ES2330902T3

ES2330902T3 - Control de referencia de hematologia y su metodo de preparacion.

Info

Publication number: ES2330902T3
Application number: ES97928807T
Authority: ES
Inventors: Young Ran Kim; Jean Emiko Kihara
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1996-06-26
Filing date: 1997-05-29
Publication date: 2009-12-16
Anticipated expiration: 2017-05-29
Also published as: JP2000513441A; ATE441846T1; CA2257359A1; US5858790A; US6187590B1; EP1021701B1; CA2257359C; JP2008026317A; JP4549440B2; JP4686506B2; DE69739565D1; WO1997049982A1; EP1021701A1

Abstract

Una suspensión de control de hematología comprendiendo: una fracción de glóbulos blancos (WBC) comprendiendo esencialmente WBC de mamífero que han sido sometidos a un entorno de lisis suave, en donde los glóbulos rojos (RBC) son lisados en el entorno de lisis suave, y después un proceso de fijación que fija las células antes de que el entorno de lisis haya destruido las características celulares deseadas de los WBC de mamífero, a fin de que las subpoblaciones de WBC puedan ser diferenciadas mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas, y en donde los WBC de mamífero poseen características celulares predeterminadas de dispersión de luz multiángulo similares a las características celulares de dispersión de luz multiángulo de los WBC de interés.

Description

Control de referencia de hematología y su método de preparación.

Antecedentes de la invención

Esta invención tiene que ver con composiciones de control de hematología y sus métodos de preparación y uso en un estándar de referencia. Más particularmente, esta invención se refiere a una suspensión de control de referencia de hematología conteniendo glóbulos blancos ("WBC") estabilizados y los núcleos de linfocitos de mamíferos o eritrocitos aviares o de peces. Aun más particularmente, esta invención tiene que ver con una suspensión de control de referencia de hematología conteniendo WBC que han sido sometidos a un proceso de lisis de sangre total durante su preparación, de manera que en su estado estabilizado conserven propiedades de dispersión de luz multiángulo. Esto permite que las células estabilizadas, cuando se utilizan en un analizador de hematología que diferencia los WBC basado únicamente en señales de dispersión de luz multiángulo, produzcan señales de dispersión de luz multiángulo que imiten a señales de WBC de sangre total. Actualmente, existen varias marcas diferentes de instrumentos de hematología en el mercado. Estos diferentes analizadores utilizan técnicas de detección diversas para cuantificar neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos. Entre las técnicas de detección utilizadas están: impedancia electrónica, dispersión de luz frontal, dispersión de luz polarizada en ángulo de 90º, absorción de luz, radiofrecuencia y combinaciones de las mismas. Los diferentes diseños de bancos ópticos afectan significativamente a las características de las señales ópticas obtenidas de células de control estabilizadas. Puesto que estos instrumentos utilizan métodos de detección diferentes para el análisis diferencial de glóbulos blancos ("Dif/WBC"), ha llegado a ser necesario utilizar diferentes tipos de soluciones de control para Dif/WBC y obtener firmas de células que sean similares a las de los glóbulos blancos cuando se aplican en un tipo de instrumento concreto.

La clase actual de instrumentos tiene que utilizar impedancia, impedancia y dispersión de luz (pero no necesariamente dispersión de luz multiángulo), o dispersión de luz, impedancia y señales de radiofrecuencia para diferenciar y determinar células entre sí. Además, estos instrumentos de hematología disponibles actualmente no son capaces de cuantificar glóbulos rojos nucleados ("NRBC"). Los NRBC interfieren con un análisis Dif/WBC preciso. Los instrumentos de hematología disponibles actualmente solo "señalan" la existencia de NRBC en una muestra. Sin embargo, el sistema analizador de hematología Cell-Dyn® 4000 de Abbott, a punto de ser publicado, será capaz de realizar un análisis de sangre total Dif/WBC y de NRBC simultáneo. El instrumento Cell-Dyn® realizará un análisis de sangre total simultáneo utilizando solamente señales de dispersión de luz multiángulo, incluyendo fluorescencia de vez en cuando para diferenciar entre WBC y NRBC. Por consiguiente, ha llegado a ser necesario desarrollar un nuevo control de hematología para análisis Dif/WBC y de NRBC. Las células de control de este nuevo control de referencia tienen que poseer todas las capacidades de dispersión de luz multiángulo de las células de la muestra de sangre total que se deben imitar.

En la esfera actual de la técnica existen varias patentes que describen métodos y sistemas reactivos para preparar materiales para controles de referencia de hematología para la clase actual de analizadores, esto es, aquellos que no realizan un análisis exclusivo Dif/WBC con dispersión de luz multiángulo. Los solicitantes no están enterados de ninguna técnica que describa un método o sistema reactivo para la preparación o utilización de un control de referencia de hematología para el análisis por dispersión de luz multiángulo de WBC o NRBC.

La Patente U.S. 4.704.364 según Carver y col., y cedida a Coulter Instrument Corp., revela un método para preparar un sistema de tres componentes que simula los tres componentes principales de los leucocitos humanos. Sin embargo, estás células simuladas son detectadas mediante un sistema de detección basado en la impedancia, no un sistema de detección por dispersión de luz multiángulo. Carver y col. emplean glóbulos rojos ("RBC") fijados de tiburón gato para simular granulocitos humanos; RBC fijados de pavos para simular células mononucleares humanas; y RBC humanos fijados para simular linfocitos humanos. El control de hematología producido por las enseñanzas del método de Carver y col. es útil solamente para la medición electrónica de la impedancia de un Dif/WBC de tres partes, puesto que los tres componentes son únicamente distinguibles por el tamaño (impedancia), no por las propiedades
ópticas.

