JPH09508971A - 細胞分離用密度勾配媒体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 末梢血液試料からの胎児の有核の赤血球を含む、希薄な血球の単離及び濃厚化のための密度勾配媒体が記載されている。該媒体は溶融し得るゲル中に分散されたコロイド状密度勾配媒体を含む。本発明の一態様では、密度勾配媒体は、胎児の血球から、母親の赤血球の分離を容易にするために高張である。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞分離用密度勾配媒体 本発明は細胞分離用、詳細には血球（blood cell）分離用の密度勾配媒体に関 する。さらに詳細には、妊娠した女性の血液試料中の母親の血球からの胎児の有 核の赤血球の分離に使用するための溶融し得るゲルに関する。 発明の背景 胎児の組織、特に胎児のDNA は、胎児のゲノムの正確な判断を必要とする胎児 期の診断及び他の医療の手順において用いられる。現在は、胎児の組織は、トン プソン及びトンプソンの「医学における遺伝学（Genetics in Medicine）」第５ 版（W．B．Saunders Co.，フィラデルフィア1991年）に記載されているように羊 水穿刺、絨毛膜絨毛試料採取(CVS)、胎児内視鏡検査または脊髄穿刺を用いるこ とにより得られる。 羊水穿刺では、胎児の細胞を含有している羊水の試料を針と注射器で母親から 腹部を通って取り除く。羊水穿刺には固有の関連する危険がある。主な危険は、 200 の羊水穿刺に一つ起こると推定される流産の誘発である。他の危険は胎児へ の母親感染及び物理的損傷を含む。CVS では胎児の栄養膜組織を絨毛膜の絨毛域 から子宮頸管を通ってまたは腹部を通って吸引する。この方法による胎児の損失 の割合は100 に１の高さかもしれない。脊髄穿刺は、超音波誘導で臍帯から直接 胎児の血液を得る方法を提供する。これらの侵入性の各方法は母親と胎児の双方 に危険をもたらす。 母親の血液から胎児の有核の血球の単離及び濃厚化が試みられた が、主に胎児の血球が循環する希薄性並びに胎児の血球及び母親の血球の間の生 化学上の及び生理学上の類似により、この手順を最高に活用するのは非常に困難 であった。 したがって、胎児の組織または胎児のDNA を単離及び濃厚化するための非侵入 性の方法を得ることが望ましいだろう。血球の集団（population）から希薄な細 胞を単離及び濃厚化する急速で信頼できる方法を得ることも望ましいだろう。し たがって、胎児の有核の赤血球を含む、希薄な細胞の単離及び濃厚化のために適 当な遠心分離媒体を得ることが望ましいだろう。驚くべきことに、本発明はこれ らのニーズ及び他の関連するニーズを達成する。 発明の概要 本発明は、細胞集団からの細胞の分離、特に他の血球から胎児の有核の赤血球 の分離のための密度勾配媒体を提供する。 本発明によると、細胞集団の遠心分離用媒体であって、該媒体は溶融し得るゲ ル中に分散されたコロイドを含んでなり、該コロイドは実質的に集合していない 状態に細胞集団を維持することができるものである。 本発明の他の面では、細胞集団中の細胞の密度分離のための密度勾配媒体を提 供し、該密度勾配は、溶融可能なゲル中に分散されたコロイドの多数の層を含み 、該コロイドは細胞集団を集合していない状態に維持することができ、該層は頂 部と底のある容器中に封入されていて頂部には開口があって、層の密度は容器の 頂部から、容器の底に増大している。 図面の簡単な説明 図１は、赤血球部分の分離のための遠心分離管を示す。 図２は図2A及び2Bからなり、臍帯の血液の平均細胞容積及び平均ヘモグロビン 濃度及び低張の（図2A）及び等張の（図2B）状態の母親の血液の試料を示すヒス トグラムである。 具体的な態様の詳細な説明 特に指示がないならば、本明細書に用いられるすべての技術的及び科学的な用 語は、当業界における通常の知識を有する人によってよく知られたものと同じ意 味を有する。 本発明の実施または試験においては、本明細書に記載されたものと同様または 均等の任意の方法及び物質を用いることができるが、好ましい方法及び物質を記 載してある。本発明の目的のために次の用記を下記に定義している。 本明細書に用いる時、「赤血球（erythrocytes）」または「赤血球(red blood cells)」または「RBC」は、成人または胎児の赤血球を含み、核があっても、な くてもよい。 本明細書に用いる時、「ゼラチン」は、高平均分子量の水溶性のタンパク質の 異成分からなる混合物であって、一般にコラーゲンの加水分解作用により誘導さ れたものである。ゼラチンの適当な型は、商業的に、たとえばノックス（Knox） 、シグマ化学会社（Sigma Chemical Company）及びアルドリッチ化学会社（Aldr ich Chemical Company）から入手できる。 本明細書で用いられる時、「張度（tonicity）」は、細胞に関係する溶液の濃 度の測定値である。