% de la hemoglobina de los adultos está compuesta por dos cadenas alfa y dos cadenas beta con aproximadamente un 1% que comprende dos cadenas alfa y dos cadenas delta. La hemoglobina del feto contiene dos cadenas alfa y dos gama. Tres hemoglobinas embriónicas, tempranas, se construyen con cadenas zeta (similar a la alfa) y épsilon (similar a la beta) . El Gower embriónico 2 se hace de hasta dos cadenas alfa y dos cadenas épsilon, mientras que la hemoglobina del Gower embriónico 1 se hace de hasta dos cadenas zeta y dos cadenas épsilon, y la hemoglobina Portland consta de dos cadenas zeta y dos cadenas gama. Ver Gale y sus colaboradores, Nature, 280:162 (19979); y Maniatis y sus colaboradores Ann Rev genetics, 14:145 (1980) . Por medio de la presente invención, se ha demostrado que las cadenas de globina embrionaria aún están presentes en los RBC fetal hasta aproximadamente 22 semanas de gestación, a pesar de que ya no está presente el mensajero ARN. Preferiblemente, estas cadenas se detectan desde aproximadamente 9 hasta aproximadamente 20 semanas mensuales.

Eventualmente, el feto cambia y produce hemoglobina fetal, que es aproximadamente 1% de la hemoglobina en un adulto. No hay hemoglobina embrionaria en los RBC de los adultos. Anticuerpos de Hemoglobina Se puede distinguir las diversas hemoglobinas específicas utilizando anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos para los sitios de antígeno de la cadena de hemoglobina. Los anticuerpos contra los globina adultos (alfa y beta) , a la globina fetal (gama) y a la. globina épsilon embrionario están comercialmente disponibles. La Chemical and Scientific Corporation (Westbury, NY) y Cortex Biochem (San Leandro, CA) suministran el anticuerpos de globina épsilon. Se pueden usar un número de inmunogenos para producir anticuerpos que reaccionan específicamente con las proteínas de la cadena de hemoglobina. La proteína recombinante es el inmunogeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. Naturalmente, ocurre una proteína que también se puede usarse en forma pura o impura. Los péptidos sintéticos hechos utilizando la secuencia del aminoácido proteína de la cadena de hemoglobina también se pueden usar como un inmunogeno para la producción de anticuerpos contra las proteínas. La proteína recombinante se puede expresar como células eucarioticos o procariotico, y purificados. Luego, la producción se inyecta en un animal capaz de producir anticuerpos. Los métodos de producción de los anticuerpos policlonales son bien conocidos por los expertos en la técnica. En resumen, un inmunogeno, preferiblemente una proteína purificada, se mezcla con un adyuvante y se inmuniza al animal. La respuesta inmune del animal a la preparación del inmunogeno se controla al tomar pruebas de sangre y determinar el titer de la reactividad. Cuando se obtienen titer altos, apropiados, del anticuerpos contra el inmunogeno, se recolecta la sangre del animal y se prepara el antisuero. Además, si se desea se puede hacer la separación del antisuero para enriquecer el reactivo de los anticuerpos para la proteína. Ver Harlow y sus colaboradores, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988) . Se pueden obtener los anticuerpos monoclonales mediante diversas técnicas conocidas para los expertos de la técnica. Brevemente, las células del bazo de un animal inmunizado con el antígeno deseado se inmortaliza, comúnmente por la fusión con una célula de mieloma. Ver Kohler y sus colaboradores, Eur. J. Immunol, 6:511-519 (1976). Métodos alternativos de inmortalización incluyen la transformación con virus de Epstein Barr, oncógenos o retroviruses u otros métodos bien conocidos en la técnica. Las colonias que surgen desde las células inmortalizadas simples se analizan para la producción de los anticuerpos de la especificidad y la afinidad deseada para el antígeno, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por estas células se puede mejorar mediante varias técnicas, incluyendo la inyección en la cavidad peritoneal el vertebrado huésped. Alternativamente, se pueden aislar la secuencia de ADN que codifica el anticuerpos monoclonal o un fragmentos de enlace mediante el análisis de la librería del ADN de las células B humanas de acuerdo con el protocolo general señalado por Huse y sus colaboradores, Science, 246:1275-1281 (1989). Los diversos componentes o fragmentos de los anticuerpos se pueden usar en la presente invención. Las diversas regiones de la inmunoglobulina son las porciones que proporciona la especificidad del reconocimiento del antígeno. En particular, la especificidad reside en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) , también se conoce como las regiones hipervariables, de las inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas pueden existir en una variedad de formas, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab, F(ab'), F(ab') y otros fragmentos, así como las cadenas simples. Ver Huston y sus colaboradores, Proc, Nat, Acad. Sci, USA, 85:5879-5883 (1988) y Bird y sus colaboradores, Science 242: 423-426 (1988) . Ver, generalmente, Hood y sus colaboradores, Immunology, Benjamín, N.Y, 2 de (1984), y Hunkapillery Hood, Natures, 323;15-16 (1986). También se pueden usar, los anticuerpos de cadena simple, en donde los genes para una cadena pesada y para una cadena simple se combinan. También el polipéptido de inmunoglobulina encierra una cadena de inmunoglobulina truncada, por ejemplo, una cadena que contiene menos dominios de la región constante que el polipéptido nativo. Estos polipéptidos truncados se pueden producir por los métodos normales, como por ejemplo la introducción de un codón de detención en la secuencia del gene 5' de la secuencia dominante que se borran. Luego, los polipéptidos truncados se pueden ensamblar en anticuerpos truncados. Los anticuerpos como se usan en el presente también incluyen anticuerpos bispecíficos que se pueden producir mediante los métodos descritos en la siguientes referencias: Glennie y sus colaboradores, J Immunol, 139:2367-2375 (1987); Segal y sus colaboradores, Biologic Therapy of Cáncer Therapy of Cáncer Updates, 2 (4) : 1-12 (1992); y Shalaby y sus colaboradores, J. Exp,. Med, 175:271-225 (1992) . También se pueden producir inmunoglobilinas monoespecíficos y biespecíficos mediante las técnica recombinantes en células huéspedes procarioticas o eucarioticas . Los anticuerpos "quiméricos" se codifican mediante genes de inmunoglobulina que se elaboran con ingeniería genética de forma que los genes de cadena pesada o ligera se componen de segmentos de genes de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpos monoclonal de ratón se pueden unir con segmentos constantes humanos (C) . Estos anticuerpos quiméricos son menos antigénicos para los humanos que los anticuerpos con regiones constantes en el ratón así como las regiones variables en el ratón. De acuerdo a como se usa en el presente, el término anticuerpo quimérico también se refiere a un anticuerpos que incluyen una inmunoglobulina que tiene una estructura similar a la humana y en la cual cualquier región constante presente tiene al menos aproximadamente 85-90%, y preferiblemente aproximadamente 95% de la secuencia de polipéptido igual a la región constante de inmunoglobulina humana, conocida como inmunoglobulina "humanizada". Ver, por ejemplo, la publicación de la PCT WO 90/07861. Así, todas las partes de esta inmunoglobulina "humanizada", excepto las regiones determinadas como complementarias (CDR) , son substancialmente iguales a las- partes correspondientes de una o más secuencias humanas nativas. Donde sea necesario, los residuos de la estructura se pueden reemplazar con aquellos en o a través de las especies especialmente si se encuentra que ciertos residuos de la estructura afecta la estructura de las CDR. Un anticuerpo quimérico también puede contener regiones constantes o truncadas variables .

