NO153987B - Fremgagsmaate for bestemmelse av celletype eller forenlighet paa en fast matrise. - Google Patents

Abstract

FREMGANGSMÅTE FOR BESTEMMELSE AV CELLETYPE ELLER FORENLIGHET PÅ EN FAST MATRISE.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for bestemmelse av celletype eller forenlighet på en fast matrise.

For mange medisinske formål er det nødvendig å

bestemme forenligheten mellom blod fra en giver og en pasient. Blodcelleforenligheten bestemmes ved en ikke-opptreden av en immunologisk reaksjon mellom antistoffer i blodserum hos en pasient og antigenet som er tilstede i blodceller fra en giver. Hvis f.eks. blodcellene hos en pasient er av type A (dvs. har "A"-antigener på de røde blodceller), så vil serum fra en slik pasients blod ha anti-B-antistoffer, dvs. antistoffer som vil reagere med "B"-celler. Hvis en slik pasient får "B"-blod, så

vil det skje en immunologisk reaksjon mellom nevnte anti-B-antistoffer hos pasientens serum og B-antigenene i de røde blodceller fra giveren. En slik uforenlighet kan resultere i meget alvorlige tilstander på grunn av en intravaskulær hemo-lyse.

Prøver på blodcellers type og forenlighet er vanlig-

vis av to typer: (i) en prøve for å bestemme hvorvidt et spesifikt antistoff tilsatt cellene vil frembringe en agglutinering av disse, og (ii) en prøve for å bestemme hvorvidt et spesifikt antistoff som tilsettes de prøvede celler sammen med serumkomplement vil forårsake celleoppløsning.

Den første av disse to typer prøver, dvs. agglutinering, refererer seg til en sammenklumping av blodceller som f.eks. inneholder type A-antigener, og hvor anti-A-antistoffer tilsettes i et fravær av komplement. A-antigenet og anti-A-antistoffene reagerer spesifikt med hverandre ved en immunolo-

gisk reaksjon hvor antistoffet danner broer mellom tilstøtende celler. Dette fører til en sammenbundet masse av blodceller som bindes til hverandre ved hjelp av de nevnte tilsatte antistoffer.

Den andre av de to prøver som er nevnt ovenfor, dvs.

celleoppløsning, angår oppriving eller oppløsning av celle-membranen som fører til en.celledød, og som gjør at de frigir sitt indre innhold. "Celleoppløsning" er et resultat av en reaksjon som skjer mellom antistoffer som er bundet til celle-membranene og en gruppe potensielt destruktive proteiner i normalt serum (ofte kalles disse "komplement").

Begge de ovenfor beskrevne fremgangsmåter brukes for utprøving av type og forenlighet i cellulære blodelementer,

dvs. erytrocytter, granulytter, lymfocytter og trombocytter eller plater. Skjønt de ofte brukes bare kvalitativt, så er begge metoder reelt kvantifiserbare og har vært brukt separat for bedømmelse av antigen, antistoff og serumkomplement.

I de fremgangsmåter som brukes i vanlige medisinske klinikker i dag for prøving av celletyper og deres forenlighet, så er både agglutineringsprøvene og celleoppløsningsprøvene utført i en flytende fase, dvs. at serum som inneholder antistoffer med eller uten det komplement som skal prøves, blir blandet med suspensjoner av blodceller hvor man ønsker å få en utprøving av deres type og forenlighet. Vanligvis blir det brukt faste volumer.

En bedømmelse av resultatene etter en agglutinerings-prøve krever at en tekniker eller lignende kvalifisert personale kan skille mellom en celleagglutinering som skyldes nevnte spesifikke antigen-antistoff-molekylbrodannelse fra en ikke-spesifikk celle-aggregering, hvor urelaterte krefter også kan forårsake en viss grad av sammenklumping. Nevnte teknikker må også være i stand til å skille frie uagglutinerte celler som kan være til stede fra sammenklumpede eller agglutinerte celler. Dette er en fremgangsmåte som krever meget erfarent personell eller meget kostbart utstyr eller instrumenter for nøyaktig partikkeltelling og fordeling på størrelse. Videre vil graden av spesifikk agglutinering i hvert enkelt tilfelle enten bli dårlig eller semi-kvantitativt, eller være meget kostbart og komplisert å utføre.

