JP4549440B2 - 基準対照血液および製法 - Google Patents
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Description
本発明は、対照血液組成物、その製法および基準品への使用に関する。より詳細には、本発明は、安定化した白血球(WBC)および哺乳類のWBCまたは鳥類または魚類の赤血球の核を含有する基準対照血液懸濁液に関する。さらに詳細には、本発明は、安定化した状態で多角度光散乱特性を保持するように、製造中に全血溶解プロセスにかけてある安定化したWBCを含有する基準対照血液懸濁液に関する。この結果、この安定化した細胞は、多角度光散乱信号にのみに基づいてWBCを識別する血液分析器で使用したときに、全血のWBC信号を模倣する多角度光散乱信号を生成することができる。現在、いくつかの異なる銘柄の自動血液測定機器が市販されている。これらの種々の分析装置では、好中球、リンパ球、単球、好酸球および好塩基球を定量するために種々の検出手法を使用している。使用されている検出手法には、電子インピーダンス、前方光散乱、偏光90°光散乱、吸光、高周波およびそれらの組み合わせがある。光学ベンチ設計が異なると、安定化した対照細胞から得られる光学信号の特性に大きく影響する。これらの測定機器は白血球分類分析(WBC/Diff)に種々の検出法を使用しているため、特定の種類の機器で実施する場合に、全血球細胞と類似した対照細胞特性を得るためには、種々の型のWBC/Diff対照溶液の使用が必要となる。
現在ある種類の機器では、細胞を他の細胞から識別し、決定するために、インピーダンス、インピーダンスと光散乱(必ずしも、多角度光散乱でなくてもよい)、または、光散乱とインピーダンスと高周波信号を使用する必要がある。さらに、これらの現在利用できる血液測定機器では有核赤血球(NRBC)の定量はできない。NRBCは正確なWBC/Diff分析を妨害する。現在利用できる血液測定機器は検体中にNRBCが存在することを「知らせる」だけである。しかし、まもなく発売されるAbbott Cell-Dyn(R) 4000血液分析器システムでは、WBC/DiffとNRBCの同時全血分析が実施できるであろう。Cell-Dyn(R)の測定機器は、WBCとNRBCとを識別するために蛍光を適宜使用することを含めて、多角度光散乱のみを使用して同時に全血を分析する。そのため、WBC/DiffとNRBCを分析するための新しい対照血液の開発が必要となった。この新しい基準対照の対照細胞は、それらが模倣すると思われる全血検体の細胞の多角度光散乱能を全て有している必要がある。
現在、当業界には、現在の種類の分析器、すなわち、多角度光散乱によるWBC/Diff分析のみを実施するのではない分析器用の基準対照血液を製造するための方法および試薬系を記載している特許がいくつかある。本出願人らは、WBCおよびNRBCの多角度光散乱分析用の基準対照血液の製造および使用のための方法および試薬系について記載したものはまったく知らない。
Coulter Instrument社に譲渡されたCarver他の米国特許第4704364号はヒト白血球の主要三成分を模倣した三成分系の製造法を開示している。しかし、これらの擬似細胞はインピーダンスによる検出系で検出されるが、多角度光散乱検出系では検出されない。Carver他は、ヒト顆粒球を模倣するためにテンジクザメ由来の固定化赤血球(RBC)を、ヒト単核細胞を模倣するためにシチメンチョウ由来の固定化RBCを、ヒトリンパ球を模倣するために固定化ヒトRBCを使用している。白血球の三つの成分は大きさ(インピーダンス)によってのみ識別され、光学特性では識別されないため、Carver他の教示により製造した対照血液は、三成分についてのWBC/Diffの電子インピーダンスによる測定にのみ有用である。
Carver他の方法で製造したこれらの三つの成分は、ヒトWBCと類似の細胞表面構造や、実質的にヒトWBCと等しい細胞質顆粒度(cytoplasmic granularity)を有していない。従って、この三成分は多角度光散乱に基づく系の基準対照としては使用できない。本出願人らは、まもなく市販されるCell-Dyn(R) 4000分析器でこれらの擬似細胞を調べ、Carver他の対照中の模倣されたWBCの光散乱特性が、正常な血液検体とは非常に異なる多角度光散乱信号を発生させることを見出した。第1a図〜第1c図は正常血についてCell-Dyn(R) 4000血液分析器で得られたドットプロットを再現したものである。
