CN101561443B - 五分类白细胞模拟物粒子、其制备方法以及含该模拟粒子的质控物和校准物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由红细胞制备五分类白细胞模拟物粒子的方法，包括选用适当的红细胞，用多功能试剂体系处理红细胞，达到维持红细胞胞膜的完整性并实现体积、形态和内含物的同步调整，然后对红细胞进行强化固定，经洗涤后保存。本发明还涉及用上述方法制备的白细胞模拟粒子和制备该白细胞模拟粒子所用的试剂体系及含该模拟粒子的血液分析仪用质控物和校准物。

Description

五分类白细胞模拟物粒子、其制备方法以及含该模拟粒子的质控物和校准物

技术领域

本发明涉及血液细胞分析领域，更具体地说，涉及使用红细胞制备的五分类白细胞模拟物粒子、其制备方法以及含该模拟粒子的质控物和校准物。

背景技术

采用光学法检测技术的五分类血液细胞分析仪，其质控物和校准物中的白细胞粒子模拟物和单纯阻抗法(参见US 4,704,364)中所使用的白细胞模拟物有很大差别(参见图1)，不但要有比较良好的体积分布，同时也需要具有良好的细胞光学复杂度分布，有的粒子还需要具备特定的荧光特性。由于人或者动物的红细胞为双凹盘状或者纺锤型，直接固定后在五分类血液细胞分析仪光学检测上无法表现出集中分布的光学特性，所以目前满足具有稳定的体积和光学散射度要求的模拟物粒子多采用人或者其他动物血液中白细胞粒子提纯后进行固定加工，这种策略对材料、成本、工艺过程均有较高的要求。而采用红细胞材料进行加工的适用粒子比较少见，且工艺多有不足。

将人或者动物白细胞制备成五分类白细胞粒子模拟物的方法包括溶血、固定、洗涤等步骤，通常先去除红细胞，分离出人白细胞，再对白细胞进行固定或逐级固定，经洗涤后保存，例如保存在添加脂蛋白的保存液，使白细胞模拟物接近真实白细胞特征。参见例如美国专利6,406,915、6,403,377、6,399,388、6,221,668、6,200,500、5,981,282、5,731,205、5,677,145、5,672,474、5,270,208和5,262,327、6,762,055、6,514,763、6,187,590和5,858,790。

然而，使用白细胞材料具有很多不足之处，主要集中在以下2个方面：

(1)白细胞粒子的获得困难，直接导致成本增加和工艺复杂

在人和动物的血液中，白细胞的浓度仅为红细胞的1/100-1/1000，希望获得不含红细胞的白细胞的过程非常复杂。而采用溶血剂可能会导致白细胞特性的改变，从而不再能够使用生理白细胞状态来评估提纯后的白细胞粒子。另外去除红细胞的工艺过程非常复杂，即使使用高成本的细胞分离液也不容易达到满意的效果，所以使五分类血液细胞分析仪校准物和质控物的成本和产品受到了很大限制；和

(2)使用白细胞很难采用加强的醛固定技术，导致产品的稳定性能不足

白细胞和红细胞在细胞膜的表面特性上存在很大的不同，非常容易表现出聚集状态。在使用醛类进行固定的过程会加强这个聚集情况。为了降低聚集粒子造成的细胞分布影响，白细胞模拟物粒子的固定方法很多不能够和红细胞一样进行醛类的高浓度、高温度、长时间处理，这样加工出来的白细胞模拟粒子在稳定性上可能会出现不同程度的下降。

使用红细胞制备五分类白细胞粒子模拟物的方法一般包括使红细胞体积膨胀并释放血红蛋白，然后固定细胞。参见例如美国专利5,512,485。用这种方法制备的白细胞模拟粒子适用于电阻、电导、散射光检测技术，即VCS技术。

