BRPI0702629B1 - Meio de suspensão para hemácias - Google Patents

Abstract

MEIO DE SUSPENSÃO PARA HEMÁCIAS. A presente invenção refere-se a um meio de suspensão para hemácias compreendendo uma combinação de aminoácidos de qualquer grupo, bem como tampão de fosfato, cloreto de sódio, glicose, adenina, conservantes, EDTA e glicina, e também inosina, citrato, ácido cítrico e bicarbonato, as concentrações dos aminoácidos sendo maiores do que aquelas necessárias para reduzir a força iônica.

Description

DESCRIÇÃO Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um novo meio de suspensão para hemácias, para realizar os principais testes de aglutinação imunohema- tológica requerendo eritrócitos os quais são realizados em hospitais e centros de transfusão de sangue. A determinação do grupo sorológico, a detecção e identificação de anticorpos irregulares, a preparação de controles positivos e negativos, e a necessidade de preservar amostras para investigação de resultados anômalos, requerem hemácias, ressuspendidas em um meio aquoso, as quais mantêm sua funcionalidade.

Estado da Técnica

O avanço clínico proporcionado por transfusão de sangue trouxe consigo um desenvolvimento da imunohematologia. Sem isto, não teria sido possível o número de transfusões que são realizadas atualmente em vítimas de acidentes, em cirurgia ou no tratamento de leucemia, câncer e outras doenças. Na Espanha, durante o ano de 2004, foram feitas um total de 1,6 milhões de doações de sangue (1), nos Estados Unidos, estima-se que em torno de 15 milhões de bolsas de sangue são doadas por ano (2) e a Organização Mundial de Saúde, com base nos dados de 178 países, estima em 81 milhões o total de unidades de sangue doadas anualmente (3). Este número de doações não teria nenhuma utilidade sem determinação imunohe- matológica anterior. Os grupos sanguíneos principais que são determinados no sistema ABO e no sistema RH, e particularmente deste segundo sistema, antígeno D (RH1).

Em uma situação de emergência, todos os indivíduos podem receber hemácias ou glóbulos vermelhos do grupo O, e indivíduos AB podem receber hemácias de qualquer grupo ABO. Deste modo, indivíduos do grupo O são conhecidos como doadores universais e indivíduos AB como receptores universais. A aceitação de glóbulos vermelhos ou hemácias oriundos de uma pessoa de um grupo sanguíneo particular por outra pessoa é condicional aos anticorpos presentes no plasma do receptor. Portanto, indivíduos do grupo O têm anticorpos contra antígenos A e B, indivíduos do grupo A têm anticorpos contra B, e vice-versa para indivíduos do grupo B, e indivíduos do grupo AB não têm anticorpos. Consequentemente, não são as hemácias, mas o plasma de indivíduos AB que pode ser doado a todos os grupos sanguíneos.

A base da análise imunológica é então a determinação do grupo ABO e do grupo RH. O sistema ABO é determinado por antígenos e anticorpos (conhecidos como anticorpos regulares), enquanto o sistema RH e os outros sistemas somente têm anticorpos (conhecidos como anticorpos irregulares) em consequência da gravidez e da prática de transfusões. No entanto, apesar de sua baixa frequência na população, a determinação de anticorpos irregulares é muito importante, e está sendo implementada em todos os hospitais e centros de transfusão de sangue de modo a evitar riscos e obter transfusões extremamente seguras. Também têm sido implementadas determinações neonatais, tanto para diagnosticar possíveis doenças hemolí- ticas do recém-nascido, quanto também para profilaxia a ser proporcionada à mãe no caso dela ser Rh- (falta de antígeno D) e a criança ser Rh+ (apresentar antígeno D).