以下の図面で軸を表示するために使用する略号を示す。
第4a図〜第4c図は、Coulter社の製品4C(R) Plus Cell対照で具体化されたCarver他の擬似WBC対照について、Cell-Dyn(R) 4000分析器で得られた結果を示している。第4a図〜第4c図から判るように、これらのクラスタは同定できない。
Ryanの米国特許第5270208号は、WBC/Diff分析のための基準対照血液を製造する別の方法を開示している。Ryanの方法では、アルデヒドで固定したヒトWBCを、全血から得られるものと実質的に同様のWBC特徴プロフィールを与える混合物を提供するのに十分な量のリポタンパク質を含む等張水性媒質に懸濁する。Ryanはクレームを支持するために、横軸をDF1とし、縦軸を容積として、Coulter社のSTK−S(R)分析器のドットプロットでWBCの分布を示した。RyanのWBC調製物は、Streck LaboratoriesからPARA 12(R)(低、正常、高)三レベル血液学対照という名前で市販されていると考えられる。本出願人はこの市販の物質について、多角度光散乱(軸方向の光の消失、多次元光散乱および蛍光)によりWBC/DiffとNRBCを同時に分析するCell-Dyn(R) 4000分析器で調べた。この結果(第5a図〜第5c図参照)から、Ryanの調製物のWBC成分は全血から得られたものと有意に異なる光散乱特性を示すことが明らかとなった。第5a図〜第5c図から明らかなように、この製品の好中球成分は全血のものに比べ軸方向の光の消失および偏光側の散乱信号が非常に少なく、好中球からの偏光解消光側の散乱信号が大きすぎるため好酸球から分離されず、単球クラスタは好中球クラスタからまったく分離されず、リンパ球成分は全血に比べ非常に大きな中間角度の散乱(7°)信号を生じ、その結果、好塩基球の領域と重なり、この領域がなくなってしまう。
Young他の米国特許第5320964号は白血球類似体を製造するための方法および試薬組成物を開示している。Young他のリンパ球類似体は低張リン酸塩緩衝溶液(15〜25mOsm/kg)中で固定したアヒルRBCから調製し、単球類似体は低張緩衝溶液(15〜25mOsm/kg)中で固定したワニRBCから調製し、好酸球類似体も低張緩衝溶液(75〜85mOsm/kg)中で固定したワニRBCから調製し、好中球類似体は低張緩衝溶液(45〜65mOsm/kg)中で固定したワニRBCから調製している。アヒルのRBCとワニのRBCはいずれも楕円形で、有核であり、滑らかな細胞表面を有している。Young他は、かれらの手法で調製した固定細胞は、各々がヒト白血球の物理特性を少なくとも二つ有している少なくとも二つの異なるヒト白血球を模倣すると主張している。これらの特性は、(a)直流電流で測定される容積、(b)高周波(RF)サイズ、(c)不透明性、(d)光散乱から選択される。光散乱の種類を特定していないが、Young他のアヒルおよびワニのRBCから調製した擬似WBC成分は細胞表面構造および細胞質の顆粒度については、哺乳類のWBCと同じ特性は有していない。従って、これらの細胞は、ヒト全血WBCと実質的に等しいまたは類似の偏光および偏光解消光90°光散乱の多角度光散乱信号と軸方向の光の消失の信号は発生しない。従って、Young他の製品は多角度光散乱、軸方向の光の消失および蛍光信号を使用する、Cell-Dyn(R) 4000分析器などの高度な血液機器で、WBC/DiffおよびNRBCの定量のための標準対照血液として使用することはできない。実際、Young他の細胞を低張緩衝溶液で固定すると、次の二つ、すなわち、溶液の浸透圧が非常に低い(5〜25mOsm/kg)場合、細胞の細胞質が溶解する、あるいは、浸透圧が約85mOsm/kgの場合、細胞容積が大きくなる、のいずれかになる。
第18a図〜第18d図は、対照細胞として固定したワニのRBCを含む対照細胞溶液を多パラメータの光散乱に基づいて分析した結果を示している。図から明らかなように、固定したワニのRBCは検出可能なPSS信号を発生せず、IAS信号はリンパ球領域と好塩基球領域の間にあり、ALL信号が低すぎるため好中球および好酸球のいずれとしても計測されない。
第6a図〜第6c図は、別の市販の対照である、R&D Systems社のCBC−3kTM対照血液についての結果を示している。CBC−3kTMの製品が特許査定されているかどうかは判らない。図に示すように、クラスタは同定できない。
発明の概要
本発明のこれらの特徴およびその他の特徴ならびに利点は以下の本発明の好適実施形態の説明から明らかとなろう。