El término "región de la estructura", como se una en la presente, se refiere a aquellas porciones de las regiones variables de la cadena de inmunoglobulina ligera o pesada que están relativamente conservadas (es decir, que no son CDR) entre inmunoglobulina diferentes en especies simples, como los define Kabat y sus colaboradores, Sequences of Proteins of Immunologic Interest, 4o edi, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EUA (1987) . De acuerdo a su uso en la presente, la "región de la estructura similar a la humana" es una región de la estructura que, en cada cadena existente, comprende al menos aproximadamente 70 o más residuos de aminoácidos, típicamente 75 u 85 o más residuos, , iguales a los residuos en la inmunoglobulina humana. Las secuencias de ADB con región constante humanas se pueden aislar de acuerdo con los procedimientos bien conocidos de una variedad de células humanas, pero, es preferible hacerlos de células B inmortalizadas. Las regiones variables o CDR para producir inmunoglobulina quimérica de la presente invención se pueden derivar de forma similar a partir de anticuerpos monoclonales capaces de unirse a la hemoglobina embrionaria o sus cadenas y se producirán en cualquier sistema conveniente en mamíferos, incluyendo ratones, ratas, conejos, líneas de células humanas u otros vertebrados capaces de producir anticuerpos por los métodos conocidos. Las regiones variables o CDR pueden producir sintéticamente, mediante los métodos normales de recombinación incluyendo la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) o a través de las librerías de presentación de bacteriófago. Para los métodos de presentación de bacteriófagos, ver, por ejemplo McCafferty et al. Nature, 348:552-554 (1990); Clackson et al, Nature, 352:624-628; y Marks et al, Biotechnology, 11:1145-1149 (1993). Se pueden utilizarlos sistemas procarióticos como bacteria, levadura y bacteriófago . " Las fuentes adecuadas de células para las secuencias de ADN u células huéspedes para la expresión de inmunoglobulina y la secreción se pueden obtener de un número de fuentes, como la Colección de Cultivos de Tipo Americano ("Catálogo de líneas celulares e Hibridomas, quinta edición (1985), Rockville, Maryland EUA) , Además de las inmunoglobulinas quiméricas y "humanizadas" específicamente descritas en el presente, se pueden diseñar y producir otras inmunoglobulinas modificadas substancialmente idénticas, utilizando varias técnicas recombinantes de ADN que se conocen bien en la técnica. En general, las modificaciones de los genes se pueden lograr, fácilmente mediante una variedad de técnicas bien conocidas, como por ejemplo PCR y mutagéneses directa en sitio. Ver Gillman y Smith, Gene, 8:81-97 (1979) y Robets et al, Nature, 328:731-734 (1987) .

