CN102109430B - 有核红细胞模拟粒子，血液质控物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明一方面提供了一种有核红细胞模拟粒子，该粒子为结合了荧光染色抑制剂的白细胞，该抑制剂与细胞内的细胞核或核酸稳定结合，从而降低该粒子在检测时与荧光染料的结合能力。本发明另一方面提供了一种有核红细胞模拟粒子的制备方法，所述方法步骤包括以下步骤：(a)获得洗涤纯化后的白细胞；(b)将白细胞悬浮于含有荧光染色抑制剂的细胞处理液中，所述抑制剂与细胞内的细胞核或核酸稳定结合；(c)对所得产物进行洗涤。本发明还提供一种含有有核红细胞模拟粒子的血液质控物。本发明还提供了有核红细胞模拟粒子及其血液质控物在血液细胞分析仪质控中的用途。

Description

有核红细胞模拟粒子,血液质控物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及血液分析质控物。具体地讲，本发明涉及有核红细胞模拟粒子，包含所述有核红细胞模拟粒子的血液质控物，以及它们的制备方法，和所述有核红细胞模拟粒子和质控物在以荧光-散射光法为检测原理的血液细胞分析仪质量控制上的用途。
背景技术
人类正常成熟红细胞不含有细胞核。但在特殊情况，包括某些病理情况下，人类外周血中会出现有核红细胞(nucleated red bloodcell，NRBC，也称为erythroblast)，即一种幼稚的红细胞。对有核红细胞的检测可以为某些疾病的诊断提供依据。部分高端血液细胞分析仪配备有核红细胞检测功能，其检测原理包括：阻抗法、荧光-散射法等。
对配备有核红细胞检测功能的血液细胞分析仪进行质量控制，需要使用含有有核红细胞模拟粒子的质控物。在有核红细胞模拟粒子的制备方面，已有一些公开的技术方案。
美国专利US7176031和US6962817公开了使用人工合成粒子模拟人有核红细胞的方法。这种方法的缺陷在于合成粒子的生产工艺复杂，成本较高。美国专利US7354767公开了使用普通哺乳动物红细胞(不含细胞核)制备有核红细胞模拟粒子的方法。这种方法制备的模拟粒子与人有核红细胞的细胞核大小接近，适用于采用阻抗法检测有核红细胞的血液细胞分析仪。但这种模拟粒子不含细胞核，不适于模拟人有核红细胞被特定荧光染料染色后的荧光特性。美国专利US7195919公开的技术方案通过在红细胞表面连接生物大分子(如：核酸、肽链等)，使其能够模拟人有核红细胞的荧光特性。这种方法的不足之处在于工艺复杂，且作为原料的生物大分子成本较高。
美国专利US6723563和US6653137提出用鸟类(如火鸡或鸡)、爬行类(如短吻鳄)或鱼类(如鲑鱼)的红细胞为原料制备有核红细胞模拟粒子。美国专利US6406915、US6403377、US6399388、US6221668和US6200500公开了使用火鸡红细胞制备有核红细胞模拟粒子的方法。美国专利US6448085公开了使用鸡红细胞制备有核红细胞模拟粒子的方法。美国专利US6187590和US5858790公开了使用火鸡、鸡和鲑鳟类鱼的红细胞制备有核红细胞模拟粒子的方法。美国专利US7285417、US7135341和US7198953公开了使用短吻鳄红细胞制备有核红细胞模拟粒子的方法。这些技术方案的共同点是：使用带有细胞核的动物红细胞，包括鸟类、爬行类和鱼类的红细胞模拟人有核红细胞。这种方法的不足之处在于，绝大多数鸟类、爬行类和鱼类的红细胞呈椭圆形，与近圆形的人类有核红细胞形态差异较大。因此在某些情况下，这些动物有核红细胞并不能很好的模拟人有核红细胞的特征。例如，运用流式细胞术对细胞进行检测时，椭圆形细胞通过流动室方向不一致，因而产生大小差异很大的前向散射光信号，而圆形或近圆形细胞则不会出现这种状况。
