JP2000512748A - 検体収集用液体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 脂肪族アルデヒドをモル濃度０．１５Ｍから３．４Ｍと、１種以上の重金属塩を総モル濃度０．２×１０^-3Ｍから０．２Ｍと、抗凝血薬をモル濃度０．２７Ｍから０．４５Ｍとを含む無菌水溶液からなり、前記溶液は６．８から８．０の範囲のｐＨを有することを備える検体収集用液体。

Description

【発明の詳細な説明】 検体収集用液体発明の背景 本発明は、検体収集用液体（specimen collection fluid）に関するものであ り、さらに詳細には免疫血液学的分析に用いられる血液および／または骨髄検体 の処理用検体収集用液体に関する。 血液学的悪性疾患およびＡＩＤＳのような免疫学的疾患に罹患した患者から得 られる検体の免疫血液学的分析での現行の方法では、適切な量の検体収集用液体 （通常、抗凝血薬溶液である）を含有する無菌血液収集管中に収集することが要 求される。しかしながら、末梢血または骨髄の収集では抗原の安定性を確保し、 サンプルの完全性が劣化しないように、関与する試験に応じて、６、１８または ２４時間以内に当該検体を処理すべきであることが数種の研究によって報告され ている。これらの厳しい時間制限のために、ほとんど常に検体を分析場所へ非常 に緊急に輸送しなければならない。分析が遅延する場合、例えば、患者の検体が 週末または祝日に得られた場合、または検体がある国から別の国に輸送される場 合、最終的に分析にかけられるときには適切な状態でないことがあり、さらなる 検体の採取が必要となることがある。 現在入手できる安定化液体は、抗凝血化血液の収集についで、１ｍｌの抗凝血 化血液検体への１ｍｌの安定化液体の添加を必要とし、その結果検体が著しく希 釈され、引き続き行われる免疫血液学的分析の結果の解釈を非常に難しいものと する。 商業的に入手可能な安定化液体は白血病において満足のいかない結果を与える 。 国際特許出願番号ＷＯ 95/01796およびＷＯ 95/27203において、重金属化合物 特に遷移金属塩を含む安定化剤で細胞を処理することにより調製された安定化細 胞の調製が記載されている。安定化剤は有効量のアルデヒドを含むこともできる 。安定化細胞の調製品は分析技術用の品質管理手順で用いられる安定化された全 血調製品を安定化することもできる。発明の目的 免疫血液学的分析検体に適する改良された検体収集用安定化液体を提供するこ とが本発明の目的であり、好ましい実施態様において、安定化液体を含む検体収 集用容器に検体を直接収集するのを可能にする。 改良された検体収集用液体を含む検体収集容器を提供することも本発明の目的 である。 免疫血液学的分析用などの検体収集法を提供することも本発明のさらなる目的 であり、新規の検体収集用液体と検体を接触させ、実質的に分析を妨げることな く改良された貯蔵特性を提供するものである。発明の概要 第１の態様において、本発明は免疫血液学的分析検体用などの、検体収集用液 体を提供し、これは脂肪族アルデヒドをモル濃度０．１５Ｍから３．４Ｍと、１ 種以上の重金属塩を総モル濃度０．２×１０^-3Ｍから０．２Ｍと、好ましくは抗 凝血薬をモル濃度０．２７Ｍから０．４５Ｍとを含む無菌緩衝溶液を備え、前記 溶液は６．８から８．０の範囲のｐＨを有する。 すでに抗凝血化された状態にある血液を用いる場合には、抗凝血薬は任意であ ることは理解されよう。 別の態様において、本発明は分析用の検体を受け入れる検体収集用容器を提供 し、これは脂肪族アルデヒドをモル濃度０．１５Ｍから３．４Ｍと、１種以上の 重金属塩を総モル濃度０．２×１０^-3Ｍから０．２Ｍと、抗凝血薬をモル濃度０ ．２７Ｍから０．４５Ｍとを含む無菌水溶液からなる安定化量の検体収集用液体 を含み、前記溶液は６．８から８．０の範囲のｐＨを有する。 さらなる態様において、本発明は組織病理学的分析などの、免疫血液学的分析 および／または他の分析技術用の検体収集法を提供し、前記溶液のｐＨが６．８ から８．０の範囲である、脂肪族アルデヒドをモル濃度０．１５Ｍから３．４Ｍ と、１種以上の重金属塩を総モル濃度０．２×１０^-3Ｍから０．