Los tres componentes producidos por el método de Carver y col. no tienen una estructura superficial celular similar o granulosidad plásmica sustancialmente igual que la de WBC humanos. Por lo tanto, no son utilizables como control de referencia en un sistema basado en dispersión de luz multiángulo. Los solicitantes probaron estas células simuladas en el analizador Cell-Dyn® 4000, a punto de estar disponible comercialmente, y encontraron que las características de dispersión de luz de los WBC simulados en el control de Carver y col. produjeron señales de dispersión de luz multiángulo muy diferentes a las de una muestra de sangre normal. Las Figuras 1a-1c son reproducciones de los diagramas de puntos obtenidos en un analizador de hematología Cell-Dyn® 4000 para sangre
normal.

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Abreviaturas utilizadas para etiquetar el eje en las figuras siguientes:

1

Las Figuras 4a-4c muestran los resultados obtenidos en un analizador Cell-Dyn® 4000 para el control de WBC simulados de Carver y col., y encarnado en el control celular Product 4C® Plus de Coulter Corp. Como se puede ver en las Figuras 4a-4c, los aglomerados no son identificables.

WO9618878 realiza análisis diferencial de células sanguíneas (Dif/WBC) basado en dispersión de luz. El método implica la lisis suave de una muestra de sangre, la fijación de los WBC y la tinción de los núcleos. El método no requiere el empleo o preparación de suspensiones de control de hematología.

La Patente U.S. 5.270.208 según Ryan, revela un método diferente para preparar un control de referencia de hematología para análisis Dif/WBC. En el método de Ryan, se suspenden WBC humanos, fijados con aldehído, en un medio acuoso isotónico constando de lipoproteína en cantidad suficiente para proporcionar una mezcla que dé un perfil de firma de WBC que sea sustancialmente similar al obtenido a partir de sangre total. Para respaldar esta reivindicación, Ryan exhibió una distribución de WBC de un diagrama de puntos del analizador STK-S® de Coulter Corp., DF1 (abscisa) frente a Volumen (ordenada). Se cree que la preparación de WBC de Ryan está disponible comercialmente bajo el nombre de control de hematología Tri-Level PARA 12® (Baja, Normal y Alta) de Streck Laboratories. Los solicitantes probaron este material comercial en un analizador Cell-Dyn® 4000, el cual realiza un análisis simultáneo de Dif/WBC y NRBC por dispersión de luz multiángulo (pérdida de luz axial, dispersión de luz multidimensional y fluorescencia).

Los resultados (ver Figuras 5a-5c) revelan que el componente WBC de la preparación de Ryan genera una firma de dispersión de luz significativamente diferente a la obtenida a partir de sangre total. Como se puede ver en las Figuras 5a-5c, los componentes neutrófilos del producto generaron señales de pérdida de luz axial y de dispersión lateral polarizada mucho menores que las de sangre total; las señales de dispersión lateral polarizada de neutrófilos son demasiado grandes para ser separadas de las de eosinófilos; el aglomerado de monocitos no se separa en absoluto del aglomerado de neutrófilos; el componente linfocito genera señales de dispersión en ángulo intermedio (7º) mucho mayores que las de sangre total, y de este modo, suprimiendo la región reservada para basófilos mediante solapamiento.

La Patente U.S. 5.320.964 según Young y col. revela métodos y composiciones de reactivos para preparar análogos de leucocitos. Los análogos de linfocitos de Young y col. se preparan a partir de RBC de ganso fijados en una solución hipotónica tamponada con fosfato (15-25 mOsm/kg); los análogos de monocitos se preparan a partir de RBC de caimán fijados en una solución hipotónica tamponada (15-25 mOsm/kg); los análogos de eosinófilos también se preparan a partir de RBC de caimán fijados en una solución hipotónica (75-85 mOsm/kg); y los análogos de neutrófilos se preparan a partir de RBC de caimán en una solución hipotónica tamponada (45-65 mOsm/kg). Tanto los RBC de ganso como los RBC de caimán son elípticos, nucleados y tienen una superficie celular lisa. Young y col. reivindican que las células fijadas, preparadas conforme a sus procedimientos, simulan al menos dos leucocitos humanos diferentes, cada uno teniendo al menos dos propiedades físicas de un leucocito humano. Estas propiedades se seleccionan de: a) volumen medido por corriente continua; b) magnitud de la alta frecuencia (RF); c) opacidad; y d) dispersión de luz. Aunque no especificaron el tipo de dispersión de luz, los componentes WBC simulados de Young y col, preparados a partir de RBC de ganso y caimán, no tienen las mismas características con respecto a la estructura superficial celular y granulosidad citoplásmica como las de WBC de mamífero. Por consiguiente, estas células no generan las señales de dispersión de luz multiángulo para dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y señales de pérdida de luz axial que sean sustancialmente equivalentes, o similares a las de WBC de sangre total humana. Así, no se puede utilizar el producto de Young y col., como control de referencia de hematología, en instrumentos de hematología sofisticados que utilizan señales de dispersión de luz multidimensional, de pérdida de luz axial y de fluorescencia, tal como el analizador Cell-Dyn® 4000, para Dif/WBC y cuantificación de NRBC. De hecho, si las células de Young y col. son fijadas en una solución hipotónica tamponada, sucederá uno de los dos resultados. Primero, si la osmolaridad de la solución es muy baja (5-25 mOsm/kg), se lisará el citoplasma de las células. Si, por otra parte, la osmolaridad es aproximadamente de 85 mOsm/kg, se expandirá el volumen celular.

Las Figuras 18a-18d muestran los resultados de un análisis multiparámetro, basado en dispersión de luz, de una solución de células de control conteniendo RBC de caimán fijados como células de control. Como se puede ver, las células de caimán fijadas no generan señales PSS detectables; las señales IAS caen entre las regiones de linfocitos y basófilos; y las señales ALL son demasiado bajas para ser contadas como neutrófilos o eosinófilos.