因此，本领域需要采用简单、经济的方法获得的更好模拟效果的有核红细胞模拟粒子，特别是适用于荧光-散射光法为检测原理的细胞血液分析仪质量控制的有核红细胞模拟粒子。
发明内容
本发明一方面提供了一种有核红细胞模拟粒子，所述粒子为结合了荧光染色抑制剂的白细胞或白细胞亚群，所述抑制剂与细胞的细胞核或核酸稳定结合，降低所述粒子在检测时与荧光染料的结合能力。
所述荧光染色抑制剂选自：
非荧光的染料，
荧光量子产率比检测用荧光染料的荧光量子产率低的荧光染料，
荧光光谱与检测用荧光染料的荧光光谱差别大的荧光染料，和
能与核苷结合的化合物。
本发明另一方面提供了一种血液质控物，所述质控物包含本发明所提供的有核红细胞模拟粒子。
本发明又一方面提供了一种有核红细胞模拟粒子的制备方法，所述方法包括，
富集含有白细胞的血液中的白细胞或白细胞亚群，
将得到的白细胞或白细胞亚群悬浮于含有荧光染色抑制剂的细胞处理液中，所述抑制剂与细胞的细胞核或核酸稳定结合，
对所得产物进行洗涤。
所述荧光染色抑制剂选自非荧光染料、荧光量子产率比检测用荧光染料的荧光量子产率低的荧光染料、荧光光谱与检测用荧光染料的荧光光谱差别大的荧光染料和能与核苷结合的化合物。
本发明还一方面提供了一种血液质控物的制备方法，将本发明所提供的有核红细胞模拟粒子与其他血液细胞模拟物，如白细胞、红细胞、血小板等的一种或几种混合与细胞保存液中。
本发明再一方面涉及有核红细胞模拟粒子和质控物在血液细胞分析仪质量控制中的应用。
还涉及了本发明所提供的荧光染色抑制剂在制备有核红细胞模拟粒子中的应用。
本发明所公开的方法采用白细胞或白细胞亚群经荧光染色抑制剂处理后模拟有核红细胞，更好地模拟人有核红细胞的特征，且不必使用核酸或类似生物多聚物，步骤简单，成本低廉，可方便地实现血液质控物的工业化生产。
附图说明
图1是含有有核红细胞的临床血样的散点图(仅提供有核红细胞通道)，图中横轴表示侧向荧光强度，纵轴表示前向散射光强度。
图2是实施例1中未经染色的白细胞散点图(仅提供有核红细胞通道)，A为白细胞区域。图中横轴表示侧向荧光强度，纵轴表示前向散射光强度。
图3是实施例1中经甲苯胺蓝O染色的白细胞散点图(仅提供有核红细胞通道)，A为白细胞区域，B为有核红细胞区域。图中横轴表示侧向荧光强度，纵轴表示前向散射光强度。
图4是实施例2中未经染色的粒细胞散点图(仅提供有核红细胞通道)。图中横轴表示侧向荧光强度，纵轴表示前向散射光强度。
图5是实施例2经瑞氏染色的粒细胞散点图(仅提供有核红细胞通道)。图中横轴表示侧向荧光强度，纵轴表示前向散射光强度。
图6的是实施例2中未经染色的粒细胞和经瑞氏染色的粒细胞混合物的散点图(仅提供有核红细胞通道)。图中横轴表示侧向荧光强度，纵轴表示前向散射光强度。
图7是实施例3中经中性红染色的粒细胞散点图(仅提供有核红细胞通道)。图中横轴表示侧向荧光强度，纵轴表示前向散射光强度。
图8是实施例3中未经染色的粒细胞和经中性红染色的粒细胞混合物的散点图(仅提供有核红细胞通道)，图中横轴表示侧向荧光强度，纵轴表示前向散射光强度。
图9是实施例4中未经染色的粒细胞和经吖啶橙染色的粒细胞混合物的散点图(仅提供有核红细胞通道)，图中横轴表示侧向荧光强度，纵轴表示前向散射光强度。