使用红细胞材料可以减少白细胞分离步骤，简化了部分工艺，但也存在不足之处，主要集中在以下2个方面：

(1)红细胞材料的形态结构和白细胞差异很大，所以其模拟粒子的仿真度一般差于白细胞材料，需进行一系列的调整；

(2)现有技术中公开的红细胞材料的处理工艺比较复杂，需要进行体积调节(包括调节前的稳定性预处理)、血红蛋白含量的调整和长时间的低温固定，由于繁杂的处理环节特别是体积膨胀调节，使得红细胞胞膜的完整性大大降低，导致其稳定性和成品率容易出现问题。另外过多的处理步骤使得工艺难度增大，产物的重复性也会受到一定影响，这将降低该工艺的实用性和可控性。

本专利针对这些情况，提出了一种简单的使用红细胞材料制备五分类血液细胞分析仪校准物、质控物的白细胞模拟粒子的方法，建立了一种一步法对红细胞的体积、形态、内含物进行调整的试剂体系，较好地解决了上述问题。

发明内容

本发明的一个实施方案涉及由动物红细胞制备白细胞模拟粒子的方法，包括以下步骤：

(1)根据制备不同分布群的模拟物粒子的要求，选用适宜物种来源的红细胞；

(2)用包含下述组分的一步法试剂，对红细胞进行性能调整：

(i)形态调整组分，其为以表面活性剂为活性成分的红细胞球形化试剂，任选含有弱酸，其中表面活性剂的浓度以不破坏红细胞并不出现血红蛋白泄漏到细胞外围的浓度为准，优选为0.005％-0.5％

(ii)内含物调整组分，其为血红蛋白的氧化剂或者还原剂，

(iii)体积调整组分，其为用于渗透压微调的渗透压调节剂，优选选自氯化钠、磷酸二氢钠、氯化钾和柠檬酸钠，和

(iv)胞膜强化组分，其为有机醛类；

(3)对上述红细胞粒子进行固定，形成抗溶血剂作用的粒子；

(4)洗涤后浓缩保存。

在该实施方案中，优选对经步骤(2)处理的红细胞粒子进行短时间高强度固定，例如用0.5％戊二醛固定约2小时。所述表面活性剂可以为阳离子、阴离子、非离子和/或两性离子表面活性剂，而所述弱酸可以为醋酸。所述氧化剂或还原剂可以选自亚硝酸钠、重铬酸钾、高锰酸钾、过氧化氢和亚硫酸钠。所述胞膜强化组分可以为多聚甲醛、甲醛、丙酮醛、乙二醛、戊二醛等醛类化合物或这些固定剂的混合物。

在其中一个优选实施方案中，步骤(2)中所用的试剂包含：(i)终浓度0.005％-0.5％(w/v)的十二烷基磺酸钠或0.005％-0.5％(w/v)的十六烷基三甲基氯化铵，和/或(ii)终浓度0.1％-1％(w/v)的亚硝酸钠、0.1％-2％(w/v)的重铬酸钾、0.05％-2％(w/v)的高锰酸钾、0.05％-5％(v/v)的过氧化氢或0.1％-2％(w/v)亚硫酸钠，和/或(iii)终浓度0.75-2％(w/v)的氯化钠溶液、1％-3％(w/v)的磷酸二氢钠溶液、0.75-2％(w/v)的氯化钾溶液或1％-4％(w/v)的柠檬酸钠溶液，和/或(iv)终浓度0.01％-0.1％(v/v)的戊二醛、0.05％-0.5％(v/v)的甲醛、0.05-0.2％(v/v)的甲醛与戊二醛体积比为3∶1-40∶1的混合醛、0.05％-0.5％(v/v)的丙酮醛、0.01％-0.1％(v/v)的多聚甲醛。

本发明的另一个实施方案涉及用于由动物红细胞制备白细胞模拟粒子的试剂，其包含：

(i)形态调整组分，其为以表面活性剂为活性成分的红细胞球形化试剂，任选含有弱酸如醋酸，其中表面活性剂的浓度以不破坏红细胞并不出现血红蛋白泄漏到细胞外围的浓度为准，优选为0.005％-0.5％；

