NO153987B

NO153987B - PROCEDURE FOR DETERMINING CELL TYPE OR COMPATIBILITY ON A FIXED MATRIX.

Info

Publication number: NO153987B
Application number: NO762801A
Authority: NO
Inventors: Richard E Rosenfield; Shaul Kochwa
Original assignee: Sinai School Medicine
Priority date: 1975-08-14
Filing date: 1976-08-12
Publication date: 1986-03-17
Also published as: ATA604776A; NO762801L; NO153987C; IT1076463B; FR2321127A1; SE8503429L; NO153988C; ZA764880B; NL7609061A; NO840135L; FR2321127B1; DE2636616A1; SE7609089L; CH631550A5; CA1089359A; GB1555142A; AU1684076A; DK153425B; BE845201A; NO153988B

Abstract

FREMGANGSMÅTE FOR BESTEMMELSE AV CELLETYPE ELLER FORENLIGHET PÅ EN FAST MATRISE.PROCEDURE FOR DETERMINING CELL TYPE OR COMPATIBILITY ON A FIXED MATRIX.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for bestemmelse av celletype eller forenlighet på en fast matrise. The present invention relates to a method for determining cell type or compatibility on a fixed matrix.

For mange medisinske formål er det nødvendig å For many medical purposes it is necessary to

bestemme forenligheten mellom blod fra en giver og en pasient. Blodcelleforenligheten bestemmes ved en ikke-opptreden av en immunologisk reaksjon mellom antistoffer i blodserum hos en pasient og antigenet som er tilstede i blodceller fra en giver. Hvis f.eks. blodcellene hos en pasient er av type A (dvs. har "A"-antigener på de røde blodceller), så vil serum fra en slik pasients blod ha anti-B-antistoffer, dvs. antistoffer som vil reagere med "B"-celler. Hvis en slik pasient får "B"-blod, så determine the compatibility of blood from a donor and a patient. Blood cell compatibility is determined by a non-occurrence of an immunological reaction between antibodies in the blood serum of a patient and the antigen present in blood cells from a donor. If e.g. the blood cells of a patient are of type A (i.e. have "A" antigens on the red blood cells), then serum from such a patient's blood will have anti-B antibodies, i.e. antibodies that will react with "B" cells . If such a patient receives "B" blood, then

vil det skje en immunologisk reaksjon mellom nevnte anti-B-antistoffer hos pasientens serum og B-antigenene i de røde blodceller fra giveren. En slik uforenlighet kan resultere i meget alvorlige tilstander på grunn av en intravaskulær hemo-lyse. an immunological reaction will occur between said anti-B antibodies in the patient's serum and the B antigens in the red blood cells from the donor. Such an incompatibility can result in very serious conditions due to an intravascular haemolysis.

Prøver på blodcellers type og forenlighet er vanlig- Tests for blood cell type and compatibility are common-

vis av to typer: (i) en prøve for å bestemme hvorvidt et spesifikt antistoff tilsatt cellene vil frembringe en agglutinering av disse, og (ii) en prøve for å bestemme hvorvidt et spesifikt antistoff som tilsettes de prøvede celler sammen med serumkomplement vil forårsake celleoppløsning. show of two types: (i) a test to determine whether a specific antibody added to the cells will cause their agglutination, and (ii) a test to determine whether a specific antibody added to the sampled cells together with serum complement will cause cell lysis .

Den første av disse to typer prøver, dvs. agglutinering, refererer seg til en sammenklumping av blodceller som f.eks. inneholder type A-antigener, og hvor anti-A-antistoffer tilsettes i et fravær av komplement. A-antigenet og anti-A-antistoffene reagerer spesifikt med hverandre ved en immunolo- The first of these two types of tests, i.e. agglutination, refers to a clumping of blood cells such as contains type A antigens, and where anti-A antibodies are added in the absence of complement. The A antigen and the anti-A antibodies react specifically with each other in an immunological

gisk reaksjon hvor antistoffet danner broer mellom tilstøtende celler. Dette fører til en sammenbundet masse av blodceller som bindes til hverandre ved hjelp av de nevnte tilsatte antistoffer. gic reaction where the antibody forms bridges between adjacent cells. This leads to a connected mass of blood cells which bind to each other with the help of the aforementioned added antibodies.

Den andre av de to prøver som er nevnt ovenfor, dvs. The second of the two samples mentioned above, i.e.

celleoppløsning, angår oppriving eller oppløsning av celle-membranen som fører til en.celledød, og som gjør at de frigir sitt indre innhold. "Celleoppløsning" er et resultat av en reaksjon som skjer mellom antistoffer som er bundet til celle-membranene og en gruppe potensielt destruktive proteiner i normalt serum (ofte kalles disse "komplement"). cell dissolution, refers to tearing or dissolution of the cell membrane which leads to cell death, and which causes them to release their internal contents. "Cell lysis" is the result of a reaction that occurs between antibodies bound to the cell membranes and a group of potentially destructive proteins in normal serum (often called "complement").

Begge de ovenfor beskrevne fremgangsmåter brukes for utprøving av type og forenlighet i cellulære blodelementer, Both of the methods described above are used for testing the type and compatibility of cellular blood elements,

dvs. erytrocytter, granulytter, lymfocytter og trombocytter eller plater. Skjønt de ofte brukes bare kvalitativt, så er begge metoder reelt kvantifiserbare og har vært brukt separat for bedømmelse av antigen, antistoff og serumkomplement. i.e. erythrocytes, granulocytes, lymphocytes and thrombocytes or platelets. Although they are often used only qualitatively, both methods are actually quantifiable and have been used separately for the assessment of antigen, antibody and serum complement.

I de fremgangsmåter som brukes i vanlige medisinske klinikker i dag for prøving av celletyper og deres forenlighet, så er både agglutineringsprøvene og celleoppløsningsprøvene utført i en flytende fase, dvs. at serum som inneholder antistoffer med eller uten det komplement som skal prøves, blir blandet med suspensjoner av blodceller hvor man ønsker å få en utprøving av deres type og forenlighet. Vanligvis blir det brukt faste volumer. In the methods used in ordinary medical clinics today for testing cell types and their compatibility, both the agglutination tests and the cell dissolution tests are carried out in a liquid phase, i.e. serum containing antibodies with or without the complement to be tested is mixed with suspensions of blood cells where one wishes to have a trial of their type and compatibility. Generally, fixed volumes are used.

En bedømmelse av resultatene etter en agglutinerings-prøve krever at en tekniker eller lignende kvalifisert personale kan skille mellom en celleagglutinering som skyldes nevnte spesifikke antigen-antistoff-molekylbrodannelse fra en ikke-spesifikk celle-aggregering, hvor urelaterte krefter også kan forårsake en viss grad av sammenklumping. Nevnte teknikker må også være i stand til å skille frie uagglutinerte celler som kan være til stede fra sammenklumpede eller agglutinerte celler. Dette er en fremgangsmåte som krever meget erfarent personell eller meget kostbart utstyr eller instrumenter for nøyaktig partikkeltelling og fordeling på størrelse. Videre vil graden av spesifikk agglutinering i hvert enkelt tilfelle enten bli dårlig eller semi-kvantitativt, eller være meget kostbart og komplisert å utføre. An evaluation of the results after an agglutination test requires that a technician or similarly qualified personnel can distinguish between a cell agglutination due to said specific antigen-antibody molecule bridging from a non-specific cell aggregation, where unrelated forces may also cause some degree of clumping. Said techniques must also be capable of distinguishing free unagglutinated cells that may be present from clumped or agglutinated cells. This is a procedure that requires very experienced personnel or very expensive equipment or instruments for accurate particle counting and size distribution. Furthermore, the degree of specific agglutination in each individual case will either be poor or semi-quantitative, or be very expensive and complicated to perform.