Skjønt det er utviklet visse instrumenterte prøver for utprøving av røde blodcellers type med agglutinering, så er utstyret for disse fremgangsmåter både kostbart og komplisert å bruke. Det er f.eks. foreslått en anordning for prøving av røde blodceller i et instrument som brukes under navnet "Autoanalyzer" fremstilt av Berkman et al og beskrevet i Transfusion, Vol. 11, nr. 6, side 317 og følgende (1971). I nevnte Autoanalyzer blir blodprøver og serum med antistoffer kombinert under spesielle omstendigheter i komplekse rørformede spiraler som er utformet slik at de skal frembringe en agglutinering. Den reagerte masse føres så forbi et T-rørledd med et av rørene i nedadvendt stilling, slik at de agglutinater som er blitt dannet har en tendens til å gå ned gjennom dette rør og deretter fjernes. Agglutineringen kan så påvises ved å måle graden eller'forskyvningen i optisk tetthet i den ikke-agglutinerte fraksjon som kommer ut i horisontal retning fra nevnte T-rør (Berkman et al.), eller ved å oppsamle agglutinatene fra den nedadvendte delen av T-røret på et filterpapir (Shield et al., Transfusion, Vol. 9, side 348, 1969). Apparatet er imidlertid komplekst og kostbart, og fører i seg selv ikke til en enkel og automatisk teknikk som er egnet for rutinebruk i blodbanker og lignende.

Et alternativt apparat er beskrevet under navnet "Groupamatic" og koster flere hundre tusen dollar (se Garretta et al., Vox Sang, Vol. 27, side 141, 1974). I dette apparatet blir serum og blodcellesuspensjoner kombinert slik at man får frembragt en agglutinering. Nærværet av agglutinering påvises ved å føre suspensjonen tvers over to lysstråler, hvorav den ene går gjennom sentrum av reaksjonskuvetten mens den andre går gjennom periferien. En forskjell i transmisjonen av strålene tas som et mål for styrken på agglutineringen. Det er imidlertid nødvendig med meget avansert elektronisk utstyr, og dette betyr at instrumentet blir så kostbart at det faller utenfor rekkevidde for de aller fleste blodbanker.

Prøver basert på en celleoppløsning er intet problem når reaksjonen på celleoverflaten mellom antigen og antistoff er effektiv med komplement, f.eks. for utprøving av vev. Dette er imidlertid meget sjeldent tilfelle med røde blodceller fra mennesker, hvor enten cellemembran antigen-antistoffkomplek-set reagerer ineffektivt med komplement eller antistoff-konsentrasjonen må være begrenset for å hindre en for intens agglutinering som mekanisk vil påvirke celleoppløsningen.

Slike problemer påvirker i høy grad driften av blodbanker hvor selv en vanlig rutineutprøving av typer for røde blodceller er en tidskrevende manuell operasjon som krever vanligvis mer erfarent og utdannet personell enn det som er tilgjengelig. Videre er det relativt få blodbanker som kan påta seg lymfocytotoksiske prøver som er nødvendig for ut-

prøving av forskjelluge typer vev. Det er videre ingen direkte immunologiske prøver som er tilgjengelige for å bestemme forenligheten mellom granulocytter, og det er bare en indirekte prøve for blodplater såsom 14.C-serotin-frigjøring. (Skjønt granulocytter og blodplater til en viss grad kan betegnes HL-A-typer for visse utvalgte og passende prøver, så vil slik type-prøving ikke garantere deres forenlighet).

Man har nå i foreliggende oppfinnelse oppdaget at

både agglutinering og celleoppløsningsprøver på blodceller hos mennesker i vesentlig grad kan betydelig forbedres når et monolag av reaktive celler irreversibelt bindes til en fast matrise.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således til-veiebragt en fremgangsmåte for bestemmelse av celletype eller forenlighet på en fast matrise, og denne fremgangsmåte er kjennetegnet ved at man

(a) danner et første monolag av celler, slik som erytrocytter som irreversibelt bindes til en fast matrise, idet cellene har egne eller ervervede antigener, (b) bringer nevnte lag (a) i kontakt med en oppløsning inneholdende antistoffer som kan bindes ved immunoabsorpsjon til nevnte første lag (a) av celler i den grad antistoffene i nevnte oppløsning er reaktive med antigenene i cellene i det første laget, (c) deretter påfører en suspensjon av andre celler, slik som andre erytrocytter, idet disse og andre celler har antigener derpå, og (d) måler graden av immunoadhering av nevnte andre cellelag som bindes ved antistoff til nevnte første cellelag.

Ved en irreversibel binding av celler til en fast matrise mener man binding av reaktive celler ved molekylære krefter, slik som en dannelse av kovalente kjemiske bindinger mellom posisjoner på celleoverflaten og reaktive grupper på substratet, eller ved at det dannes bindinger ved svakere molekylære krefter som van der Waal-krefter, kolumbske krefter,

eller hydrogenbindinger som vil motstå effekten av de videre utprøvingsbetingelser. Ikke bare øker man sensitiviteten

eller følsomheten ved prøvingen, men resultatet av immun-reaksjonen lar seg lett måle ved enkle instrumenter.

Som en enkel illustrasjon kan nevnte blodtypeprøver utføres i tre trinn:

(1) Et encellet lag av erytrocytter (som en illustrasjon,

så vil disse bli betegnet type A), bindes irreversibelt til en fast matrise; (2) ved å bruke monolaget av celler som et immuno-adsorpsjonslag, blir antistoffer som anti-A-antistoffer påført og adsorbert spesifikt, og (3) de antistoffbelagte celler kan nå prøves for deres evne til å binde et annet monolag av celler som bærer passende antigener (fastfase-agglutinering) .