Em imunohematologia, a introdução de novas tecnologias para tipagem de hemácias, testes de compatibilidade e detecção de anticorpos regulares e irregulares têm representado os avanços mais significativos nesta área. Os aprimoramentos têm sido relacionados com os componentes que favorecem aglutinação específica (por exemplo, solução de Coombs, solução LISS (solução de baixa força iônica), soluções com albumina, soluções com enzimas proteolíticas ou outros potencializadores da união antígeno- anticorpo), o aprimoramento de anticorpos reativos (por exemplo, anticorpos monoclonais), e também metodologias novas ou essencialmente diferentes se tornando disponíveis para apresentar aglutinação (por exemplo, técnica de gel e microlâmica-micro-sheet). O aparecimento da técnica de microtubos em uma coluna, também conhecida como técnica de gel ou cartão, proporciona a base para a modernização da imunohematologia. Desde seu apareci- mento em 1986, a técnica de microtubos em uma coluna (4) não parou de experimentar espetacular crescimento. Devido a sua facilidade de automação, esta metodologia deslocará o resto das técnicas, sendo prevista como a única técnica que permanecerá para determinação fenotípica. Junto com a técnica genotípica que prevalece, formarão a base para análise imunológica. Atualmente, a maioria das metodologias para determinação genotípica estão nos estágios preliminares, em todos os casos limitados a laboratórios de pesquisa.

A técnica de gel separa as células aglutinadas das células que não aglutinaram, através de centrifugação em uma matriz de filtração formada por pequenas bolas de gel (EP 194212, EP 305337), de vidro ou outro material esférico (EP 485228, EP 725276, EP 755719). Na parte superior do microtubo, a câmara de reação, localizada acima da coluna de gel, as amostras são dispensadas. Na coluna na qual o gel ou matriz de filtração está contido, há uma solução tamponada a qual, dependendo da análise, pode conter anticorpos específicos (por exemplo, anti-A, anti-B ou anti-D) ou anti- globulina humana (anticorpos anti-IgG ou anti-IgM humana), conhecida como solução de Coombs. A matriz de filtração é composta de partículas esféricas as quais sedimentam em uma solução aquosa tamponada. De modo a apresentar a aglutinação imunohematológica, é realizada centrifugação, forçando as células (hemácias) a passar através da matriz de filtração. O espaço que permanece entre as partículas é suficientemente grande para permitir que as células que não aglutinaram, isto é, células individuais, atravessem. Enquanto no caso de ter ocorrido aglutinação, as células aglutinadas são retidas entre as bolas. Embora, estritamente, seja uma técnica qualitativa, a passagem através da matriz de filtração torna possível distinguir diferentes graus de aglutinação. Em amostras positivas na parte superior do gel os aglutinados muito fortes serão retidos, enquanto os aglutinados fracos podem passar uma certa distância através da matriz, permanecendo a meio caminho, por exemplo. A ausência de aglutinação significará que todas as células atingiram a base do microtubo (reação negativa). Conforme ocorre em imunohematologia convencional, devido à cor vermelha intensa das he- mácias, a técnica não requer qualquer marcador ou amplificador da união antígeno (hemácias) - anticorpo.

A técnica de gel tornou possível separar fisicamente os resultados positivos dos resultados negativos, isto é, os positivos na parte superior do gel (aglutinado de alta intensidade), ao longo da coluna (aglutinados médios ou fracos), e na parte inferior da coluna os resultados negativos (hemá- cias não-aglutinadas).

Nos testes imunohematológicos para detectar anticorpos regulares e irregulares no plasma ou soro, são usadas hemácias reagentes. As hemácias referidas são preparadas em uma solução a fim de manter sua funcionalidade e integridade por um determinado período de tempo, habitualmente entre 1 e 4 semanas. Nos laboratórios de bancos de sangue ou nos responsáveis por transfusão de sangue, as hemácias com antígenos específicos são selecionadas de modo que possam agir como hemácias reagentes em cada um dos testes imunohematológicos. As combinações necessárias para preparar as células de triagem, reunião de 2, 3 ou 4 hemácias com especificidades antigênicas concretas as quais tornam possível detectar anticorpos, ou painéis, reunião de 11 ou mais hemácias o que torna possível identificar a especificidade dos anticorpos detectados, não são fáceis de produzir e também podem se comprovar de difícil execução em centros de tamanho médio. As dificuldades para obter os painéis ou células de triagem referidos, adicionados à necessidade de preparar estas hemácias reagentes frequentemente, são muito familiares para qualquer versados na técnica, assim como a necessidade essencial de ter disponível uma solução de suspensão para hemácias ou um diluente para hemácias. Além disso, painéis ou células de triagem também são preparados com um tratamento enzimáti- co (por exemplo, papainização) de modo a potencializar a reatividade de grupos sanguíneos específicos. Os grupos sanguíneos potencializados por este tratamento são de conhecimento geral de qualquer versados na técnica.