Las Figuras 6a-6c muestran los resultados de otro control disponible comercialmente, los controles de hematología CBC-3k^{TM} de R&D Systems, Inc. No se sabe si el producto CBC-3k^{TM} ha sido patentado. Como se muestra, no se pueden identificar los aglomerados.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona en primer lugar una suspensión de control de hematología constando de:

una fracción de glóbulos blancos (WBC) comprendiendo esencialmente WBC de mamífero que han sido sometidos a un entorno de lisis suave,

en donde los glóbulos rojos (RBC) son lisados en el entorno de lisis suave, y después un proceso de fijación que fija las células antes de que el entorno de lisis haya destruido las características celulares deseadas de los WBC de mamífero, a fin de que las subpoblaciones de WBC puedan ser diferenciadas mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas, y en donde los WBC de mamífero poseen características celulares predeterminadas de dispersión de luz multiángulo similares a las características celulares de dispersión de luz multiángulo de WBC de interés.

En una forma de realización, la suspensión de control de hematología comprende además una fracción de glóbulos rojos nucleados (NRBC), en donde las células de la fracción de NRBC son seleccionadas del grupo que se compone de eritrocitos aviares, eritrocitos de peces y linfocitos de mamífero, y que han sido sometidos a un entorno de lisis suave que lisa el citoplasma, y después un proceso de fijación que fija los núcleos antes de que el entorno de lisis haya destruido sus características celulares deseadas, para que los NRBC de interés puedan ser diferenciados mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas, y en donde los núcleos posean características celulares predeterminadas de dispersión de luz multiángulo similares a las características celulares de dispersión de luz multiángulo de los NRBC de interés.

La presente invención también proporciona una suspensión de control de hematología para sangre total constando de:

una fracción de glóbulos rojos ("RBC") estabilizados;

una fracción de plaquetas estabilizadas ("PLT");

una fracción de glóbulos blancos ("WBC") estabilizados; y

un medio de resuspensión y almacenamiento;

en donde la fracción WBC consta esencialmente de WBC de mamífero que han sido sometidos a un entorno de lisis suave, en donde los glóbulos rojos (RBC) son lisados en el entorno de lisis suave, y después un proceso de fijación que fije las células antes de que el entorno de lisis haya destruido las características celulares deseadas de los WBC de mamífero, para que las subpoblaciones de WBC puedan ser diferenciadas mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas, y en donde los WBC de mamífero posean características celulares predeterminadas de dispersión de luz multiángulo similares a las características celulares de dispersión de luz multiángulo de los WBC de interés. En una forma de realización preferida, la suspensión de control de hematología para sangre total comprende además una fracción de glóbulos rojos nucleados ("NRBC") en donde las células de la fracción NRBC son seleccionadas del grupo que se compone de eritrocitos aviares, eritrocitos de peces y linfocitos de mamífero, y que hayan sido sometidas a un entorno de lisis suave que lise el citoplasma, y después un proceso de fijación que fija los núcleos antes de que el entorno de lisis haya destruido sus características celulares deseadas, para que los NRBC de interés puedan ser diferenciados mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas, y en donde los núcleos posean características celulares predeterminadas de dispersión de luz multiángulo similares a las características celulares de dispersión de luz multiángulo de los NRBC de interés.

Además, la presente invención proporciona un método para producir una fracción de glóbulos blancos (WBC) de una suspensión de control de hematología, el método comprendiendo:

a) proporcionar sangre total de mamífero o una capa leucocitaria;

b) combinar la sangre total con un reactivo de lisis durante 1 a 5 minutos, en una proporción de aproximadamente 1 parte de sangre, o de capa leucocitaria, a 12 partes de reactivo de lisis, para proporcionar un entorno de lisis suave para eliminar cualquier glóbulo rojo presente, en donde el reactivo de lisis está presente en una cantidad de 1 parte de lisador a 12 partes de diluyente;

c) combinar la suspensión celular de lisador y diluyente de la etapa b con un fijador, e incubar de 60ºC a 70ºC hasta 10 minutos para fijar y estabilizar las células antes de que el entorno de lisis haya destruido las características celulares deseadas de los WBC, para que las subpoblaciones de WBC puedan ser diferenciadas con la suspensión de control mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas;

d) enfriar la mezcla de la etapa c hasta temperatura ambiente, y dejar que sedimente;

e) descartar el sobrenadante formado en la etapa d y lavar las células fijadas resultantes, lo suficiente para eliminar los reactivos activos de las etapas b y c;

f) resuspender las células fijadas y lavadas en un medio de resuspensión apropiado para el almacenamiento de larga duración de las células fijadas, en donde las células fijadas exhiben características celulares de dispersión de luz multiángulo similares a las características celulares de dispersión de luz multiángulo de WBC de interés.

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La presente invención proporciona además un método para producir una fracción de glóbulos rojos nucleados de una suspensión de control de hematología, comprendiendo:

a) proporcionar sangre total o una capa de glóbulos rojos seleccionada de los grupos que se componen de eritrocitos aviares y de peces;

b) combinar los eritrocitos y un reactivo de lisis durante 1 a 5 minutos, en una relación de aproximadamente 1 parte de eritrocitos a 12 partes de reactivo de lisis, para formar una suspensión celular;

c) combinar la suspensión celular de la etapa b con un fijador, e incubar de 60ºC a 70ºC hasta 10 minutos para fijar y estabilizar los núcleos, en donde la relación de fijador a suspensión celular es 1:8 a 1:11;

d) enfriar la mezcla de la etapa c hasta temperatura ambiente, y dejar que sedimente la suspensión;

e) descartar el sobrenadante formado en la etapa d y lavar los núcleos fijados resultantes, lo suficiente para eliminar los reactivos activos de las etapas b y c;

f) resuspender los núcleos fijados y lavados en un medio de resuspensión apropiado para el almacenamiento de larga duración de los núcleos fijados, en donde los núcleos fijados exhiben características de dispersión de luz multiángulo similares a las características de dispersión de luz multiángulo de glóbulos rojos nucleados de interés, para que los glóbulos rojos nucleados de interés puedan ser detectados con la suspensión de control mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas.