本発明の一つの目的は、多次元光散乱WBC/Diff分析を使用するAbbott Laboratories Cell-Dyn(R) 3000機器などの自動血液測定機器の基準対照血液を提供することである。
本発明の別の目的は、WBC/DiffとNRBCを同時に分析するために、多次元光散乱、軸方向の光の消失および蛍光を利用するAbbott Laboratories Cell-Dyn(R) 4000機器などの自動血液学的システムの基準対照血液を提供することである。
本発明の別の目的は、WBC/DiffおよびNRBCを同時に分析するために、多次元光散乱、軸方向の光の消失および蛍光を使用するAbbott Laboratories Cell-Dyn(R) 4000機器などの自動血液測定システムで使用できる、安定化したRBC、血小板、好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球およびNRBC成分を含有する安定な基準対照血液を提供することである。
広範には、本発明は、安定なWBCおよびNRBC成分およびこれらの成分を一つまたは複数含有する基準対照血液溶液の製造方法に関する。この方法では、ヒト全血細胞の電子光学信号と類似の信号を発生する、しっかりと固定し、安定化したWBCおよび擬似NRBCが製造され、その結果、新鮮なヒト血液検体用の分析器で使用するものと同じアルゴリズムを使用する完全なWBC/Diff/NRBC分析が可能となる。本発明方法で製造される固定したWBCおよび擬似NRBCはクランプを含まず、適当な血漿様媒質中で冷蔵下、長期にわたり安定であり、多パラメータ光散乱を使用する機器などの日常的な臨床血液学測定機器のWBC/Diff/NRBC用の対照血液として使用できる。これらの利点は従来技術に対する実質的な改良に相当する。
【図面の簡単な説明】
本発明およびその利点をより完全に理解するために、添付図面と共に以下の説明を参照する。
第1a図〜第1c図は、多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のWBCサイトグラムである。
第2a図〜第2c図は、1.78k/μLのNRBCを含有する臨床検体について多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBC/NRBCサイトグラムである。
第3a図〜第3c図は、40.4K/μLのNRBCを含有する臨床検体について多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBC/NRBCサイトグラムである。
第4a図〜第4c図は、Coulter(R) 4C(R) Plus Cell Controlについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第5a図〜第5c図は、正常レベルのStreck LaboratoriesのPARA 12(R) Multi-Parameter Hematology Controlについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第6a図〜第6c図は、R&D SystemのCBC-3KTM Hematology Controlについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第7a図〜第7c図は、本発明の基準対照血液について多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第8a図〜第8c図は、本発明方法で製造したマスの固定赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第9a図〜第9c図は、第8a図〜第8c図のマスの固定赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第10a図〜第10c図は、本発明方法で製造したニワトリの固定赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第11a図〜第11c図は、第10a図〜第10c図のニワトリの固定赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第12a図〜第12c図は、本発明方法で製造したシチメンチョウの固定赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第13a図〜第13c図は、第12a図〜第12c図