(ii)内含物调整组分，其为血红蛋白的氧化剂或者还原剂，优选选自亚硝酸钠、重铬酸钾、高锰酸钾、过氧化氢和亚硫酸钠；

(iii)体积调整组分，其为用于渗透压微调的渗透压调节剂；和

(iv)胞膜强化组分，其为有机醛类，优选多聚甲醛、甲醛、丙酮醛、乙二醛、戊二醛等醛类化合物或这些固定剂的混合物。

本发明还涉及包含用上述方法制备的白细胞模拟粒子的血液分析仪用的质控物和校准物。

附图说明

图1是在阻抗法中所使用的由红细胞制备的白细胞模拟物(其制备方法参见US 4,704,364)在本公司BC-5500五分类血液分析仪的白细胞分类检测通道(即白细胞四分类DIFF通道)上测定的散点图。

图2是人新鲜全血在BC5500五分类血液分析仪测定的DIFF通道的散点图。

图3DIFF图像中蓝色部分(椭圆圈内的部分)是由人红细胞使用一步法模拟技术制备的模拟淋巴细胞的分布。可见细胞的聚类性均已良好，碎片和杂散的颗粒粒子少。已经具备了作为仪器系统质量控制工作的基本条件。

图4DIFF图像中蓝色部分(椭圆圈内的部分)是用象红细胞使用一步法模拟技术制备的模拟中性粒细胞的分布，可见细胞的聚类性均已良好，碎片和杂散的颗粒粒子少。已经具备了作为仪器系统质量控制工作的基本条件。

图5为图3经反色处理后得到的图像。

图6为图4经反色处理后得到的图像。

图7是将用两种不同方法处理的红细胞混合后得到的散点图，其中DIFF图像中绿色部分(A)是人红细胞使用一步法模拟技术制备的模拟淋巴细胞的分布，DIFF图像中浅蓝色部分(B)是用象红细胞使用一步法模拟技术制备的模拟中性粒细胞的分布。

具体实施方式

本发明人对多种生物的红细胞进行了筛选，针对红细胞本身结构特点进行研究，对多种处理反应的同步并行的可能性进行了深入的探讨，并对同体系中各反应的兼容性进行了严格的测试，既注重保持红细胞结构的完整性，又最大程度上模拟了白细胞的光学特点，既简化了固定流程，又加强了粒子强度，得到高稳定性的白细胞模拟粒子。本发明的具体特征如下：

(1)在保持红细胞结构完整性的同时，对其形态和内含物进行同步调整。

红细胞如果保持完整的结构则其对固定环节的要求可以比较简单，容易控制和避免干扰。同时，完整的红细胞结构固定后可以保持更高的稳定性。所以本发明所设计的工艺方案采取了各种方法最大限度的保护了红细胞结构的完整性。

从血液细胞分析仪光学检测原理分析，红细胞的光散射比白细胞大主要是由于其形态不是球形，在通过光学检测区域的姿态(角度)不同而表现出较大的光散射差异。所以要提高在光散射性能上的一致性，只需要将红细胞尽量球形化即可达到，而无需进行更多的处理。

在血液细胞分析中，为了减少对血红蛋白的影响和进一步稳定细胞内血红蛋白，对细胞内血红蛋白直接进行简单的氧化或者还原等化学修饰，如将血红蛋白中的Fe²⁺氧化为Fe³⁺，则在未来长期的保存中，其血红蛋白的稳定性可以大大提高。使血红蛋白不释放到细胞外而保留在红细胞内部，避免了对细胞膜结构的破坏，进一步保持了细胞结构，提升了粒子的稳定性。

由于在球形化之后，红细胞胞膜仍具有很高的弹性，导致其在失去球形化环境时，形态有恢复自然状态的倾向，所以在本发明中，发明人通过加入适当浓度的有机醛，来对胞膜进行初步的强化。