São atualmente usadas soluções diluentes as quais são variações da solução de Alsever original. Estas soluções contêm geralmente um anticoagulante (por exemplo, citrato), um tampão de fosfato, uma fonte de energia (por exemplo, glicose), purinas e nucleosídeos (por exemplo, adeni- na e inosina), cloreto de sódio, e conservantes (antibióticos). No entanto, as hemácias reagentes preparadas com estas soluções convencionais podem apresentar problemas na tecnologia de gel. A separação física a qual tem permitido tecnologia de gel pode ser afetada, uma vez que algumas das he- mácias não-aglutinadas são frequentemente retidas ao longo da coluna. Esta retenção não-específica produz resultados positivo falsos, uma vez que é confundida com um aglutinado médio ou fraco.

A solução de suspensão para as células sanguíneas reagentes deve tornar possível manter as características funcionais e sua capacidade para passar através da coluna de gel para a parte inferior da coluna no caso de não terem aglutinado. Estas características devem ser mantidas pelo máximo de tempo possível, devido às dificuldades de preparar hemácias em laboratórios de imunohematologia determinadas previamente. Os parâmetros que devem ser mantidos constantes durante este período são, entre outros, o pH, a osmolaridade e a força iônica. Do mesmo modo, é essencial proporcionar glicose e adenina de modo que as hemácias mantenham sua viabilidade. A reunião e concentração destas substâncias provoca um aumento na força iônica que é reduzida pela adição de glicina. As hemácias perderam o núcleo genético e qualquer capacidade para biossíntese, de modo que a adição deste aminoácido não está de modo algum relacionada com síntese de proteína.

Descrição da Invenção

Na pesquisa realizada pelos inventores de modo a reduzir a perda de especificidade que é observada em hemácias reagentes, foi descoberto surpreendentemente que a adição a estas soluções diluentes para hemá- cias reagentes de combinações de aminoácidos a parte de glicina, em concentrações maiores do que as necessárias para reduzir a força iônica, torna possível reduzir a perda de especificidade que é observada em hemácias reagentes, isto é, reduz consideravelmente a retenção não-específica de hemácias não-aglutinadas ao longo da coluna de gel.

Por este motivo, será dada agora uma descrição no presente requerimento de patente das composições de soluções diluentes para he- mácias reagentes as quais tornam possível manter a integridade e a funcionalidade das hemácias reagentes durante um período de tempo prolongado, por exemplo, 8 semanas. Durante este período de tempo, as hemácias preservam sua capacidade para passar através do gel ou qualquer outro espaço estreito e a capacidade para não aglutinar não especificamente, mantendo a característica de deformabilidade, integridade e antigenicidade, de modo que podem ser usadas como um reagente imunohematológico para a determinação do grupo sérico, um teste para detectar anticorpos regulares, e na investigação e identificação de anticorpos irregulares.

A incorporação das combinações de aminoácidos de acordo com a invenção em uma solução diluente ou meio de suspensão para he- mácias mantém as hemácias em um estado de integridade e com características de funcionalidade as quais permitem seu uso em tecnologia de gel. A passagem das hemácias através de uma matriz de gel não apresenta nenhuma diferença em retenção entre as hemácias frescas (tempo da preparação inicial para a suspensão) e as mantidas por 8 semanas. Isto é, os ami- noácidos incorporados na solução diluente tornam possível manter nas he- mácias as características físicas iniciais das hemácias frescas. Quanto mais tempo leva a preparação de hemácias, mais possibilidades existem para o aparecimento de resultados positivo falsos. As hemácias reagentes são células vivas, de modo que a degradação em um tempo relativamente curto é de conhecimento geral de qualquer versados na técnica.