のシチメンチョウの固定赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第14a図〜第14c図は、本発明方法で製造したブタの固定リンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第15a図〜第15c図は、本発明方法で製造したウシの固定WBCの多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第16a図〜第16c図は、すべての操作を本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシWBCについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第17a図〜第17d図は、本発明方法で製造した固定したウシのWBCについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたWBCサイトグラムである。
第18a図〜第18d図は、対照細胞として固定したワニのRBCを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたWBCサイトグラムである。
発明の詳細な説明
細胞を検出し、分類するための自動システムではいずれも、そのシステムが適切に作動していることを確認するために基準対照の使用が必要である。これはどんな検出システムを使用した場合にもいえる。
新しい検出方式、主として検体中のWBCのサブポピュレーションおよびNRBCを分類し、識別するために多角度/パラメータ光散乱信号のみを使用する(他のすべての非光信号を除く)検出方式が出現したため、新しい対照が必要となった。当業界の現在の基準対照はこのような多パラメータシステムで適切に機能しない。
本発明者らは、現在の対照が、多角度光散乱に基づく血液分析器で機能しない理由を発見し、機能する対照を製造する方法を考案した。本発明の対照は多パラメータ光散乱に基づくシステムで機能するだけではなく、他の検出法に基づくシステムでも機能するはずである。これは、新しい対照の細胞が、処理しただけの血液検体中で認められる細胞と同じであるためである。従って、新しい対照の細胞はそれらの細胞の光散乱特性を保持している。
本発明の基準対照懸濁液の細胞性成分は、多パラメータ光散乱に基づく検出システムにかけると、全血検体中のWBCまたはNRBCの多パラメータ光散乱特性を実質的に模倣する。
本発明では、多パラメータ、多角度または多次元光散乱とは、検体の細胞を測定または分類するために、偏光および偏光解消光90°光散乱および軸方向の光の消失の信号およびこれらを組み合わせたもののみ(すなわち、非の付くものを除く)を使用することを含む。この測定には、その他の光ベースではない信号は使用できない。蛍光などのその他の種類の光信号も使用できるが、インピーダンスおよびその他の光ベースではない信号は使用できない。しかし、例えば、光ベースではない信号、または光散乱とインピーダンスとの組み合わせを使用する機器にも本発明の対照は役立つが、現在のところ、多角度光散乱に基づく測定機器には、利用できるこのような対照がないため、最も恩恵を受けるのはこのような機器であろう。
本発明の対照懸濁液のWBC成分は、(血液検体を分析する分析器内における環境と同様な)非常に緩和な溶解環境におかれ、次いで固定された、血液由来のWBCである。NRBC成分についても同様であり、核を溶解環境に露出し、固定してその細胞特性を保持する。しかし、NRBC成分については、哺乳類の有核赤血球は遊離した核の源として使用できる唯一の細胞ではない。鳥類または魚類の赤血球もこの画分に使用できる。
対照細胞が検体細胞の光散乱特性を模倣することができるのは、先ず、細胞組成(すなわち光散乱特性)により細胞を選択したためである。最初に緩和な溶解環境においてRBCを溶解し、所望の細胞特性が失われる前に、残存するWBCおよびNRBCの核を固定させることにより、対照細胞のこれらの細胞成分が製造プロセス中保存される。この製造プロセスは、「本当の」血球が分析器の内部を通過する際におかれる環境を模倣している。対照細胞は「固定」されているため、分析器を通過するときに溶解環境の影響はそれほど受けず、その結果、所望の特性を保持する。さらに、固定した細胞は対照溶液中で安定であるが、全血細胞は安定ではない。しかし、細胞の光散乱特性を主として決定する屈折率が実質的に同じとなるようにするには、検体中の血球が分析器中でおかれる溶解環境と同じまたは同様の環境に対照細胞をおく必要があると考えられている。このように、対照細胞はその機器によって「機器で溶解した」検体の細胞とみなされ、そのように記録される。