たとえば、等張溶液（血球に関して）は、その中では固体及 び塩の濃度が、該血球が浸透性によって相当量の水を得たり、失なったりしてい ないような、天然に見い出されるものと同じである溶液である。低張媒体は、そ の中で、該血球が浸透性により水を得るような、該血球よりも塩及び固体が低濃 度のものである。高張溶液は、その中で塩及び固体が、該血球が浸透性により水 を失うような該血球よりも塩及び固体が高濃度のものである。 成人の赤血球の平均寿命は 120日である。 120日の間に、赤血球はたとえばヘ モグロビンのグリコシル化における、不可逆的な変化を蓄積する。固体塊におけ る変化のない、水の低下は、米国特許第 4835097及びボラン(Borun)の「臨床研 究雑誌（J．Clin．Invest．）」36：第 676〜679 頁（1957年）に記載されてい るように、RBC の加令とともに一貫して、密度を増加させる。 胎児の血球は、母親の血流において循環している希薄な血球である。胎児の血 球は胎盤を通って母親の血流に漏れて入ってくると考えられている。この希少な 出来事の頻度の推定は変化するものであるが、約10⁸血球に１個から10¹¹球に１ 個と報告されている。ホルツグレーブ(Holzgreve)、Ｗ他の「ランセット（Lance t）」ｉ：1220頁（1990年）。懐胎期間の初期の間、胎児の赤血球は有核であり 得る。したがって、核のない胎児の赤血球とは異なり、それらは胎児のDNA を含 み、侵入性の手順の必要なしに胎児の遺伝子分析に用いることができる。 ボユム(Boyum)、「スカンジナビア臨床実験研究雑誌（Scand．J．Clin．Lab． Invest.）」21（付録97）ｐ．31〜50（1968年）及びバート（Bhart）「N．M．免 疫学的方法雑誌（N．M．J．Immunol．Meth）158：ｐ.277〜280(1993年)に記載さ れているように、血球の単離方法が記載されており、それは細胞凝集剤または細 胞集合剤、たとえばメチルセルロース、Isopaque（商標）、デキストラン及びFi coll（商標）、を含有する密度勾配を用いる。Isopaque（商標）は、Ｎ−メチル −３，５−ジアセタミノ−２，４，６−トリヨード安息香酸ナトリウムであって 、前記ボユムに記載されている。Fico ll（商標、Accurate Chemical and Scientifrc Corporation、ウェストバリー、 NY）は、ショ糖とエピクロルヒドリンとの共重合により作られる合成高分子であ る。該分子は水性媒体に溶解性を与える高含有量の水酸基を持つ側鎖構造を有し ている。これらの試薬は赤血球を凝集させ、したがって赤血球から白血病を単離 する方法を提供する。しかしながら、これらの血球凝集条件のもとでは、胎児の 赤血球は、物理的に凝集した母親の赤血球のかたまりの中に閉じ込められて、そ のかたまりの平均密度が沈降特性を決定するので、したがって、母親の赤血球と ともに沈降するだろう。 パ−コール密度勾配は、レニー他「Clinica Chemica Acta」98：ｐ.119〜125( 1979年)及びビンセント及びナビ（Nadeaw）「分析生化学（Anal．Biochem.）」1 41：ｐ.322〜328(1984年)に記載されている。レニーの研究では、等張パ−コー ル密度勾配は、赤血球を加令−分画(age−fractionate)するのに用いられた。等 張勾配条件では白血球は赤血球と共に分画したので、 遠心分離の前に白血球を除去した。したがってレニーの方法を用いるための白 血球の除去は追加の時間のかかる段階を必要とした。 胎児の細胞を特徴づける最初の試みは、母親の細胞がＹ染色体を含まない、し たがって、Ｙ−特異的DNA を含有する細胞は胎児起源であるという事実を利用し た。しかしながら、この技術は胎児が女である場合は利用できず、したがって実 用性が限られる。 胎児のRBC と母親のRBC とは、含有されたヘモグロビンの化学的構造、カルボ ニックアンヒドラーゼのような種々の酵素の存在及び活性並びにそれらの表面抗 原を含む、種々の点で異っている。胎児の血球及び母親の血球の一般的な大きさ 及びヘモグロビンの含有量も異なっている。したがって、RBC が年をとり、水を 失いそして、濃密になった時、母親の血球の中で最も若いもの及び胎児の血球の 中で最も若いもの、すなわち、有核の胎児のRBC は、非常に異った密度を持つか もしれない、Saunders A．M「臨床化学（Clinical Chemistry）」157：ｐ．1531 （1991年）。 母親の血液から胎児の赤血球を分離する試みは米国特許第 4,416,778号に記載 されている。これらの技術は扱いにくく、時間のかかり、高価で、そして、大規 模スクリーニングまたは臨床試験の応用に適合させるのは難かしい。 より最近の技術は母親の細胞と胎児の細胞の生化学的な差、たとえば細胞表面 抗原に集中した。