２Ｍと、抗凝血 薬をモル濃度０．２７Ｍから０．４５Ｍとを含む無菌水溶液からなる検体収集用 液体に検体を接触させることを備える。 発明の詳細な説明 本発明は特に免疫血液学的分析目的用の末梢血および骨髄検体の収集に適用す ることができ、これに加えて今後より詳細に記述される。しかし本発明はそのよ うな物質の収集に限定されるものではなく、例えば、組織病理学のような病理学 的検体の分析などの、分析目的用に収集されたヒトおよび動物の広範な検体に広 く適用することができることが理解されよう。 検体収集用液体に用いられる脂肪族アルデヒドは、あらゆる適切な脂肪族アル デヒドであることができるが、好ましくはホルムアルデヒドであり、そして最も 好ましくはパラホルムアルデヒドである。水溶液にアルデヒドを溶解するのを補 助するために、必要であれば溶液を加温することができるが、温度は５０℃を超 えるまで上昇させてはならない。 適切な重金属塩は錯体形成特性を有し、かつ原子量２０を超える金属であり、 例えば、遷移金属、特に周期表のIV AからVII Aの遷移金属群であるマンガン、 クロム、モリブデン、バナジウムおよびチタンなど、I B群の銅など、ならびにI V B群のスズなどがある。VI A群およびVII A群、遷移金属、そして特にクロムお よびマンガンが特に好ましい。ある種の目的にとっては溶液が無色であるという 有利な点があるマンガン塩、とりわけマンガン塩とクロム塩との混合物を用いて 大変良い結果が得られた。 該重金属のいずれかの適切な水溶性塩を用いることができ、とりわけ無機酸塩 、例えば、硫酸塩、および特に塩化物を用いることができる。クロムおよびマン ガン化合物、例えば、塩化クロム ＣｒＣｌ₃のようなクロム塩、および例えば 、塩化マンガン ＭｎＣｌ₂のようなマンガン塩を用いて特に良い結果が得られ 、これらは本発明において用いられる好ましい金属塩である。 いずれの適切な抗凝血薬をも用いることができるが、ＥＤＴＡ塩が好ましく、 例えば、エチレンジアミン四酢酸二カリウム（Ｋ₂ＥＤＴＡ）およびエチレンジ アミン四酢酸三カリウム（Ｋ₃ＥＤＴＡ）のようなアルカリ金属塩が好ましい。 他に用いることのできる抗凝血薬はシトレート／ホスフェート／デキストロース ／アデニン（ＣＰＤＡ）を含む。 本発明による好ましい検体収集用液体はパラホルムアミド、マンガンおよび塩 化クロム、ならびに抗凝血薬を含む。好ましくは、マンガンのクロムに対する重 量比は、１００：１から５０：１の範囲内であり、例えば約７５：１である。 水溶液は、好ましくは０．１５モルから１．０モルの脂肪族アルデヒドと、０ ．２×１０^-3Ｍから０．１モルの重金属塩と、０．２７から０．４５モルの抗凝 血薬とを含む。前記水溶液は、好ましくは７．２から７．６の範囲の、例えば、 約７．４のｐＨを有する。 検体収集用液体は、好ましくは１種以上の細胞栄養素、例えば、それぞれ約２ ．５Ｍ、０．０５Ｍおよび０．１Ｍまでの量のデキストロース、アデノシン三リ ン酸およびイノシン、ならびに解糖系前駆体、例えば、ジヒドロキシアセトンお よび2,3-ジホスホグリセロールをも含む。クエン酸三ナトリウムおよび塩化ナト リウムは、しかしながら、好ましくは除外される。 検体収集用液体は、好ましくは細菌の成長を防ぐために１種以上の抗生物質を も含み、特に栄養素を伴う場合、抗生物質が存在しない場合には細菌が成長する 。抗生物質、例えば、それぞれ約０．０１５Ｍおよび０．００５Ｍまでの量のク ロラムフェニコールおよび硫酸ネオマイシンが適することが発見された。 検体収集用液体は、好ましくは血小板安定剤、例えば、塩化マグネシウムまた はヨードアセトアミドまたはその誘導体をも含む。 検体収集用液体は、調製してすぐ用いることができ、あるいは好ましい場合に は、用いる前にしばし放置しておくこともできる。調製してすぐの溶液は水酸化 クロム重合種（chromium hydroxy polymeric species）と思われる沈殿の形成を 起こすことが、クロム化合物の溶液のあるものにおいて観測された。好ましくは 使用前に溶液から沈殿を濾別する。沈殿の形成は、勿論、溶液中の重金属イオン の濃度を低下させるので、もしこれが起こるならば、重金属塩の濃度がまだ好ま しい範囲内に留まっているのかどうかを決定するために溶液の分析を実施すべき である。 