Skjønt det er utviklet visse instrumenterte prøver for utprøving av røde blodcellers type med agglutinering, så er utstyret for disse fremgangsmåter både kostbart og komplisert å bruke. Det er f.eks. foreslått en anordning for prøving av røde blodceller i et instrument som brukes under navnet "Autoanalyzer" fremstilt av Berkman et al og beskrevet i Transfusion, Vol. 11, nr. 6, side 317 og følgende (1971). I nevnte Autoanalyzer blir blodprøver og serum med antistoffer kombinert under spesielle omstendigheter i komplekse rørformede spiraler som er utformet slik at de skal frembringe en agglutinering. Den reagerte masse føres så forbi et T-rørledd med et av rørene i nedadvendt stilling, slik at de agglutinater som er blitt dannet har en tendens til å gå ned gjennom dette rør og deretter fjernes. Agglutineringen kan så påvises ved å måle graden eller'forskyvningen i optisk tetthet i den ikke-agglutinerte fraksjon som kommer ut i horisontal retning fra nevnte T-rør (Berkman et al.), eller ved å oppsamle agglutinatene fra den nedadvendte delen av T-røret på et filterpapir (Shield et al., Transfusion, Vol. 9, side 348, 1969). Apparatet er imidlertid komplekst og kostbart, og fører i seg selv ikke til en enkel og automatisk teknikk som er egnet for rutinebruk i blodbanker og lignende. Although certain instrumented tests have been developed for testing red blood cell type with agglutination, the equipment for these methods is both expensive and complicated to use. It is e.g. proposed a device for testing red blood cells in an instrument used under the name "Autoanalyzer" manufactured by Berkman et al and described in Transfusion, Vol. 11, No. 6, page 317 et seq. (1971). In the aforementioned Autoanalyzer, blood samples and serum with antibodies are combined under special circumstances in complex tubular spirals designed to produce agglutination. The reacted mass is then passed past a T-tube joint with one of the tubes in a downwards position, so that the agglutinates which have been formed tend to go down through this tube and are then removed. The agglutination can then be detected by measuring the degree or the shift in optical density in the non-agglutinated fraction that comes out in a horizontal direction from said T-tube (Berkman et al.), or by collecting the agglutinates from the downward-facing part of the T- the tube on a filter paper (Shield et al., Transfusion, Vol. 9, page 348, 1969). However, the apparatus is complex and expensive, and in itself does not lead to a simple and automatic technique that is suitable for routine use in blood banks and the like.

Et alternativt apparat er beskrevet under navnet "Groupamatic" og koster flere hundre tusen dollar (se Garretta et al., Vox Sang, Vol. 27, side 141, 1974). I dette apparatet blir serum og blodcellesuspensjoner kombinert slik at man får frembragt en agglutinering. Nærværet av agglutinering påvises ved å føre suspensjonen tvers over to lysstråler, hvorav den ene går gjennom sentrum av reaksjonskuvetten mens den andre går gjennom periferien. En forskjell i transmisjonen av strålene tas som et mål for styrken på agglutineringen. Det er imidlertid nødvendig med meget avansert elektronisk utstyr, og dette betyr at instrumentet blir så kostbart at det faller utenfor rekkevidde for de aller fleste blodbanker. An alternative apparatus is described under the name "Groupamatic" and costs several hundred thousand dollars (see Garretta et al., Vox Sang, Vol. 27, page 141, 1974). In this apparatus, serum and blood cell suspensions are combined so that an agglutination is produced. The presence of agglutination is detected by passing the suspension across two light beams, one of which passes through the center of the reaction cuvette while the other passes through the periphery. A difference in the transmission of the rays is taken as a measure of the strength of the agglutination. However, very advanced electronic equipment is required, and this means that the instrument becomes so expensive that it falls out of reach for the vast majority of blood banks.

Prøver basert på en celleoppløsning er intet problem når reaksjonen på celleoverflaten mellom antigen og antistoff er effektiv med komplement, f.eks. for utprøving av vev. Dette er imidlertid meget sjeldent tilfelle med røde blodceller fra mennesker, hvor enten cellemembran antigen-antistoffkomplek-set reagerer ineffektivt med komplement eller antistoff-konsentrasjonen må være begrenset for å hindre en for intens agglutinering som mekanisk vil påvirke celleoppløsningen. Samples based on a cell solution are no problem when the reaction on the cell surface between antigen and antibody is effective with complement, e.g. for tissue testing. This is, however, a very rare case with red blood cells from humans, where either the cell membrane antigen-antibody complex reacts ineffectively with complement or the antibody concentration must be limited to prevent too intense agglutination which will mechanically affect cell dissolution.

Slike problemer påvirker i høy grad driften av blodbanker hvor selv en vanlig rutineutprøving av typer for røde blodceller er en tidskrevende manuell operasjon som krever vanligvis mer erfarent og utdannet personell enn det som er tilgjengelig. Videre er det relativt få blodbanker som kan påta seg lymfocytotoksiske prøver som er nødvendig for ut- Such problems greatly affect the operation of blood banks, where even a routine routine testing of types for red blood cells is a time-consuming manual operation that usually requires more experienced and trained personnel than is available. Furthermore, there are relatively few blood banks that can undertake lymphocytotoxic samples, which are necessary for

prøving av forskjelluge typer vev. Det er videre ingen direkte immunologiske prøver som er tilgjengelige for å bestemme forenligheten mellom granulocytter, og det er bare en indirekte prøve for blodplater såsom 14.C-serotin-frigjøring. (Skjønt granulocytter og blodplater til en viss grad kan betegnes HL-A-typer for visse utvalgte og passende prøver, så vil slik type-prøving ikke garantere deres forenlighet). testing of different tissue types. Furthermore, there are no direct immunological tests available to determine compatibility between granulocytes, and there is only an indirect test for platelets such as 14.C-serotin release. (Although granulocytes and platelets can be HL-A typed to some extent for certain selected and appropriate samples, such typing does not guarantee their compatibility).

Man har nå i foreliggende oppfinnelse oppdaget at It has now been discovered in the present invention that

både agglutinering og celleoppløsningsprøver på blodceller hos mennesker i vesentlig grad kan betydelig forbedres når et monolag av reaktive celler irreversibelt bindes til en fast matrise. both agglutination and cell lysis tests on human blood cells can be significantly improved when a monolayer of reactive cells is irreversibly bound to a solid matrix.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således til-veiebragt en fremgangsmåte for bestemmelse av celletype eller forenlighet på en fast matrise, og denne fremgangsmåte er kjennetegnet ved at man According to the present invention, there is thus provided a method for determining cell type or compatibility on a fixed matrix, and this method is characterized by

(a) danner et første monolag av celler, slik som erytrocytter som irreversibelt bindes til en fast matrise, idet cellene har egne eller ervervede antigener, (b) bringer nevnte lag (a) i kontakt med en oppløsning inneholdende antistoffer som kan bindes ved immunoabsorpsjon til nevnte første lag (a) av celler i den grad antistoffene i nevnte oppløsning er reaktive med antigenene i cellene i det første laget, (c) deretter påfører en suspensjon av andre celler, slik som andre erytrocytter, idet disse og andre celler har antigener derpå, og (d) måler graden av immunoadhering av nevnte andre cellelag som bindes ved antistoff til nevnte første cellelag. (a) forming a first monolayer of cells, such as erythrocytes, which are irreversibly bound to a solid matrix, the cells having their own or acquired antigens, (b) bringing said layer (a) into contact with a solution containing antibodies which can be bound by immunoabsorption to said first layer (a) of cells to the extent that the antibodies in said solution are reactive with the antigens in the cells in the first layer, (c) then applying a suspension of other cells, such as other erythrocytes, these and other cells having antigens thereupon, and (d) measures the degree of immunoadherence of said second cell layer which is bound by antibody to said first cell layer.

Ved en irreversibel binding av celler til en fast matrise mener man binding av reaktive celler ved molekylære krefter, slik som en dannelse av kovalente kjemiske bindinger mellom posisjoner på celleoverflaten og reaktive grupper på substratet, eller ved at det dannes bindinger ved svakere molekylære krefter som van der Waal-krefter, kolumbske krefter, By an irreversible binding of cells to a solid matrix is meant the binding of reactive cells by molecular forces, such as the formation of covalent chemical bonds between positions on the cell surface and reactive groups on the substrate, or by the formation of bonds by weaker molecular forces such as van where Waal forces, Columbian forces,

eller hydrogenbindinger som vil motstå effekten av de videre utprøvingsbetingelser. Ikke bare øker man sensitiviteten or hydrogen bonds that will resist the effects of the further test conditions. Not only does one increase sensitivity

eller følsomheten ved prøvingen, men resultatet av immun-reaksjonen lar seg lett måle ved enkle instrumenter. or the sensitivity of the test, but the result of the immune reaction can be easily measured with simple instruments.