Prøveresultatet kan bedømmes på enhver hensikts-

messig måte, f.eks. ved undersøkelse under et mikroskop, men det er av spesiell viktighet i foreliggende oppfinnelse at prøve-resultatene er spesielt godt egnet for bedømmelse ved tetthets-målingsteknikk hvor man bruker lett tilgjengelige standard-instrumenter. For en fastfase-hem-agglutinering kan nevnte prøve-plater fremstilt slik det er beskrevet ovenfor, underkastes en statisk eller skanderingsmåling av tetthet ved bølgelengder hvor hemoglobininnholdet i de prøvede erytrocytter absorberer lyset (f.eks. blått lys med en bølgelengde på 415 nm er meget godt egnet). Måling av tetthet ved skandering innbefatter bare bruken av veletablert og kjent laboratorieutstyr som er lett tilgjengelig, og som gir et kvantitativt svar på følgende spørs-mål: (1) Er det dannet et annet lag? .(2) Hvor mange celler representerer nevnte andre lag? og (3) Hvorledes er fordelingen med det andre lag? (Med "fordeling" forstås ensartetheten eller jevnheten av det andre lag. Et ensartet annet lag innbefatter at 100% av cellene i den påførte suspensjon bærer det nødven-

dige antigen slik at de bindes til det første lag, mens en ujevn fordeling innbefatter at det opptrer noen "negative" celler i den påførte suspensjon).

I den fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor for bedømmelse av immunologiske faktorer på celleoverflater,

kan nærværet av antistoffer eller antigener som er immuno-adsorbert fra nevnte oppløsning, hensiktsmessig påvises ved å påføre en ny suspensjon av den cellepopulasjon som skal

prøves, etter at det bundne monocellelag er reagert med antigen (eller antistoff)-oppløsningen, og så måle dannelsen av et nytt cellelag hvor antigenet (eller antistoffet) med kjent spesifdtet virker som et kryssbindingsmiddel.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan også brukes for å prøve nærvær av konkurrerende reaksjoner, mellom oppløsninger eller suspensjoner som man antar eller mistenker for å ha antigeniske egenskaper. Således kan et irreversibelt bundet monocellelag fremstilles som beskrevet ovenfor. Dette lag kan så kontaktes med en blanding av to opp-løsninger, en som inneholder antigener eller antistoffer med kjent spesifitet for å danne immunoadsorbsjon på et bundet monocellelag, og en annen oppløsning eller suspensjon som skal prøves. Konkurrerende binding av de kjente antistoffer eller antigener ved faktorer som er tilstede i den andre oppløsning eller suspensjon vil reflekteres ved en reduksjon av dannelsen av nevnte immunoadsorbsjonsreaksjon med det irreversibelt bundne cellelag.

Parallelt med denne fremgangsmåte fremstiller man et iiionocellelag med et annet lag av antigener bundet slik det er beskrevet ovenfor. Konkurrerende reaksjoner kan så måles mellom en suspensjon av celler som er i stand til å danne et annet monocellelag og en annen oppløsning eller suspensjon som inneholder ukjente faktorer som skal prøves. Nærværet av konkurrerende immunologiske reaksjoner mellom disse to suspensjoner vil kunne påvises ved en reduksjon i dannelsen av et annet monocellelag.

Innenfor disse generelle retningslinjer kan man tenke seg følgende prøvemetoder: 1 _. Bestemmelse av antigener ved konkurrerende immunoadsorpsjon Denne bestemmelse eller analyse innbefatter følgende trinn (a) at man påfører en fast matrise, en første suspensjon av celler som man vet bærer antigener som skal prøves, under slike betingelser at man effektivt og irreversibelt får bundet et lag av nevnte celler til nevnte matrise; (b) kontakter nevnte lag (a) med en blanding av (i) en oppløsning av et antistoff som lar seg reagere ved immunoadsorbsjon med det antigen som bæres av cellene i nevnte lag (a), og (ii) en annen oppløsning eller suspensjon som skal bedømmes for antigen ved konkurrerende hemming av antistoffet i nevnte oppløsning (i); og (c) deretter måler hvorvidt og hvor sterkt nevnte antistoff i opp-løsning (i) er bundet ved immunoadsorpsjon til nevnte lag (a) .