在本发明中，上述三种主要的调整通过利用一种试剂体系(一步法试剂)来进行实现。这虽然增加了一定的技术难度，但却避免了每步调整之间过渡阶段的未知风险，并提高了工艺标准化的程度。

(2)使用加强的固定条件，强化胞膜强度，增加稳定性。

由于本发明的方法对红细胞的结构影响小，且血红蛋白始终位于细胞内部，对固定环节的影响少，这使得提高固定剂的浓度成为可能，所以能够用较高浓度的固定剂或混合固定剂进行短时间高强度的固定处理，可以在简化固定工艺的同时达到更稳定的效果。

(3)使用更多种类的红细胞来符合仪器测定分布要求

为了保持红细胞的完整性，一般可以使用渗透压调节和化学、物理等常见处理方法，但由于本发明方法并不严重破坏细胞结构，并尽量减小了血红蛋白外泄等情况发生的可能，所以上述调节红细胞体积的方法和红细胞体积的可调节的变化程度是有限的。为了保证仪器更多的分布特性，建议的方法是增加生物红细胞的种类。比如使用猪红细胞可以制备接近淋巴分布特征的白细胞模拟粒子，使用象或泥鳅红细胞可以制备类似嗜酸细胞、中性粒细胞的白细胞模拟粒子，使用禽红细胞可以制备单核白细胞模拟粒子等等。当然根据适用仪器的不同，可以扩展研究更多的生物种类，充分利用生物本身的细胞特性以达到适用仪器检测的目的。

总之，采用本发明的方法，可以显著简化工艺、降低成本，并制备出稳定性良好的用于五分类校准物、质控物的白细胞模拟粒子。

采用红细胞制备五分类白细胞模拟粒子大致需要以下主要步骤：

(1)根据制备不同分布群的模拟物粒子的要求，选用适宜物种来源的红细胞；

(2)对红细胞进行性能调整：包括细胞体积上进行微调(如有必要)、形态上球形化从而减低光学复杂度分布、对内含物的光学性质进行调整、以及使胞膜进行初步强化；

(3)将上述红细胞粒子短时间高强度固定，形成抗溶血剂作用的粒子；

(4)严格洗涤后浓缩保存；

(5)需要时，加入红细胞、血小板成份制备成为多参数校准物、质控物产品。

以下对本发明方法及所用的具体试剂、材料作进一步的说明。

(一)材料准备

1.红细胞

本发明方法所用的红细胞为适宜动物红细胞，可根据待模拟粒子的不同而适当选择。本文所述的“动物”包括人类，因此本文所述的动物红细胞包括鱼类、两栖类、爬行类、鸟类(禽类)和哺乳动物的红细胞，包括人红细胞。如上所述，例如使用猪红细胞可以制备接近淋巴分布特征的白细胞模拟粒子，使用象或泥鳅红细胞可以制备类似嗜酸细胞、中性粒细胞的白细胞模拟粒子，使用禽红细胞可以指标单核白细胞模拟粒子等等。此外，由于在动物(包括人)的全血中，红细胞占整个血细胞的绝大多数，可无需除去其他组分，因而可以用全血作为本发明方法中所使用的红细胞来制备白细胞模拟粒子。

2.一步法试剂

本发明的一步法试剂，即用于维持红细胞胞膜的完整性、实现体积、形态和内含物的同步调整的试剂，其含有以下组分：

(1)形态调整组分：

该组分以阳离子、阴离子、非离子、两性离子表面活性剂为活性成分的红细胞球形化试剂，如季铵盐类、皂苷等常规或商业用溶血剂，任选含有弱酸如醋酸等。表面活性剂的浓度以不破坏红细胞且不出现血红蛋白泄漏到细胞外围的浓度为准，其判断标准为不使血液颜色由原始的鲜红色变为暗红色。例如，可以使用终浓度0.005％-0.5％(w/v)的十二烷基磺酸钠或终浓度0.005％-0.5％(w/v)的十六烷基三甲基氯化铵。