Som en enkel illustrasjon kan nevnte blodtypeprøver utføres i tre trinn: As a simple illustration, said blood type tests can be carried out in three steps:

(1) Et encellet lag av erytrocytter (som en illustrasjon, (1) A single cell layer of erythrocytes (as an illustration,

så vil disse bli betegnet type A), bindes irreversibelt til en fast matrise; (2) ved å bruke monolaget av celler som et immuno-adsorpsjonslag, blir antistoffer som anti-A-antistoffer påført og adsorbert spesifikt, og (3) de antistoffbelagte celler kan nå prøves for deres evne til å binde et annet monolag av celler som bærer passende antigener (fastfase-agglutinering) . then these will be designated type A), are irreversibly bound to a fixed matrix; (2) by using the monolayer of cells as an immuno-adsorption layer, antibodies such as anti-A antibodies are applied and adsorbed specifically, and (3) the antibody-coated cells can now be tested for their ability to bind another monolayer of cells that carries appropriate antigens (solid-phase agglutination).

Prøveresultatet kan bedømmes på enhver hensikts- The test result can be judged on any objective

messig måte, f.eks. ved undersøkelse under et mikroskop, men det er av spesiell viktighet i foreliggende oppfinnelse at prøve-resultatene er spesielt godt egnet for bedømmelse ved tetthets-målingsteknikk hvor man bruker lett tilgjengelige standard-instrumenter. For en fastfase-hem-agglutinering kan nevnte prøve-plater fremstilt slik det er beskrevet ovenfor, underkastes en statisk eller skanderingsmåling av tetthet ved bølgelengder hvor hemoglobininnholdet i de prøvede erytrocytter absorberer lyset (f.eks. blått lys med en bølgelengde på 415 nm er meget godt egnet). Måling av tetthet ved skandering innbefatter bare bruken av veletablert og kjent laboratorieutstyr som er lett tilgjengelig, og som gir et kvantitativt svar på følgende spørs-mål: (1) Er det dannet et annet lag? .(2) Hvor mange celler representerer nevnte andre lag? og (3) Hvorledes er fordelingen med det andre lag? (Med "fordeling" forstås ensartetheten eller jevnheten av det andre lag. Et ensartet annet lag innbefatter at 100% av cellene i den påførte suspensjon bærer det nødven- appropriate way, e.g. by examination under a microscope, but it is of particular importance in the present invention that the test results are particularly well suited for assessment by density measurement techniques where readily available standard instruments are used. For a solid-phase heme agglutination, said sample plates prepared as described above can be subjected to a static or scanning measurement of density at wavelengths where the hemoglobin content of the sampled erythrocytes absorbs the light (e.g. blue light with a wavelength of 415 nm is very well suited). Measuring density by scanning only involves the use of well-established and known laboratory equipment that is readily available and that provides a quantitative answer to the following questions: (1) Has another layer formed? .(2) How many cells represent said second layer? and (3) How is the distribution with the other team? (By "distribution" is meant the uniformity or evenness of the second layer. A uniform second layer includes that 100% of the cells in the applied suspension carry the necessary

dige antigen slik at de bindes til det første lag, mens en ujevn fordeling innbefatter at det opptrer noen "negative" celler i den påførte suspensjon). antigen so that they bind to the first layer, while an uneven distribution includes the appearance of some "negative" cells in the applied suspension).

I den fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor for bedømmelse av immunologiske faktorer på celleoverflater, In the method described above for the assessment of immunological factors on cell surfaces,

kan nærværet av antistoffer eller antigener som er immuno-adsorbert fra nevnte oppløsning, hensiktsmessig påvises ved å påføre en ny suspensjon av den cellepopulasjon som skal the presence of antibodies or antigens immuno-adsorbed from said solution can be conveniently detected by applying a new suspension of the cell population to be

prøves, etter at det bundne monocellelag er reagert med antigen (eller antistoff)-oppløsningen, og så måle dannelsen av et nytt cellelag hvor antigenet (eller antistoffet) med kjent spesifdtet virker som et kryssbindingsmiddel. is tested, after the bound monocell layer has reacted with the antigen (or antibody) solution, and then measure the formation of a new cell layer where the antigen (or antibody) of known specificity acts as a cross-linking agent.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan også brukes for å prøve nærvær av konkurrerende reaksjoner, mellom oppløsninger eller suspensjoner som man antar eller mistenker for å ha antigeniske egenskaper. Således kan et irreversibelt bundet monocellelag fremstilles som beskrevet ovenfor. Dette lag kan så kontaktes med en blanding av to opp-løsninger, en som inneholder antigener eller antistoffer med kjent spesifitet for å danne immunoadsorbsjon på et bundet monocellelag, og en annen oppløsning eller suspensjon som skal prøves. Konkurrerende binding av de kjente antistoffer eller antigener ved faktorer som er tilstede i den andre oppløsning eller suspensjon vil reflekteres ved en reduksjon av dannelsen av nevnte immunoadsorbsjonsreaksjon med det irreversibelt bundne cellelag. The method according to the present invention can also be used to test the presence of competitive reactions, between solutions or suspensions which are assumed or suspected to have antigenic properties. Thus, an irreversibly bound monolayer can be prepared as described above. This layer can then be contacted with a mixture of two solutions, one containing antigens or antibodies of known specificity to form immunoadsorption on a bound monocell layer, and another solution or suspension to be tested. Competitive binding of the known antibodies or antigens by factors present in the second solution or suspension will be reflected by a reduction in the formation of said immunoadsorption reaction with the irreversibly bound cell layer.

Parallelt med denne fremgangsmåte fremstiller man et iiionocellelag med et annet lag av antigener bundet slik det er beskrevet ovenfor. Konkurrerende reaksjoner kan så måles mellom en suspensjon av celler som er i stand til å danne et annet monocellelag og en annen oppløsning eller suspensjon som inneholder ukjente faktorer som skal prøves. Nærværet av konkurrerende immunologiske reaksjoner mellom disse to suspensjoner vil kunne påvises ved en reduksjon i dannelsen av et annet monocellelag. In parallel with this method, an ionocell layer is produced with another layer of antigens bound as described above. Competitive reactions can then be measured between a suspension of cells capable of forming another monolayer and another solution or suspension containing unknown factors to be tested. The presence of competing immunological reactions between these two suspensions can be demonstrated by a reduction in the formation of another monocell layer.

Innenfor disse generelle retningslinjer kan man tenke seg følgende prøvemetoder: 1 _. Bestemmelse av antigener ved konkurrerende immunoadsorpsjon Denne bestemmelse eller analyse innbefatter følgende trinn (a) at man påfører en fast matrise, en første suspensjon av celler som man vet bærer antigener som skal prøves, under slike betingelser at man effektivt og irreversibelt får bundet et lag av nevnte celler til nevnte matrise; (b) kontakter nevnte lag (a) med en blanding av (i) en oppløsning av et antistoff som lar seg reagere ved immunoadsorbsjon med det antigen som bæres av cellene i nevnte lag (a), og (ii) en annen oppløsning eller suspensjon som skal bedømmes for antigen ved konkurrerende hemming av antistoffet i nevnte oppløsning (i); og (c) deretter måler hvorvidt og hvor sterkt nevnte antistoff i opp-løsning (i) er bundet ved immunoadsorpsjon til nevnte lag (a) . Within these general guidelines, the following test methods can be considered: 1 _. Determination of antigens by competitive immunoadsorption This determination or analysis includes the following step (a) that one applies a solid matrix, a first suspension of cells known to carry antigens to be tested, under such conditions that one effectively and irreversibly binds a layer of said cells of said matrix; (b) contacting said layer (a) with a mixture of (i) a solution of an antibody capable of reacting by immunoadsorption with the antigen carried by the cells of said layer (a), and (ii) another solution or suspension which must be judged for antigen by competing inhibition of the antibody in said solution (i); and (c) then measures whether and how strongly said antibody in solution (i) is bound by immunoadsorption to said layer (a).