Alternativamente, se pueden producir los fragmentos de polipéptidos comprenden solamente una porción de la estructura de inmunoglobulina primaria. Por ejemplo, es deseable producir fragmentos de polipéptido de inmunoglobulina que posean una o más actividades de inmunoglobulina adicional al reconocimiento de antígenos (por ejemplo fijación complementaria). Etiquetas Los anticuerpos o los fragmentos se puede etiquetar directa o indirectamente para su aislamiento e identificación. Las etiquetas adecuadas incluyen radionúclidos, encimas, substratos, cofactores, inhibidores, fluorescentes quemiluniscentes, partículas magnéticas, tintes y similares. Ver las Patentes de los Estados Unidos 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,227,437; 4,275,149 y 4,366,241. También se incluyen los grupos de reporteros, como por ejemplo, biotina, con enlaces a grupos como estreptavidina o ayidinas, que a su vez se unen directa o indirectamente con la encimas, como por ejemplo fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábann picante. Los fluorescentes o fluorocro as incluyen fluorescentes, cumarina, rodamina, ficoeritrina, cloro de ácido sulforodamina (rojo de Texas) y similares . Estas etiquetas detectables se han desarrollado muy bien en el campo de la invención y, en general, se pueden aplicar la mayoría de las etiquetas. Preferiblemente, se utilizan las encimas o fluorescentes. Muestran se sangre El método de acuerdo con la presente invención preferiblemente utiliza muestras de sangre de la madre durante la gestación; sin embargo, se puede usar cualquier otra fuente de células fetales además de las aisladas o identificadas en la circulación de la madre. El tejido fetal se puede obtener vía amniocentesis, CVS, fetoscopía o cordocentesis para el análisis que se describió. En otros casos en donde la sangre de la madre en la fuentes de células fetales, la muestra de sangre puede ser una toda la sangre o un componentes fraccionado de la sangre que contiene células eritrocitos o eritroblastos de selección en una capa de células mononucleares. Típicamente, la fuente de sangre se prepara para enriquecer la concentración de células fetales antes y/o después de usar el anticuerpo de hemoglobina antiembriónica del método reivindicado. Además, la muestra de sangre se puede suspender, secar al aire, o fijar químicamente en una matriz sólida antes de ponerse en' contacto con --el anticuerpo. A pesar de que cualquier madre o feto de mamíferos se puede considerar como una fuente de tejido fetal, se prefiere una fuente humana. También se prefieren otros mamíferos domésticos, como por ejemplo perros, gatos, vacas, caballos y similares. Gradientes de densidad en los métodos de enriquecimiento Además de la fractura de la sangre, los métodos para el aislamiento o enriquecimientos de las células de la sangre se han descrito usando gradientes de densidad que contienen células agregadas o agentes aglutinantes como metilcelulosa, Isopaque™, detran y Ficoll™, como se describe en Boyu , Scand J. Clin, Lab, Invst., 21 (supl 97) : 31-50 (1968), y en Bhat N. M. J, Immnol. Meth, 158:277-280 (1993). Isopaque™ es N-metil-3, 5, -diacetamino-2, 4, 6-triiodocenzoato de sodio, como se describió en Boyum, Ficoll™ (de Accurate Chemical y Scientific Corporation, Westburry NY) es un ----alto polímero sintético hecho por copolimerización de sucrosa y epiclorohidrona. Las moléculas tienen una estructura ramificada con un alto contenido de grupos hidroxilos que dan una solubilidad en un medio acuoso. Muchos de estos agentes son libremente difusibles. Estos agentes causan la aglutinación de los eritrocitos, y así los métodos proporcionados para aislar los leucocitos de los glóbulos rojos. Sin embargo, bajo estas condiciones de células agregadas, los glóbulos rojos nucleados fetales se puede quedar atrapados físicamente dentro de un grupo de glóbulos rojos de la madre, agregados, y por lo tanto se sedimentarán con los eritrocitos maternos, mientras que el promedio de la densidad del aglutinante determina sus características de sedimentación . Los gradientes de densidad Percoll se describen en Rennie et al, Clinical Chemica Acta, 98:119-125 (1979) y en Vicente y Nadeau, Anal Biochem, 141:322-328 (1984). En el estudio de Rennie, el gradiente de densidad de Percoll isotónico se uso para envejecer eritrocitos fraccionados. Se retiraron los leucocitos (glóbulos blancos) antes del proceso de centrifugación, mientras se co-fraccionan con los eritrocitos en condiciones de gradiente isotónico. Gansher-Ahler et a, Am J. Obstet. Gynecol., 1350-1355 (1992) y la publicación de la PCT Wo93/23754, describe un método para enriquecer los eritrocitos fetales utilizando un gradientes de triple densidad en la sangre materna completa, seguido por el uso de un receptor de transferina para enriquecer los glóbulos rojos nucleados. Se requiere una citometría de- flujo' o una separación magnética _ para enriquecer las células etiquetadas . Como se nota en la referencia Ganshert-Ahler, el uso de un receptor de transferina no proporciona una identificación' confiable de las células fetales en la población de células maternas circulantes . Un método preferido para aislar los glóbulos rojos nucleados fetales, aislados, de la población materna comprende los pasos de centrifugar la muestra de sangre en un primer recipiente de centrifugado para obtener una fracción de glóbulos rojos; transferir la fracción de glóbulos rojos a una porción superior de un segundo recipiente de centrifugado, el segundo recipiente de centrifugado tiene un medio de gradiente de densidad que consta de un coloide dispersado en un gel que se puede derretir, en donde el coloide es capaz de mantener a los glóbulos rojos en un estado substancialmente sin cambios; hemolizar los eritrocitos materno en la fracción de glóbulo rojo para obtener una fracción de eritrocito enriquecida; fundir o derretir el gel; centrifugar la fracción de eritrocito enriquecida a través de un medio de gradiente de densidad para obtener una fracción enriquecida en eritrocitos nucleados fetales. Ver la Patentes de los Estados Unidos 5,432,054. El primer paso de centrifugado proporciona un enriquecimiento inicial que separa la fracción de glóbulo rojo nucleado_ de baja densidad y todos los glóbulos blancos de los glóbulos rojos, sin núcleo, más densos, y del suero, así como de las proteínas de suero. Preferiblemente, el primer tubo de^ centrifugado se hace de plástico suave, con el objetivo de facilitar el movimiento de los glóbulos blancos en el tubo. Los tubos adecuados se describen en la Patentes de los Estados . Unidos 5,422,018. Se prefieren los tubos con forma de cristal de reloj, de plástico, apoyados dentro de la centrifugadora para evitar que el tubo se deforme en exceso o se colapse en las porciones del canal central. El soporte se puede proporcionar por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, se puede envolver, alrededor del tubo, un soporte que se retire. En la forma de realización preferida, el tubo se apoya en un medio de soporte líquido dentro de un recipiente más grande, como un tubo de ensayo. El nivel de líquido es suficiente para cubrir una porción estrecha del tubo. Preferiblemente, el peso de volumen del medio de soporte líquido desplazado por el tubo de la muestra es aproximadamente equivalente al peso del volumen del tubo de la muestra y su contenido. El medio de soporte líquido preferido para el uso es agua. Después del primer paso de centrifugado, se obtienen una fracción que contiene glóbulos rojos nucleados. Esta fracción también incluye glóbulos blancos. La parte superior del tubo contiene fracciones de plasma. Los glóbulos rojos nucleados, que son más densos que el plasma pero menos densos que los otros glóbulos rojos, se fraccionarán por encima de los glóbulos rojos justo debajo del plasma y se mezclarán, de manera variable, con los glóbulos blancos. El uso de un primer tubo de centrifugado, calibrado, permite la fácil extracción de la fracción relevante de la porción estrecha del primer tubo, por lo que minimiza la inclusión de otras fracciones de sangre, incluyendo suero y plasma del primer paso de centrifugado. La fracción que contiene glóbulos rojos y glóbulos blancos se pueden hemolizar para romper diferencialmente, los glóbulos' rojos de la madre. La hemolisis diferencial de los glóbulos rojos de la madre permite la destrucción de un número significativo del resto de los glóbulos rojos de la madre mientras se preserva la mayoría de las células fetales. Ver Boyer et al, Blood, 47(6): 883-897 (1976). La hemolisis diferencia puede ocurrir en cualquier recipiente de reacción adecuado. En una forma de realización preferida, la hemolisis diferencial de los glóbulos rojos de la madre ocurre en la porción superior del segundo recipiente de centrifugación, de forma que la reacción de hemolisis se puede detener al centrifugar los productos de la reacción, es decir, los glóbulos rojos preservados, en un medio de gradiente de densidad, para así retirar los glóbulos rojos de los reagentes hemolíticos. La hemolisis diferencial utiliza el factor de que los glóbulos rojos se puede romper en soluciones que contienen agentes de hemolisis como amonio (NH4-) e iones de bicarbonato' (HC03) . La rumptura de las células se puede desacelerar mediante inhibidores de encimas de anhidrasa carbónica. Los niveles de anhidrasa carbónica son al menos cinco veces más altos en los eritrocitos humanos que en los eritrocitos fetales. Así, el promedio de hemolisis mediada de NH4-HC03 es menor para los glóbulos rojos fetales, incluyendo los glóbulos rejos nucleados, fetales, que para los glóbulos rojos de _lqs adultos, particularmente en presencia de inhibidores de anhidrasa carbónica. Los inhibidores de anhidrasa carbónica preferidos para el uso en la invención incluyen acetazolamida, etoxizolamida ( 6-etoxizolamida, de Sigma Chemical CO) y metoizolamida. La hemolisis diferencial en una población de glóbulos blancos junto con glóbulos rojos da como resultado glóbulos rojos enriquecidos. La fracción de glóbulos rojos fetales, enriquecidos luego se centrifugan a través del medio de gradiente de densidad para recolectar la fracción enriquecida para glóbulos rojos nucleados fetales, y para remover los- fragmentos de glóbulos rojos que resultan de la reacción de hemolisis y la mayoría de glóbulos blancos. Los glóbulos rojos nucleados, fetales presentes en una muestra inicial de 20 ml de sangre periférica se pude reducir en una muestra de 2 microlitros, así se proporciona una identificación y análisis fácil en un portaobjetos de microscopio o mediante la reacción de cadena de polimerasa. El segundo paso de centrifugado utiliza un medio de gradiente de densidad. Después de la hemolisis, se espera que los glóbulos rojos nucleados se equilibren en un gradientes de densidad a aproximadamente la misma densidad de los granulocitos, un componente de la fracción de los glóbulos blancos se describe en la Solicitud Internacional de PCT No. WO 93/23754. El tono y la densidad del medio de gradiente puede permitir la separación y el enriquecimiento de los eritrocitos nucleados fetales de los componentes de los glóbulos blancos de la muestra. El - medio de gradiente de densidad preferido comprende un coloide dispersado en un gel que se puede derretir. Ver la Patente de los Estados Unidos 5,489,386. El coloide imparte la densidad requerida al medio de gradiente. Así, alterando la concentración del coloide, la densidad del medio se puede alterar. La naturaleza en partículas del coloide permite la inmovilización de las capas separadas de la densidad sin la difusión de una capa en la otra mientras está en estado de gel. Además, el coloide es capaz de mantener la células de sangre en un estado substancialmente desagregado. El coloide preferido que se da la densidad al medio es polivinilo-pirrolidona recubierto con sílice, por ejemplo Percoll™t elaborado por Pharmacia, y disponible de Sigma Chemical CO. El medio del gradiente de densidad para usar en los eritrocitos nucleados fetales es hipertónico. Bajo condiciones hipertónicas, los glóbulos rojos se contraen y por lo tanto se hacen más densas. Bajo estas condiciones, los glóbulos blancos mantienen una densidad constante. Así, al contraer selectivamente los eritrocitos en un medio hipertónico, la densidad de estos glóbulos aumenta y se equilibran dentro de un gradiente a una densidad diferente a la de los glóbulos blancos. Métodos de enriquecimiento - Citometría de flujo y otros El enriquecimiento de la muestra de sangre se pude lograr usando otras técnicas, como icrodisección usando microscopía de luz, citometría de flujo, y/o cama magnética o separación de partícula. Por ejemplo, se pueden agregar anticuerpos específicos para los marcar la célula madura o materna y/o los anticuerpos específicos para marcar la células fetales al método de la presente invención para enriquecer la muestra de las células fetales . Se puede aplicar un enfoque de selección bien sea positivo o negativo, es decir mejorar la células fetales deseadas o eliminar la células maduras no deseadas. El uso de una columna de anticuerpos unidos se puede hacer solo o junto con otras técnicas de enriquecimiento. Mueller et al, en Lancet, 336:197 (1990) describe el método para aislar las células trofoblasto derivadas de la placenta en la sangre de una mujer embarazada usando las camas magnéticas. Existen otras variaciones en los métodos para conjugar anticuerpos en las camas. Ver Thomas et al, J. Immunol., 120:221 (1989) y deKretser et al., Tissue Antigens 16: 317 (1980) . Un método alternativo de enriquecimiento se discute en Berenson et al, J. Immunol Methods 91:11 (1986) en que la alta afinidad entre la avidina de proteína y la biotina de vitamina se explotó para crear un procedimiento inmunoadsorbido . En la citometría de flujo, las células se pueden analizar y seleccionar en un flujo de selección basado en las propiedades de las células para difundir la luz hacia adelante y hacia un lado. En cada experimento los parámetros se establecen empíricamente en relación con las propiedades de difusión hacia adelante y hacia un lado. En general, la ganancia en los tubos fotomultiplicadores que detentan la luz de difusión hacia adelante y hacia un lado se ajusta en cada dimensión para distribuir un arreglo de señales desde las células a través de los canales disponibles para el análisis en una manera bien conocida para los expertos en la técnica. Bajo estas circunstancias se observa un patrón característico o diagrama de difusión. El análisis de las muestras de sangre revelan los tres tipos principales de las células en el diagrama de difusión, a saber, las células monocíticas, linfocitos y granulocitos, cada uno tiene características de difusión de luz distinguibles. Se registran la región de células monocíticas, la región de células de granulocitos y la región de células linfocitos del diagrama de difusión de forma que se puedan analizar las células que se clasifican como monocitos, granulocitos o linfocitos además que se pueden recolectar por selección de flujo. Se puede realizar un análisis adicional manchando las células con anticuerpos monoclonales acoplados a un fluorescente o sometiendo a las células a una hibridación in situ con oligonucléotidos acoplados a un fluorescente o probetas de ácido nucleico. Bajo estas condiciones, las células que tienen propiedades de difusión de luz particulares también se analizan para la presencia de fluorescencia. Cuando se utilizan anticuerpos acoplados a un fluorescente, se llevan a cabo experimentos de control utilizando anticuerpos monoclonales de control unidos isotípicamente. Cuando se usan oligonucleótidos acoplado a un fluorescente, el control consta de secuencias oligonucleótidas no relacionadas a las secuencias de mamíferos . Las muestras recolectadas se depositan en uno o más portaobjetos, con no más de 2-3,000 células depositadas en un solo portaobjeto; se debe tener mucho cuidado al depositar las células que forman una monocapa de manera que_ la concentración de células en el portaobjeto sea lo suficientemente baja para que las células no se monten unas sobre otras. En otras ocasiones, las células se recolectan en los' tubos de microfuga y se fijan en suspensión como se describe en otro documento.

