DE2828820A1 - Verfahren zur herstellung einer stabilen blutplaettchensuspension und nach dem verfahren erhaltene stabile blutplaettchensuspension - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer stabilen blutplaettchensuspension und nach dem verfahren erhaltene stabile blutplaettchensuspension

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Description

3 0. JUN11978
"Verfahren zur Herstellung einer stabilen Blutplättchensuspenslon und nach dem Verfahren erhaltene stabile Blutplättchensuspension" .
Von den verschiedensten Verbindungen ist es bekannt, daß sie eine Plättchenaggregation inhibieren. Eine Verwendung dieser Verbindungen bei der Herstellung oder Zubereitung stabiler Plättchensuspensionen hat sich jedoch nicht als erfolgreich erwiesen.
Erfindungsgemäß hat es sich nun überraschenderweise gezeigt, daß man bei Verwendung von Verbindungen, die die Plättchenmembran durch Bilden von vernetzenden Bindungen Zwischengruppen Bit Proteinfunktion fixieren und stabilisieren, eine Plättchenaggregation inhibieren kann. Verbindungen, die eine derartige Fixierung herbeiführen können, sind Aldehyde, z.B. Glutaraldehyd. Diese reagieren mit Amino-, Imino-, Guanidyl-, Hydroxyl-, Carboxyl- und SH-Qrüppen des Proteinnoleküls. Weitere Verbindungen, die zur Ausbildung von vernetzenden Bindungen mit Proteinen auf der Plättchenoberfläche fähig eind, sind Chromaalze, z.B. Kaliumdichromat. In Gegenwart von Wasser bilden Chromsalze Komplexe dee Type -Cr-O-Cr-, die mit reaktionsfähigen Gruppen an benachbarten Proteinketten unter Vernetzung entsprechend der Verwendung von Aldehyden reagieren.
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Die Erfindung besteht nun in der Verwendung von Aldehyden und Mischungen aus Aldehyden und Chromsalzen zur Zubereitung stabiler Suspensionen einzelner Blutplättchen.
Es hat sich gezeigt, daß optimale Bedingungen für eine Plättchenfixierung erreicht werden, wenn ein Aldehyd unverdünntem, plättchenreichem Plasma in einer Konzentration von 0,05 bis 0,20 96 zugesetzt wird. Ferner hat'es sich gezeigt, daß die Anwesenheit von Chromsalzen in Konzentrationen von 0,20 bis 0,30 % die Stabilität der Plättchensuspension verbessert.
Besonders gute Suspensionen fixierter Plättchen erhält man, wenn die Plättchen mit beiden Verbindungsarten" gleichzeitig fixiert werden.
Optimale Bedingungen zum Fixieren der Plättchen stellen sich ein, wenn Glutaraldehyd unverdünntem, plättchenreichem Plasma in einer Konzentration von 0,1 bis 0,15 %, vorzugsweise 0,1 96, und Kaliumdichromat in einer Menge von 0,25 % einverleibt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Fixieren von Blutplättchen wird durch folgende Beispiele näher erläutert:
Beispiel Zubereitung von plättchenreichem Plasma
Frisches Vollblut wird durch silikonisierte Nadeln JLn Kunststoffspritzen aufgezogen und sofort in ein Polypropylenröhrchen mit 1/6 Volumen ACD-Lösung (2,5 g Natriumeitrat, 1,3 g Zitronensäure, 2,0 g Dextrose, mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt) überführt. Danach wird das Röhrchen verschlossen, umgedreht und 25 min lang bei 66 xg zentrifugiert. Schließlich
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wird das plättchenreiche Plasma durch Absaugen und Übertragen in ein sauberes Polypropylenröhrchen von den sonstigen Blutzellen abgetrennt.
Beispiel
Fixierung der Plättchen:
Verfahren A:
Jeweils 0,5 ml gemäß Beispiel 1 hergestellten plättchenreichen Plasmas wird nach und nach unter schwachem Schütteln mit 50 μΐ einer 2,5#igen Kaiiumdichromatic"sung und 10 μΐ Glutaraldehydlösung, die durch Verdünnen" einer 25%igen Glutaraldehydvorratsiösurig mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 5,0 bis 7,5 % erhalten worden war, versetzt.
Verfahren B:
Jeweils 0,5 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten plättchenreichen Plasmas wird nach und nach unter schwachem Schütteln mit 0,5 ml 0,15 m Natriumchlorid, 150 μΐ einer 2,5#igen Kaliumdichromatlösung und 2 ml einer 4%igen Glutaraldehydlösung, die durch Verdünnen einer 25#igen Vorratslösung mit physiologischer Kochsalzlösung zubereitet worden war, versetzt.
Die Plättchenaggregation wird mittels eines Lichtmikroskops verfolgt. Zu diesem Zweck wird ein Tropfen der Suspension auf einen silikonisierten Glasobjektträger gesetzt, worauf der Aggregationsgrad nach 0-,6-bzw. 15-tägigem Stehenlassen bei Raumtemperatur festgestellt wird.
Wenn die Glutaraldehydkonzentration in Abwesenheit von Kaliumdichromat (Beispiel 1, Weglassen der Dichromatlösung)
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variiert wird, erreicht man optimale Fixierbedingungen bei einer Glutaraldehydkonzentration von 0,1 %. Glutaraldehydkonzentrationen oberhalb oder unterhalb 0,1 % erhöhen deutlich die Plättchenaggregation. Konzentrationen über 0,15 % Glutaraldehyd führen zu einer Gelbildung in dem plättchenreichen Plasma.
Wenn die Glutaraldehydmengen bei 0,25 % Kaliumdichromat enthaltendem, plättchenreichem Plasma variiert werden, zeigen Suspensionen mit 0,1 bis 0,15 % Glutaraldehyd keine Aggregation. Glutaraldehydkonzentrationen von über 0,15 % oder unter 0,10 % führen jedoch zu einer merklichen Plättchenaggregation. Konzentrationen über 0,2 % gelieren das plättchenreiche Plasma.
Obwohl das Aldehyd/Dichromat-Verfahren die Plättchen stabilisiert und eine Aggregation verhindert, lassen sich bereits vier Tage nach der Fixierung bei einer Reihe fixierter Plättchensuspensionen unlösliche fibröse Stränge beobachten. Diese tragen offensichtlich zur Instabilität der Suspensionen bei. Mikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, daß die Plättchen in diesen Strängen eingeschlossen sind oder an diesen haften. Das Anfärben dieser Stränge erfolgt mit Hilfe von Nigrosin, was nahelegt, daß es sich bei den Strängen um proteinartige Massen handelt.
Plättchenreiche Plasmasuspensionen werden gemäß Beispiel 2 30 min bis 3 h lang bei vier verschiedenen Temperaturen von 25° bis 560C fixiert. Die fixierten Plättchen werden zentrifugiert, in einer 7,5%igen Lösung von Humanserum Albumin physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert und mikroskopisch auf ihren Aggregationsgrad hin überwacht. Zu einer Aggregation kommt es bei 3-monatiger Lagerung bei Raumtemperatur.
In Humanserum albuminsuspendierte Plättchen, die durch
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Fixieren bei einer Temperatur von 37°C erhalten wurden, zeigen eine größere Stabilität als Plättchen, die bei 250C, 450C oder 560C fixiert wurden. Eine deutliche Stabilitätserniedrigung ist bei einer Fixierung bei 25° bzw. 560C festzustellen. Die Fixierdauer bei 370C bzw. 450C besitzt keinen merklichen Einfluß auf die Plättchenstabilität. Bei keiner der Plättchensuspensionen in Humanserum Albumin sind fibröse Stränge feststellbar.
Zur Ermittlung, ob fixierte Plättchen durch Resuspendieren in verschiedenen Proteinlösungen stabilisiert werden können, werden Plättchen 1 h lang bei einer Temperatur von 370C stabilisiert. Nach dem Zentrifugieren werden die fixierten Plättchen in defibriniertem Plasma, Normalhumanserum und physiologischen Kochsalzlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (1,25 % bis 7,5 %) Humanserum Albumin resuspendiert.
In der Plättchensuspension in entfibriniertem Plasma lassen sich fibröse Stränge feststellen. Diese sind bei den Plättchenzubereitungen in Normalhumanserum oder Humanserum Albumin nicht feststellbar. Nach 2-wöchiger Lagerung bei Raumtemperatur sind jedoch lediglich die in Humanserum Albumin suspendierten fixierten Plättchen stabil.
Zur Ermittlung, ob die Plättchen durch Resuspend!eren in Nichtproteinlösungen stabilisiert werden können, werden fixierte Plättchen nach dem Zentrifugieren in O bis 20 % Dimethylsulfoxid enthaltenden physiologischen Kochsalzlösungen resuspendiert.
Lediglich bei Dimethylsulfoxidkonzentrationen von 10 bis 20 % sind die Suspensionen fixierter Plättchen nach 7 Wochen noch stabil. Dimethylsulfoxidkonzentrationen unter
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7,5 % führen zu einer erhöhten Plättchenaggregation. Durch Resuspendieren fixierter Plättchen in 20 % Dimethylsulfoxid enthaltenden physiologischen Kochsalzlösungen erhält man Zubereitungen, die mindestens 7 Wochen lang stabil sind.
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Claims (10)