ビアンチ(Bianchi)他(PCT国際出願番号PCT/US90/06623)は、胎 児の血球の血球の表面に存在する抗原に結合する抗体の使用により、末梢血液試 料から、胎児の有核の赤血球を濃厚にする方法を記載している。抗体を適当に標 識化することにより、胎児の血球／抗体複合体を、フローサイトメトリー、たと えば、蛍光−活性化細胞選別（FACS）を用いるか、または磁気活性細胞分離（MA CS）を用いることによって、母親の血球から選別し得る。 同様にガンシャート−アーラート（Ganshert−Ahlert）他「米国産科婦人科雑 誌(Am．J．Obstet．Gynecol.)」ｐ．1350〜1355（1992年）及びPCT 公報 WO9323 754号は、母親の全血に三部分からなる密度勾配を用いて胎児の有核の赤血球を 濃厚化し、続いて胎児の有核の赤血球を濃厚化するのにトランスフェリン受容体 を使用するという複雑な方法を記載している。次いで標識した細胞の同定にフロ ーサイトメトリーまたは磁気分離工程を必要とする。ガンシャート−アーラート の参考文献に言及したように、トランスフェリン受容体はいまだに循環している 母親の細胞集団中の胎児の細胞の信頼できる同定を提供しない。さらに、この濃 厚化の実施要綱は高価な試薬と長い実験室の手順を要し、したがって、多くの商 業的 または大規模スクリーニング及び診断の応用には受け入れられない。 本発明は、細胞試料の遠心分離で用いるための及び特に血球の集団から希薄な 細胞の濃厚化に用いるための、そして、さらに特に母親の血球集団から胎児の有 核の赤血球を濃厚化するために有用な経済的な密度勾配媒体を提供する。 本発明の一態様では、引用により組み入れられる継続中の出願番号08/190,327 号（代理人番号 16249−１）に記載されているように母親の末梢の血液試料から 胎児の有核の赤血球を単離及び濃厚化するのに用い得る。第１の遠心分離段階は 、低密度赤血球部分及びすべての白血球を、より濃い赤血球並びに血清または血 清タンパク質から分離する初期の濃厚化を提供する。好ましくは、本発明の第１ の遠心分離管は、管を通過する血球の動きを容易にするために、軟いプラスチッ ク製である。適当な管は継続中の米国特許出願番号08/189,249号（代理人書類番 号 16249−３）に記載されている。プラスチックの砂時計型の管は、過度の変形 または狭い中央の導管(channel)の部分での管の破壊を防ぐために、好ましくは 遠心分離機の内に支持されている。支持は任意の適当な手段により提供され得る 。たとえば、固体の取りはずし可能な注型物が管の囲りを取り巻く。本発明の好 ましい態様では、継続中の米国特許出願番号08/189,249号（代理人書類番号 162 49−３）に記載されているように、管は大きな容器、たとえば試験管の内の液体 支持媒体中の支持されている。液体のレベルは少くとも管の狭い部分を覆うのに 十分な高さである。好ましくは、この液体支持媒体の試料によって置換された容 積の重量は、試料管及びその内容物の容積の重量とほぼ等しい。本発明で用いる ための好ましい液体支持媒体は水である。 本発明の好ましい遠心分離管を図１に示す。図１の管（２）は砂 時計形で、狭くなった中央の導管（４）と共にそれより大きい上部（６）室及び 下部（８）室を含んでいる。管は、外側容器（10）に収容されており、該容器は 液体支持媒体（12）、たとえば水を砂時計型の管の狭い部分を浸すのに十分なレ ベルで、好ましくは、遠心分離の間の試料のレベルと等しいレベルで含有してい る。管は与えられた容積の血液サンプル（13）のためのように、目盛をあらかじ め決めることができ、決められた遠心分離機の回転速度及び時間で、管の狭い導 管の中に所望の部分を単離するとそれが帯を広くし、したがって所望の赤血球部 分の収集を容易にする。 第１遠心分離段階の遠心分離媒体は好ましくは、胎児及び母親の赤血球の相対 的密度を増加させ、血球同士の相対的な動きを増加させるのに十分な量であるが 、細胞の溶解を引き起こすには十分でない量の水の添加により少し低張にする。 好ましくは、水を全血液の容積の20〜30％の間の量で加える。さらに好ましくは 、水を全血液の容積の25％にほぼ等しい量で加える。いくつかの応用では、抗凝 集剤を存在させるか、第１の遠心分離に先き立って加えてもよい。いくつかの応 用で、遠心分離に先き立ってのさらなる添加は、血漿の密度を 1.025〜1.035 ｇ ｍ／mlに上げるために計算された小量の高密度水溶性媒体である。本発明の一 態様では、付加的な細胞の変形と細胞同士の相対的な動きの増加を提供するため に、赤血球の変形を可能とさせる化合物を第１の遠心分離管中の血液試料に加え る。適当な赤血球変形化合物は当業者に公知である。好ましい赤血球変形化合物 は、ハートマン(Hartman)とグレーサー（Glaser）の「生物科学報告（Bioscienc e Reports）」11：４ ｐ.213〜221(1991年)に記載されている。クロルプロマジ ン（２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−10Ｈ−フェノチアジン−10−プロパナミン ）である。 