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Proporcionado también por la presente invención es un método para producir una fracción de glóbulos rojos nucleados de una suspensión de control de hematología; comprendiendo:

a) proporcionar linfocitos de mamífero;

b) mezclar los linfocitos y un reactivo de lisis durante 5 minutos hasta 3 horas, en una relación 1:5 de linfocitos a reactivo de lisis hasta 1:30 de linfocitos a reactivo de lisis, para exponer los núcleos de los linfocitos y formar una suspensión de núcleos;

c) combinar la suspensión de núcleos de la etapa b con un fijador, e incubar de 55ºC a 60ºC hasta 10 minutos para fijar y estabilizar los núcleos, en donde la relación de fijador a suspensión de núcleos es 1:1 a 1:10;

f) resuspender los núcleos fijados y lavados en un medio de resuspensión apropiado para el almacenamiento de larga duración de las células fijadas, en donde los núcleos fijados exhiben características de dispersión de luz multiángulo similares a las características de dispersión de luz multiángulo de glóbulos rojos nucleados de interés, para que los glóbulos rojos nucleados de interés puedan ser detectados con la suspensión de control mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas.

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Un objeto de la presente invención es proporcionar un control de referencia de hematología en un instrumento de hematología automatizado tal como el instrumento Cell-Dyn® 3000 de Abbott Laboratories, el cual utiliza análisis Dif/WBC por dispersión de luz multidimensional.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un control de referencia de hematología en un sistema de hematología automatizado, tal como el instrumento Cell-Dyn® 4000 de Abbott Laboratories, el cual utiliza dispersión de luz multidimensional, pérdida de luz axial y fluorescencia para el análisis simultáneo de Dif/WBC y NRBC.

Todavía otro objetivo es proporcionar un control de referencia de hematología estable que contenga los componentes estabilizados RBC, Plaquetas, Neutrófilos, Linfocitos, Eosinófilos, Basófilos y NRBC, los cuales se pueden utilizar en un instrumento de hematología automatizado, tal como el instrumento Cell-Dyn® 4000, el cual utiliza dispersión de luz multidimensional, pérdida de luz axial y fluorescencia para el análisis simultáneo de Dif/WBC y NRBC.

Como se definió antes, la presente invención tiene que ver con un método para la preparación de un componente estable de WBC y NRBC, y la solución de control de referencia de hematología conteniendo uno o más de estos componentes. El método produce WBC fuertemente fijados y estabilizado y NRBC simulados que generan señales electro-ópticas similares a las de células sanguíneas completas humanas, permitiendo un completo análisis Dif/WBC/NRBC utilizando los mismos algoritmos utilizados en un analizador para muestras de sangre humanas recientes. Los WBC fijados y los NRBC simulados producidos por el método de la presente invención están libres de agregados y estables en un medio apropiado semejante al plasma, durante un largo periodo de tiempo bajo refrigeración, y se pueden utilizar como Controles de Hematología para Dif/WBC/NRBC en un instrumento de hematología clínico rutinario, incluyendo aquellos que utilicen dispersión de luz multiparámetro. Estas ventajas representan una mejora sustancial sobre la técnica anterior.

Breve descripción de los dibujos

Para una comprensión más completa de la presente invención, y de las ventajas de la misma, ahora se hace referencia a las siguientes descripciones tomadas conjuntamente con las figuras que se adjuntan, en las que:

Las Figuras 1a-1c son citogramas de WBC de una aplicación de sangre normal en un analizador basado en dispersión de luz multiángulo.

Las Figuras 2a-2c son citogramas de WBC/NRBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de una muestra clínica conteniendo 1'78 k/\mul de NRBC.

Las Figuras 3a-3c son citogramas de WBC/NRBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de una muestra clínica conteniendo 40'4 k/\mul de NRBC.

Las Figuras 4a-4c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, del Control Celular 4C® Plus de Coulter.

Las Figuras 5a-5c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de Controles de Hematología Multiparámetros PARA 12® de Streck Laboratories, Nivel normal.

Las Figuras 6a-6c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de Controles de Hematología CBC-3k^{TM} de R&D Systems.

Las Figuras 7a-7c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, del control de referencia de hematología de la presente invención.

Las Figuras 8a-8c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de núcleos de eritrocitos de trucha fijados producidos mediante los métodos de la presente invención.

Las Figuras 9a-9c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de sangre total normal reforzada con los núcleos de eritrocitos de trucha fijados de las Figuras 8a-8c.

Las Figuras 10a-10c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de núcleos de eritrocitos de pollo fijados producidos mediante los métodos de la presente invención.

Las Figuras 11a-11c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de sangre total reforzada con los núcleos de eritrocito de pollo fijados de las Figuras 10a-10c.

Las Figuras 12a-12c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de núcleos de eritrocitos de pavo fijados producidos mediante los métodos de la presente invención.

Las Figuras 13a-13c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de sangre total reforzada con los núcleos de eritrocitos de pavo fijados de las Figuras 12a-12c.

Las Figuras 14a-14c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de núcleos de linfocitos porcinos fijados producidos mediante los métodos de la presente invención.

Las Figuras 15a-15c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de WBC bovinos mediante el método de la presente invención.

Las Figuras 16a-16c son citogramas de WBC, del analizador basado en dispersión de luz multiángulo, de WBC bovinos fijados reforzados con linfocitos porcinos fijados, todos producidos según los métodos de la presente invención.