2. Bestemmelse av antigener ved konkurrerende hemming

Denne bestemmelse innbefatter følgende trinn: (a) at man påfører en fast matrise en første suspensjon av celler som inneholder antigener som skal prøves, under slike betingelser at man effektivt og reversibelt binder et lag av nevnte celler til nevnte matrise; (b) påfører nevnte lag (a) en oppløsning inneholdende et antistoff som reaktivt ved immunoadsorpsjon reagerer med antigener på cellene i nevnte lag (a); og (c) deretter påfører en blanding av (i) en annen suspensjon av celler fra nevnte populasjon, og (ii) en suspensjon eller oppløsning inneholdende et antigen som konkurrerende vil reagere med det immuno adsorberte antistoff i nevnte oppløsning (b) , og deretter måler hvorvidt celler fra nevnte andre suspensjon danner et annet cellelag på nevnte matrise.

3. Bestemmelse av antigener i nærvær av antistoffer i en cellepopulasjon

Denne bestemmelse innbefatter følgende trinn: (a) at man påfører en fast matrise en første suspensjon av celler som er kjent for å ha antistoffer, under betingelser slik at man effektivt og irreversibelt binder et lag av celler på nevnte matrise; (b) kontakter nevnte lag (a) med en blanding av (i) en oppløs-ning som skal prøves for antigen og (ii) en annen oppløsning eller suspensjon som inneholder antistoffer som reagerer ved immunoadsorpsjon med de antigener som skal prøves ved såkalt konkurrerende hemming; og (c) deretter måler graden hvorvidt slike antigener i oppløsning (i) er bundet ved immunoadsorpsjonen på nevnte lag (a).

I hver av de foregående fremgangsmåter kan graden

av immunoadsorpsjon bestemmes ved en eller flere av de teknikker som generelt er beskrevet ovenfor.

Til tross for langvarige kliniske problemer forbundet med utprøving i blodbanker samt nødvendigheten av å for-

bedre fremgangsmåter og gjøre disse tilgjengelige for instrumentering og automasjon, har det vært lite fremgang på feltet i de senere år. I en rekke år har man brukt de såkalte "Eldon"-kort for prøver av blodtyper. Disse kort er bl.a. beskrevet i US-patent 2.770.572. Dette patent beskriver et prøvekort som

kan brukes for prøving av typer i menneskeblod, hvor et bærende ark bærer på forskjellige steder på overflaten tørkede prøver av forskjellige sera som inneholder antistoff-faktorer i en blanding med konglutinin eller konglutinin-erstatningsstoffer.

Når man utfører en blodtypeprøve ved hjelp av dette kort, blir blodprøver fra den pasient hvis blod man skal typebestemmes plasert i små dråper på de forskjellige serumflekker som finnes på kortet, og deretter undersøkt etter en passende reaksjonstid for nærvær eller fravær av agglutinering. Prøvene er imidlertid begrenset til anti-A, anti-B og anti-Rh (RhQ eller D) , og selv disse prøver er forbundet med betydelige tolkningsfeil.

Mer nylig er det i US patent 3.666.421 beskrevet

et annet diagnostisk prøveobjektglass hvor serologiske reagenser er plassert i dråper på prøveglasset og tørket til en flekk som deretter kan rekonstitueres og reageres i en agglutinerings-reaksjon for identifikasjon av blodtype (eller andre antigen-antistoff-reaksjonssystemer som lar seg identifisere ved agglutinering) . Det objektglass som er beskrevet i sistnevnte US patent,

ér imidlertid utsatt for de defekter som er karakteristisk for vanlig flytende fase-agglutinering, idet prøven i alt vesentlig bare viser nærvær eller fravær av agglutinering og er avhengig av en bedømmelse av erfarent personell for å bestemme hvorvidt agglutineringen er et resultat av en spesifikk antigen-antistoff-reaksjon eller kun er et resultat av en ikke-spesifikk celle-aggregering. Det er vanskelig eller umulig å bedømme hvorvidt frie uagglutinerte celler er til stede sammen med sammenklumpede celler i spesifikke agglutinater.

US patent 3.770.380 beskriver en anordning som er angitt å kunne bedømme immunoadherings-reaksjoner. Det skal imidlertid bemerkes at nevnte immunoadheringsreaksjoner som beskrives i dette US patent, skiller seg fra de immunoadsorpsjons-fenomener som foreliggende oppfinnelse er basert på. Immunoadhering er en ikke-spesifikk sammenklumping av partikler eller celler som skyldes nærværet av komplement, og i denne prøve er det komplementet som forårsaker bindingen. Immunoadhering er karakterisert ved ikke-spesifikke reaksjoner mellom komplementet og de partikler eller celler det binder. Immunoadsorpsjon er på den annen side en spesifikk binding mellom antigeniske posisjoner på en cellemembran og de antistoffer som måtte være til stede i et serum. Således er immunoadsorpsjon i motsetning til immunotilfesting en spesifikk binding mellom antigener og antistoffer.