2. Bestemmelse av antigener ved konkurrerende hemming 2. Determination of antigens by competitive inhibition

Denne bestemmelse innbefatter følgende trinn: (a) at man påfører en fast matrise en første suspensjon av celler som inneholder antigener som skal prøves, under slike betingelser at man effektivt og reversibelt binder et lag av nevnte celler til nevnte matrise; (b) påfører nevnte lag (a) en oppløsning inneholdende et antistoff som reaktivt ved immunoadsorpsjon reagerer med antigener på cellene i nevnte lag (a); og (c) deretter påfører en blanding av (i) en annen suspensjon av celler fra nevnte populasjon, og (ii) en suspensjon eller oppløsning inneholdende et antigen som konkurrerende vil reagere med det immuno adsorberte antistoff i nevnte oppløsning (b) , og deretter måler hvorvidt celler fra nevnte andre suspensjon danner et annet cellelag på nevnte matrise. This determination includes the following steps: (a) applying to a solid matrix a first suspension of cells containing antigens to be tested, under such conditions as to efficiently and reversibly bind a layer of said cells to said matrix; (b) applying to said layer (a) a solution containing an antibody which reacts reactively by immunoadsorption with antigens on the cells of said layer (a); and (c) then applying a mixture of (i) another suspension of cells from said population, and (ii) a suspension or solution containing an antigen which will competitively react with the immunoadsorbed antibody in said solution (b), and then measures whether cells from said second suspension form another cell layer on said matrix.

3. Bestemmelse av antigener i nærvær av antistoffer i en cellepopulasjon 3. Determination of antigens in the presence of antibodies in a cell population

Denne bestemmelse innbefatter følgende trinn: (a) at man påfører en fast matrise en første suspensjon av celler som er kjent for å ha antistoffer, under betingelser slik at man effektivt og irreversibelt binder et lag av celler på nevnte matrise; (b) kontakter nevnte lag (a) med en blanding av (i) en oppløs-ning som skal prøves for antigen og (ii) en annen oppløsning eller suspensjon som inneholder antistoffer som reagerer ved immunoadsorpsjon med de antigener som skal prøves ved såkalt konkurrerende hemming; og (c) deretter måler graden hvorvidt slike antigener i oppløsning (i) er bundet ved immunoadsorpsjonen på nevnte lag (a). This determination includes the following steps: (a) applying to a solid matrix a first suspension of cells known to have antibodies, under conditions such as to effectively and irreversibly bind a layer of cells on said matrix; (b) contacting said layer (a) with a mixture of (i) a solution to be tested for antigen and (ii) another solution or suspension containing antibodies which react by immunoadsorption with the antigens to be tested by so-called competitive inhibition; and (c) then measuring the degree to which such antigens in solution (i) are bound by the immunoadsorption on said layer (a).

I hver av de foregående fremgangsmåter kan graden In each of the preceding methods, the degree can

av immunoadsorpsjon bestemmes ved en eller flere av de teknikker som generelt er beskrevet ovenfor. of immunoadsorption is determined by one or more of the techniques generally described above.

Til tross for langvarige kliniske problemer forbundet med utprøving i blodbanker samt nødvendigheten av å for- Despite long-standing clinical problems associated with testing in blood banks as well as the necessity to

bedre fremgangsmåter og gjøre disse tilgjengelige for instrumentering og automasjon, har det vært lite fremgang på feltet i de senere år. I en rekke år har man brukt de såkalte "Eldon"-kort for prøver av blodtyper. Disse kort er bl.a. beskrevet i US-patent 2.770.572. Dette patent beskriver et prøvekort som better methods and make these available for instrumentation and automation, there has been little progress in the field in recent years. For a number of years, the so-called "Eldon" cards have been used for samples of blood types. These cards are i.a. described in US Patent 2,770,572. This patent describes a test card which

kan brukes for prøving av typer i menneskeblod, hvor et bærende ark bærer på forskjellige steder på overflaten tørkede prøver av forskjellige sera som inneholder antistoff-faktorer i en blanding med konglutinin eller konglutinin-erstatningsstoffer. can be used for testing types in human blood, where a carrier sheet carries at different places on the surface dried samples of different sera containing antibody factors in a mixture with conglutinin or conglutinin substitutes.

Når man utfører en blodtypeprøve ved hjelp av dette kort, blir blodprøver fra den pasient hvis blod man skal typebestemmes plasert i små dråper på de forskjellige serumflekker som finnes på kortet, og deretter undersøkt etter en passende reaksjonstid for nærvær eller fravær av agglutinering. Prøvene er imidlertid begrenset til anti-A, anti-B og anti-Rh (RhQ eller D) , og selv disse prøver er forbundet med betydelige tolkningsfeil. When performing a blood typing test using this card, blood samples from the patient whose blood is to be typed are placed in small drops on the various serum spots found on the card, and then examined for an appropriate reaction time for the presence or absence of agglutination. However, the tests are limited to anti-A, anti-B and anti-Rh (RhQ or D), and even these tests are associated with significant interpretation errors.

Mer nylig er det i US patent 3.666.421 beskrevet More recently, it is described in US patent 3,666,421

et annet diagnostisk prøveobjektglass hvor serologiske reagenser er plassert i dråper på prøveglasset og tørket til en flekk som deretter kan rekonstitueres og reageres i en agglutinerings-reaksjon for identifikasjon av blodtype (eller andre antigen-antistoff-reaksjonssystemer som lar seg identifisere ved agglutinering) . Det objektglass som er beskrevet i sistnevnte US patent, another diagnostic specimen slide where serological reagents are placed in drops on the specimen slide and dried to a spot which can then be reconstituted and reacted in an agglutination reaction for identification of blood type (or other antigen-antibody reaction systems that can be identified by agglutination). The microscope slide described in the latter US patent,

ér imidlertid utsatt for de defekter som er karakteristisk for vanlig flytende fase-agglutinering, idet prøven i alt vesentlig bare viser nærvær eller fravær av agglutinering og er avhengig av en bedømmelse av erfarent personell for å bestemme hvorvidt agglutineringen er et resultat av en spesifikk antigen-antistoff-reaksjon eller kun er et resultat av en ikke-spesifikk celle-aggregering. Det er vanskelig eller umulig å bedømme hvorvidt frie uagglutinerte celler er til stede sammen med sammenklumpede celler i spesifikke agglutinater. is, however, subject to the defects that are characteristic of ordinary liquid phase agglutination, as the sample essentially only shows the presence or absence of agglutination and is dependent on the judgment of experienced personnel to determine whether the agglutination is the result of a specific antigen- antibody reaction or is only the result of a non-specific cell aggregation. It is difficult or impossible to judge whether free unagglutinated cells are present together with clumped cells in specific agglutinates.

US patent 3.770.380 beskriver en anordning som er angitt å kunne bedømme immunoadherings-reaksjoner. Det skal imidlertid bemerkes at nevnte immunoadheringsreaksjoner som beskrives i dette US patent, skiller seg fra de immunoadsorpsjons-fenomener som foreliggende oppfinnelse er basert på. Immunoadhering er en ikke-spesifikk sammenklumping av partikler eller celler som skyldes nærværet av komplement, og i denne prøve er det komplementet som forårsaker bindingen. Immunoadhering er karakterisert ved ikke-spesifikke reaksjoner mellom komplementet og de partikler eller celler det binder. Immunoadsorpsjon er på den annen side en spesifikk binding mellom antigeniske posisjoner på en cellemembran og de antistoffer som måtte være til stede i et serum. Således er immunoadsorpsjon i motsetning til immunotilfesting en spesifikk binding mellom antigener og antistoffer. US patent 3,770,380 describes a device which is stated to be able to assess immunoadherence reactions. However, it should be noted that said immunoadherence reactions described in this US patent differ from the immunoadsorption phenomena on which the present invention is based. Immunoadhesion is a non-specific clumping of particles or cells due to the presence of complement, and in this sample it is the complement that causes the binding. Immunoadhesion is characterized by non-specific reactions between the complement and the particles or cells it binds. Immunoadsorption, on the other hand, is a specific binding between antigenic positions on a cell membrane and the antibodies that may be present in a serum. Thus, immunoadsorption, in contrast to immunoattachment, is a specific binding between antigens and antibodies.