Las Figuras 17a-17d son citogramas de WBC de WBC bovinos fijados producidos mediante los métodos de la presente invención, y aplicados en un analizador que utiliza impedancia y dispersión de luz.

Las Figuras 18a-18d son citogramas de WBC de una solución celular de control conteniendo RBC de caimán fijados como células de control, y aplicados en un analizador basado en dispersión de luz multiparámetro.

Descripción detallada de la invención

Cualquier sistema automatizado para la detección y diferenciación de células requiere la utilización de controles de referencia para garantizar que el sistema está operando adecuadamente. Esto es verdad, no importa qué sistema de detección se emplee.

Con la llegada de un nuevo esquema de detección, principalmente el de utilizar solamente señales de dispersión de luz multiángulo/parámetro para diferenciar y distinguir subpoblaciones de WBC y NRBC en una muestra (para la exclusión de todas las otras señales sin luz), han llegado a ser necesarios nuevos controles. Actualmente, los controles de referencia modernos no funcionarán adecuadamente en tales sistemas multiparámetro.

Los presentes inventores han descubierto porqué los controles actuales no funcionan en analizadores de hematología basados en dispersión de luz multiángulo, e idearon métodos para producir controles que funcionen. No solamente con la presente invención funcionan los controles en sistemas basados en dispersión de luz multiparámetro, sino que también deberían funcionar en sistemas basados en otras detecciones. Esto es porque las células de los nuevos controles son las mismas células que se encuentran en una muestra de sangre, únicamente procesadas. Por lo tanto, mantienen las características de dispersión de luz de las células.

Los componentes celulares de las suspensiones de control de referencia de esta invención imitan sustancialmente las características de dispersión de luz multiparámetro de los WBC o NRBC en una muestra de sangre total cuando se aplican en un sistema de detección basado en dispersión de luz multiparámetro.

Por lo que concierne a esta invención, la dispersión de luz multiparámetro, multiángulo o multidimensional abarca el uso exclusivo (esto es, excluye las no) señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas, para determinar o diferenciar las células de interés. Para esta determinación, no se utilizan otras señales basadas sin luz. También se pueden utilizar otros tipos de señales luminosas, tales como fluorescencia, pero no se utilizan la impedancia y otras señales basadas sin luz. Sin embargo, los instrumentos que utilicen señales basadas sin luz o, por ejemplo, combinaciones de dispersión de luz e impedancia, pueden sacar provecho de los controles de esta invención, pero son los instrumentos basados en dispersión de luz multiángulo los que se beneficiarán el máximo ya que actualmente no están disponibles tales controles.

Los componentes WBC de la suspensión de control de esta invención son WBC de sangre que han sido sometidos a un entorno de lisis muy suave (similar al entorno al que habrían sido sometidos en el analizador que hubiese sido analizada esa muestra de sangre) y fijados después. Lo mismo también es verdad para los componentes NRBC, los núcleos son expuestos a un entorno de lisis y fijados para conservar sus características celulares. Sin embargo, con el componente NRBC, las células sanguíneas nucleadas de mamífero no son las únicas células que se pueden utilizar como fuente de núcleos liberados. Para esta fracción también se pueden utilizar eritrocitos aviares o de peces.

La habilidad de las células de control para imitar las características de dispersión de luz de las células de interés es debida al hecho de que las células son elegidas en primer lugar por su composición celular (esto es, sus características de dispersión de luz). Durante el proceso de fabricación, estos componentes celulares de las células de control son conservados sometiéndolos en primer lugar a un entorno de lisis suave para lisar los RBC; después, los restantes núcleos de WBC y NRBC son fijados antes de que el entorno de lisis haya destruido las características celulares deseadas. Este proceso de fabricación imita el entorno "real" donde las células sanguíneas son sometidas en los conductos interiores del analizador. Las células de control, debido a que están "fijadas", no son afectadas significativamente por el entorno de lisis cuando pasen a través del analizador, a fin de que mantengan sus características deseadas. Además, las células fijadas son estables en la solución de control, donde no están las células sanguíneas completas. Sin embargo, se cree que las células de control necesitan ser sometidas al mismo o similar entorno de lisis que las células sanguíneas en una muestra vista mientras en un analizador, para producir sustancialmente el mismo índice de refracción, el cual determina principalmente las características de dispersión de luz de una célula. De esta forma, las células de control parecerán al instrumento ser las células de interés "lisadas por el instrumento", y serán registradas tal cual.

También se ha determinado que los mismos componentes de la presente invención, si se "fijan" antes de someterlos a un entorno de lisis, no se ejecutan satisfactoriamente en un sistema basado en dispersión de luz multiángulo. Las células necesitan ser sometidas a un entorno de lisis antes de que sean "fijadas". Después, cuando sean procesadas como células de control en el analizador, estas células procesadas "parecerán" al analizador ser las células sanguíneas de interés. Esto es debido a que los analizadores basados en dispersión de luz multiparámetro están únicamente programados para reconocer células sanguíneas completas en el entorno de procesamiento interno del analizador. Así, a menos que las células de control de referencia o componentes celulares mantengan las características celulares apropiadas y, por lo tanto, reaccionen o se comporten (dispersen luz y/o fluorescencia) de una manera que sea sustancialmente similar a la sangre total, "parecerán" ser células diferentes al analizador o serán completamente irreconocibles.

Por lo tanto, los métodos principales de esta invención someten las células o componentes celulares a un entorno de lisis durante el proceso de fabricación del control de referencia, y antes de su "fijación", que encontrarán en el analizador cuando sean aplicadas como controles de referencia.