また、本発明の同じ細胞成分は、溶解環境におかれる前に「固定される」と、多角度光散乱に基づくシステムで満足に機能しないことも判明した。これらの細胞は「固定される」前に、溶解環境におく必要がある。その後、これらの細胞が分析中で対照細胞として処理されると、これらの処理された細胞は分析器によって当該の血球と「みなされる」。これは、多パラメータ光散乱に基づく分析器が、分析器の内部処理環境で全血細胞を認識するようにしかプログラムされていないためである。従って、基準の対照細胞または細胞成分が適当な細胞特性を保持しており、その結果、全血と実質的に同様に反応または行動(光および/または蛍光を散乱)しない限り、分析器によって異なる細胞であるまたは完全に認識できないと「みなされる」。
従って、本発明の主な方法では、基準対照を製造するプロセス中、「固定化」の前に、細胞または細胞成分を、基準対照として使用されるときに分析器内で遭遇するであろう溶解環境におく。
以下の実施例では、次の試薬を使用した。
溶解試薬:
約0.75M〜約1.10Mの塩化アンモニウム(NH4Cl)
約0.1M〜約0.4Mのホルムアルデヒド(HCHO)
約10mM〜約25mMの酢酸ナトリウム(CH3COONa)
約10mM〜約25mMの重炭酸カリウム(KHCO3)
約50mg/L〜約250mg/Lのサポニン
約0.2g/L〜約0.4g/LのProclin 300
WBC−Cyto−Lyse:
約2.5g/L〜約5.0g/Lのマレイン酸、コハク酸またはフタル酸
約10.0g/Lから約30.0g/LのBrij 35、Tween 20またはTriton X−100
固定液:
約3.0g/Lから約5.0g/Lのリン酸一ナトリウム
約6.0g/Lから約7.0g/Lのリン酸二ナトリウム
約100ml/Lから約200ml/Lのホルマリン(37〜40%のホルムアルデヒド溶液)
第2a図〜第2c図および第3a図〜第3c図は各々、NRBCを1.78k/mLおよび40.4k/mL含む臨床血液検体についてAbbott Laboratories Cell-Dyn(R) 4000多パラメータ光散乱に基づくシステムで得られたWBC/NRBC分布のサイトグラムである。これらの図面は、本明細書の図面中に記載され、示された種々の方法で製造される対照または細胞との比較の目的で示している。
本発明の鳥類、魚類および哺乳類の固定したWBCおよび細胞の核は挿入物であるため、任意の緩衝食塩水に再懸濁でき、緩衝食塩水はクランピングを防止するなんらかのタンパク質を含んでいてもよい。しかし、これらの固定した細胞は、全域対応型対照血液を製造するためには、固定していないが、安定化したRBCと合わせる必要があり、細胞再懸濁媒質は安定化したRBCを溶解から保護できなければならない。下記の処方は、本発明の対照細胞と共に良好に使用できることが判っている再懸濁用媒質の例である。この処方は、固定したWBCおよび核のクランピングを防ぎ、対照溶液中のRBC成分を溶解から保護する血漿様細胞再懸濁液である。
血漿様細胞再懸濁用媒質(CRSM):
本発明方法で製造した対照血液を、多次元光散乱、軸方向の光の消失および蛍光によりWBC/Diff/NRBCを分析するCell-Dyn(R) 4000血液測定機器で使用すると、試薬と共にシステムの性能を毎日モニターできる。Cell-Dyn(R) 4000システムでこの製品を使用して結果の質をモニターできるパラメータは以下の通りである。
実施例1:
この実施例では、上記の溶解試薬および固定液を使用する。以下の手順で、安定で、クランプを含まない、固定したヒトWBCを調製する。この実施例の固定したヒトWBCについてCell-Dyn(R) 4000血液測定機器で得られたWBCのサイトグラムの例を第7a図〜第7c図に示す。
1.ヒトのバフィコート層1部を(予め42℃に温めた)溶解試薬5部と混合した。直ちに、緩和に渦状に回転させて、成分を混合し、室温に50秒間放置して、RBCを完全に溶解させた。
2.ステップ1で溶解したWBC懸濁液1部を固定液10部と混合し、直ちに60℃〜70℃の水浴に入れ、ゆっくりと混合することにより10分間固定させた。
3.固定させた細胞の懸濁液を室温に冷却し、10℃で、2,500rpmで5分間遠心して、固定液を除去し、中性pHの等張リン酸塩緩衝食塩水(PBS)を使用して、同じ遠心速度で3回洗浄した後、CRSMに再懸濁させた。