Se puede usar un citómetro de flujo, Coulter, Profile II (de Coulter Haileah, Fl) para detectar los ácidos nucleicos dentro de las células fetales. También se puede usar un sistema Epic Élite (Coulter, Haileah, Fl)para seleccionar las células fetales de una muestra de sangre materna. Preferiblemente, se usa un seleccionados de células activas fluorescentes (FACS) para llevar a cabo la citometría de flujo y para identificar las células fetales, usando fluorescencia como la etiqueta o unir directa o indirectamente un tinte al anticuerpo. Otros marcadores Se puede utilizar un segundo marcador fetal para definir las células como fetales. Por ejemplo, se pueden usar los anticuerpos que representan marcadores celulares. Para los glóbulos rojos, se prefiere el marcador de hemoglobina, como un anticuerpo de la cadena gama fetal de la hemoglobina. También se pueden usar secuencias de ARN específico de células fetales como marcadores de las células fetales. Esta secuencia se transcribe por ejemplo, de un gen de hemoglobina fetal. La secuencia de estos genes y de otros se puede obtener del banco de datos de secuencia genética, GenBank, versión 69.0. Una probeta de ADN, o un grupo de probetas, que contengan cualquiera de estas secuencias se sintetiza como un oligodeoxinucleótido usando un sintetizador comercial de ADN como el Modelo 380B de Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA. Las probetas pueden comprender las bases de nucleotidos naturales o análogos conocidos de bases nucleotidos naturales, incluyendo los modificados para unir mitades etiquetadas. Para la selección negativa, se puede usar un-marcador de células maduras, como un. antígeno para anti-CD45, anti-CD13 y/o anti-CD34, que se unen selectivamente a los glóbulos blancos. Se pueden incluir anticuerpos anti-CD34 para remover los contaminantes de los glóbulos rojos de la madre. La adición de los anticuerpos anti-CD31 remueve, específicamente, los contaminantes de las plaquetas o trombocitos. Preferiblemente, se pueden utilizar los anticuerpos dirigidos a la cadena beta de un adulto de hemoglobina. Proteínas y Ácidos nucleicos fetales Una vez" que las células fetales se aislan de las de la madre, se pueden cultivar para aumentar el número de células disponibles para el diagnóstico, Ver Fibach et al, Blood, 73:100 (1989). Las proteínas fetales particulares y/o ácidos nucleicos se puede seleccionar o aislar como sigue. Las-células se pueden lisinar y por lo tato hacer que el ácido nucleico o la proteína esté disponible para el análisis. En algunos casos", se puede extraer el ADN de otros complejos, es decir, por calentamiento, haciéndolo por hibridación con probetas de ácido nucleico. Antes del análisis, se puede amplificar el ADN fetal por medio de los métodos como la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) o la reacción de la cadena de ligasa (LCR) . Si se lleva a cabo la amplificación, las muestras seleccionadas se amplifican en un número apropiado de ciclos de desnaturalización o ablandamiento (por ejemplo, aproximadamente 25-60) . El control de las muestras puede incluir un tubo sin agregar ADN al control para la amplificación de falsos positivos. Con una modificación apropiada de las condiciones PCR, se puede amplificar más de un gen fetal separado, simultáneamente. Esta técnica, conocida como amplificación "multiplicada", se puede usar con seis juegos de primarios en el diagnóstico de DMD. Ver Chamberlin et al., Prenat . Diagn, 9:349-355 (1989). Cuando se lleva a cabo la amplificación, el producto que resulta de la amplificación es una mezcla que contiene ADN fetal amplificado, de interés, es decir el ADN cuya presencia se va a detectar y/o cuantificar. El ADN fetal amplificado de interés y otras secuencias de ADN se separan, usando las técnicas conocidas. También se pueden llevar a cabo análisis subsecuentes de ADN amplificado, usando las técnica conocidas, como: digestión con restricción de endonucleasa, visualización de luz ultravioleta de geles de agarosa manchados con bromuro de - etidio, secuencias de ADN o hibridación con probetas de oligonucleotidos específicos. Ver Saiki et al., Am. J. Hum. Genet., 43 (supl.): A35 (1988). Éste análisis determinará si existen diferencias polimórficas entre las muestras fetales y materna ampliadas. La mezcla amplificada se puede separar en base al tamaño y el resultado del ADB fetal separado se pone en contacto con la probeta o probetas de ADN seleccionada de manera apropiada (ADN suficientemente complementario con el ADN fetal de interés que hibridiza el ADN fetal de interés bajo las condiciones usadas) . Generalmente, las probetas con ADN se etiquetan usando las etiquetas que se mencionaron anteriormente . Después que el ADN fetal de tamaño separado y las probetas con ADN seleccionadas se mantienen, por un tiempo suficiente, bajo las condiciones apropiadas para la hibridación de la secuencias de ADN complementarias, resultando en la producción de ADN fetal o complejos en probeta de ADN, se lleva a cabo la detección de los complejos usando los métodos conocidos. Por ejemplo, si la probeta se etiqueta, se detecta el ADN fetal o el complejo en la probeta de ADN etiquetado y/o se cuantifica (por ejemplo mediante autoradiografía, detección de la etiqueta fluorescente) . La cantidad de complejos etiquetados (y así, la cantidad de ADN fetal) se puede determinar al compararla con la curva normal (es decir, predetermina la relación entre la cantidad de la etiqueta detectada y la lectura dada) . Detección de Anormalidades genéticas La presencia de ADN fetal asociado con enfermedades o condiciones, se puede detectar y/o cuantificar mediante el método presente. En cada caso, se usa una probeta apropiada para detectar la secuencia de interés. Por ejemplo, las secuencias de las probetas Stl4 (Oberle et al., New Engl, Med., 312:682-686 (1985)), 49a (Geurin et al., Nucleic acid res., 16:7759 (1988)), KM-19 (Gasparini et al., Prenat Diagnosis, 9:349-355 (1989)) o eliminar la posición prona del gene para la distrofia muscular Duchenne (DMD) (Chamberlain et al, Nucleic Acids Res, 16:11141-11156 (1988)) se usan como probetas. Stl4 es una secuencia altamente polimórfica aislada, de un brazo largo del cromosoma X que tiene una utilidad potencial al distinguir el ADN femenino del ADN materno. Se hace un mapa cerca del gen para el Factor VIII :C y así, también se puede utilizar para el diagnóstico prenatal de Hemofilia A. También se puede usar los primarios correspondientes a las secuencias al lado de los seis exons más comúnmente eliminados en el gen DMD, que se ha utilizado exitosamente para el diagnóstico por PCR. Ver Chamberlain et al, Nucleic Acids Res, 16:11141-11156 (1988). Otras condiciones que se pueden diagnósticas por el método de la presente invención incluyen Síndrome de Down, ß-talasemia (Cai et al, Blood, 73:372-374 (1989); Cai et al., J. Hum Genet, 45:112-114 (1989); Saiki et al, New Engl J. Med, 319:537-541 (1988), anemia de la célula (Saiki et al., New Engl J. Med., 319:537-541 (1988)), fenilcetonuria (DiLella et al, Lancet, 1:497-499 (1988)) y el mal de Gaucher (Theophilus et al, Am. J. Hum. Genet. 45:212-215 (1989)). Las anormalidades genéticas detectadas por la presente invención pueden ser eliminación, adición, amplificaciones, traslocaciones o nuevos arreglos. Por ejemplo, la eliminación se pueden identificar al detectar la ausencia del enlace de hibridación de la probeta en la secuencia objetivo. Para detectar- una eliminación de una secuencia genética, se prepara una población de probetas complementarias a la secuencia del ácido nucleico que está presente en la células fetal normal pero está ausente en las anormales. Si las probetas se hibridiza en la secuencia en la células que se prueba, entonces se detecta la secuencia y la célula es normal para esta secuencia. Si las pruebas fallan en la hibridación del ácido nucleico de la célula, entonces la secuencia no se detecta en esta célula y la célula se designa como anormal, previendo que la secuencia de control, como la del cromosoma X, se detecta en la misma célula. Una adición se pude identificar al detectar el enlace de una probeta etiquetada con un segmento polinucléotido repetido de un cromosoma. Para detectar la adición de una secuencia genética, como la inserción en un cromosoma o una anormalidad del cariotipo por ejemplo trisomía del cromosoma 21 lo que indica Síndrome de Cow, se prepara una. población de probetas que se complementan con la secuencia genética en cuestión. Continuando en el ejemplo del Síndrome de Dow, si las probetas complementarias al cromosoma 21 se hibridiza según la apariencia de tres secuencias del cromosoma 21 en la célula, entonces la presencia de tres secuencias del cromosoma 21 se detectará e indicará la condición de trisómica del síndrome de Dow. Si el medio de detección es un tinte fluorescente, por ejemplo, entonces los tres puntos distintivos fluorescentes visibles en cada célula indicará la condición de trisomía. Cuando ' está presente la amplificación de un fragmento particular de ADN, hay un aumento en la intensidad de la señal en una probeta etiquetada para la secuencia que se somete a la amplificación. Usando cualquier número de sistemas de análisis de imagen, esta señal se cuantifica y se compara con los controles normales para determinar si está presente la mutación particular. Una translocación o un nuevo arreglo se puede identificar mediante varios métodos. Por ejemplo, una primera probeta identificada se puede enlazar en una región marcada de un cromosoma que no se ha translocado. Luego, la segunda probeta etiquetada se enlaza a una segunda región del mismo cromosoma (para un nuevo arreglo) o un segundo cromosoma (para la traslocación) y se detectan enlaces subsecuentes de la primera y segunda probetas. Alternativamente, se pueden identificar la translocación mediante la unión de la probeta etiquetada _co_n la región del marcador de una sección polinecleótida de un cromosoma que se trasloca o se vuelve a arreglar; usualmente durante la metafase. Subsecuentemente, se detecta el enlace de la probeta etiquetada. Por ejemplo, para detectar la traslocación, se identifica un