本発明の第１遠心分離段階は一連の回転速度の増加を含む。速度 は遠心分離段階の間に手動で調節するか、または適当な自動遠心分離機に前もっ てプログラムすることができる。 第１の遠心分離は、単一の高速回転よりもむしろ、多数の増加する速度で処理 するのが好ましい。この漸進的な取り組み方は、単一の高速容積分離段階で達成 される密度よりも細かい分離を提供する。 第１の遠心分離段階では、全血液部分は最初は低速で回転して、血漿から血球 を取り出し、したがって血球分離への最初の助力をもたらす。次いで管を１また はそれよりも多い中間の速度で血球の相互に関連する動きを可能とさせ、血球の 相互に関連する平衡密度を達成する。最高の速度で、血球もその平衡密度の位置 に充填されて、血球の積み重ねをつくり、遠心分離後赤血球層の回収を容易とす る。 本発明の好ましい態様では、最初の回転は 200ｇより少く、５分間起こり、25 00〜3000ｇの範囲で15分間の回転、14,000ｇの高速回転で５分間と続く。当業者 は、遠心分離の速度及び持続の最高の活用は血液試料の容積、型、形及び遠心分 離管の巾に対する高さの比、媒体及び密度修飾血漿の低張並びに血球変形化合物 の存在もしくは不存在を含む因子に依存することを認識するだろう。これらの状 態の最高の活用は熟練者の範囲内である。 第１遠心分離段階後、赤血球を含有する部分が得られる。この部分は白血球も 含む。管の頂部は血漿部分を含んでいる。血漿よりは濃いが他の赤血球よりは濃 くない、有核の赤血球は、血漿のすぐ下に見い出される赤血球の積み重ねの頂部 に分画されそして、白血球と可変的に混ざり合うであろう。前もって目盛りを決 めた第１の遠心分離管の使用は第１の管の狭い部分から関連する部分の容易な抜 き取り可能とし、したがって、第１の遠心分離段階からの血清及び 血漿を含む、他の血液部分の包含を最小とする。 赤血球及び白血球を含有する部分は、溶血させて母親の赤血球を差別的に破裂 させることができる。母親の赤血球の差別的な溶血は、残存する母親の赤血球の かなりの量の破壊を可能とするのに対し、大多数の胎児−起源の血球は保存され る（Boyer S．H．他「血液(Blood)」47（６）ｐ.883〜897(1976年)。差別的な溶 血は、任意の反応容器で生じ得る。好ましい態様では、母親の赤血球の差別的な 溶血は、第２の遠心分離容器の上部で起こり、溶血反応は、反応生成物、すなわ ち保存された赤血球を密度勾配媒体中に遠心分離することによって停止され、し たがって、赤血球を溶血試薬から除去することができる。 本発明による差別的な溶血は、赤血球はNH₄−及びHCO₃−イオンを含有する溶 液中で破壊されるという事実を利用する。血球の破裂は、カルボニックアンヒド ラーゼ酵素の阻害剤により減速し得る。カルボニックアンヒドラーゼの程度は胎 児の赤血球中よりも成人の赤血球中で少くとも５倍高い。したがって、NH₄−HCO₃ 仲介の溶血速度は、特にカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤の存在下では、成 人の赤血球よりも、胎児の有核の赤血球を含む、胎児の赤血球では遅い。本発明 において用いる好ましいカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤は、アセタゾールア ミド、エトキシゾールアミド（６−エトキシゾールアミド、Sigma Chemical Co. ）及びメトキシゾールアミド（methoxzolamide）である。 差別的な溶血は、白血球とともに、胎児の赤血球について濃厚な赤血球の集団 をもたらす。本発明によると、溶血後の胎児の血球の濃厚化の程度は少くとも10 00倍である。濃厚化された胎児の赤血球部分を、胎児の有核の赤血球の濃厚化さ れた部分を収集し、溶血反応に起因する赤血球断片及び大部分の白血球を除去す るために、次 いで密度勾配媒体を通して遠心分離する。本発明により、20mlの末梢の血液の最 初の試料中に存在する胎児の有核の赤血球を20μｌに減少でき、したがって、顕 微鏡のスライド上でのまたはポリメラーゼ連鎖反応による同定及び分析を容易と する。 本発明の第２の遠心分離段階は密度勾配媒体を利用する。溶血後、有核の赤血 球はPCT 出願番号 WO9323754号に記載されているように、白血球部分の成分であ る顆粒球とほぼ同じ密度で密度勾配中で平衡すると予想される。しかしながら、 本発明においては勾配媒体の低張及び密度が、試料の白血球成分から胎児の有核 の赤血球の分離及び濃厚化を可能にする。 本発明で用いる密度勾配媒体は溶融し得るゲル中に分散したコロイドを含む。 コロイドは勾配媒体に必要な密度を与える。したがって、コロイドの濃度を変更 することによって、媒体の密度は相応して変更し得る。コロイドの微粒子の性質 がゲル状態の間には、一層から他層への拡散なしに密度の異なった層の固定を可 能とする。さらに、コロイドは、血球を実質的に集合していない状態に保持する ことができる。