  1. PATENTANSPRÜCHE
    1', Verfahren zur Herstellung einer stabilen Blut plattchensuspension, dadurch gekennzeichnet, daß man eine bestimmte Menge plattchenreichen Plasmas gegebenenfalls nach Zusatz einer bestimmten Menge Chromionen mit einer bestimmten Menge eines organischen Aldehyds versetzt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem plattchenreichen Plasma ein Chromsalz, und zwar Kaliumdichromat zusetzt und als organischen Aldehyd Glutaraldehyd verwendet.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aldehydkonzentration von 0,05 bis 0,20 % und eine Chromsalzkonzentration von 0,2 bis 0,3 Ji einhält.
  4. A. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aldehydkonzentration von 0,1 bis 0,15 # und eine Dichromatkonzentration von 0,25 % einhält.
  5. 5. Stabile Blutplättchensuspension, hergestellt nach einem
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    ORIGINAL INSPECTED
    282882Ü
    oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 3·
  6. 6. Verfahren zur Herstellung einer stabilen Blutplättchensuspension, dadurch gekennzeichnet, daß man ein plättchenreiches Plasma mit einem Chromsalz und die Mischung aus dem Chromsalz und plättchenreichem Plasma mit einem organischen Aldehyd versetzt, die erhaltene Suspension 30 bis 180 min lang bei einer Temperatur von 18° bis 450C reagieren läßt, die fixierten Plättchen entfernt und die Plättchen in mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 0 bis 7f5 % verdünntem Humanserum Albumin mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 7,5 bis 20 % verdünntem Dimethyl sulfoxid oder physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chromsalz Kaliumdichromat und als Aldehyd Glutaraldehyd verwendet.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Resuspendierlösung 20#iges Dimethylsulfoxid oder 1,25-bis 7,5#iges Humanserum Albuein verwendet.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Suspension etwa 60 min lang reagieren läßt.
  10. 10. Blutplättchensuspension, hergestellt nach einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 9t insbesondere nach Anspruch 8.
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