A técnica do gel permite quantificação visual entre aglutinados de diferente tamanho. Os resultados da aglutinação são habitualmente designados por uma graduação de escore similar à da tabela 1. Conforme descrito previamente, hemácias não-aglutinadas, hemácias as quais devem ser encontradas no fundo da coluna, podem apresentar resultados similares a +/- e 1+ os quais dariam um diagnóstico incorreto, uma interpretação positiva incorreta Tabela 1.

A adição das combinações de aminoácidos de acordo com a presente invenção a um líquido o qual contém os constituintes habituais conhecidos por qualquer versados na técnica, reduz consideravelmente retenções não-específicas das hemácias reagentes. Estes constituintes são tampão de fosfato, cloreto de sódio, glicose, adenina, conservantes (por exemplo, cloranfenicol e neomicina), EDTA e glicina.

A concentração de cada um dos aminoácidos os quais formam as combinações de aminoácidos da presente invenção pode variar de acordo com sua solubilidade em soluções aquosas e de tal modo, como um todo, a osmolaridade total da solução diluente para hemácias está dentro de um alcance de 100 a 700 miliosmol/kg.

Agora será dada uma descrição de exemplos de combinações de aminoácidos em uma solução de suspensão para hemácias de acordo com a presente invenção. Por exemplo, se em um líquido de base sem ami- noácidos (líquido N° 1) são adicionados aminoácidos (líquido N° 2), o número total de falsos positivos obtidos em 50 determinações individuais durante 10 semanas é reduzido de 13 para zero em uma triagem de duas células pela técnica de Coombs para anticorpos irregulares. Deve ser mencionado que 10 semanas a partir da fabricação das hemácias reagentes é um perío- do o qual excede os limites convencionais para conservação das hemácias reagentes. Outro modo de quantificar as diferenças entre os líquidos é comparar os escores médios obtidos de todas as determinações individuais. Os escores médios obtidos em 50 determinações de 10 frascos pequenos avaliados durante 10 semanas para o líquido N° 1 e o líquido N° 2 são, respectivamente, 2,44 e 1,52. Para uma técnica de triagem de 2 células com hemá- cias papainizadas, o número de falsos positivos é reduzido de 40 para 7 entre o líquido sem aminoácidos (líquido N° 1) e o líquido com aminoácidos (líquido N° 2). Os 7 falsos positivos foram obtidos na semana 10, ao passo que os falsos positivos para o líquido N° 1 foram obtidos em tempos menores a partir da preparação da suspensão. Comparando os escores médios nesta técnica de triagem de 2 células com hemácias papainizadsa também mostra claramente as diferenças entre os líquidos, o valor do escore médio de 50 determinações para o líquido N° 1 e o líquido N° 2 sendo 5,92 e 1,84 respectivamente. Líquido N° 1 Ingredientes Concentração (g/l) KH2PO4 (fosfato monopotássico anídrico) 1,36 Na2HPO4 (fosfato dissódico) 1,42 Cloranfenicol 0,17 Neomicina 0,10 NaCl 1,0 Dextrose (D-glicose anídrica) 3,5 Adenina 0,02 EDTA (dissódio diidratado) 2,80 Glicina 14,70 Líquido N° 2 Ingredientes Concentração (g/l) KH2PO4 (fosfato monopotássico anídrico) 1,36 Na2HPO4 (fosfato dissódico) 1,42 Cloranfenicol 0,17 Neomicina 0,10 NaCl 1,0 Dextrose (D-glicose anídrica) 3,5 Adenina 0,02 EDTA (dissódio diidratado) 2,80 Glicina 14,70 L-valina 3,20 L-metionina 2,52 L-leucina 2,60 L-isoleucina 6,48