検体収集用容器は、例えば、末梢血または骨髄の収集用の慣用の血液収集シス テムにおいて用いられるタイプのいずれの適切なガラスまたはプラスチック容器 でもよい。容器は例えば、空間を除いて、１から１０ｍｌ、好ましくは約５ｍｌ の容量の、ガラスまたはプラスチック管からなることができ、照射によって滅菌 される。通常、検体収集用容器は、検体収集用液体を少なくとも１０マイクロリ ットル、好ましくは２０から１００マイクロリットル、例えば、約５０マイクロ リットルを含有することのできる容積を有する。 本発明の収集方法において、血液または骨髄は現在当該技術において用いられ ている静脈切開の方法のいずれによっても、検体収集用容器に直接採取すること ができる。一般に、血液または骨髄の５ｍｌアリコートがほとんどの分析目的に 適しており、これらは例えば５０マイクロリットルの新規検体収集用液体を含む ことのできる本発明の検体収集用容器中に採取することができる。 検体容積の検体収集用液体容積に対する比は、好ましくは３０：１から１２５ ：１である。 本発明の検体収集用液体、容器および方法の好ましい実施態様を用いることに より、抗原または細胞の全体性が実質的に変質せずに採血後５日を超えて７日ま での末梢血で免疫血液学的分析を実施できることが発見された。本発明の好まし い検体収集用液体および方法を用いて、白血球および血小板抗原ＣＤ３、ＣＤ４ 、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４５、ならびに通常測定される 血液学的パラメーター、例えば、白血球数、赤血球数、血小板数、白血球分画（ white cell differential）およびヘモグロビンは、この期間中実質的に安定し ていた。白血球数は実質的に終始一定であるので、ＣＤ４およびＣＤ３４のよう な抗原に対する絶対値の測定を助ける。例えば、ＰＣＲ分析法用では収集後５日 までの間、ＲＮＡを検体から抽出することができる。 本発明の検体収集用液体、容器および方法は、ＡＩＤＳのような疾患の管理に おいて著しい利益を提供する。末梢血パラメーターは実質的に安定しているので 、検体の長距離輸送を容易にし、分析に都合良い時間まで検体を保持することが できる。少量の検体収集用液体の添加は通常およそ１００分の１で、絶対値の計 算に影響しうる著しい希釈を起こさない。 本発明は以下に示す実施例で例示される。 実施例１ 検体収集用液体は下記の成分を重量モル含む無菌水溶液から調製される。 パラホルムアルデヒド １．５モル 塩化マンガン ０．１２５モル Ｋ₂ＥＤＴＡ ０．３７モル 溶液のｐＨを７．４に調節し、溶液を濾過する。溶液５０μｌを７ｍｌガラス 製検体収集管に入れる。健康なドナーからＣＰＤＡ中に収集された２４時間経過 した血液サンプルを採取し、管に５ｍｌ引き抜く。管の内容分を十分に混合する 。管は４℃で貯蔵する事が好ましく、試験の前に内容物を室温にまで暖める。 ５日後ベクトン・ディキンソンのフローサイトメーターで検体を試験し、同様 の安定化していない対照と比較する。前方および側方散乱（forward and side s catter）（ＦＳＣ）の結果を図１および２（安定化させた検体）ならびに図３お よび４（対照）に示す。安定化させた検体では比較的に影響がなかったのに対し 、対照検体においては測定値が信頼できないとみなされる程度まで非リンパ球お よび細片が増加した。 上記実施例において検体はＣＰＤＡ抗凝血薬中に収集されたが、抗凝血薬を前 もって添加せずに、検体収集用液体に直接採取しても同様の結果を得ることがで きる。 実施例２ 検体収集用液体は下記の成分を重量モル含む無菌水溶液から調製される。 パラホルムアルデヒド ０．３３モル デキストロース（D-グルコース） ２．２２モル アデノシン三リン酸 ０．０３６モル イノシン ０．０７５モル クロラムフェニコール ０．０１２モル 硫酸ネオマイシン ０．００４４モル 塩化クロム（III） ０．０１９モル 塩化マンガン ０．０２５モル 塩化マグネシウム ０．５２モル 溶液のｐＨを７．４に調節し、大量の沈殿が形成した。