本明細書においては、実質的に集合していないは、血球はその密 度及び媒体の低張により相互に関連して動くことができ、それらの密度にしたが って密度勾配媒体を通って、とらえられた血球が自由に移動できないような仕方 で血球をとらえる、かたまりを生成しない。本発明で用いる媒体に密度を与える 好ましいコロイドはポリビニルピロリドンを被覆したシリカであり、たとえば、 ファルマシア(Pharmacia)により製造され、シグマ化学会社（Sigma Chemical Co .）から入手できるパーコール（Percoll：商標）である。 本発明による胎児の有核の赤血球の濃厚化に用いられる密度勾配媒体は高張で ある。高張状態下では、赤血球は縮み、したがって、 もっと濃厚になる。これらの条件下で、白血球は一定の密度を維持する。したが って、高張媒体中の赤血球の選択的な縮みにより、これらの血球の密度は増加し 、それらは白血球とは異なった密度で勾配中で平衡化する。 媒体は遠心分離混合物への塩の添加により高張にすることができる。本発明で 用いるのに適当な塩は塩化ナトリウム、塩化カリウムもしくは塩化リチウムまた はそれらの任意の混合物である。商業的に入手できる平衡塩溶液、たとえばダル ベッコのリン酸塩緩衝塩類塩(PBS)、ハンクの緩衝塩溶液、アール（Earl）の緩 衝塩溶液及び同種のものも用い得る。 本発明で用いるゲルは溶融し得るゲルである。本明細書では、「溶融し得る」 はゲル状態からゾル状態の間を遷移することができる任意のゲルを含む。本明細 書では、「溶融」は、ゲル状態からゾル状態への遷移をいい、それは、熱、光、 電流、磁性または物理的破裂、化学物質及びその同種のものの適用を含む任意の 適当な手段によって達成することができる。本発明の好ましい態様では、溶融し 得るゲルは、ゲル状態からゾル状態に熱の適用によって変換する。この態様では 、ゲルは好ましくは室温でゲル状態であるが、ゲルといっしょの任意の細胞成分 の完全な状態を維持するのに十分な低温でゾル状態に変換できるものである。 最も好ましい態様では、溶融し得るゲルを含む密度勾配媒体は室温ではゲル状 態であり、37℃でゲル状態からゾル状態に変換することができ、その後、本発明 の方法を実施するのに十分な持続期間、ゾル状態を維持する。 本発明の他の態様では、溶融し得るゲルは化学物質の適用によりゲル状態から ゾル状態に変換し得る。たとえば、カラギーニン（Sigma Chemical Company，St ．Louis Mo）またはアルギン酸（Kelco， San Diego，CA）は多価カチオンで架橋したゲルを生成する。EDTAのようなキレ ート化剤の適用はゲルの架橋を破壊し、ゲルをゾル状態に溶融する。化学的キレ ート化剤は当業者に既知であり、たとえばメルクインデックス11版に記載されて いる。 本発明において用いる溶融し得るゲルの非−限定例は、寒天、アガロース、低 融点アガロース、アルギン酸、カラギーナン、ペクチンまたはゼラチンである。 本発明で用いる好ましいゲルはゼラチンである。当業者は、これらのゲルの組み 合せも用い得ることがわかるであろう。好ましくは、ゾル型の時、ゲルは分離さ れた部分を収集のためにみることができるように、適度に透明である。 コロイド／ゲル密度勾配媒体の調製方法は、勾配が貯蔵される時間、分離され る血球の性質及びゲルが溶融する温度に依存して変化し得る。たとえば、比較的 に高融点を有するゲルは、一般的に低融点のゲルよりも低い濃度で調製される。 本発明の好ましい態様では、密度勾配媒体は、前もって充填されたユニットと して、第２遠心分離管に供給される。したがって、密度勾配は長い期間貯蔵する ことができ、それは実験室での調製段階を除く。使用にあたり、第１遠心分離段 階から得られた濃厚化された赤血球部分を直接に第２遠心分離管の上部に移し、 その位置で溶血反応を行うことができる。次いで該ゲルを溶融し、溶血反応の反 応生成物、すなわち、保存された血球を溶融されたゲル中に追いやるように遠心 分離する。密度勾配媒体の高張は溶血反応を減速するのに役立つ。 本発明のこの態様では、前もって充填された密度勾配媒体は下記のいずれか１ またはそれよりも多い追加の化合物といっしょにキット型で供給され得る：すな わち、溶血試薬、クロルプロマジンのような赤血球変形化合物、前もって目盛を 決めた第１段階遠心分離管 及び実験を制御するための試薬である。 本発明の他の態様では、溶血反応は、別の反応容器で生じ、溶血反応は、上記 のように、化学物質の適用により停止し得る。 密度勾配は任意に防腐剤を含むことができ、それは、密度勾配に導入するのに 適切な任意の形で、たとえば固体または液体防腐剤であり得る。適切な防腐剤の 非−限定的な例は、アジド、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル及びｐ−ヒドロキ シ安息香酸メチルである。 