Den anordning som er beskrevet i US patent 3.770.380f er en flat cellelignende struktur som er belagt med suksessive lag av et bakterie- eller virusholdig materiale som et topp- The device described in US patent 3,770,380f is a flat cell-like structure that is coated with successive layers of a bacterial or viral material as a top-

lag, som er bundet til bunnen av cellestrukturen eller anordningen ved hjelp av et transparent tørket proteinunderlag. Immunoadherings-reaksjoner mellom bakterier eller virus i det således preparerte lag og røde celler som har antistoff og komplement i en prøvevæske som påføres, kan så bedømmes ved å bestemme graden hvorved de spesielt fremstilte røde celler i den på- layer, which is bound to the bottom of the cell structure or device by means of a transparent dried protein substrate. Immunoadherence reactions between bacteria or viruses in the thus prepared layer and red cells that have antibody and complement in a test liquid that is applied can then be assessed by determining the degree to which the specially prepared red cells in the applied

førte væske fester seg til det bakterie- eller virusholdige topplag. Den fremgangsmåte som er beskrevet i US patent 3.770.380, har ikke funnet praktisk klinisk anvendelse på grunn av at immunoadhering i seg selv ikke er særlig anvendbart, og fordi immunoadhering er en ikke-spesifikk reaksjon som ikke er egnet for bedømmelse av spesifikke antigen-antistoff-reaksjoner. Conducted fluid adheres to the bacterial or virus-containing top layer. The method described in US patent 3,770,380 has not found practical clinical application because immunoadherence in itself is not particularly applicable, and because immunoadherence is a non-specific reaction that is not suitable for the assessment of specific antigen- antibody reactions.

Et lag av blodceller innleiret i et fast bærende lag er blitt brukt for visse vitenskapelige formål som ikke har noe å gjøre med blodtyper og prøving av forenlighet. Slike lag er ikke bundet ved kovalente eller andre molekylære krefter. A layer of blood cells embedded in a solid support layer has been used for certain scientific purposes unrelated to blood typing and compatibility testing. Such layers are not bound by covalent or other molecular forces.

Således beskriver Goodman (Nature, 193:350, 1962) en kolonne av formaliniserte røde blodceller fra mennesker innleiret i polyuretan som han brukte for å fraksjonere anti-antistoffer fra røde blodceller hos mennesker på basis av deres bindestyrke til de innleirede røde celler. Edelman et al. (Proe. Nati. Acad. Thus, Goodman (Nature, 193:350, 1962) describes a column of formalinized human red blood cells embedded in polyurethane which he used to fractionate anti-antibodies from human red blood cells on the basis of their binding strength to the embedded red cells. Edelman et al. (Proe. Nat. Acad.

Sei. 68:2153, 1971) fraksjonerte blodceller på basis av deres evne til spesifikt å binde seg til lektiner, antistoffer eller antigener som på forhånd var bundet til partielt hydrolyserte nylonfibre. Pollock. 68:2153, 1971) fractionated blood cells on the basis of their ability to specifically bind to lectins, antibodies, or antigens previously bound to partially hydrolyzed nylon fibers.

Prinsippet med å binde en prostetisk gruppe (i et antigen, antistoff, enzym, etc.) til en fast matrise, er en velkjent og etablert biokjemisk metode (se Cuatrecases og Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40:259, 1971), og er meget The principle of binding a prosthetic group (in an antigen, antibody, enzyme, etc.) to a solid matrix is a well-known and established biochemical method (see Cuatrecases and Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40:259, 1971) , and is very

anvendt i fast fase radioimmunoprøver (se Brit. Med. Bull., 30:1-103, 1974). Imidlertid har blod eller andre celler ikke vært bundet irreversibelt til en fast matrise for å lette blod-typeprøving eller forenlighetsprøving, etc. used in solid phase radioimmunoassays (see Brit. Med. Bull., 30:1-103, 1974). However, blood or other cells have not been irreversibly bound to a solid matrix to facilitate blood typing or compatibility testing, etc.

Det er i det etterfølgende gitt en beskrivelse av oppfinnelsen med hensyn til de nåværende brukte prøver med erythrocyter. Polystyren-prøverør ble belagt med fibrinogen (mengde 0,5 mg/ml) som binder irreversibelt. Etter vasking ble polylysin (0,1 mg/ml) påført det bundne fibrinogen. Etter ytterligere vasking tilførte man en suspensjon av enten normal eller proteasebehandlede erytrocytter (RBC). Disse erytrocytter ble bundet irreversibelt (for det formål at de skulle prøves) som et monolag på den polysin-fibrinogen-belagte polystyren-overflate. Bindings-tettheten på o 2 x 10 6 erytrocytter pr. cm 2 er i god overensstemmelse med det som kunne forventes for slike erytrocytter som har en diameter på 7 mikrometer. A description of the invention is given in the following with regard to the currently used samples with erythrocytes. Polystyrene test tubes were coated with fibrinogen (amount 0.5 mg/ml) which binds irreversibly. After washing, polylysine (0.1 mg/ml) was applied to the bound fibrinogen. After further washing, a suspension of either normal or protease-treated erythrocytes (RBC) was added. These erythrocytes were bound irreversibly (for the purpose of testing) as a monolayer on the polysin-fibrinogen-coated polystyrene surface. The binding density of o 2 x 10 6 erythrocytes per cm 2 is in good agreement with what could be expected for such erythrocytes which have a diameter of 7 micrometres.

Monocellelaget av de bundne erytrocytter er stabilt og vil i sin tid kunne tjene som et immunoadsorpsjonsmiddel for å binde antistoffer fra en påført oppløsning eller et serum som er spesifikt til antigeniske posisjoner på membranene i de bundne erytrocytter. The monocell layer of the bound erythrocytes is stable and will in time be able to serve as an immunoadsorption agent to bind antibodies from an applied solution or a serum that is specific to antigenic positions on the membranes of the bound erythrocytes.

Metoden for å binde blodceller som et monolag på en fast matrise er ikke nødvendigvis begrenset til ovennevnte formål. Den litteratur som angår kobling av proteiner til polymerer (se Cuatrecases og Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40: 259, 1971) angir at man som et alternativ kan bruke preparater av polymerer (flak av polyuretan, polystyren, etc.) som på The method of binding blood cells as a monolayer on a solid matrix is not necessarily limited to the above purpose. The literature concerning the coupling of proteins to polymers (see Cuatrecases and Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40: 259, 1971) states that as an alternative, preparations of polymers (flakes of polyurethane, polystyrene, etc.) can be used which on

sine overflater inneholder reaktive grupper som glutaraldehyd, cyanogenbromid, amino eller karboksylgrupper, og andre som vil tillate en direkte kovalent binding av blodceller til matrisen. their surfaces contain reactive groups such as glutaraldehyde, cyanogen bromide, amino or carboxyl groups, and others that will allow a direct covalent binding of blood cells to the matrix.

Det er selvsagt at bindestoffet ma være immunologisk inaktivt med hensyn til eventuelle antigener eller antistoffer som kan være til stede i de prøveoppløsninger som kan anvendes. It goes without saying that the binder must be immunologically inactive with respect to any antigens or antibodies that may be present in the sample solutions that may be used.

Andre substrater eller matriser som kan brukes i foreliggende oppfinnelse, kan være ethvert hensiktsmessig materiale som (1) er av en slik karakter at et monocellelag irreversibelt kan bindes slik det er beskrevet ovenfor, og (2) Other substrates or matrices that can be used in the present invention can be any suitable material that (1) is of such a nature that a monocell layer can be irreversibly bonded as described above, and (2)

er egnet for å brukes med hensyn til den påvisningsmetode som skal brukes. Ettersom de fleste hensiktsmessige påvisningsmetoder er basert på lystransmisjon, såsom mikroskopisk telling og skanning 'med hensyn til tetthetsmåling, så er det foretrukket at man bruker et lystransparent substrat. Hvis man imidlertid skal bruke måling av radioaktivitet, så er det selvsagt unødvendig å bruke et lystransparent materiale. is suitable to be used with regard to the detection method to be used. As most suitable detection methods are based on light transmission, such as microscopic counting and scanning with respect to density measurement, it is preferred that a light transparent substrate is used. If, however, one is going to use the measurement of radioactivity, then it is of course unnecessary to use a light-transparent material.