Se em um líquido de base (por exemplo, líquido N° 1), à parte dos aminoácidos, são incorporados outros componentes descritos e amplamente usados em soluções de hemácias, tais como inosina, citrato, ácido cítrico e bicarbonato (por exemplo, líquido N° 3), o efeito dos aminoácidos podem ser ainda maior. No caso de uma triagem de duas células pela técnica de Coombs para anticorpos irregulares, não são obtidos falsos positivos em 50 determinações durante 10 semanas, e o escore médio é 0,96. Nem na triagem de duas células papainizadas são obtidos falsos positivos, e o escore médio é 0,80. Líquido N° 3 Ingredientes Concentração (g/l) KH2PO4 (fosfato monopotássico anídrico) 0,30 Na2HPO4 (fosfato dissódico) 0,28 Cloranfenicol 0,17 Neomicina 0,10 NaCl 1,00 Dextrose (D-glicose anídrica) 3,50 Adenina 0,02 EDTA (dissódio diidratado) 2,80 Inosina 0,02 NaHCO3 0,80 Citrato diidratado de Na3 2,00 Ácido cítrico monoidratado 0,18 Glicina 6,00 L-valina 3,20 L-metionina 2,52 L-leucina 2,60 L-isoleucina 6,48

Foi determinado (5) que antígenos específicos dos grupos sanguíneos (M, P1, Fya, Fyb, S e s) podem ser perdidos ou reduzir sua antigeni- cidade na ressuspensão das hemácias em soluções de baixa força iônica. A adição de aminoácidos não altera a expressão dos referidos antígenos, a mesma reatividade, potência antigênica, sendo observada a partir da preparação da suspensão até 10 semanas depois, isto é, durante a vida útil do produto.

A hemólise observada nos líquidos que incorporam aminoácidos é menor do que a obtida com o líquido sem aminoácidos ou somente com glicina. Isto indica que a adição destas substâncias não tem um efeito negativo sobre a fragilidade osmótica da célula.

No caso das hemácias reagentes para a determinação do grupo sérico, isto é, a detecção de anticorpos regulares, as suspensões de hemá- cias que incorporam aminoácidos apresentam funcionamento correto.

Em técnicas de grupo sérico com um líquido de base sem ami- noácidos, líquido N° 1, em 240 determinações usando células de 4 grupos séricos (A1, A2, B e O) durante 10 semanas, foram obtidos 187 falsos positivos, ao passo que se forem adicionados aminoácidos, líquido N° 2 e líquido N° 3, o número total de falsos positivos será reduzido para zero. Os falsos positivos do líquido N° 1 são obtidos iniciando a partir de 2 e 4 semanas da preparação da suspensão de hemácias, ao passo que com os líquidos que incorporam aminoácidos, 10 semanas a partir de sua fabricação, ainda não são observados falsos positivos. Os escores médios de 240 determinações usando células de 4 grupos séricos, com 10 frascos pequenos para cada célula, avaliados durante 10 semanas para líquido N° 1, líquido N° 2 e líquido N° 3 são, respectivamente, 4,06, 1,37 e 0,94.

A adição de aminoácidos diferentes de valina, leucina, isoleucina e metionina, os três primeiros pertencentes aos alifáticos não-polares e o último destes o quais contêm enxofre, também tem o efeito de reduzir retenções não-específicas. Por exemplo, com o líquido N° 4, o qual contém ami- noácidos alifáticos não-polares, aminoácidos aromáticos, aminoácidos hidro- fílicos e aminoácidos polares com carga positiva, negativa ou neutra, é igualmente obtida uma redução em retenções não-específicas de hemácias na coluna de gel. Líquido N° 4 Ingredientes Concentração (g/l) KH2PO4 (fosfato monopotássico anídrico) 0,30 Na2HPO4 (fosfato dissódico) 0,28 Cloranfenicol 0,17 Neomicina 0,10 NaCl 1,00 Dextrose (D-glicose anídrica) 3,50 Adenina 0,02 EDTA (dissódio diidratado) 2,80 Inosina 0,02 NaHCO3 0,80 Citrato diidratado de Na3 2,00 Ácido cítrico monoidratado 0,18 Glicina 6,00 L-valina 1,60 L-metionina 1,26 L-leucina 1,30 L-isoleucina 3,24 L-fenilalanina 2,00 L-lisina 1,22 L-histidina 0,50 L-triptofano 0,50 L-arginina 1,60 L-treonina 1,10