En los ejemplos que siguen, se utilizaron las formulaciones de reactivos siguientes:

Reactivo de Lisis

desde aproximadamente 0'75 M hasta aproximadamente 1'10 M de cloruro amónico (NH_{4}Cl);

desde aproximadamente 0'1 M hasta aproximadamente 0'4 M de formaldehido (HCHO);

desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 25 mM de acetato sódico (CH_{3}COONa);

desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 25 mM de bicarbonato potásico (KHCO_{3});

desde aproximadamente 50 mg/l hasta aproximadamente 250 mg/l de Saponina;

desde aproximadamente 0'2 g/l hasta aproximadamente 0'4 g/l de Proclin 300.

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WBC-Cyto-Lyse

desde aproximadamente 2'5 g/l hasta aproximadamente 5'0 g/l de ácido maleico, ácido succínico o ácido ftálico.

desde aproximadamente 10'0 g/l hasta aproximadamente 30'0 g/l de Brij 35, Tween 20 o Tritón X-100.

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Fijador

desde aproximadamente 3'0 g/l hasta aproximadamente 5'0 g/l de fosfato monosódico;

desde aproximadamente 6'0 g/l hasta aproximadamente 7'0 g/l de fosfato disódico;

desde aproximadamente 100 ml/l hasta aproximadamente 200 ml/l de formalina (solución de formaldehido al 37-40%).

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Las Figuras 2a-2c y Figuras 3a-3c son citogramas, del sistema basado en dispersión de luz multiparámetro Cell-Dyn® 4000 de Abbott Laboratories, de distribuciones de WBC/NRBC de muestras de sangre clínicas que contienen 1'78 k/ml de NRBC y 40'4 k/ml de NRBC, respectivamente. Estas Figuras se presentan con el fin de comparación con los controles o células producidas mediante los diversos procesos descritos y representados en las Figuras aquí.

Puesto que los WBC y núcleos fijados de células aviares, de peces y de mamífero utilizadas en esta invención son inertes, pueden ser resuspendidos en cualquier salino tamponado, el cual puede contener alguna proteína para evitar la aglomeración. Sin embargo, estas células fijadas necesitan ser combinadas con RBC no fijados, pero estabilizados, para producir un control de hematología de rango completo, el medio de resuspensión celular debería ser capaz de proteger los RBC estabilizados de la lisis. La formulación de abajo es un ejemplo de un medio de resuspensión que ha sido descubierto por funcionar bien con las células de control de esta invención. Esta formulación es un medio de resuspensión celular semejante al plasma, que evita la aglomeración de los WBC y núcleos fijados, protegiendo mientras los componentes RBC en la solución de control de la lisis.

Medio de Resuspensión Celular semejante al Plasma (MRSC)

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El uso del control de hematología producido mediante el método de la presente invención, en el instrumento de hematología Cell-Dyn® 4000, el cual analiza Dif/WBC/NRBC por dispersión de luz multidimensional, pérdida de luz axial y fluorescencia, permite monitorizar día a día las ejecuciones del sistema, así como los reactivos. Los parámetros que la calidad de los resultados pueden ser monitorizados con el producto en el sistema Cell-Dyn® 4000, son como sigue:

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Ejemplo 1

El reactivo de lisis y el fijador descritos antes son utilizados en este ejemplo. Se prepararon WBC humanos fijados, estables y sin agregados, conforme al protocolo siguiente, y en las Figuras 7a-7c se presentan ejemplos de citogramas de WBC del instrumento Cell-Dyn® 4000, de los WBC humanos fijados de este ejemplo.

1. Se mezcló una (1) parte de capa leucocitaria humana con 5 partes de reactivo de lisis (precalentado a 42ºC). Los componentes fueron mezclados inmediatamente con suave remolino, y se dejó estar a temperatura ambiente, durante 50 segundos, para lisar completamente los RBC.

2. Una parte de la suspensión de RBC lisados de la etapa 1 fue mezclada con diez (10) partes de fijador, e inmediatamente puesta en un baño de agua a 60º-70ºC, y se fijaron durante 10 minutos con mezclado suave.

3. Se enfrió la suspensión celular fijada hasta temperatura ambiente, se centrifugó a 2.500 rpm a 10ºC durante 5 minutos para eliminar el fijador, se lavó 3 veces, utilizando la misma velocidad de centrífuga, con salino isotónico tamponado con fosfato a pH neutro (PBS), y después se resuspendió en MRSC.

4. Se aplicó una alícuota de producto acabado en un instrumento Cell-Dyn® 4000, para los recuentos y distribución de WBC.

5. La concentración celular fijada fue ajustada a una concentración final, en el medio de resuspensión, de aproximadamente 7.500/\mul, para un control de nivel normal.

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Ejemplo 2

Se utilizaron los mismos reactivos de lisis y de fijación empelados en el Ejemplo 1, pero la lisis de los RBC y la fijación de los WBC se realizaron según el protocolo siguiente:

1. Se mezcló inmediatamente, con suave remolino, una (1) parte de capa leucocitaria humana con 5 partes de solución de reactivo de lisis, y se dejó estar a temperatura ambiente, durante 10 minutos, para lisar completamente los RBC.

2. Una (1) parte de la suspensión de WBC lisados de la etapa 1 fue mezclada con diez (10) partes de fijador, se mezcló y se dejó fijar a temperatura ambiente durante 2-3 horas.

3. Se centrifugo la suspensión celular fijada a 2.500 rpm, a 10ºC durante 5 minutos para eliminar el fijador, se lavó 3 veces utilizando la misma velocidad de centrífuga, con salino tamponado con fosfato a pH neutro, y después se resuspendió en MRSC.

5. La concentración celular fijada fue ajustada a una concentración final de aproximadamente 2.000/\mul, para un control de nivel bajo.