For det foreliggende formål kan substratet eller matrisen ganske enkelt være innersiden av et prøverør. Hvis en densiometrisk avsøkningsmetode skal brukes for å bedømme prøve-resultatene, så er det hensiktsmessig å bruke en flat overflate. Hvis man skal bruke prøving i stor skala, kan man bruke striper av matriser med cellebindende egenskaper for å fremstille det første cellelaget. Deretter kan antistoffer merkes og prøves for sin kapasitet til å binde et annet cellelag av ukjent type. Det kvantitative resultat av begge prøver kan så bestemmes For the present purpose, the substrate or matrix may simply be the inside of a test tube. If a densiometric scanning method is to be used to judge the test results, then it is appropriate to use a flat surface. If large-scale testing is to be used, strips of matrices with cell-binding properties can be used to produce the first cell layer. Antibodies can then be labeled and tested for their capacity to bind another cell layer of unknown type. The quantitative result of both samples can then be determined

ved skanningdensiometri ved tap av farge som indikerer opp-løsning eller øking av farge som indikerer binding av et annet lag av røde celler. For det sistnevnte formål kan det være passende som en del av flekkprepareringen hypotonisk å oppløse det første cellelag slik at dets bakgrunn ikke trenger å fratrekkes prøveresultatene. Hypotonisk oppløsning vil ikke i særlig betydelig grad fjerne membranbundet antistoff, og dannelsen av et annet cellelag kan påvises visuelt eller ved optisk densiometri ved hjelp av dets hemoglobininnhold. Ved å bruke skanningdensiometri f.eks. ved 415 nm, kan man oppnå kvantitative svar på spørsmål som f.eks. "Er det dannet et annet lag?","hvor mange celler (sett på bakgrunn av et kjent maksimum) representerer det annet lag?", "hva er fordelingen av det annet lag?". by scanning densitometry by loss of color indicating dissolution or increase in color indicating binding of another layer of red cells. For the latter purpose, it may be appropriate as part of the stain preparation to hypotonically dissolve the first cell layer so that its background need not be subtracted from the sample results. Hypotonic solution will not significantly remove membrane-bound antibody, and the formation of a second cell layer can be detected visually or by optical densiometry using its hemoglobin content. By using scanning densitometry e.g. at 415 nm, one can obtain quantitative answers to questions such as "Has a second layer formed?",","how many cells (seen against the background of a known maximum) represent the second layer?", "what is the distribution of the second layer?".

For å få et svar på det siste spørsmål må den cellesuspensjon som påføres det antistoffbelagte monocellelag bare ha tilstrekkelig konsentrasjon til at man får avsatt et annet monocellelag. Det annet lag vaskes så for å fjerne ubundne celler, hvoretter fordelingen av de bundne deler av annet lag blir en funksjon av prosentsats av "positive celler" som kan feste seg, og "negative" celler som ikke binder seg. Hullene eller øyene som blir et resultat kan påvises ved mikroskopisk skanningdensiometri, og deres frekvens og størrelse kan uttrykkes som en prosentsats av den avsøkede overflate. To get an answer to the last question, the cell suspension that is applied to the antibody-coated monocell layer must only have a sufficient concentration to deposit another monocell layer. The second layer is then washed to remove unbound cells, after which the distribution of the bound portions of the second layer becomes a function of the percentage of "positive cells" that can adhere, and "negative" cells that do not. The resulting holes or islands can be detected by microscopic scanning densitometry, and their frequency and size can be expressed as a percentage of the scanned surface.

Det skal bemerkes at i foreliggende oppfinnelse vil bindingen av antistoff ved en immunoadsorpsjon til et lag av røde blodceller flere viktige fordeler. For det første kan man bruke sera med konsentrasjoner av antistoffer som er for lave for vanlige væskefaseprøver, fordi deres spesifikke anti-stoffinnhold kan konsentreres som bundet antistoff på monocellelaget. For det annet, under omstendigheter hvor ufortynnet sera ikke kan brukes i væskefaseprøver på grunn av andre serumprote-iner, så kan slik påvirkning elimineres i en prøve med fast fase ved at man selektivt adsorberer det antistoff som skal prøves og hvoretter man vasker for å fjerne andre påvirkende proteiner. For det tredje er mange sera ubrukbare for væskefaseprøver på grunn av at de inneholder ikke-fjernbare antistoffer med uønsket spesifitet. Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse kan man ved et passende valg av celler som skal danne det første lag adsorbere bare de antistoffer som skal prøves. It should be noted that in the present invention the binding of antibody by immunoadsorption to a layer of red blood cells will have several important advantages. First, one can use sera with concentrations of antibodies that are too low for normal liquid phase samples, because their specific antibody content can be concentrated as bound antibody on the monolayer. Second, in circumstances where undiluted sera cannot be used in liquid phase samples due to other serum proteins, such influence can be eliminated in a solid phase sample by selectively adsorbing the antibody to be sampled and then washing to remove other influencing proteins. Third, many sera are unusable for liquid phase samples because they contain non-removable antibodies of undesirable specificity. With the help of the present invention, by a suitable choice of cells which will form the first layer, only the antibodies to be tested can be adsorbed.

Foreliggende oppfinnelse er meget godt egnet for prøving av både celletype og celleforenlighet. For celletypi-fisering vil man f.eks. konstruere et første lag med sitt bundne antistoff av celler og antistoffer av en kjent type. Typifi-seringen av ukjente celler fra en pasient eller blodgiver kan så bestemmes fra deres evne til å danne et annet cellelag. For å utføre forenlighetsprøver kan blodgiverens celler brukes til å danne det første monocellelag som deretter reageres med hensyn til mulige antistoffer i en pasients serum, som så vil bli bundet ved immunoadsorbsjon. Deretter kan disse påvises ved å bestemme evnen til oe bundne antistoffer fra pasientens serum (og graaen av hvorvidt slik binding skjer eller opptrer) til å danne et annet lag av de samme blodgiverceller etter en ny påføring. The present invention is very well suited for testing both cell type and cell compatibility. For cell typing, one will e.g. construct a first layer with its bound antibody of cells and antibodies of a known type. The typing of unknown cells from a patient or blood donor can then be determined from their ability to form another cell layer. To perform compatibility tests, the blood donor's cells can be used to form the first monolayer which is then reacted with respect to possible antibodies in a patient's serum, which will then be bound by immunoadsorption. These can then be detected by determining the ability of bound antibodies from the patient's serum (and the extent to which such binding occurs or occurs) to form another layer of the same blood donor cells after a new application.

Påvisningsmetoder som er egnet for bruk i foreliggende oppfinnelse vil være innlysende for fagfolk. Erytrocytter inneholder sin egen etikett, nemlig pigmentert protein (hemo-globin) som har en maksimal adsorbsjon ved 415 nm. Nærvær eller fravær av erytrocytter kan derfor hensiktsmessig påvises slik det er beskrevet ovenfor. Man kan imidlertid også bruke annen påvisningsteknikk hvis dette er ønskelig. Slik teknikk innbefatter at man bruker radioaktive atomer (f.eks. <51>Cr, 125I) biokjemisk teknikk (f.eks. ved hjelp av et utvalgt intracellu-lært enzym) eller påvisning ved hjelp av fluorescens (f.eks. Detection methods suitable for use in the present invention will be obvious to those skilled in the art. Erythrocytes contain their own label, namely pigmented protein (hemo-globin) which has a maximum adsorption at 415 nm. The presence or absence of erythrocytes can therefore be appropriately detected as described above. However, other detection techniques can also be used if this is desired. Such techniques include using radioactive atoms (e.g. <51>Cr, 125I) biochemical techniques (e.g. using a selected intracellular enzyme) or detection by fluorescence (e.g.

ved å bruke en molekylær forbindelse for å identifisere enten en levende eller død celle). Alle disse metoder kan lett instrumenteres og derfor gjøres automatiske. De kan enten anvendes for serologiske prøver i blodbanker, medisinsk blod-prøve-typifisering, vevstypifisering og prøver før blodover-føring eller før transplantering for forenlighet. using a molecular compound to identify either a living or dead cell). All these methods can be easily instrumented and therefore made automatic. They can either be used for serological samples in blood banks, medical blood sample typing, tissue typing and samples before blood transfusion or before transplantation for compatibility.