溶液を１２００ｇで遠 心分離して沈殿を上清から分離した。上清を除去し、残っている粒子を濾別した 。 Ｋ₃ＥＤＴＡを添加して、最終濃度０．３４モルとし、溶液を再び濾過する。 ５４μｌの溶液を４．５ｍｌガラス製検体収集管に入れる。静脈穿刺により採取 された血液を直ちに管に入れる。上下に振ることにより管の内容分を十分に混合 して、新鮮な血液の抗凝血化および安定化プロセスを開始させる。管は４℃で貯 蔵する事が好ましく、試験の前に内容物を室温にまで暖める。 ５日後ベクトン・ディキンソンのフローサイトメーターで検体を試験し、安定 化させていない対照と比較する。ＣＤ４５＋染色および側方散乱の結果を図５お よび６（安定化させたサンプル）ならびに図７および８（対照）に示す。安定化 させた検体では比較的に影響がなかったのに対し、対照検体においては測定値が 信頼できないとみなされる程度まで顆粒球が分解し、細片の量が著しく増加した 。 上記実施例において検体は安定化液体中に存在するＫ₃ＥＤＴＡにより抗凝血 化されたが、前もって抗凝血化してある検体に安定化液体（Ｋ₃ＥＤＴＡなし） を直接添加しても同様の結果を得ることができる。 本発明による安定化させた検体をCoulter STKSのような血液学分析機械で拒絶 されることなく試験することができ、正常な赤血球および白血球数を計測するこ とができる。図９は静脈穿刺３日後の安定化させた全血液像を示す。図１０の表 １および２はそれぞれ、実施例２の手順に従って安定化させた検体で５日にわた って測定した白血球分画の絶対値およびパーセント値を表す。 本発明により安定化させた検体は７日間にわたる溶血が最小であることも発見 された。 図１１において、レーンＣ５は５日経過した安定化全血サンプルからのＲＴ- ＰＣＲ生成物の結果を示す。 非安定化および安定化サンプルのμｇ／ｍｌでのＲＮＡ含量の５日間にわたる 典型的値は以下の通り。 非安定化サンプル、０日目 ４９５μｇ／ｍｌ ＲＮＡ 非安定化サンプル、５日目 ２１５μｇ／ｍｌ ＲＮＡ 安定化サンプル、０日目 ３４０μｇ／ｍｌ ＲＮＡ 安定化サンプル、５日目 ２４０μｇ／ｍｌ ＲＮＡ 本願に関連して本明細書と同時にまたは先に提出されたもの、および本明細書 の検索用に公開されたすべての論文および文献に読者の注意がはらわれ、そのよ うなすべての文献の内容およびコメントをここに参照により本明細書に援用する 。 本明細書（付随する請求項、要約書および図面を含む）に開示された全ての特 徴および／またはそのように開示された全ての方法または手順の工程は、少なく ともいくつかのそのような特徴および／または工程が互いに排他する場合の組み 合わせを除いて、いずれの組み合わせも可能である。 本明細書（付随する請求項、要約書および図面を含む）に開示された各特徴は 、特記しない限り、同じ、同等または類似の目的にかなう代替的な特徴で代理す ることができる。従って、特記しない限り、開示された各特徴は一般的な一連の 同等または類似する特徴の１例にすぎない。 本発明は前述の実施態様の詳細に限定されない。本明細書（付随する請求項、 要約書および図面を含む）に開示されたあらゆる新規の特徴または、あらゆる新 規の特徴の組み合わせあるいは開示されたあらゆる新規な方法または手順の工程 あるいは新規な方法または手順の工程の組み合わせにまで拡張される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 グランジャー，ヴィヴィアン. 英国 エス８ ０エヌエス シェフィール ド ウッドシーツ レッドストーン ロー ド 12 (72)発明者 バーネット，デイヴィッド. 英国 エス６ ６エフエル シェフィール ド スタニントン ホルム オーク ウェ イ 18