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Ejemplo 3

Se preparó una fracción de NRBC a partir de eritrocitos de pavo, según el protocolo siguiente, y en las Figuras 12a-12e y 13a-13c, respectivamente, se presentaron ejemplos de citogramas de NRBC del instrumento Cell-Dyn® 4000, de núcleos de eritrocitos de pavo fijados y de sangre total humana normal reforzada con los núcleos de eritrocitos de pavo fijados.

A. Materiales

1. Sangre total de pavo.

2. Reactivo de lisis: el mismo del Ejemplo 1.

3. Fijador: a/dextrosa: fosfato monosódico, 4 g/l; fosfato disódico, 6'5 g/l; formalina, 150 ml/l; dextrosa, 100 g/l; pH aproximadamente 6'98.

4. Solución de lavado celular: solución tamponada con fosfato (PBS).

5. MRSC: el mismo MRSC listado antes.

B. Protocolo para la fijación de núcleos de eritrocitos de pavo

1. Calentar una alícuota de 10 ml del reactivo de lisis a 37ºC.

2. Centrifugar la sangre total de pavo a 3.000 rpm, durante 10 minutos, para separar la capa de plasma y eliminar la capa leucocitaria. Añadir el plasma anterior a la capa de RBC compacta y mezclar.

3. Añadir 1'0 ml de la capa de RBC a la solución de reactivo de lisis precalentada, tapar y mezclar 3 veces por inversión. Mezclar con remolino a velocidad total, durante unos 10 segundos, para ayudar a la lisis del citoplasma de los RBC. Dejar estar a temperatura ambiente durante unos 10 minutos, o hasta que se complete la lisis del citoplasma. Examinar bajo el microscopio la integridad de la lisis del citoplasma.

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4. Centrifugar a 2.000 rpm durante 15 minutos, y sacar con sifón todo el sobrenadante, dejando justo lo suficiente para resuspender el botón celular. Resuspender las células mediante agitación suave hasta que no se observen agregados celulares.

5. Lavar las células 3 veces con PBS, utilizando las mismas condiciones de centrifugación que en la etapa 4.

6. Añadir 10 ml de fijador, mezclar y ponerlo inmediatamente en un baño de agua a 60ºC, y fijar durante al menos 5 minutos con agitación constante para evitar la agregación celular.

7. Dejar la suspensión celular a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante toda la noche.

8. Mezclar y repetir dos veces las etapas 4 y 5.

9. Resuspender los núcleos fijados en MRSC.

10. Aplicar en un instrumento Cell-Dyn® 4000 para determinar la concentración de núcleos FL3+ y la posición de la aglomeración.

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Ejemplo 4

Se preparó una fracción de NRBC a partir de eritrocitos de trucha, utilizando los mismos reactivos y protocolo descritos en el Ejemplo 3. En las Figuras 8a-8c y 9a-9c se presentan ejemplos de citogramas de NRBC del instrumento Cell-Dyn® 4000, de los núcleos de eritrocitos de trucha fijados y de sangre total normal reforzada con los núcleos de eritrocitos de trucha fijados.

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Ejemplo 5

Se preparó una fracción de NRBC a partir de linfocitos porcinos conforme a los materiales y métodos siguientes, y en las Figuras 14a-14c se presenta un ejemplo de citogramas de NRBC del instrumento Cell-Dyn® 4000, de los núcleos de linfocitos porcinos fijados.

A. Materiales

Capa leucocitaria porcina (eliminadas ya las plaquetas).

Cyto-Lyse:

: Brij 35: 15'0 g/l

: Ácido ftálico: 5'5 g/l

Reactivo de lisis: el mismo que en el Ejemplo 1.

Fijador: el mismo que en el Ejemplo 1.

Salino tamponado con fosfato (PBS)

B. Procedimiento

1. Diluir una (1) parte de la capa de linfocitos porcinos enriquecida con 5 partes de reactivo de lisis, y dejar estar a temperatura ambiente durante 5 minutos para completar la lisis de los RBC que quedan en la suspensión celular.

2. Centrifugar la suspensión celular 3 minutos a 3.000 rpm, y vaciar el sobrenadante y desprender el botón celular.

3. Mezclar las células con Cyto-Lyse en una relación 1:10, y dejar a temperatura ambiente durante 2 horas.

4. Resuspender los núcleos en Cyto-Lyse y centrifugar durante 3 minutos a 3.000 rpm, y vaciar el sobrenadante.

5. Resuspender los núcleos en un mínimo de 2 volúmenes de fijador y mezclar.

6. Fijar a 60ºC durante 10 minutos (o durante 4 horas a temperatura ambiente), y dejar enfriar a temperatura ambiente.

7. Centrifugar los núcleos durante 3 minutos a 3.000 rpm, y vaciar el sobrenadante.

8. Resuspender el gránulo de células en PBS, para lavar los núcleos 3 veces.

9. Resuspender los núcleos en MRSC.

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Ejemplo 6

Se fijan WBC bovinos conforme al protocolo descrito en el Ejemplo 1, y se mezclan con núcleos porcinos fijados preparados conforme al procedimiento descrito en el Ejemplo 4. En las Figuras 15a-15c y Figuras 16a-16f se presentan ejemplos de citogramas del canal de WBC, del instrumento Cell-Dyn® 4000, de los WBC bovinos fijados solos y de los WBC bovinos fijados mezclados con núcleos de linfocitos porcinos.

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Ejemplo 7

Se preparó una fracción de NRBC a partir de eritrocitos de pollo conforme al protocolo descrito en el Ejemplo 3, y en las Figuras 10a-10c y Figuras 11a-11c se presentan ejemplos de citogramas de NRBC, del instrumento Cell-Dyn® 4000, de los núcleos de eritrocitos de pollo fijados y de sangre total normal reforzada con los núcleos de eritrocitos de pollo fijados.