4.最終生成物のアリコートをCell-Dyn(R) 4000血液測定機器にかけて、WBC数および分布を調べた。
5.固定した細胞の濃度を、正常レベルの対照については、最終濃度が再懸濁用媒質中約7,500/μLとなるよう調整した。
実施例2:
実施例1に使用したものと同じ溶解試薬および固定試薬を使用したが、RBCの溶解およびWBCの固定を下記プロトコールに従って実施した。
1.ヒトのバフィコート層1部を溶解試薬溶液5部と共に緩和に渦状に回転させて、直ちに混合させ、室温に10分間放置して、RBCを完全に溶解させた。
2.ステップ1で溶解したWBC懸濁液1部を固定液10部と合わせ、混合し、室温で2〜3時間固定した。
3.固定した細胞の懸濁液を10℃、2,500rpmで5分間遠心して、固定液を除去し、中性pHのリン酸塩緩衝食塩水(PBS)を使用して、同じ遠心速度で3回洗浄し、CRSMに再懸濁した。
4.最終生成物のアリコートをCell-Dyn(R) 4000血液測定機器にかけて、WBC数および分布を調べた。
5.固定した細胞の濃度を、低濃度の対照については、最終濃度が約2,000/μLとなるように調整した。
実施例3:
次のプロトコールおよびCell-Dyn(R) 4000血液測定機器の例示に従ってシチメンチョウの赤血球からNRBC画分を調製した。固定したシチメンチョウの赤血球の核、および固定したシチメンチョウの赤血球の核でスパイクした正常ヒトのNRBCサイトグラムを各々第12a図〜第12e図および第13a図〜第13c図に示す。
A.材料:
1.シチメンチョウ全血
2.溶解試薬:実施例1に記載の通り
3.固定液:w/デキストロース:リン酸一ナトリウム 4グラム/L、リン酸二ナトリウム 6.5グラム/L、ホルマリン 150ml/L、デキストロース 100g/L、pH約6.8
4.細胞洗浄液:リン酸塩緩衝食塩水(PBS)
5.CRSM:上記と同じCRSM
B.シチメンチョウ赤血球核固定用プロトコール:
1.溶解試薬のアリコート10mlを37℃まで加温する。
2.シチメンチョウ全血を3000rpmで10分間遠心して、血漿層を分離し、バフィコート層を除去する。濃縮赤血球層に血漿を戻し、混合する。
3.予熱した溶解試薬溶液にRBC層1.0mlを加え、蓋をして、直ちに3回上下混合する。全速で約10秒間渦状に回転させ、RBCの細胞質の溶解を促進する。約10分間または細胞質の溶解が完了するまで室温に放置する。細胞質が完全に溶解していることを顕微鏡下で確認する。
4.2000rpmで15分間遠心し、細胞ペレットを再懸濁するのに調度十分な量を残して、上清をすべてサイホンで除去する。細胞クランプが見えなくなるまで緩和に攪拌して細胞を再懸濁する。
5.ステップ4と同じ遠心条件でPBSを使用して、細胞を3回洗う。
6.固定液10mlを加え、混合し、直ちに60℃の水浴に入れ、細胞のクランピングを防ぐために撹拌を続けながら、少なくとも5分間固定させる。
7.細胞懸濁液を室温に30分または一晩放置する。
8.混合し、ステップ4および5を2回繰り返す。
9.固定した核をCRSMに再懸濁する。
10.Cell-Dyn(R) 4000血液測定機器にかけて、FL3+の核の濃度とクラスタの位置を測定する。
実施例4:
実施例3に記載したものと同じ試薬およびプロトコールを使用して、マスの赤血球からNRBC画分を調製した。固定したマスの赤血球の核、および固定したマスの赤血球の核でスパイクした正常な全血をCell-Dyn(R) 4000血液測定機器にかけて得られたNRBCサイトグラムの例を第8a図〜第8c図および第9a図〜第9c図に示す。
実施例5:
下記の材料および方法によりブタのリンパ球からNRBC画分を調製し、固定したブタのリンパ球の核をCell-Dyn(R) 4000血液測定機器にかけて得られたNRBCサイトグラムの例を第14a図〜第14c図に示す。
A.材料:
ブタのバフィコート層(血小板を既に除去したもの)
Cyto-Lyse:
Brij 35:15.0g/L
フタル酸:5.5g/L
溶解試薬:実施例1と同様
固定液:実施例1と同様
リン酸緩衝食塩水(PBS)
B.手順:
1.ブタのリンパ球高含有層1部を溶解試薬5部で希釈し、室温に5分間放置して、細胞懸濁液に残っているRBCの溶解を完了させる。
2.細胞懸濁液を3000rpmで3回遠心し、上清を注ぎ出し、細胞ペレットを取り出す。
3.この細胞をCyto−Lyseと1対10の比で混合し、室温に2時間放置する。
4.核をCyto−Lyseに再懸濁し、3000rpmで3分間回転させ、上清を注ぎ出す。
5.核を少なくとも2倍容の固定液に再懸濁し、混合する。