marcador para el cromosoma en cuestión, y se prepara la población de probetas que se hibridizan selectivamente. Estas se marcan con una etiqueta detectable, como por ejemplo un tinte que sea fluorescente en una longitud de onda particular. También se identifica la secuencia que se trasloca o se vuelve a arreglar en la anormalidad que se está probando, y se prepara una segunda población de probetas que la identifica. Los miembros de la segunda población de probetas se marcan con una etiqueta diferente, distinguibles, como un tinte que es fluorescente en una longitud de onda diferente de la primera serie de probetas etiquetadas. Se lleva a cabo la hibridación in situ usando ambas poblaciones de las probetas, y se comparan los resultados de --la hibridación para cada población de probetas. Si coinciden las dos etiquetas virtualmente en todas las muestras, no se realiza ninguna traslocación. Si no se encuentra una coincidencia en la primera etiqueta con la segunda etiqueta, en una fracción significativa de la muestra, entonces se lleva a cabo una traslocación o un nuevo arreglo. Ver-- Speleman, Clinical Genetics, 41(4): 169-174 81992); y Gray, Progress in Clinical and Biol Res., 372:399-411 (1991) . Hibridación del ácido nucleico El término "ácido nucleico", como se usa en el presente, se refiere a ADN o ARN. La' "secuencia de ácido nucleico" o secuencia polinecleótida" se refiere a un polímero de rama doble o simple de bases desoxiribonucleico o ribonucleico leído desde el extremo 5' hasta el 3' . Esto incluye plásmidos autoreplicados, polímeros infecciosos de ADN o ARN y ADN o ARN no funcional. Las "probetas de ácido nucleico" pueden ser fragmentos de ADN o ARN. Los fragmentos de ADN se pueden preparar, por ejemplo al digerir ADN plásmido o por el uso de OCR, o la sintetización bien sea por el método de fosforamidita descrito por Beaucage y Carrethers, Tetrahedron Lett., 22:1859-1862 (1981) o bien por el método triester de acuerdo con Mettaucci et al, J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981) . Luego se puede obtener un fragmento de doble rama, si se desea, al ablandar las ramas simples sintetizadas químicamente bajo condiciones apropiadas o por la síntesis de una primera secuencia apropiada. En donde se da una secuencia apropiada para la probeta de ácido nucleico, se entiende que también se identifica e incluye una rama complementaria. La rama complementaria trabajará igual en situaciones en donde el objetivo es un ácido nucleico de doble rama. La fase "hibridizada selectivamente" se refiere a una probeta de ácido nucleico que se hibridiza, se duplica o engaza solamente a una secuencia de ADN o ARN particular cuando la secuencia objetivo se presenta en una preparación de ADN o ARN celular total. Las secuencias de ácido nucleico "complementarias" u "objetivo" se refieren a las secuencias de ácido nucleico que se hibridizan selectivamente a la probeta de ácido nucleico. Las condiciones de probeta blanda dependen, por ejemplo, de la longitud de la probeta, la condición base y el número de discrepancias así como su posición en la probeta, y frecuentemente se debe determinar empíricamente. Para las discusiones, el diseño de la probeta de ácido nucleico y la condiciones de ablandamiento, ver, por ejemplo Sambrook et al, Molecular Clonning: A. laboratory Manual ( 2 ° edición) , vols 1-3, Cold Sprihg Harbor laboratory, (1989) y Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology de. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) . Los ácidos nucleicos que se usan como probetas se sintetizan químicamente de acuerdo con el método de triester fosforamidita en fase sólida que primero se describe por Beaucage y Carruthers Tetrahedron Lett, 22 (20) : 1859-1862 (1981) usando un sintetizador automático, como se describe en Needham-VanDevanter et al, Nucleic Acids Res, 12:6159-6168 (1984) . La purificación de los oliginucléicos se hace bien sea por alectroforesis de gel de acrilamida nativa o por un intercambio de aniones HPLC como se describe en Pearson y Regnier, J. Chrom, 255:137-149 (1983). La secuencia del oligonucléico sintético se puede verificar usando un método de degradación química de Maxam y Gilbert, en Grossman y Moldave, eds Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499-560 (1980) . Los expertos en la técnica se conocen una variedad de métodos para la medida específica del ADN y ARN usando técnicas de hibridación de ácido nucleico. Por ejemplo, un método para evaluar la presencia o ausencia de ADN en la muestra involucra una transferencia en el sur. Brevemente, el ADN genómico digerido está en geles de agarosa en un amortiguador y se transfiere a membranas. La hibridación se lleva a cabo usando probetas de ácido nucleico. Preferiblemente, las probetas de ácido nucleico son de base 20 o más largas. (Ver Sambrook et al, para los métodos para seleccionar secuencias de probetas de ácido nucleico para usar en la hibridación del ácido nucleico) . La visualización de las porciones hibridizadas permite la determinación cuantitativa de la presencia o la ausencia de ADN. Se puede usar una transferencia norte similar para la detección de mARN. En resumen, el mARN se aisla de una muestra de células dadas utilizando el método de extracción de guanidina-fenol-cloroformo . Luego, el ARNm sufre una electroforesis para separar las especies de ARNm y el ARNm transferido desde el gel hacia la membrana de nitrocelulosa. Como con las manchas el sur, las probetas identificadas se usan para identificar la presencia o ausencia de ARNm apropiado . Los expertos en la técnica conocen una variedad de formatos para la hibridación de ácido nucleico. Por ejemplo, los formatos comunes incluyen los ensayos emparedados y los ensayos de competencia o desplazamiento. Generalmente, la's técnicas de hibridación se describen en "nuecleic Acid Hibridization, A practical Approach" De Hames y Higgins, IRL Press, 1985; Gall y Pardue, Proc Nati Acad Sci USA, 63:378-383 (1969); y John, Burnsteil y Jones, Nature, 223:582-587 (1969) . Se considera adecuado el uso de etanol, por ejemplo 80% etanol/agua (v/v), como un agente de fijación durante la preparación de las células para una hibridación in situ. Otros fijadores de la precipitación útiles incluyen ácido acético, metanol, acetona y combinaciones de estos, por ejemplo, mezclas de etanol/metanol de 3:1. Otros fijadores e hibridación de células fijas, en general, se discuten en la Patente 5,225,326. Los fijadores deben proporcionar un buen preservativo de la morfología celular, debe preservar y mantener la accesibilidad de antígenos, y promover una alta hibridación eficiente. También, algunas sales y temperaturas extremas, como la que se logra al pasar el portaobjeto sobre la flama, pueden funcionar como fijadores. El fijador puede contener un compuesto que fija los componentes celulares reticulando estos materiales juntos, por ejemplo, paraformaldehidos, glutaraldehidos o formaldehidos. Los agentes de reticulado, mientras preservan la ultraestructura, frecuentemente reducen la eficiencia de la hibridación al formar redes que atrapan el ácido nucleico y los antígenos, haciéndolos inaccesibles para las probetas y los anticuerpos. Algunos de los agentes de reticulado también modifican el ácido nucleico, evitando la formación posterior del híbrido. Típicamente, la solución de hibridación comprenden agentes que incluyen formamida, urea, tiocianten guanidina, tricloroacetato, tetrametiamina, perclorato y yoduro de sodio. Se puede utilizar cualquier amortiguador que mantenga el pH entre aproximadamente 6.0 y aproximadamente 8.0, y preferiblemente entre 7.0 y 8.0. Misceláneos Muchos tipos de soporte sólidos se pueden usar en la invención. Los soportes pueden incluir vidrio, nilón, nitrocelulosa y similares. Más preferiblemente, se usan portaobjetos para microscopio de plástico o vidrio. Los expertos en la técnica conocen el uso de estos soportes y los procedimientos para depositar las muestras. La selección del material de soporte dependerá del procedimiento para la visualización de las células y el procedimiento de cuantificación utilizados. Además, se pueden usar ramas nucleares para reconocer la cromatina, proteínas nuclear, componentes nucleares, ADN y similares. Estas ramas incluyen azul de metileno, hematoxilina, DAP 1, yoduro de propidinio, tionina y similares. La invención también incluye varias técnicas para manchar o marcar el cromosoma. Generalmente, la pintura para el cromosoma se describe en la patente de los Estados Unidos 5,447,841. Típicamente, las mezclas heterogéneas de fragmentos de ácido nucleico etiquetados o de probetas no tienen secuencias repetidas. Todos los genomas, los cromosomas simples, las subregiones de cromosomas y similares se pueden manchar o entintar, usualmente durante el ciclo de metafase de la célula. Equipos Se puede producir un equipo para usarlo al llevar a cabo el método de la invención para aislar y detectar el ADN fetal de interés, como una anormalidad en un cromosoma asociada con una enfermedad u otra condición, en una muestra de sangre materna. Esto incluye, por ejemplo, un recipiente para contener el reagente necesario; los reagentes y, opcionalmente, un recipiente sólido para usarlo en la separación de células nucleadas fetales o complejos de anticuerpos específicos de otros componentes de la muestra o para remover las células maternas complejas con un anticuerpo específico . Preferiblemente, el equipo proporcionado por la invención para identificar eritrocitos o eritroblastos nucleados, fetales, comprende un anticuerpo de hemoglobina, antiembrión, etiquetado, en donde la etiqueta es un fluorocroma, una encima o biotina. Alternativamente, el anticuerpo de hemoglobina, antiembrión se conjuga con un hapteno antigénicos y se usa un segundo anticuerpo etiquetado dirigido a un hapteno o a un anticuerpo de hemoglobina para la captura. Otros ingredientes pueden ser componentes adicionales en el equipo, como por ejemplo tubos de fragmentación de la sangre, reagentes de hemolisis, medio de gradiente de densidad, agentes de lisina, probetas de ácido nucleico etiquetados y similares junto con las instrucciones para su uso.