Det er velkjent at en rekke fremgangsmåter som nå brukes i væskefaseprøver like godt kan brukes i prøver hvor man bruker fast fase. Disse inkluderer optimal bruk av additiver som er velkjent for å fremme agglutinering (f.eks. symmetriske og asymmetriske hydrofile kolloider, protease, ionisk konsentrasjon, polyelektrolytter, tonisitet og buffersystemer for å kontrollere pH). Disse faktorer er blant annet beskrevet av Berkman et al., Transfusion, 11:317,(1971). It is well known that a number of methods that are now used in liquid phase samples can just as well be used in samples where a solid phase is used. These include optimal use of additives known to promote agglutination (eg, symmetric and asymmetric hydrophilic colloids, protease, ionic concentration, polyelectrolytes, tonicity, and buffer systems to control pH). These factors are among others described by Berkman et al., Transfusion, 11:317, (1971).

Det skal bemerkes at foreliggende oppfinnelse også har anvendelse på andre problemer som innbefatter immunospesi-fikke cellereaksjoner. En slik prøve er antiglobulinprøver for å bedømme celler for deres belegg av IgG, IgM, IgA, IgD og IgE immunoglobuliner, og ved C3, C4 og andre komplementkomponenter eller bundne aktiveringsprodukter (se Rosenfield et al., Vox-Sang, 26:289-333, 1974). Et annet anvendelsesområde vil være fast fase-prøver med kvantitativ bedømmelse, av både passive og reversert passive hemaglutinasjonsprøver. Passive hemaglutina-sjonsprøver kan brukes for direkte analyse av antistoffkonsentrasjon og også for indirekte analyse av oppløselige antigenkonsentrasjon ved konkurrerende binding på basis av felles antigener (Nusbacher et al., J. Immunol., 108:893, 1972). Reverserte passive prøver måler oppløselig antigen direkte It should be noted that the present invention also has application to other problems involving immunospecific cell reactions. One such test is antiglobulin tests to assess cells for their coating of IgG, IgM, IgA, IgD and IgE immunoglobulins, and by C3, C4 and other complement components or bound activation products (see Rosenfield et al., Vox-Sang, 26:289- 333, 1974). Another area of application will be solid phase tests with quantitative assessment, of both passive and reversed passive hemagglutination tests. Passive hemagglutination tests can be used for direct analysis of antibody concentration and also for indirect analysis of soluble antigen concentration by competitive binding on the basis of common antigens (Nusbacher et al., J. Immunol., 108:893, 1972). Reversed passive samples measure soluble antigen directly

(Cook, Immunol. 8:74, 1965 og Juji og Yokochi, Japan, J. Exptl. Med., 39:615, 1969). På lignende måte som blodceller kan prøves for deres følsomhet overfor antistoffstyrt agglutinering eller oppløselighet ved prøver i faste faser, så kan bakterier, protozoer, sopp og kultiverte cellelinjer enten fra vev eller svulster, analyseres for antigeniske bestanddeler på sin overflate ved de fast-faseprøver som er beskrevet i dette patent. (Cook, Immunol. 8:74, 1965 and Juji and Yokochi, Japan, J. Exptl. Med., 39:615, 1969). In a similar way that blood cells can be tested for their sensitivity to antibody-directed agglutination or solubility in solid-phase samples, bacteria, protozoa, fungi and cultured cell lines either from tissues or tumors can be analyzed for antigenic components on their surface in the solid-phase samples that is described in this patent.

Man kan endog forutse at man kan bruke fast-faseprøver for å One can even predict that one can use solid-phase samples to

løse problemer som angår molekylær antistoffkonsentrasjon, K-verdien for antistoffbindingen og graden av K-verdiens hetero-genitet . solve problems concerning molecular antibody concentration, the K-value for antibody binding and the degree of K-value heterogeneity.

Det er underforstått at mange av de underliggende kjemiske prinsipper som er brukt i foreliggende oppfinnelse er velkjente. Oppfinnelsen er enestående fordi man ikke tidligere har forstått at disse prinsipper kunne brukes for å konstruere et fast fase-monocellelag som effektivt kan utføre blodcelle-typifisering og prøver for å undersøke forenligheten mellom blodceller og andre celler. It is understood that many of the underlying chemical principles used in the present invention are well known. The invention is unique because it has not previously been understood that these principles could be used to construct a solid phase monocell layer that can effectively perform blood cell typing and tests to examine the compatibility of blood cells with other cells.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. The following examples illustrate the invention.

Eksempel 1 Example 1

Blodtypifisering. Problemet med typifisering av røde blodceller hos mennesker og påvisning av anti-røde blodcelleantistoffer hos mennesker ved en pre—transplanterings-forenlighetsprøve, er betydelige. De eneste metoder man har for å påvise disse blodtyper ved en direkte agglutinering, er både kostbare og krever komplisert instrumentering (Berkman, E.M. et al., Transfusion, 11:317, 1971). Man har imidlertid nå anvendt og tilpasset instrumenterte væskefasemetoder til fast faseprøvemetodikk, og man har oppnådd spesifikk typifisering av Rh, Keil, Kidd, Duffy, Xg<a>, Lewis, Lutheran og MNSs, alle med en følsomhet som overgår det man oppnår med de tidligere beskrevne instrumenterte prøver i væskefase. Blood typing. The problems of typing human red blood cells and detecting anti-red blood cell antibodies in humans by a pre-transplant compatibility test are significant. The only methods available to detect these blood types by direct agglutination are both expensive and require complicated instrumentation (Berkman, E.M. et al., Transfusion, 11:317, 1971). However, instrumented liquid phase methods have now been applied and adapted to solid phase testing methodology, and specific typing of Rh, Keil, Kidd, Duffy, Xg<a>, Lewis, Lutheran and MNSs has been achieved, all with a sensitivity that exceeds what is achieved with the previously described instrumented samples in liquid phase.

For blodtypifisering anla man et monocellelag av røde blodceller på følgende måte: Ved å bruke "Falcon" polystyren-prøverør (10 mm indre diameter x 75 mm) påførte man 0,2 ml av en fibrinogenoppløsning (0,5 mg/ml) i 2 min. hvoretter man etter vasking påførte 0,2 ml 140.000 molekylvekt poly-D-lysin HBr-oppløsning (0,1 mg/ml) i 2 min. Etter ytterligere vasking påførte man For blood typing, a monolayer of red blood cells was prepared as follows: Using "Falcon" polystyrene test tubes (10 mm inner diameter x 75 mm), 0.2 ml of a fibrinogen solution (0.5 mg/ml) was applied for 2 my. after which, after washing, 0.2 ml of 140,000 molecular weight poly-D-lysine HBr solution (0.1 mg/ml) was applied for 2 min. After further washing, one applied

0,2 ml av en 2-5% (volum/volum) suspensjon av type A^-celler i 0,9% NaCl i 2 min. Dette resulterte i at man fikk festet et flatt monolag av røde celler med en tetthet på 2 x 10 6 celler/cm 2. Disse røde celler forble tilfestet til 0.2 ml of a 2-5% (vol/vol) suspension of type A^ cells in 0.9% NaCl for 2 min. This resulted in the attachment of a flat monolayer of red cells with a density of 2 x 10 6 cells/cm 2 . These red cells remained attached to

tross for tallrike vaskinger. despite numerous washings.