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．脂肪族アルデヒドをモル濃度０．１５Ｍから３．４Ｍと、１種以上の重金属 塩を総モル濃度０．２×１０^-3Ｍから０．２Ｍとを含む無菌緩衝水溶液であり、 前記溶液は６．８から８．０の範囲のｐＨを有することを特徴とする検体収集用 液体。 ２．抗凝血薬を提供することを特徴とする請求項１に記載の検体収集用液体。 ３．抗凝血薬はモル濃度０．２７Ｍから０．４５Ｍで提供されることを特徴とす る請求項２に記載の液体。 ４．病理学的分析用に適することを特徴とする前記の請求項のいずれかに記載の 検体収集用液体。 ５．血液学的分析用に適することを特徴とする前記の請求項のいずれかに記載の 検体収集用液体。 ６．組織学的分析用に適することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載 の検体収集用液体。 ７．脂肪族アルデヒドはパラホルムアルデヒドであることを特徴とする前記の請 求項のいずれかに記載の検体収集用液体。 ８．重金属塩は遷移金属の塩であることを特徴とする前記の請求項のいずれかに 記載の検体収集用液体。 ９．遷移金属はクロムおよび／またはマンガンであることを特徴とする請求項８ に記載の検体収集用液体。 １０．重金属塩は塩化物であることを特徴とする前記の請求項のいずれかに記載 の検体収集用液体。 １１．抗凝血薬はＥＤＴＡ塩であることを特徴とする請求項２から１０のいずれ かに記載の検体収集用液体。 １２．パラホルムアルデヒド、塩化マンガン、塩化クロムおよび抗凝血薬の水溶 液を含むことを特徴とする前記の請求項のいずれかに記載の検体収集用液体。 １３．０．１５Ｍから３．４モルの脂肪族アルデヒドと、０．２×１０^-3Ｍから ０．２モルの重金属塩と、０．２７から０．４５モルの抗凝血薬とを含むことを 特徴とする前記の請求項のいずれかに記載の検体収集用液体。 １４．１種以上の細胞栄養素をも含むことを特徴とする前記の請求項のいずれか に記載の検体収集用液体。 １５．１種以上の抗生物質をも含むことを特徴とする前記の請求項のいずれかに 記載の検体収集用液体。 １６．血小板安定化剤をも含むことを特徴とする前記の請求項のいずれかに記載 の検体収集用液体。 １７．血小板安定化剤は塩化マグネシウムであることを特徴とする請求項１６に 記載の検体収集用液体 １８．水溶液は７．２から７．６の範囲内のｐＨを有することを特徴とする前記 の請求項のいずれかに記載の検体収集用液体。 １９．実質的に実施例に記載された検体収集用液体。 ２０．実質的に本明細書に記載された検体収集用液体。 ２１．脂肪族アルデヒドをモル濃度０．１５Ｍから３．４Ｍと、１種以上の重金 属塩を総モル濃度０．２×１０^-3Ｍから０．２Ｍとを含む無菌水溶液からなり、 前記溶液は６．８から８．０の範囲のｐＨを有する安定化量の検体収集用液体を 含むことを特徴とする分析用の検体を受け入れる検体収集用容器。 ２２．溶液はさらに抗凝血薬をモル濃度０．２７Ｍから０．４５Ｍ含むことを特 徴とする請求項２１に記載の容器。 ２３．請求項１から２０のいずれかに記載の溶液を含むことを特徴とする請求項 ２１または２２に記載の容器。 ２４．１から１０ｍｌの容量を有し、かつ１０から１００μｌの溶液を含むこと を特徴とする請求項２１から２３のいずれかに記載の容器。 ２５．実質的に本明細書に記載された請求項２１から２４のいずれかに記載の容 器。 ２６．検体をモル濃度０．１５Ｍから３．４Ｍの脂肪族アルデヒドと、総モル濃 度０．２×１０^-3Ｍから０．２Ｍの１種以上の重金属塩とを含む無菌水溶液から なり、前記溶液は６．８から８．０の範囲のｐＨを有する検体収集用液体に接触 させることを備えることを特徴とする血液学的分析用の検体の収集方法。 ２７．液体はモル濃度０．２７Ｍから０．４５Ｍの抗凝血薬をさらに含むことを 特徴とする請求項２６に記載の方法。 ２８．請求項１から２０のいずれかに記載の溶液を用いることを特徴とする請求 項２６または２７に記載の方法。 ２９．検体収集用液体を含む検体収集用容器に、検体を直接収集するかまたは移 すことを特徴とする請求項２６から２８のいずれかに記載の方法。 ３０．検体容積の検体収集用液体容積に対する比は、約３０：１から１２５：１ であることを特徴とする請求項２６から２９のいずれかに記載の方法。 ３１．実質的に実施例に記載された請求項２６から３０のいずれかに記載の方法 。 ３２．実質的に本明細書に記載された請求項２６から３１のいずれかに記載の方 法。 ３３．請求項１から２０のいずれかに記載の検体収集用液体により安定化される ことを特徴とする血液学的分析検体。