(2)内含物调整组分：

可以使用本领域已知的可氧化或者还原血红蛋白的任何物质，例如亚硝酸钠、重铬酸钾、高锰酸钾、过氧化氢和亚硫酸钠等。其浓度可以根据本领域已有的技术来确定。例如可以使用浓度为0.1％-1％(w/v)的亚硝酸钠、0.1％-2％(w/v)的重铬酸钾、0.05％-2％(w/v)的高锰酸钾、0.05％-5％(v/v)的过氧化氢、0.1％-2％(w/v)亚硫酸钠等。

(3)体积调整组分：

为了减少来料细胞批间的体积细小差异，可以使用渗透压调节剂对渗透压微调来进行细胞体积调整，但为了保证细胞结构的完整性，体积的微调以不发生细胞溶解，无血红蛋白溢出为判断标准。渗透压调节剂对于本领域技术人员而言是众所周知，例如有氯化钠、磷酸二氢钠、氯化钾、柠檬酸钠等。本领域技术人员可以根据本领域的技术常识，选择具体使用的渗透压调节剂和浓度。例如，使用终浓度0.75-2％(w/v)的氯化钠溶液、1％-3％(w/v)的磷酸二氢钠溶液、0.75-2％(w/v)的氯化钾溶液、1％-4％(w/v)的柠檬酸钠溶液等，可以适当地放大或者缩小细胞的体积同时不会发生血红蛋白等细胞内部物质溢出，保持了细胞结构的完整。

(4)胞膜强化组分：

可采用有机醛类，如多聚甲醛、甲醛、丙酮醛、乙二醛、戊二醛等醛类化合物或这些固定剂的混合物。可以根据选用的具体醛类物质来确定所使用的适当浓度，例如可以使用终浓度0.01％-0.1％(v/v)的戊二醛、0.05％-0.5％(v/v)的甲醛、0.05-0.2％(v/v)混合醛(甲醛与戊二醛体积比为3∶1-40∶1)、0.05％-0.5％(v/v)的丙酮醛、0.01％-0.1％(v/v)的多聚甲醛等等。

3.固定剂

可以使用任何用于固定红细胞的固定剂，包括多聚甲醛、甲醛、丙酮醛、乙二醛、戊二醛等醛类化合物或这些固定剂的混合物，例如可以使用体积比1∶3-1∶40的戊二醛与甲醛的混合液。固定剂的浓度可以参考现有技术的固定方法根据具体的固定剂来确定。由于使用本发明的方法，细胞内的血红蛋白不会溢出到细胞外部，可降低对高浓度醛固定的干扰情况，所以可以使用高浓度的固定剂进行短时间固定。例如可以使用终浓度为0.5％-1％(v/v)的戊二醛或0.5％-1％(v/v)的混合醛(体积比1∶3-1∶40的戊二醛与甲醛的混合液)等高浓度固定剂。

4.洗涤液

可以使用常规等渗磷酸盐溶液(PBS)、生理盐水溶液、等渗甘氨酸溶液、等渗柠檬酸钠溶液等的等渗溶液。

5.保存液

可以使用适于细胞保存的防腐条件良好的保存液。

(二)制备方法

本发明的由红细胞制备白细胞模拟粒子的方法包括以下步骤：

1)体积、形态及内含物调整

红细胞取得后首先进行球形化和血红蛋白的处理。处理血红蛋白可以加强红细胞本身光学特性的均一性并增强稳定性。方法是血液先使用缓冲液或者盐水适当稀释，然后加入处理试剂处理。处理试剂包含表面活性剂、氧化剂、醛类等。这里表面活性剂的浓度以不破坏红细胞并不出现血红蛋白泄漏到细胞外围(即不使血液颜色由原始的鲜红色变为暗红色)的浓度为准，主要作用是球形化；氧化剂的作用是氧化血红蛋白，稳定其结构；醛类的浓度在本步骤比较低，其作用是给予胞膜一定的强度，逐渐维持红细胞的球形变化情况。