6.60℃で10分間(または室温で4時間)固定し、室温に冷却する。
7.核を3000rpmで3分間回転させ、上清を注ぎ出す。
8.細胞ペレットをPBSに再懸濁し、核を3回洗浄する。
9.核をCRSMに再懸濁する。
実施例6:
ウシのWBCを実施例1に記載のプロトコールで固定し、実施例4に記載の手順に従って調製した固定したブタの核と混合する。固定したウシのWBCのみ、およびブタのリンパ球核と混合した固定したウシのWBCについてCell-Dyn(R) 4000血液測定機器で得られたWBCチャネルサイトグラムの例を第15a図〜第15c図および第16a図〜第16f図に示す。
実施例7:
実施例3に記載のプロトコールに従ってニワトリの赤血球からNRBC画分を調製し、固定したニワトリの赤血球核および固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常なヒトの全血についてCell-Dyn(R) 4000血液測定機器で得られたNRBCサイトグラムの例を第10a図〜第10c図および第11a図〜第11c図に示す。
本発明の方法で製造した血液対照は、Cell-Dyn(R) 3000または3500血液測定機器にかけて次のパラメータをモニターするのに使用できる。上記機器は光散乱およびインピーダンス信号の両者を使用して、次のWBC/Diffパラメータを追跡できる。
第17a図〜第17d図は、本発明方法で製造した、固定したウシWBCについて、光散乱パラメータ(軸方向の光の消失または蛍光ではない)を使用してWBC/Diff分析を実施し、インピーダンスを使用してRBCおよび血小板を測定するCell-Dyn(R) 3500分析機器で得たWBCサイトグラムである。この図では、WBC画分は固定した血小板、および安定化したが固定していないRBCと合わせて、全域対応型対照懸濁液を製造した。
Claims (24)
- 多角度光散乱に基づく血液学的分析器において対照血液懸濁液として使用するための、ヒト白血球(WBC)画分を含む組成物であって、前記ヒトWBCが、
a.ヒトの全血またはバフィコート層を提供するステップと、
b.全血またはバフィコート層と溶解試薬とを混合して、赤血球を溶解するステップであって、全血またはバフィコート層と溶解試薬の比が1:5であるステップと、
c.ステップbで溶解処理したWBC懸濁液を固定液と混合し、インキュベートしてWBCを固定するステップであって、WBC懸濁液と固定液との比が1:10であるステップと、
d.ステップcの混合物から固定WBCを沈殿させるステップと、
e.ステップdで形成された上清を捨て、得られた固定WBCを再懸濁用媒質に再懸濁するステップとを含む方法によって得られ、
前記WBC画分のWBCサブポピュレーションが多角度光散乱に基づく血液学的分析器の使用によってのみ識別される、前記組成物。 - ステップbにおいて、全血またはバフィコート層と溶解試薬との混合物を室温に10分間放置する、請求項1に記載の組成物。
- ステップbにおいて、溶解試薬を予め42℃に温めておき、全血またはバフィコート層と溶解試薬との混合物を室温に50秒間放置する、請求項1に記載の組成物。
- ステップcにおけるインキュベートの温度および時間が、60〜70℃および10分間である、請求項1に記載の組成物。
- ステップdにおいて、沈殿の前にステップcの混合物を室温まで冷却する、請求項1に記載の組成物。
- 多角度光散乱に基づく血液学的分析器において対照血液懸濁液として使用するための、哺乳類白血球(WBC)画分を含む組成物であって、前記哺乳類WBCが、
a.哺乳類の全血またはバフィコート層を提供するステップと、
b.全血またはバフィコート層と溶解試薬とを混合して、赤血球を溶解するステップであって、全血またはバフィコート層と溶解試薬の比が1:5であるステップと、
c.ステップbで溶解処理したWBC懸濁液を固定液と混合し、インキュベートしてWBCを固定するステップであって、WBC懸濁液と固定液との比が1:10であるステップと、
d.ステップcの混合物から固定WBCを沈殿させるステップと、
e.ステップdで形成された上清を捨て、得られた固定WBCを再懸濁用媒質に再懸濁するステップとを含む方法によって得られる、前記組成物。 - ステップbにおいて、全血またはバフィコート層と溶解試薬との混合物を室温に10分間放置する、請求項6に記載の組成物。
- ステップbにおいて、溶解試薬を予め42℃に温めておき、全血またはバフィコート層と溶解試薬との混合物を室温に50秒間放置する、請求項6に記載の組成物。