Por meio da presente invenção foi possível aumentar significati-vamente a vida útil do armazenamento de suspensões de hemácias para os fins de análise, do período habitual de quatro semanas para um período mínimo de oito semanas, conforme mostrado pelos testes realizados. BIBLIOGRAFIA (1) Federaciòn Espanola de donantes de sangre (Spanish Blood Donor Federation). www.donantesdesangre.net. July 2005. (2) Facts about blood. American Association of Blood Banks (2004). (3) Global Database on Blood Safety : Report 2001-2002. Blood Transfusion Safety, Essential Health Technologies, World Health Or-ganization. Geneva, Switzerland. (4) The gel test: A new way to detect cell antigen-antibody reactions. Y. Lapierre et al. Transfusion 33:639-643 (1990). (5) The preservation of red cell antigens at low ionic strength. J.C.Allan et al. Transfusion 30:423-426 (1990).

Embora a invenção tenha sido descrita com respeito a modalidades típicas preferenciais, estas não devem ser consideradas como limitan- tes da invenção, a qual será definida pela mais ampla interpretação das seguintes

Claims (15)

1. Meio de suspensão para hemácias reagentes do tipo usado em técnicas de análise as quais requerem hemácias, caracterizado por compreender uma combinação de aminoácidos de qualquer grupo, tampão de fosfato, cloreto de sódio, glicose, adenina, conservantes, EDTA, glicina, inosina, citrato, ácido cítrico e bicarbonato, em que as concentrações dos aminoácidos são de tal modo que, como um todo, a osmolaridade total da solução diluente para hemácias está dentro da faixa de 100 a 700 milios- mol/kg.

2. Meio de suspensão para hemácias reagentes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender aminoácidos alifáticos.

3. Meio de suspensão para hemácias reagentes, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender glicina, L-alanina, L- valina, L-leucina e L-isoleucina.

4. Meio de suspensão para hemácias reagentes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender aminoácidos alifáticos, aminoácidos aromáticos e aminoácidos que contêm enxofre.

5. Meio de suspensão para hemácias reagentes, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptofano, L-metionina e L-cisteína.

6. Meio de suspensão para hemácias reagentes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender L-valina, L-metionina, L- leucina, L-isoleucina.

7. Meio de suspensão para hemácias reagentes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos.

8. Meio de suspensão para hemácias reagentes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma combinação de ami- noácidos alifáticos e aminoácidos polares sem carga, carregados positivamente e carregados negativamente.

9. Meio de suspensão para hemácias reagentes, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender uma combinação de ami- noácidos alifáticos e dos aminoácidos: L-serina, L-treonina, L-cisteína, L- metionina, L-asparagina, L-glutamina, L-lisina, L-arginina, L-histidina, L- aspártico e L-glutâmico.

10. Meio de suspensão para hemácias reagentes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma combinação de aminoácidos alifáticos, e de aminoácidos polares, neutros ou carregados (positivos e/ou negativos), e aromáticos.

11. Meio de suspensão para hemácias reagentes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma combinação de aminoácidos não-polares e polares.

12. Meio de suspensão para hemácias reagentes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por ser para uso em técnicas de análise imunohematológica em gel ou microtubos em uma coluna, ou em técnicas imunohematológicas as quais requerem hemá- cias reagentes ou em técnicas de análise as quais requerem hemácias.

13. Uso do meio de suspensão para hemácias conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por ser em técnicas de análise imunohematológica em gel ou microtubos em uma coluna.

14. Uso do meio de suspensão para hemácias conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por ser em técnicas imunohematológicas as quais requerem hemácias reagentes.

15. Uso do meio de suspensão para hemácias conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por ser em técnicas de análise as quais requerem hemácias.