Den anordning som er beskrevet i US patent 3.770.380f er en flat cellelignende struktur som er belagt med suksessive lag av et bakterie- eller virusholdig materiale som et topp-

lag, som er bundet til bunnen av cellestrukturen eller anordningen ved hjelp av et transparent tørket proteinunderlag. Immunoadherings-reaksjoner mellom bakterier eller virus i det således preparerte lag og røde celler som har antistoff og komplement i en prøvevæske som påføres, kan så bedømmes ved å bestemme graden hvorved de spesielt fremstilte røde celler i den på-

førte væske fester seg til det bakterie- eller virusholdige topplag. Den fremgangsmåte som er beskrevet i US patent 3.770.380, har ikke funnet praktisk klinisk anvendelse på grunn av at immunoadhering i seg selv ikke er særlig anvendbart, og fordi immunoadhering er en ikke-spesifikk reaksjon som ikke er egnet for bedømmelse av spesifikke antigen-antistoff-reaksjoner.

Et lag av blodceller innleiret i et fast bærende lag er blitt brukt for visse vitenskapelige formål som ikke har noe å gjøre med blodtyper og prøving av forenlighet. Slike lag er ikke bundet ved kovalente eller andre molekylære krefter.

Således beskriver Goodman (Nature, 193:350, 1962) en kolonne av formaliniserte røde blodceller fra mennesker innleiret i polyuretan som han brukte for å fraksjonere anti-antistoffer fra røde blodceller hos mennesker på basis av deres bindestyrke til de innleirede røde celler. Edelman et al. (Proe. Nati. Acad.

Sei. 68:2153, 1971) fraksjonerte blodceller på basis av deres evne til spesifikt å binde seg til lektiner, antistoffer eller antigener som på forhånd var bundet til partielt hydrolyserte nylonfibre.

Prinsippet med å binde en prostetisk gruppe (i et antigen, antistoff, enzym, etc.) til en fast matrise, er en velkjent og etablert biokjemisk metode (se Cuatrecases og Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40:259, 1971), og er meget

anvendt i fast fase radioimmunoprøver (se Brit. Med. Bull., 30:1-103, 1974). Imidlertid har blod eller andre celler ikke vært bundet irreversibelt til en fast matrise for å lette blod-typeprøving eller forenlighetsprøving, etc.

Det er i det etterfølgende gitt en beskrivelse av oppfinnelsen med hensyn til de nåværende brukte prøver med erythrocyter. Polystyren-prøverør ble belagt med fibrinogen (mengde 0,5 mg/ml) som binder irreversibelt. Etter vasking ble polylysin (0,1 mg/ml) påført det bundne fibrinogen. Etter ytterligere vasking tilførte man en suspensjon av enten normal eller proteasebehandlede erytrocytter (RBC). Disse erytrocytter ble bundet irreversibelt (for det formål at de skulle prøves) som et monolag på den polysin-fibrinogen-belagte polystyren-overflate. Bindings-tettheten på o 2 x 10 6 erytrocytter pr. cm 2 er i god overensstemmelse med det som kunne forventes for slike erytrocytter som har en diameter på 7 mikrometer.

Monocellelaget av de bundne erytrocytter er stabilt og vil i sin tid kunne tjene som et immunoadsorpsjonsmiddel for å binde antistoffer fra en påført oppløsning eller et serum som er spesifikt til antigeniske posisjoner på membranene i de bundne erytrocytter.

Metoden for å binde blodceller som et monolag på en fast matrise er ikke nødvendigvis begrenset til ovennevnte formål. Den litteratur som angår kobling av proteiner til polymerer (se Cuatrecases og Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40: 259, 1971) angir at man som et alternativ kan bruke preparater av polymerer (flak av polyuretan, polystyren, etc.) som på

sine overflater inneholder reaktive grupper som glutaraldehyd, cyanogenbromid, amino eller karboksylgrupper, og andre som vil tillate en direkte kovalent binding av blodceller til matrisen.

Det er selvsagt at bindestoffet ma være immunologisk inaktivt med hensyn til eventuelle antigener eller antistoffer som kan være til stede i de prøveoppløsninger som kan anvendes.

Andre substrater eller matriser som kan brukes i foreliggende oppfinnelse, kan være ethvert hensiktsmessig materiale som (1) er av en slik karakter at et monocellelag irreversibelt kan bindes slik det er beskrevet ovenfor, og (2)

er egnet for å brukes med hensyn til den påvisningsmetode som skal brukes. Ettersom de fleste hensiktsmessige påvisningsmetoder er basert på lystransmisjon, såsom mikroskopisk telling og skanning 'med hensyn til tetthetsmåling, så er det foretrukket at man bruker et lystransparent substrat. Hvis man imidlertid skal bruke måling av radioaktivitet, så er det selvsagt unødvendig å bruke et lystransparent materiale.