密度勾配は、その中に遠心分離される血球に作用するさらなる試薬も任意に含 むことができ、たとえば高濃度のカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤を、溶血を 引き起こす反応を完全に停止させるために含むことができる。 遠心分離された試料の成功した分離及び胎児の有核の赤血球の濃厚化を示す方 法は、当業者に既知であり、有核の赤血球の実際の収集、調製されたスライドま たは血球計数器のような固体支持体上で、その場でのハイブリダイズでの蛍光を 算定し、各赤血球または各赤血球部分の密度の代用物を測定することを含む。 最初の方法では、濃厚化された血球集団を固体支持体上に移し、胎児または有 核の物質に特異的な染料で着色する。これらの方法は当業者に既知である。たと えば、クライハウアーＥ．（Kleihouer）他「Clinicia Wochenschr.」35：Ｐ.63 7（1957年）及びベッケ(Betke)、Ｋ「Bibl．Haem．」29：ｐ．1085（1968年）に 記載されている、クライハウアー−ベッケ(Betke)成人ヘモグロビン抽出は、任 意の残存母親赤血球からヘモグロビンを抽出し、したがって、胎児のヘモグロビ ンを保存するのに用いることができる。次いで、該血球をヘモグロビンについて 検査し得る。あるいは、該血球を当業者に既知の核染料を用いて核の存在を検査 し得る。核染料はクロマチン、核タンパク質、DNA または他の核成分を認識し得 る。核染料の 非−限定的例はメチレン−ブルー、ヘマトキシリン、沃化プロピジニウム及びチ オニンを含む。 後の方法ではサブ試料または全赤血球の部分中の赤血球の平均血球容積(MCV) はこのような代理物(surrogate)である。同様に、平均血球ヘモグロビン濃度（M CHC）は、赤血球の密度を測定するための他の代用物である。両測定は血液の（h emalogs）または日常の自動血液学器具、たとえば Miles−Technicon のＨ・１ （商標）、Ｈ・２（商標）及びＨ・３（商標）を含む「Ｈ」シリーズを利用でき る。 本発明の方法と組成物を用いることにより、胎児の有核の赤血球の集団は、10 00倍またはそれよりも多い因子で、表１に例示するように出発容積の20mlから濃 厚化し得る。表１では、母親の末梢血液の20ml試料中に見い出されると予期され た胎児の有核の赤血球の出発数は、10⁸血球に１及びI0¹¹球に１の間という推測 「もれ（leak）」値に基づいて計算された。 本発明の他の態様では、血球集団から希薄な血球を分離し得る。希薄な血球の 存在または不在の検出は、希薄な血球が存在している病気の状態の診断または差 別的な診断に用い得る。あるいは、希薄な血球は、診断または治療に用いる本発 明の方法にしたがって単離し得る。 本発明の態様では、該方法は、第１遠心分離容器中の血液試料を遠心分離して 、希薄な血球を含有する部分を得る段階、希薄な血球部分を第２遠心分離容器の 上部に移す段階、第２遠心分離容器は溶融し得るゲル中に分散されたコロイドか らなる密度勾配媒体を含んでおり、該コロイドは、希薄な血球を実質的に集合し ていない状態に維持することが可能である、ゲルを溶融する段階、そして、密度 勾配媒体を通して、希薄な血球を遠心分離して、希薄な血球に富んだ部分を得る 段階を含む。 希薄な血球は、増加もしくは減少した密度または変更された形のような差別的 な密度勾配特性を示すか、示すことができるようにされたいかなる血球であって もよい。したがって、希薄な血球のこれらの特性は、周囲のモル浸透圧または細 胞の量を変えることにより操作できる。 本発明により単離し得る希薄な血球の非−限定例は、ウイルスまたは他の感染 性作因で感染された赤血球、寄生的なインフェステーション及びトリパノゾーマ を含む赤血球のインフェステーション、がんの血球または異常な形の血球、たと えば鎌状血球を含む。既知の赤血球インフェステーションは、イハラムラ（Ihar amulla）Ｒ．Ｌ．他が「Trans．Royal．Soc．of Tropical Medicine and Hygien e」81：ｐ．25〜28（1987年）に記載されているようにマラリア原虫プラスモジ ウム ビバックス（Plasmodium vivax）及びプラスモジウム ファルシパルム(P lasmodium falciparum)に伴うものを含む。希薄な血球は変型の血球、たとえば サラセミア、鎌状赤血球性貧血症及び他の多くの血液学の障害に見い出される血 球を含み得る。希薄な血球は成人の有核赤血球も含み、それはいくつかの病気の 状態、たとえば、骨髄線維症のような骨髄増殖性疾患及び一次性赤血球増加症（ バーケズ(Vaquez')病）で生じ得る。 胎児の有核赤血球を含む、濃厚化された希薄血球は、熟練者に明らかである種 々の方法に用い得る。たとえば、胎児の有核赤血球は、適当なプライマーとのポ リメラーゼ連鎖反応において、医療の条件、たとえば特定の病気の対立遺伝子の 存在または不在を検出するのに用い得る。該血球は、第２のまたは安定な細胞系 を創造するのに用い得る。 本発明をさらに例１〜５を用いて説明するが、それは例示であって、範囲を制 限するつもりではない。