- ステップcにおけるインキュベートの温度および時間が、60〜70℃および10分間である、請求項6に記載の組成物。
- ステップdにおいて、沈殿の前にステップcの混合物を室温まで冷却する、請求項6に記載の組成物組成物。
- さらに有核赤血球(NRBC)画分を含む、請求項1または6に記載の組成物であって、
前記NRBC画分の細胞が鳥類の赤血球または魚類の赤血球から調製され
前記NRBC画分の細胞が、
a.鳥類または魚類の全血または赤血球層を提供するステップ、
b.全血または赤血球層と溶解試薬を合わせて細胞懸濁液を形成するステップと、
c.ステップbの細胞懸濁液を固定液とインキュベートして赤血球の核を固定するステップであって、細胞懸濁液と固定液との比が1:8〜1:11であるステップと、
d.ステップcの混合物から固定された赤血球の核を沈殿させ、形成された上清を捨てる洗浄ステップと、
e.固定・洗浄した赤血球の核を、再懸濁要媒質に再懸濁するステップと
を含む方法によって得られる、前記組成物。 - ステップcにおけるインキュベートの温度および時間が60〜70℃および少なくとも5分間である、請求項11に記載の組成物。
- ステップdにおいて、沈殿の前にステップcの混合物を室温まで冷却する、請求項11に記載の組成物。
- さらに有核赤血球(NRBC)模倣画分を含む、請求項1または6に記載の組成物であって、
前記NRBC模倣画分が哺乳類のリンパ球から調製され、
前記NRBC模倣画分が、
a.哺乳類のリンパ球を提供するステップと、
b.ステップaのリンパ球と溶解試薬とを混合して、残存赤血球を除去するステップと、
c.ステップbで得られたリンパ球とCyto−Lyseとを混合するステップであって、ステップbで得られたリンパ球とCyto−Lyseとの比が1:10であるステップと、
d.ステップcで得られたリンパ球の核をCyto−Lyseに再懸濁して、リンパ球の核を沈殿させるステップと、
e.ステップdで得られたリンパ球の核と固定液とを混合するステップであって、核懸濁液と固定液の比が1:1〜1:10であるステップと、
f.ステップeの混合物をインキュベートして、リンパ球の核を固定・安定化するステップと、
g.ステップfで得られた固定・安定化したリンパ球の核を沈殿し、形成された上清を捨てる洗浄ステップと、
h.ステップgの固定・洗浄したリンパ球の核を再懸濁用媒質に再懸濁するステップと
を含む方法によって得られる、前記組成物。 - ステップbにおけるリンパ球層と溶解試薬との比が1:5〜1:30であり、混合物を5分間〜3時間おく、請求項14に記載の組成物。
- ステップcにおいて、リンパ球とCyto−Lyseとの混合物を室温で2時間放置する、請求項14に記載の組成物。
- ステップfのインキュベートの温度および時間が、60℃および10分間である、請求項14に記載の組成物。
- 赤血球(RBC)画分と血小板(PLT)画分をさらに含む、請求項1または6に記載の組成物。
- 請求項11に記載の有核赤血球(NRBC)画分または請求項14に記載の有核赤血球(NRBC)模倣画分をさらに含む、請求項18に記載の組成物。
- 対照血液懸濁液の白血球(WBC)画分を製造する方法であって、
a.哺乳類の全血またはバフィコート層を提供するステップと、
b.全血またはバフィコート層と予め42℃で温めたまたは温めない溶解試薬とを混合して、存在する赤血球を除去するステップであって、全血またはバフィコート層と溶解試薬の比が1:5の割合であるステップと、
c.ステップbの溶解処理後のWBC懸濁液を固定液と合わせてインキュベートして、WBCを固定し、安定化させるステップであって、WBC懸濁液と固定液の比が1:10の割合であるステップと、
d.ステップcの混合物から固定化されたWBCを沈殿させるステップと、
e.ステップdで形成された上清を捨て、得られた固定WBCを、洗浄するステップと、
f.固定し、洗浄したWBCを、再懸濁用媒質に再懸濁するステップとを含む方法。 - 前記溶解試薬を予め42℃で温めた場合には、全血またはバフィコート層を混合して室温に50秒放置する、請求項20に記載の組成物。
- 前記溶解試薬を予め温めない場合には、全血またはバフィコート層を混合して室温に10分間放置する、請求項20に記載の組成物。
- ステップcにおけるインキュベートの温度と時間が60℃〜70℃および10分間である、請求項20に記載の組成物。
- ステップdにおいて、沈殿の前にステップcの混合物を室温まで冷却する、請求項20に記載の組成物。
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