For det foreliggende formål kan substratet eller matrisen ganske enkelt være innersiden av et prøverør. Hvis en densiometrisk avsøkningsmetode skal brukes for å bedømme prøve-resultatene, så er det hensiktsmessig å bruke en flat overflate. Hvis man skal bruke prøving i stor skala, kan man bruke striper av matriser med cellebindende egenskaper for å fremstille det første cellelaget. Deretter kan antistoffer merkes og prøves for sin kapasitet til å binde et annet cellelag av ukjent type. Det kvantitative resultat av begge prøver kan så bestemmes

ved skanningdensiometri ved tap av farge som indikerer opp-løsning eller øking av farge som indikerer binding av et annet lag av røde celler. For det sistnevnte formål kan det være passende som en del av flekkprepareringen hypotonisk å oppløse det første cellelag slik at dets bakgrunn ikke trenger å fratrekkes prøveresultatene. Hypotonisk oppløsning vil ikke i særlig betydelig grad fjerne membranbundet antistoff, og dannelsen av et annet cellelag kan påvises visuelt eller ved optisk densiometri ved hjelp av dets hemoglobininnhold. Ved å bruke skanningdensiometri f.eks. ved 415 nm, kan man oppnå kvantitative svar på spørsmål som f.eks. "Er det dannet et annet lag?","hvor mange celler (sett på bakgrunn av et kjent maksimum) representerer det annet lag?", "hva er fordelingen av det annet lag?".

For å få et svar på det siste spørsmål må den cellesuspensjon som påføres det antistoffbelagte monocellelag bare ha tilstrekkelig konsentrasjon til at man får avsatt et annet monocellelag. Det annet lag vaskes så for å fjerne ubundne celler, hvoretter fordelingen av de bundne deler av annet lag blir en funksjon av prosentsats av "positive celler" som kan feste seg, og "negative" celler som ikke binder seg. Hullene eller øyene som blir et resultat kan påvises ved mikroskopisk skanningdensiometri, og deres frekvens og størrelse kan uttrykkes som en prosentsats av den avsøkede overflate.

Det skal bemerkes at i foreliggende oppfinnelse vil bindingen av antistoff ved en immunoadsorpsjon til et lag av røde blodceller flere viktige fordeler. For det første kan man bruke sera med konsentrasjoner av antistoffer som er for lave for vanlige væskefaseprøver, fordi deres spesifikke anti-stoffinnhold kan konsentreres som bundet antistoff på monocellelaget. For det annet, under omstendigheter hvor ufortynnet sera ikke kan brukes i væskefaseprøver på grunn av andre serumprote-iner, så kan slik påvirkning elimineres i en prøve med fast fase ved at man selektivt adsorberer det antistoff som skal prøves og hvoretter man vasker for å fjerne andre påvirkende proteiner. For det tredje er mange sera ubrukbare for væskefaseprøver på grunn av at de inneholder ikke-fjernbare antistoffer med uønsket spesifitet. Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse kan man ved et passende valg av celler som skal danne det første lag adsorbere bare de antistoffer som skal prøves.

Foreliggende oppfinnelse er meget godt egnet for prøving av både celletype og celleforenlighet. For celletypi-fisering vil man f.eks. konstruere et første lag med sitt bundne antistoff av celler og antistoffer av en kjent type. Typifi-seringen av ukjente celler fra en pasient eller blodgiver kan så bestemmes fra deres evne til å danne et annet cellelag. For å utføre forenlighetsprøver kan blodgiverens celler brukes til å danne det første monocellelag som deretter reageres med hensyn til mulige antistoffer i en pasients serum, som så vil bli bundet ved immunoadsorbsjon. Deretter kan disse påvises ved å bestemme evnen til oe bundne antistoffer fra pasientens serum (og graaen av hvorvidt slik binding skjer eller opptrer) til å danne et annet lag av de samme blodgiverceller etter en ny påføring.

Påvisningsmetoder som er egnet for bruk i foreliggende oppfinnelse vil være innlysende for fagfolk. Erytrocytter inneholder sin egen etikett, nemlig pigmentert protein (hemo-globin) som har en maksimal adsorbsjon ved 415 nm. Nærvær eller fravær av erytrocytter kan derfor hensiktsmessig påvises slik det er beskrevet ovenfor. Man kan imidlertid også bruke annen påvisningsteknikk hvis dette er ønskelig. Slik teknikk innbefatter at man bruker radioaktive atomer (f.eks. <51>Cr, 125I) biokjemisk teknikk (f.eks. ved hjelp av et utvalgt intracellu-lært enzym) eller påvisning ved hjelp av fluorescens (f.eks.

ved å bruke en molekylær forbindelse for å identifisere enten en levende eller død celle). Alle disse metoder kan lett instrumenteres og derfor gjøres automatiske. De kan enten anvendes for serologiske prøver i blodbanker, medisinsk blod-prøve-typifisering, vevstypifisering og prøver før blodover-føring eller før transplantering for forenlighet.

Det er velkjent at en rekke fremgangsmåter som nå brukes i væskefaseprøver like godt kan brukes i prøver hvor man bruker fast fase. Disse inkluderer optimal bruk av additiver som er velkjent for å fremme agglutinering (f.eks. symmetriske og asymmetriske hydrofile kolloider, protease, ionisk konsentrasjon, polyelektrolytter, tonisitet og buffersystemer for å kontrollere pH). Disse faktorer er blant annet beskrevet av Berkman et al., Transfusion, 11:317,(1971).