Por ejemplo, los reagentes en el equipo que 'se usan para detectar el ADN fetal de interés después de la amplificación del ADN fetal por PCD pueden incluir: 1) al menos un anticuerpo específico para una cadena o hemoglobina embriónica; ADN seleccionado para el uso de ADN fetal ampliado por PCR; y al menos una probeta de ADN complementaria para el ADN fetal que se va a detectar (ADN fetal de interés) . El equipo, como se indicó, también puede incluir un soporte o recipiente sólido que se usa en complejos separador formados de otros componentes de muestras. Estos recipientes sólidos pueden ser, por ejemplo, un portaobjeto de vidrio, un filtro de nitrocelulosa o camas inmunomagnéticas y pueden tener un anticuerpo selectivo para el anticuerpo presente en la célula nucleada fetal/otros complejos de anticuerpo específicos. Otros equipos pueden incluir una solución que tiene una mezcla de fijación e hibridación y una o más probetas etiquetadas . El equipo también proporciona los medios e instrucciones para llevar a cabo la reacción de hibridación. Además, el equipo puede incluir una' película fotográfica o emulsión con la cual se registran los resultados de la prueba que se realiza con la invención. Aún otro aspecto de la presente - invención, sería un equipo para enriquecer y detectar las células fetales dentro de una muestra de sangre, por ejemplo sangre del cordón umbilical o de la madre. Este equipo puede contener uno o más reagente para preparar un gradiente de densidad que concentra células fetales. Los anticuerpo etiquetados para detectar las células fetales y/o las probetas específicas para el mARN y/o ADN de la célula fetal, también se pueden incluir los medios e instrucciones para llevar a cabo el enriquecimiento de la célula. Un "equipo alternativo puede incluir uno o más anticuerpos, enlaces deseable para un soporte sólido, para concentrar positiva o negativamente las células fetales dentro de la muestra, las probetas específicas para secuencias específicas de ADN en el cromosoma, los medios y las instrucciones para llevar a cabo el enriquecimiento de la célula fetal usando centrifugación del gradiente de densidad o la citometría de flujo, y, opcionalmente uno o más reagente para preparar el gradiente de densidad que concentran las células fetales. Opcionalmente, este equipo proporciona los reagente y los materiales para usar en un sistema automatizado para llevar a cabo cualquiera de los método de la presente invención. E emplo El siguiente ejemplo se proporciona simplemente para ilustrar y no se puede considerar, de ninguna forma, un limitante para el alcance de la presente invención. Los conocedores - de la técnica reconocerán que se pueden hacer ciertas variaciones y modificaciones dentro del alcance de la invención. Se prepararon unas manchas triangulares con sangre del cordón umbilical tomadas de un aborto de 14 semanas de gestación, sangre completa de la madre (después del aborto) y una mezcla al 1:25 de la sangre del cordón en la muestra de la sangre de la madre. Las manchas se secaron con un ventilador por aproximadamente media hora a temperatura ambiente, se fijaron en metanol al 100% a -20°C por 10 minutos y luego en acetona al 100% por 10 minutos a -20°C. Luego los portaobjetos se lavaron en PBS (lOnM una solución salina amortiguada de fosfato (pH 7.4)) por 5 minutos a temperatura ambiente, con una agitación moderada y se fijó en formaldehido/PBS al 2% a temperatura ambiente por 10 minutos con agitación moderada, Después de lavar los portaobjetos dos veces en PBS por 5 minutos a temperatura ambiente con una agitación moderada, los portaobjetos se lavaron dos veces con TBS (100 mm de tri-HCl, pH 7.6) por 5 minutos a temperatura ambiente con una agitación moderada. Las muestras se trataron con un agente bloqueador depositando 200 µm de TNBB (0.5% de un reagente de bloqueo (Boehringer Mannheim) y 1% BSA en 100 mM TBS) en una cubreobjeto e 24x60 para cada lado de la mancha. Los cubre objetos se colocaron con la tapa hacia abajo en una caja de almacenamiento del portaobjeto plástico, que a su vez se coloca en una cámara húmeda abierta que contiene tallas de papel humedecidas con agua. Finalmente, la cámara húmeda se coloca en un descantado y se aplica vacío (Bomba de- vacío Modelo DD20) en toda la caja por 15 minutos a temperatura ambiente. Se retiran los portaobjeto del descantador. Suavemente se retira el cubreobjeto y se agrega 100 µl de una mezcla que contiene un anticuerpo biotinilado de una dilusión de 1:250 de antiHbE de ratón (hemoglobina épsilon embrionica) (monoclonal) y una dilusión de anti-HbF de conejo (globina gamma fetal) (policlonal) y se agrega TNBB/0.75% " Tween 20 a cada portaobjeto. La mancha se cubre con un cubreobjeto limpio, y como antes, el portaobjeto se incuba volteado en una caja plástica para el almacenamiento de portaobjeto en una cámara abierta húmeda en un decantador al vacío, por 15 minutos. Suavemente .se retira el cubreobjeto y los portaobjetos se lavan a temperatura ambiente con una agitación moderada en TBS por 10 minutos, y luego se lavan dos veces por 5 minutos. A cada portaobjeto se agrega 100 µl de una segunda mezcla que contiene una dilusión 1:100 de anticuerpos anti-ratón de cabra conjugado con FITC y una dilusión 1:100 de anticuerpo, antiratón de caballo conjugada con rojo Texas en TNBB/0.75% Tween 20 y se incubaron, al vacío como se describió anteriormente.