実験例 例１−第１遠心分離段階のための試料の調製 第１遠心分離管を次のように調製した。狭い（１mm）柄を有するポリエチレン （PE）移動ピペット、Ｅ＆Ｋ＃ 50020（Ｅ＆Ｋ Scientific Saratoga，CA）のバ ルブから最も離れた端部を口が閉鎖されるまでポリエチレンを熱溶融することに よりシールした。バルブを横に切って巾の広い口を提供した。 試料を管に充填するために、試料を柄にいまだに結合している切られたバルブ の残部に入れた。充填された毛細管PEを 9.5mlの水を含有している10mlの試験管 中に入れ、次いでCentra IEC遠心分離機型７に入れた。全集成体を低ｇ力(138ｇ )で５分間遠心分離した。これは、血球分離の工程を開始し毛細管中の空気のブ ロックを除去した。 138ｇで５分間の最初の遠心分離後、赤血球を低末端にゆるく充填した。管を さらに2800Ｇで15分間、7000Ｇで15分間、14,000Ｇで５分間遠心分離した。毛細 管中の赤血球の積み重ねを次いでメスで各々が赤血球を含有している10の等しい 断片に切った。各断片からの血球を血漿に似せて塩及びタンパク質を含有する媒 体(0.9％のNaCl，６％のウシ血清アルブミン(BSA)）に再懸濁した。血球を胎児 の有核赤血球を同定するために顕微鏡スライド試験のために準備するか、MCV 及 びMCHCを分析した。例２−コロイド／ゲル密度勾配媒体の調製 10ｇのKnox（商標）ゼラチンを50mlの脱イオン水上に置き、浸して、膨潤を可 能とした。次いで、ゼラチンの膨潤した粒子を溶解して溶融するまで55℃に加熱 した。これは20％のゼラチンの貯蔵溶液として用いた。この貯蔵溶液は直ちに用 いるか、または、４℃でゲルとして貯蔵し、使用の前に溶融することができる。 貯蔵塩類溶液は、50mlの脱イオン水中のNaCl（4.96ｇ），KCl(0.76ｇ)，LiCl （0.21ｇ），Na₂HPO₄(0.67ｇ)及びKH₂PO₄（0.25ｇ）から調製した。貯蔵塩類溶 液はpH6.8、密度1.085ｇ／ml及びモル浸透圧4389.2mOsmを有していた。 パ−コールの変化する密度勾配媒体溶液を式： に従って作った。 式中、Ｄ ＝所望の密度 Ｖ_o ＝添加パ−コールの容積 Ｖ ＝作業溶液の最終容積 Ｄ_o ＝パ−コール貯蔵溶液の密度 MS＝添加された貯蔵塩類液の割合 TN／TSから計算した TN＝所望の最終溶液の張度 TS＝貯蔵塩混合物の測定された張度 DS＝貯蔵塩類溶液の密度 CG＝所望のゼラチンの倍数としての貯蔵ゼラチンの濃度 MG＝添加された貯蔵ゼラチンの割合 １／CGから計算した DG＝貯蔵ゼラチンの密度 及び 式中、Ｄ_o＝1.129ｇ／ml，DS＝1.047ｇ／ml，TS＝4389mOsm，DG＝1.052ｇ／ml及 びCGは10×最終の２％である。 密度1.110，1.095，1.080及び 1.065ｇ／ml及び張度 300（等張）、360（少し 高張）及び500(強く高張)mOsmを有する密度勾配媒体(Ｖ＝100ml)を上述の関係式 に従って、次のように調製した。 溶液は室温で約１時間安定で、その後ゲル化し始める。 勾配をガラス製の13×100mm 試験管(全溶積9.5ml)中に、１mlの各300mOsm 密 度勾配溶液の一層を一度に加え、最も濃いものから始めて、続いて下っていく順 で作った。 各層を加えた後、管を氷水で冷却した。溶液は15〜20分置き、その時間に次の 溶液を加えて非常に鋭い境界面を生産した。各管をシールし、使用時まで４℃で 貯蔵した。例３ 全血のみを用い、13試料の平均血球容積及び平均血球ヘモグロビン濃度を、各 試料に25％の容積の水の標準的な添加する、前後に検査した。結果を図２のヒス トグラムに示す。図２において、各「×」は臍帯の血液試料を表わし、各「○」 は懐胎12〜19週の母親の末梢血液試料を表わし及び「●」は出産（40週）で得ら れた母親の末梢血液を表わす、図２の上のパネル（図2A）は等張全血試料の分布 を示すのに対し、下のパネル（図2B）は高張に作られた試料における分布を示す 。 図２から、臍帯の試料の平均血球容積は母親の血液試料の平均血球容積から、 試料を低張に下げる前、後の両方で良く分離された。付加的に、試料を低張に下 げた後にMCHC測定における母親の血球及び臍帯の血球の間の分離に著しい改良が ある。したがって、MCHCによって観察すると、血球の密度はMCV 中での差と同様 に大きい。しかしながら、非−等張条件では、各血球中のヘモグロビンは変化し ないが、より小さい母親の血球よりもより大きい胎児の血球はもっと膨潤するか 、または縮む。したがって、よりよいコントラストはMCHC中で、臍帯の血液試料 及び母親の試料の間で、媒体が非−等張の時に観察され、密度勾配中の胎児の有 核赤血球の濃厚化及び単離を容易にする。例４ 約300ｍモル浸透圧の塩強度で塩化アンモニウム及び重炭酸ナトリウムの溶血 を起こす混合物を調製した。