Det skal bemerkes at foreliggende oppfinnelse også har anvendelse på andre problemer som innbefatter immunospesi-fikke cellereaksjoner. En slik prøve er antiglobulinprøver for å bedømme celler for deres belegg av IgG, IgM, IgA, IgD og IgE immunoglobuliner, og ved C3, C4 og andre komplementkomponenter eller bundne aktiveringsprodukter (se Rosenfield et al., Vox-Sang, 26:289-333, 1974). Et annet anvendelsesområde vil være fast fase-prøver med kvantitativ bedømmelse, av både passive og reversert passive hemaglutinasjonsprøver. Passive hemaglutina-sjonsprøver kan brukes for direkte analyse av antistoffkonsentrasjon og også for indirekte analyse av oppløselige antigenkonsentrasjon ved konkurrerende binding på basis av felles antigener (Nusbacher et al., J. Immunol., 108:893, 1972). Reverserte passive prøver måler oppløselig antigen direkte

(Cook, Immunol. 8:74, 1965 og Juji og Yokochi, Japan, J. Exptl. Med., 39:615, 1969). På lignende måte som blodceller kan prøves for deres følsomhet overfor antistoffstyrt agglutinering eller oppløselighet ved prøver i faste faser, så kan bakterier, protozoer, sopp og kultiverte cellelinjer enten fra vev eller svulster, analyseres for antigeniske bestanddeler på sin overflate ved de fast-faseprøver som er beskrevet i dette patent.

Man kan endog forutse at man kan bruke fast-faseprøver for å

løse problemer som angår molekylær antistoffkonsentrasjon, K-verdien for antistoffbindingen og graden av K-verdiens hetero-genitet .

Det er underforstått at mange av de underliggende kjemiske prinsipper som er brukt i foreliggende oppfinnelse er velkjente. Oppfinnelsen er enestående fordi man ikke tidligere har forstått at disse prinsipper kunne brukes for å konstruere et fast fase-monocellelag som effektivt kan utføre blodcelle-typifisering og prøver for å undersøke forenligheten mellom blodceller og andre celler.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Blodtypifisering. Problemet med typifisering av røde blodceller hos mennesker og påvisning av anti-røde blodcelleantistoffer hos mennesker ved en pre—transplanterings-forenlighetsprøve, er betydelige. De eneste metoder man har for å påvise disse blodtyper ved en direkte agglutinering, er både kostbare og krever komplisert instrumentering (Berkman, E.M. et al., Transfusion, 11:317, 1971). Man har imidlertid nå anvendt og tilpasset instrumenterte væskefasemetoder til fast faseprøvemetodikk, og man har oppnådd spesifikk typifisering av Rh, Keil, Kidd, Duffy, Xg<a>, Lewis, Lutheran og MNSs, alle med en følsomhet som overgår det man oppnår med de tidligere beskrevne instrumenterte prøver i væskefase.

For blodtypifisering anla man et monocellelag av røde blodceller på følgende måte: Ved å bruke "Falcon" polystyren-prøverør (10 mm indre diameter x 75 mm) påførte man 0,2 ml av en fibrinogenoppløsning (0,5 mg/ml) i 2 min. hvoretter man etter vasking påførte 0,2 ml 140.000 molekylvekt poly-D-lysin HBr-oppløsning (0,1 mg/ml) i 2 min. Etter ytterligere vasking påførte man

0,2 ml av en 2-5% (volum/volum) suspensjon av type A^-celler i 0,9% NaCl i 2 min. Dette resulterte i at man fikk festet et flatt monolag av røde celler med en tetthet på 2 x 10 6 celler/cm 2. Disse røde celler forble tilfestet til

tross for tallrike vaskinger.

Det således oppnådde monocellelag ble først eksponert overfor kjent spesifikt antistoff (0,2 ml), og deretter hypotonisk lysert med destil-lert vann. På dette tidspunkt lot man et nytt belegg med 0,1 ml røde blodceller i en styrke på 0,2% (volum/volum) sedimentere seg ved hjelp av tyngde-kraften som et lett annet monocellelag. Det var nå mulig å forsterke den spesifikke antistoffbinding i dette andre monocellelag på en rekke måter. For eksempel anvendte man med godt resultat den lavioniske metode som er beskrevet av Berkman et al., ved først å erstatte den overliggende væske med en oppløsning av 5% mannitol og 0,0025% protaminsulfat ved pH 6,0, og etter 5 min. ved romtemperatur vaske nevnte andre monocellelag med 0,0014 M sulfat bufret med 0,85% NaCl ved pH 7,3. Dette fjernet ikke-antistoffbundne kjente negative celler, men ikke antistoffbundne kjente positive celler. Andre fremgangsmåter for å forsterke de antistoffbundne celler viser seg å være enda mer fordelaktig, og noen av disse kunne ikke brukes med hell i forannevnte Berkmans væskefasemetode. Man kunne således øke den spesifikke antistoffbindingen i nevnte andre monocellelag ved at man i sekvens erstattet den overliggende væske først med en buffer ved 7,0 inneholdende 2,5 % PVP og så med en tilsvarende buffer ved 6,0 inneholdende 0,01 % protaminsulfat. Laget ble så vasket med 0,2M fosfatbuffer ved pH 7,3. Således er det innlysende at mulighetene for å forsterke den faste fase agglutinering er tallrike, fordi fremgangsmåten unngår mange av de problemer som oppstår med væskefaseprøver.