Suavemente se retiraron los cubreobjetos y los portaobjetos se lavaron a temperatura ambiente con una agitación moderada en TBS por 10 minutos, y luego se lavaron dos veces por 5 minutos. Luego, los portaobjeto se secaron al aire y se montaron en Vectrashield/DAPI . Resultados El sistema anterior mancha la hemoglobina embriónica (hBE, hemoglobina épsilon) con un fluorescente FITC verde y la hemoglobina fetal (HbF, hemoglobina gamma) con rojo Texas fluorescente. Además, los núcleos de las células nucléadas se manchan o tiñen de azul por un contramancha DAPI . El anticuerpo anti-HbE (hemoglobina embriónica) fue muy específico. La fluorescencia FITC (hemoglobina. embriónica) se observó solamente en los glóbulos rojos del cordón y las manchas del cordón y la sangre de la madre. Se observaron tanto glóbulos rojos HbE-positivos, maduros y nucleados. No se encontró glóbulos blancos FITC-manchados en ninguna mancha . Se observó fluorescencia de rojo Texas (hemoglobina gamma) en los glóbulos rojos maduros en todas las manchas: del cordón, de la madre y la mezcla. También se observó en los glóbulos rojos nucleados en las manchas del cordón y de la mezcla. No se observó glóbulos rojos nucleados manchados de otra forma, en la mancha materna. También se observó fluorescente rojo Texas en el citoplasma de algunos granulocitos en las manchas del cordón y de la madre. No se sabe si esta fluorescencia roja en los granulocitos representa una toma de hemoglobina por lo granulocitos, o era un hecho de origen policlonal del anticuerpo. Las manchas del cordón y las mezclas también contienen glóbulos rojos maduros y nucleados que manchan positivo tanto para la hemoglobina gamma como para embriónica. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes que se mencionan en la presente se incorporan como referencia, así como las publicaciones individuales o solicitudes de patentes se mencionaron específica e individualmente como referencia. La descripción anterior de las formas de realizaciones preferidas de la presente invención se describen como ilustración de la descripción. No se aplican para ampliar o limitar la invención en una forma precisa de la presentación, y se consideran las variaciones y modificaciones posibles de las enseñanzas anterior, y se consideran dentro del alcance de la invención. A pesar de que la invención se describió en detalle mediante la ilustración y el ejemplo, simplemente para facilitar la comprensión de la invención, es obvio que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar eritrocitos o eritroblastos en la muestra de sangre, el método comprende: a) poner en contacto la muestra de sangre con un anticuerpo, o con un fragmento del mismo, dirigir la porción de globina embriónica de hemoglobina, en donde el anticuerpo o su fragmento se enlazará con la célula fetal; e b) identificar las células que se unen al anticuerpo o a su fragmento como células eritrocitos o eritroblastos .