上述调整过程可以在室温环境下静置，将细胞调整到位，体积差异比较明显的细胞群最好采用不同生物来源的方法进行选择，在形态和内含物调整的同时适当的体积调节也是可以采用的技术手段。一般采用渗透压的方法，其主要目的是解决因相同物种的个体差异造成的差异。这个差异比较小，可以通过体积微调实现。

2)强化固定：

在五分类血液细胞分析仪上对经过上述处理的红细胞粒子进行测定。如果经测定未满足分布要求，则适当延长处理时间。当经处理的红细胞粒子在五分类血液细胞分析仪上的测定满足分布要求且相对比较稳定时，说明细胞的调整已经基本到位。此时可以进一步加强醛固定以增强粒子的稳定性。经上述处理的红细胞粒子可以用本领域已知的方法进行固定。

此外，因血浆成分含量很低，所以高浓度的醛不会导致出现血浆蛋白的聚集物。同时由于按照本发明的方法，细胞内的血红蛋白不会溢出到细胞外部，也可以降低对高浓度醛固定的干扰情况，所以优选使用高浓度的固定剂进行短时间固定。例如可以采用终浓度0.5％(v/v)的戊二醛室温固定约2小时。有的细胞在加工时可能会使用混合醛固定方法。混合醛是利用了不同醛类的固定特点进行应用。比如甲醛和戊二醛的混合物，就是利用了甲醛的穿透特性和戊二醛的交联特性的共同作用，从而使加工的粒子具有能满足仪器监测要求的长期稳定性。例如可以采用终浓度0.5％(v/v)的1∶10的戊二醛-甲醛混合液室温固定约2小时。经0.5％(v/v)戊二醛(数据未显示)或0.5％(v/v)的1∶10戊二醛-甲醛混合液室温固定2小时所制得的白细胞模拟粒子，完全可抵抗测定时所使用的常规溶血剂而保持稳定。

3)离心洗涤和保存：

上述固定粒子可以使用生理盐水或其他等渗溶液洗涤多次，消除醛类残留，然后使用防腐条件良好的保存液进行低温保存。

4)多参数产品的合成

根据要求，可以加入红细胞、血小板成份制备成为多参数校准物、质控物产品。

综上所述，本发明的特点是：

(1)使用结构完整的红细胞加工用作校准物、质控物的白细胞模拟物；

(2)使用一步法试剂处理，使红细胞在多功能试剂体系的作用下，维持了红细胞胞膜的完整性，实现体积、形态和内含物的同步调整，使测试参数更加稳定且符合白细胞分群要求，使光学复杂度更加均一；和

(3)结合适当的固定方法，配合细胞球形化和血红蛋白处理过程，直到满足要求后加强固定。

与现有技术相比，本发明的主要优点是：

1)来料丰富：红细胞的浓度远远高于白细胞，所以非常容易获得；

2)工艺简单：省略了白细胞提纯过程，避免了白细胞聚集因素。将红细胞的各种性能调整归集为一步反应处理，降低了红细胞处理的工艺要求；

3)成本低廉：整个过程不需要贵重试剂和器材，环境要求低；

4)产品稳定：可采用高强度固定处理，产品的稳定性高。

实验证明，按照本发明所制备的粒子体积分布良好，可以在阻抗法仪器校准物、质控物方面进行应用。本发明的方法实际上是一种兼容阻抗法检测技术的粒子加工技术。

本发明的方法改变了红细胞的光学检测特性，加工出来的粒子还是一种载体，可以继续修饰，比如增加荧光物质或者抗原、抗体等生物物质，从而形成满足荧光或免疫学检测原理的模拟粒子。