Disse faste faseprøvene har vist seg å være ekstra-ordinært følsomme for påvisning av IgG Rh-antistoff. Man har oppnådd omtrent den samme følsomhet på et antistoffmolekyl pr. rød blodcellebasis slik det er beskrevet tidligere for en forsterket autoanalysator-prøve, d<y>s. io antistoffmolekyler pr. celle ved 50 % hemagglutinering (Rosenfield et al., Ann. N.Y. Acad. Sei., 190:519, 1971). Med prøver med faste faser kan man imidlertid anvende en tusendedels færre røde blodceller og ha en 1000 ganger sterkere arbeidsfølsomhet, idet man kan påvise ca. 1 pg antistoffprotein pr. ml, noe som overstiger følsomheten for enhver tidligere beskrevet prøve, blant annet prøver fo • såkalt celleoverleving in vivo.

Prøver med anti-Rh ble også utført med hell med proteasebehandlede røde blodceller. Slike prøver ble utført på flatbunnede mikrotitrerings-polystyrenskiver som tillot en mikroskopisk undersøkelse av spesifikt tilfestede røde blodceller. Bundne celler var bare tilstede hvis de var Rh-positive, og i prøver med kunstige blandinger av Rh-positive og Rh-negative røde blodceller, kunne man observere "huller" fra ikke-tilfestede celler som tilsvarte i overflateareal den prosentsats man hadde av Rh-negative celler i den kunstige blanding. Dette resultat indikerer klart at foreliggende oppfinnelse kvantitativt kan fastslå mengden av ubundne celler i en blodprøve, noe som er et uhyre viktig problem både ved prøver på såkalt transfusert celleoverleving ved Ashby-metoden (Arch.

Int. Med., 35:516, 1925) og ved karakterisering av chimærer hos mennesker (Race og Sanger, "Blood Groups in Man", Davis, 1968, side 475-490).

Eksempel 2

Direkte antiglobulinprøver. Disse prøver ble utført som blodtypifiseringsprøvene, bortsett fra at de vaskede blodceller fra en pasient hvor man hadde mistanke om en hemolytisk anemi ble brukt for å konstruere både det første og det annet monocellelag. Det første monolag (bundet av polylysin-fibrinogen) ble eksponert overfor et enkelt xenogenisk anti-menneske-globulinserum, og syv spesifiteter ble bedømt. Disse sera var individuelt spesifikke for IgG, IgM, IgA, IgD, IgE,

C3 og C4. Det antistoffbelagte første monocellelag ble så hypotonisk oppløst og vasket før man påførte celler for nevnte andre monocellelag. Binding av dette andre monocellelag ble forsterket ved å tilsette 1 % K-90 polyvinylpyrrolidon (PVP, midlere molekylvekt 300.000) i 0,9 % NaCl. Det andre monolag ble til slutt vasket med enkel 0,9 % NaCl-oppløsning. Fremgangsmåten ligner meget på den som er beskrevet av Hsu et al (Vox Sang, 26:305, 1974), men positive resultater ved prøving med fast fase var langt bedre enn de man får med Hsu<1>s instrumenterte prøver med væskefase. En pasient med aktiv hemolytisk anemi, som på grunn av intens spontan agglutinering i væskefase med PVP, ikke kunne typifiseres for tilfestede proteiner, fant man var klart positiv for IgG, IgM, IgA, IgE, C3 og C4 .

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av celletype eller forenlighet på en fast matrise, karakterisert ved at man (a) danner et første monolag av celler, slik som erytrocytter som irreversibelt bindes til en fast matrise, idet cellene har egne eller ervervede antigener, (b) bringer nevnte lag (a) i kontakt med en oppløsning inneholdende antistoffer som kan bindes ved immunoadsorpsjon til nevnte første lag (a) av celler i den grad antistoffene i nevnte oppløsning er reaktive med antigenene i cellene i det første laget, (c) deretter påfører en suspensjon av andre celler, slik som andre erytrocytter, idet disse andre celler har antigener derpå, og (d) måler graden av immunoadhering av nevnte andre cellelag som bindes ved antistoff til nevnte første cellelag.