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en que la muestra de sangre es sangre de una madre, humana, y en donde el eritrocito fetal es un eritrocito fetal nucleado.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en que el anticuerpo se dirige a una cadena globina épsilon, embriónica o una cadena globina zeta, embriónica de hemoglobina .

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en que el anticuerpo está etiquetado directa o indirectamente.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende poner en contacto la muestra de sangre con un segundo marcador fetal:

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en que el segundo marcador fetal es un anticuerpo, o un fragmento de éste, dirigido a la cadena globina gamma fetal de la hemoglobina.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende poner con contacto con la muestra de sangre con un marcador de célula madura.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en que el marcador de la célula madura es un anticuerpo, o un fragmento de éste, dirigido a la cadena globina beta, de un adulto, de hemoglobina.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en que las células de la sangre están en suspensión.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en que la muestra de sangre se seca al aire o se fija químicamente en la matriz sólida antes o después de entrar en contacto con el anticuerpo o su fragmento.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende el enriquecimiento de la concentración de las células fetales en la muestra de sangre antes de que se ponga en contacto con el anticuerpo o su fragmento, para la identificación de las células fetales.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en que las células fetales se enriquecen a través de la citometría de flujo, el fraccionamiento de la sangre, la separación del gradiente de densidad o la separación de cama magnética.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende la selección o aislamiento del ácido nucleico o una proteína dentro de la célula fetal.

16. EÍ método de acuerdo con la reivindicación 15, en que el ácido nucleico o la proteína se amplifican o detectan.

17. Un equipo para identificar eritrocitos o eritroblastos nucleados, fetales, que comprende: a) un anticuerpo de hemoglobina, antiembriónico, etiquetado; y b) las instrucciones de uso.

18. El equipo de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el anticuerpo se etiqueta con un fluorocroma o con una encima .

19. El equipo para identificar eritrocitos o eritroblasto nucleados, fetales, que comprende: a) un anticuerpo hemoglobina, antiembriónico etiquetado con un hapteno antigénico; b) un segundo anticuerpo etiquetado dirigido al hapteno o a un anticuerpo hemoglobina antiembriónico; así como c) las instrucciones para el uso.

20. El equipo para identificar eritrocitos o eritroblastos nucleados, fetales, que comprende: a) un anticuerpo hemoglobina antiembriónico conjugado con biotina; b) avidina etiquetada o una molécula de estreptavidina; así como c) las instrucciones de uso.

21. El equipo de acuerdo con la reivindicación 20, que además comprende: d) un tubo para fragmentar la sangre; e) un reagente para hemolisis; y f) un medio de gradiente de densidad.

22. El equipo para seleccionar o aislar la secuencia de ácido nucleico dentro de eritrocitos o eritroblastos que comprende : a) un anticuerpo hemoglobina, antiembriónico, etiquetado; b) un medio para gradiente de densidad; c) un agente para aplicar lisina a las células fetales; d) una probeta especifica de ácido nucleico etiquetado para la selección o aislamiento de la secuencia de ácido nucleico; así como e) las instrucciones de uso.

23. El equipo de acuerdo con la reivindicación 22, en que la probeta de ácido nucleico es una probeta de ADN o ARN.