Det således oppnådde monocellelag ble først eksponert overfor kjent spesifikt antistoff (0,2 ml), og deretter hypotonisk lysert med destil-lert vann. På dette tidspunkt lot man et nytt belegg med 0,1 ml røde blodceller i en styrke på 0,2% (volum/volum) sedimentere seg ved hjelp av tyngde-kraften som et lett annet monocellelag. Det var nå mulig å forsterke den spesifikke antistoffbinding i dette andre monocellelag på en rekke måter. For eksempel anvendte man med godt resultat den lavioniske metode som er beskrevet av Berkman et al., ved først å erstatte den overliggende væske med en oppløsning av 5% mannitol og 0,0025% protaminsulfat ved pH 6,0, og etter 5 min. ved romtemperatur vaske nevnte andre monocellelag med 0,0014 M sulfat bufret med 0,85% NaCl ved pH 7,3. Dette fjernet ikke-antistoffbundne kjente negative celler, men ikke antistoffbundne kjente positive celler. Andre fremgangsmåter for å forsterke de antistoffbundne celler viser seg å være enda mer fordelaktig, og noen av disse kunne ikke brukes med hell i forannevnte Berkmans væskefasemetode. Man kunne således øke den spesifikke antistoffbindingen i nevnte andre monocellelag ved at man i sekvens erstattet den overliggende væske først med en buffer ved 7,0 inneholdende 2,5 % PVP og så med en tilsvarende buffer ved 6,0 inneholdende 0,01 % protaminsulfat. Laget ble så vasket med 0,2M fosfatbuffer ved pH 7,3. Således er det innlysende at mulighetene for å forsterke den faste fase agglutinering er tallrike, fordi fremgangsmåten unngår mange av de problemer som oppstår med væskefaseprøver. The monocell layer thus obtained was first exposed to known specific antibody (0.2 ml), and then hypotonically lysed with distilled water. At this point, a new coating with 0.1 ml of red blood cells at a strength of 0.2% (volume/volume) was allowed to settle by gravity as a light second monocell layer. It was now possible to enhance the specific antibody binding in this second monocell layer in a number of ways. For example, the Lavionic method described by Berkman et al. was used with good results, by first replacing the overlying liquid with a solution of 5% mannitol and 0.0025% protamine sulfate at pH 6.0, and after 5 min. at room temperature wash said second monolayer with 0.0014 M sulfate buffered with 0.85% NaCl at pH 7.3. This removed non-antibody-bound known negative cells, but not antibody-bound known positive cells. Other methods of amplifying the antibody-bound cells prove to be even more advantageous, some of which could not be used successfully in the aforementioned Berkman's liquid phase method. One could thus increase the specific antibody binding in the aforementioned second monocell layer by sequentially replacing the overlying liquid first with a buffer at 7.0 containing 2.5% PVP and then with a corresponding buffer at 6.0 containing 0.01% protamine sulfate . The layer was then washed with 0.2M phosphate buffer at pH 7.3. Thus, it is obvious that the possibilities for enhancing the solid phase agglutination are numerous, because the method avoids many of the problems that arise with liquid phase samples.

Disse faste faseprøvene har vist seg å være ekstra-ordinært følsomme for påvisning av IgG Rh-antistoff. Man har oppnådd omtrent den samme følsomhet på et antistoffmolekyl pr. rød blodcellebasis slik det er beskrevet tidligere for en forsterket autoanalysator-prøve, d<y>s. io antistoffmolekyler pr. celle ved 50 % hemagglutinering (Rosenfield et al., Ann. N.Y. Acad. Sei., 190:519, 1971). Med prøver med faste faser kan man imidlertid anvende en tusendedels færre røde blodceller og ha en 1000 ganger sterkere arbeidsfølsomhet, idet man kan påvise ca. 1 pg antistoffprotein pr. ml, noe som overstiger følsomheten for enhver tidligere beskrevet prøve, blant annet prøver fo • såkalt celleoverleving in vivo. These solid phase tests have been shown to be extraordinarily sensitive for the detection of IgG Rh antibody. Approximately the same sensitivity has been achieved on one antibody molecule per red blood cell base as described previously for an enhanced autoanalyzer sample, d<y>s. io antibody molecules per cell at 50% hemagglutination (Rosenfield et al., Ann. N.Y. Acad. Sei., 190:519, 1971). With samples with solid phases, however, one can use one thousandth fewer red blood cells and have a 1000 times stronger working sensitivity, as one can detect approx. 1 pg of antibody protein per ml, which exceeds the sensitivity of any previously described sample, including samples for • so-called cell survival in vivo.

Prøver med anti-Rh ble også utført med hell med proteasebehandlede røde blodceller. Slike prøver ble utført på flatbunnede mikrotitrerings-polystyrenskiver som tillot en mikroskopisk undersøkelse av spesifikt tilfestede røde blodceller. Bundne celler var bare tilstede hvis de var Rh-positive, og i prøver med kunstige blandinger av Rh-positive og Rh-negative røde blodceller, kunne man observere "huller" fra ikke-tilfestede celler som tilsvarte i overflateareal den prosentsats man hadde av Rh-negative celler i den kunstige blanding. Dette resultat indikerer klart at foreliggende oppfinnelse kvantitativt kan fastslå mengden av ubundne celler i en blodprøve, noe som er et uhyre viktig problem både ved prøver på såkalt transfusert celleoverleving ved Ashby-metoden (Arch. Anti-Rh tests were also successfully performed with protease-treated red blood cells. Such tests were performed on flat-bottomed microtiter polystyrene discs which allowed a microscopic examination of specifically attached red blood cells. Bound cells were only present if they were Rh-positive, and in samples containing artificial mixtures of Rh-positive and Rh-negative red blood cells, one could observe "holes" of unattached cells corresponding in surface area to the percentage of Rh present -negative cells in the artificial mixture. This result clearly indicates that the present invention can quantitatively determine the amount of unbound cells in a blood sample, which is an extremely important problem both in tests of so-called transfused cell survival by the Ashby method (Arch.

Int. Med., 35:516, 1925) og ved karakterisering av chimærer hos mennesker (Race og Sanger, "Blood Groups in Man", Davis, 1968, side 475-490). Int. Med., 35:516, 1925) and in the characterization of chimeras in humans (Race and Sanger, "Blood Groups in Man", Davis, 1968, pp. 475-490).

Eksempel 2 Example 2

Direkte antiglobulinprøver. Disse prøver ble utført som blodtypifiseringsprøvene, bortsett fra at de vaskede blodceller fra en pasient hvor man hadde mistanke om en hemolytisk anemi ble brukt for å konstruere både det første og det annet monocellelag. Det første monolag (bundet av polylysin-fibrinogen) ble eksponert overfor et enkelt xenogenisk anti-menneske-globulinserum, og syv spesifiteter ble bedømt. Disse sera var individuelt spesifikke for IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, Direct antiglobulin tests. These tests were performed like the blood typing tests, except that washed blood cells from a patient suspected of having hemolytic anemia were used to construct both the first and second monolayers. The first monolayer (bound by polylysine-fibrinogen) was exposed to a single xenogeneic anti-human globulin serum and seven specificities were assessed. These sera were individually specific for IgG, IgM, IgA, IgD, IgE,

C3 og C4. Det antistoffbelagte første monocellelag ble så hypotonisk oppløst og vasket før man påførte celler for nevnte andre monocellelag. Binding av dette andre monocellelag ble forsterket ved å tilsette 1 % K-90 polyvinylpyrrolidon (PVP, midlere molekylvekt 300.000) i 0,9 % NaCl. Det andre monolag ble til slutt vasket med enkel 0,9 % NaCl-oppløsning. Fremgangsmåten ligner meget på den som er beskrevet av Hsu et al (Vox Sang, 26:305, 1974), men positive resultater ved prøving med fast fase var langt bedre enn de man får med Hsu<1>s instrumenterte prøver med væskefase. En pasient med aktiv hemolytisk anemi, som på grunn av intens spontan agglutinering i væskefase med PVP, ikke kunne typifiseres for tilfestede proteiner, fant man var klart positiv for IgG, IgM, IgA, IgE, C3 og C4 . C3 and C4. The antibody-coated first monolayer was then hypotonically dissolved and washed before applying cells for said second monolayer. Binding of this second monolayer was enhanced by adding 1% K-90 polyvinylpyrrolidone (PVP, average molecular weight 300,000) in 0.9% NaCl. The second monolayer was finally washed with simple 0.9% NaCl solution. The procedure is very similar to that described by Hsu et al (Vox Sang, 26:305, 1974), but positive results when tested with solid phase were far better than those obtained with Hsu<1>'s instrumented samples with liquid phase. A patient with active haemolytic anaemia, who due to intense spontaneous agglutination in liquid phase with PVP, could not be typed for attached proteins, was found to be clearly positive for IgG, IgM, IgA, IgE, C3 and C4.

Claims

Method for determining cell type or compatibility on a solid matrix, characterized by (a) forming a first monolayer of cells, such as erythrocytes, which irreversibly bind to a solid matrix, the cells having their own or acquired antigens, (b) bringing said layer (a) in contact with a solution containing antibodies which can be bound by immunoadsorption to said first layer (a) of cells to the extent that the antibodies in said solution are reactive with the antigens in the cells of the first layer, (c) then applying a suspension of other cells, such as other erythrocytes, these other cells having antigens thereon, and (d) measuring the degree of immunoadherence of said second cell layer which is bound by antibody to said first cell layer.