母親（ｍ）の血液試料及び腑帯（ｃ）の血液試料を 希釈剤としての生理的塩類溶液または溶 血を起こす混合物のいずれかに、20μｌのカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤ア セタゾールアミド（１mMの最終濃度で）、フッ化ナトリウム（最終濃度 150μｍ で）またはアジド（１％）の存在または不存在でさらす。溶解混合物中で15倍に 希釈した血液の最終容積中で完全な血球の数を７分及び17分後に定量した。結果 を表３及び４に示す。 表３から分かるように、混合物中にアセタゾールアミドが存在するとき、臍帯 の血はより耐溶血性であるのに対し、フッ化物及びア ジドは防御効果が少ない。 試料15及び16から分かるように、溶血は高張媒体（試料15及び16）中で妨げら れる（または血球の算定は維持される）。これは、カルボニックアンヒドラーゼ 仲介溶血反応によって駆動された、血球外の塩の濃度及び血球内の塩の濃度の間 の均等化に起因する。したがって、血球内及び血球外の塩の濃度は相互に関連し て安定性を維持し、よって溶血を防ぐ。 表４から分かるように、400ｍ O smを超える塩濃度は、成人及び臍帯の血液 試料の両方の溶解を防ぐだろう。例５ 妊娠していない成人個体から採取した血液試料に、臍帯の血液を25％，12.5％ ，8.3％及び6.25％の量で追加した。胎児の有核赤血球を例１及び例２の方法に したがって単離した。遠心分離段階の後で得られた最終容積は20μｌであった。 20μｌの容積を 3.5μｌのアリコートに分割した。各アリコートについて、有核 赤血球の数を、試験片のライト（Wright）の染色した顕微鏡スライド上で標準の 一定の通路にわたって定量した。各20μｌ容積から回収されたNRBCの全体の数を 表５に示す。 表５のデータは、通常の血液試料に加えた臍帯の％と試料から回収された有核 赤血球の量の間は直線状の関係を示し、本発明の方法による希薄な血球の成功し た濃厚化及び同定を示している。 本明細書のすべての刊行物、特許及び特許出願は、各個々の刊行物または特許 出願が引用により、特定的に及び個別に組み入れられることを示したのと同じ程 度で、引用により組み入れられる。 本発明の好ましい態様の前述の記載は、説明と記載の目的で提示されている。 それらは余すところがないことまたは開示されたその通りの形に 本発明を制限することを意図するものではなく、上記教示を考慮すると多くの修 正または変更が可能であり、本発明の範囲内であることを意図している。 前述の発明は説明及び例をもって少々詳しく記載したが、それは理解を明瞭に する目的であって、ある程度の変更及び修正は添付した請求の範囲内で、実施す ることができることは明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞集団の遠心分離のための媒体であって、該媒体は、溶融し得るゲル中 に分散されたコロイドを含み、該コロイドは該細胞集団を実質的に集合していな い状態に維持できるものである、媒体。 ２．該溶融し得るゲルが、寒天、アガロース、低融点アガロース、アルギン酸 、カラギーニン、ペクチン及びゼラチンからなる群より選択される、請求項１に 記載の媒体。 ３．該コロイドがポリビニルピロリドンを被覆されたシリカである、請求項１ に記載の媒体。 ４．該溶融し得るゲルがゼラチンである請求項１に記載の媒体。 ５．請求項１に記載の媒体であって、該媒体は多数の層を含み、各層が異った 密度を有し、そして、該媒体は、頂部と底を有し、頂部は開口を有している遠心 分離容器内に封入されていて、該層は容器の頂部から容器の底に密度が増加して いる、媒体。 ６．さらに防腐剤を含んでなる請求項５に記載の媒体。 ７．細胞集団中の細胞の密度分離のための密度勾配媒体であって、該密度勾配 媒体は、溶融し得るゲル中に分散されたコロイドの多数の層を含んでなり、該コ ロイドは細胞集団を実質的に集合していない状態に維持することができるもので あって、該層は、頂部と底を有し、頂部は開口を有している容器内に封入されて おり、該層の密度は容器の頂部から容器の底に増加するものである媒体。 ８．該細胞が胎児の有核赤血球である請求項７に記載の密度勾配媒体。 ９．請求項１に記載の密度勾配媒体であって、該多数の層が密度1.065ｇ／ml ，1.080ｇ／ml，1.095ｇ／ml及び1.110ｇ／mlの密度を有する層を含んでなる媒 体。 10．該媒体が胎児の有核の赤血球に関連して高張である請求項８に記載の密度 勾配媒体。 11．請求項10に記載の密度勾配媒体であって、さらに、塩化ナトリウム、塩化 カリウム、リン酸塩緩衝塩類液及び平衡塩類液からなる群から選択された塩を含 んでなる媒体。 12．請求項７に記載の密度勾配媒体であって、該溶融し得るゲルが、寒天、ア ガロース、低融点アガロース、アルギン酸、カラギーニン、ペクチン及びゼラチ ンからなる群から選択されたものである媒体。 13．該コロイドがポリビニルピロリドンで被覆されたシリカである請求項10に 記載の密度勾配媒体。 14．さらに防腐剤を含んでなる請求項12に記載の密度勾配媒体。