以下提供本发明的说明性实施例，以便本领域技术人员能更好地理解和实施本发明。

实施例

实施例1：用人红细胞模拟淋巴细胞

1.配置如下处理试剂：在195ml纯水中加入1.5g氯化钠、1g亚硝酸钠、100μl的1％(w/v)十六烷基磺酸钠和100μl 25％(v/v)戊二醛；

2.将人抗凝全血5ml和上述处理试剂混合，于室温放置约30分钟；

3.上机(BC5500)测定，根据不同分布要求确定是否开始加强固定；

4.当反应物满足所需分布要求时(即DIFF图像已位于淋巴细胞区域时)，在反应液中加入终浓度为0.5％(v/v)的1∶10的戊二醛-甲醛混合液，室温放置2小时。

5.上机测定，观察计数和细胞分布变化；

6.满足要求(即计数与图像相对稳定)后，使用生理盐水经离心洗涤3次，以消除醛残留，浓缩后使用保存液低温保存。用BC5500测定得到DIFF图像，见图3。

实施例2：用象红细胞模拟中性粒细胞

1.配置如下处理试剂：在195ml纯水中加入1.5g氯化钠、1g亚硝酸钠、100μl的1％(w/v)十六烷基磺酸钠和100μl 25％(v/v)戊二醛；

2.将5ml象抗凝全血和处理试剂混合，室温放置约30分钟；

3.上机测定，根据不同分布要求确定是否开始加强固定；

4.当反应物满足所需分布要求时(即DIFF图像已位于中性粒细胞区域时)，在反应液中加入终浓度为0.5％(v/v)的1∶10的戊二醛-甲醛混合液，室温放置2小时。

5.上机(BC5500)测定，观察计数和细胞分布变化；

6.满足要求(即计数与图像相对稳定)后，使用生理盐水经离心洗涤3次，消除醛残留，浓缩后使用保存液低温保存。用BC5500测定得到DIFF图像，见图4。

将实施例1和2中制备的白细胞模拟粒子混合，用BC5500测定，得到图5所示的DIFF图像。

结果

如图1所示，在阻抗法中所使用的由红细胞制备的白细胞模拟物的白细胞四分类DIFF通道散点图，可见其散点图毫无聚类性，且不同于人的任何一类白细胞的散点图分布(参见图2)，因此不可能用这种模拟物对仪器的计数与分类进行监测，即以前的质控物制备技术已经不能满足当前五分类仪器的需要。

相比之下，由图3-图7可见，用本发明的方法(一步法)制备的白细胞模拟粒子的聚类性均已良好，碎片和杂散的颗粒粒子少，可很好地模拟真实白细胞的光散射特性，已经具备了作为仪器系统质量控制工作的基本条件。

另外，发明人还用猪红细胞制备了淋巴细胞模拟粒子，也获得了相似的效果(结果未显示)。

此外，按照本发明方法制备的模拟粒子通过稳定性测试(数据未显示)证明，其保存稳定性与使用稳定性等各项指标均已达到国外同类产品水平，可在2-8℃封闭保存120天以上而保持稳定。

虽然以上通过具体的实施例对本发明进行了描述，但本领域技术人员理解，本发明并不限于这些具体的实施方案。在不偏离本发明精神和范围的情况下，可对本发明的具体实施方式作出各种修改和改进。这些等同的实施方式包括在本发明的范围内。

Claims (13)