El control de hematología producido mediante el método de la presente invención puede ser utilizado también para monitorizar los parámetros siguientes en instrumentos Cell-Dyn® 3000 ó 3500, los cuales utilizan ambas señales de dispersión de luz e impedancia, para monitorizar los siguientes parámetros Dif/WBC:

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Las Figuras 17a-17d son citogramas de WBC de WBC bovinos fijados producidos mediante los métodos de la presente invención, y aplicados en un analizador Cell-Dyn® 3500 que conduce el análisis Dif/WBC utilizando parámetros de dispersión de luz (pero no pérdida axial de luz o fluorescencia) y determinados RBC y plaquetas por medio de la impedancia. Para esta figura, la fracción de WBC fue combinada con plaquetas fijadas y estabilizada, pero RBC no fijados para producir una suspensión de control de rango completo.

Claims

1. Una suspensión de control de hematología comprendiendo:

en donde los glóbulos rojos (RBC) son lisados en el entorno de lisis suave, y después un proceso de fijación que fija las células antes de que el entorno de lisis haya destruido las características celulares deseadas de los WBC de mamífero, a fin de que las subpoblaciones de WBC puedan ser diferenciadas mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas, y en donde los WBC de mamífero poseen características celulares predeterminadas de dispersión de luz multiángulo similares a las características celulares de dispersión de luz multiángulo de los WBC de interés.

2. La suspensión de control de hematología de la reivindicación 1, comprendiendo además una fracción de glóbulos rojos nucleados (NRBC), en donde las células de la fracción de NRBC son seleccionadas del grupo que se compone de eritrocitos aviares, eritrocitos de peces y linfocitos de mamífero, y que han sido sometidas a un entorno de lisis suave que lisa el citoplasma, y después un proceso de fijación que fija los núcleos antes de que el entorno de lisis haya destruido sus características celulares deseadas, para que los NRBC de interés puedan ser diferenciados mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas, y en donde los núcleos posean características celulares predeterminadas de dispersión de luz multiángulo similares a las características celulares de dispersión de luz multiángulo de los NRBC de interés.

3. Una suspensión de control de hematología para sangre total constando de:

una fracción de glóbulos rojos (RBC) estabilizados;

una fracción de plaquetas estabilizadas (PLT);

una fracción de glóbulos blancos (WBC) estabilizados; y

un medio de resuspensión y almacenamiento;

en donde la fracción de WBC consta esencialmente de WBC de mamífero que han sido sometidos a un entorno de lisis suave, en donde los glóbulos rojos (RBC) son lisados en el entorno de lisis suave, y después un proceso de fijación que fije las células antes de que el entorno de lisis haya destruido las características celulares deseadas de los WBC de mamífero, para que las subpoblaciones de WBC puedan ser diferenciadas mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas, y en donde los WBC de mamífero posean características celulares predeterminadas de dispersión de luz multiángulo similares a las características celulares de dispersión de luz multiángulo de los WBC de interés.

4. La suspensión de control de hematología de la reivindicación 3, comprendiendo además una fracción de glóbulos rojos nucleados (NRBC), en donde las células de la fracción de NRBC son seleccionadas del grupo que se compone de eritrocitos aviares, eritrocitos de peces y linfocitos de mamífero, y que han sido sometidas a un entorno de lisis suave que lisa el citoplasma, y después un proceso de fijación que fija los núcleos antes de que el entorno de lisis haya destruido sus características celulares deseadas, para que los NRBC de interés puedan ser diferenciados mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas, y en donde los núcleos posean características celulares predeterminadas de dispersión de luz multiángulo similares a las características celulares de dispersión de luz multiángulo de los NRBC de interés.

5. Un método para producir una fracción de glóbulos blancos (WBC) de una suspensión de control de hematología, el método comprendiendo:

a) proporcionar sangre total de mamífero o una capa leucocitaria;

b) combinar la sangre total con un reactivo de lisis durante 1 a 5 minutos, en una proporción de aproximadamente 1 parte de sangre o de capa leucocitaria a 12 partes de reactivo de lisis, para proporcionar un entorno de lisis suave para eliminar cualquier glóbulo rojo presente, en donde el reactivo de lisis está presente en una cantidad de 1 parte de lisador a 12 partes de diluyente;

c) combinar la suspensión celular de lisador y diluyente de la etapa b con un fijador, e incubar de 60ºC a 70ºC hasta 10 minutos para fijar y estabilizar las células antes de que el entorno de lisis haya destruido las características celulares deseadas de los WBC, para que las subpoblaciones de WBC puedan ser diferenciadas con la suspensión de control mediante el exclusivo uso de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas;

f) resuspender las células fijadas y lavadas en un medio de resuspensión apropiado para el almacenamiento de larga duración de las células fijadas, en donde las células fijadas exhiben características celulares de dispersión de luz multiángulo similares a las características celulares de dispersión de luz multiángulo de los WBC de interés.

6. Un método para producir una fracción de glóbulos rojos nucleados de una suspensión de control de hematología, comprendiendo:

a) proporcionar sangre total o una capa de glóbulos rojos seleccionados de los grupos que se componen de eritrocitos aviares y de peces;

f) resuspender los núcleos fijados y lavados en un medio de resuspensión apropiado para el almacenamiento de larga duración de los núcleos fijados, en donde los núcleos fijados exhiben características celulares de dispersión de luz multiángulo similares a las características de dispersión de luz multiángulo de glóbulos rojos nucleados de interés, para que los glóbulos rojos nucleados de interés puedan ser detectados con la suspensión de control mediante el uso exclusivo de señales de dispersión de luz a 90º polarizada y despolarizada y de pérdida de luz axial y combinaciones de las mismas.

7. Un método para producir una fracción de glóbulos rojos nucleados de una suspensión de control de hematología; comprendiendo:

a) proporcionar linfocitos de mamífero;