1.由动物红细胞制备白细胞模拟粒子的方法，包括以下步骤：

(1) 根据制备不同分布群的模拟物粒子的要求，选用适宜物种来源的红细胞；

(2) 用包含下述组分的一步法试剂，对红细胞进行性能调整：

(i) 形态调整组分，其为以表面活性剂为活性成分的红细胞球形化试剂，任选含有弱酸，其中表面活性剂的浓度以不破坏红细胞并不出现血红蛋白泄漏到细胞外围的浓度为准，

(ii) 内含物调整组分，其为血红蛋白的氧化剂或者还原剂，

(iii) 体积调整组分，其为用于渗透压微调的渗透压调节剂，和

(iv) 胞膜强化组分，其为有机醛类；

(3) 对上述红细胞进行固定，形成抗溶血剂作用的粒子；

(4) 洗涤后浓缩保存。

2.权利要求1的方法，其中步骤(2)中的表面活性剂的浓度为0.005%－0.5% (w/v)；和/或步骤(2)中的渗透压调节剂选自氯化钠、磷酸二氢钠、氯化钾和柠檬酸钠。

3.权利要求1的方法，其中对经步骤(2)处理的红细胞进行短时间高强度固定。

4.权利要求3的方法，其中对经步骤(2)处理的红细胞用0.5%戊二醛固定约2小时。

5.权利要求1－4中任一项的方法，其中所述表面活性剂为阳离子、阴离子、非离子和/或两性离子表面活性剂，所述形态调整组分任选含有醋酸。

6.权利要求1－4中任一项的方法，其中所述表面活性剂为十二烷基磺酸钠或十六烷基三甲基氯化铵。

7.权利要求1－4中任一项的方法，其中所述氧化剂或还原剂选自亚硝酸钠、重铬酸钾、高锰酸钾、过氧化氢和亚硫酸钠。

8.权利要求1－4中任一项的方法，其中所述胞膜强化组分为多聚甲醛、甲醛、丙酮醛、乙二醛、戊二醛等醛类化合物或这些固定剂的混合物。

9.权利要求1－4中任一项的方法，其中步骤(2)中所用的试剂包含：(i)终浓度0.005%－0.5% (w/v)的十二烷基磺酸钠或0.005%－0.5% (w/v)的十六烷基三甲基氯化铵，和/或(ii)终浓度0.1%－1% (w/v)的亚硝酸钠、0.1%－2% (w/v)的重铬酸钾、0.05%－2% (w/v)的高锰酸钾、0.05%－5% (v/v)的过氧化氢或0.1%－2% (w/v)亚硫酸钠，和/或(iii)终浓度0.75－2% (w/v)的氯化钠溶液、1%－3% (w/v)的磷酸二氢钠溶液、0.75－2% (w/v)的氯化钾溶液或1%－4% (w/v)的柠檬酸钠溶液，和/或(iv) 终浓度0.01%－0.1% (v/v)的戊二醛、0.05%－0.5% (v/v)的甲醛、0.05－0.2% (v/v)的甲醛与戊二醛体积比为3:1－40:1的混合醛、0.05%－0.5% (v/v)的丙酮醛、0.01%－0.1% (v/v)的多聚甲醛。

10.用于由动物红细胞制备白细胞模拟粒子的试剂，其包含：

(i) 形态调整组分，其为以表面活性剂为活性成分的红细胞球形化试剂，任选含有弱酸，其中表面活性剂的浓度以不破坏红细胞并不出现血红蛋白泄漏到细胞外围的浓度为准；

(ii) 内含物调整组分，其为血红蛋白的氧化剂或者还原剂；

(iii) 体积调整组分，其为用于渗透压微调的渗透压调节剂；和

(iv) 胞膜强化组分，其为有机醛类。

11.权利要求10的试剂，其中所述弱酸为醋酸；和/或表面活性剂的浓度为0.005%－0.5% (w/v)；和/或内含物调整组分选自亚硝酸钠、重铬酸钾、高锰酸钾、过氧化氢和亚硫酸钠；和/或胞膜强化组分为多聚甲醛、甲醛、丙酮醛、乙二醛、戊二醛等醛类化合物或这些固定剂的混合物。

12.血液分析仪用的质控物，其包含用权利要求1－9中任一项的方法制备的白细胞模拟粒子。

13.血液分析仪用的校准物，其包含用权利要求1－9中任一项的方法制备的白细胞模拟粒子。

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