具体实施方式
本发明的其它方面和优点在阅读以下描述和具体实施方案后将变得显而易见。
有核红细胞模拟粒子
本发明一个实施方案提供了一种有核红细胞模拟粒子。所述有核红细胞模拟粒子为结合了荧光染色抑制剂的白细胞或白细胞亚群，细胞的细胞核或核酸与所述抑制剂稳定结合，降低所述粒子在检测时与荧光染料的结合能力；所述抑制剂选自非荧光的染料、比检测用荧光染料的荧光量子产率低的荧光染料、与检测用荧光染料的荧光光谱差别大的荧光染料和能与核苷结合的化合物。所述有核红细胞模拟粒子适用于荧光-散射光法检测有核红细胞的血液细胞分析仪。
一般来说，荧光-散射光法检测有核红细胞的步骤包括：用一定的溶血剂和检测用荧光染料处理血液，使红细胞溶解，而白细胞和有核红细胞与检测用荧光染料结合，被染色。用流式细胞术对染色后的细胞进行检测，根据荧光强度和散射光强度信号，可以将有核红细胞同白细胞区分开，实现对有核红细胞的计数。例如，申请号为200810218267.2的中国发明专利申请公开了这种检测有核红细胞的方法。其步骤包括：用检测用荧光染料和一定的溶血剂处理血液，使红细胞溶解，而白细胞和有核红细胞与检测用荧光染料结合。用流式细胞术对染色后的细胞进行检测，采集细胞的侧向荧光(SFL)和前向散射光(FSC)强度信号。由于有核红细胞比白细胞中的核酸物质少，在使用荧光法检测有核红细胞和白细胞时，有核红细胞的荧光强度会低于白细胞。在用该法检测含有有核红细胞的临床血样，得到SLF-FSC散点图上，白细胞和有核红细胞的位置如图1示，A为白细胞区域，B为有核红细胞区域。图中可见，有核红细胞的荧光强度低于白细胞，而白细胞的某些亚群与有核红细胞的散射光特性接近。
本发明实施方案中的有核红细胞模拟粒子，是结合了荧光染色抑制剂的白细胞或白细胞亚群，细胞的细胞核或核酸与所述抑制剂结合且在水溶液中不易发生解离(即稳定结合)，占据了部分能与检测用荧光染料结合的位点，这样就能够在一定程度上抑制荧光染料与白细胞的结合，即降低白细胞结合荧光染料的能力，从而降低白细胞荧光强度，使之能模拟有核红细胞的荧光特性。在本发明中，这类能与细胞核或核酸稳定结合的，预先占据或保护细胞与检测用荧光染料的结合位点，抑制检测用荧光染料与细胞核或核酸结合的物质，被称为荧光染色抑制剂。用荧光法检测时，经处理过的白细胞或白细胞亚群，在有核红细胞的区域出现细胞群。如果将有核红细胞模拟粒子按照一定比例掺入到白细胞中，经以荧光法为检测原理的血液细胞分析仪检测，可以显示出两个有明显界限的细胞群，一个位于白细胞位置，一个位于有核红细胞位置，从而实现对有核红细胞计数的质量控制。
有核红细胞模拟粒子的制备方法
本发明的一个实施方案提供了一种有核红细胞模拟粒子的制备方法，包括以下步骤：
洗涤与分离抗凝血，得到纯化的白细胞，或者将白细胞进一步纯化得到白细胞亚群，例如粒细胞或淋巴细胞；
将白细胞或者白细胞亚群悬浮于含有荧光染色抑制剂的细胞处理液中，细胞的细胞核或核酸与所述抑制剂稳定结合；
对所得的产物进行洗涤。
所述抑制剂选自非荧光的染料、比检测用荧光染料的荧光量子产率低的荧光染料、与检测用荧光染料的荧光光谱差别大的荧光染料和能与核苷结合的化合物。
得到白细胞的方法有很多，常规的白细胞洗涤纯化方法都可以。本发明的实施方案通过溶解或沉淀后再溶解的方法除去血液中的红细胞，然后用离心或静置等方式得到纯化的白细胞。所得的白细胞可进一步用常规的方法纯化得到白细胞亚群，例如粒细胞或淋巴细胞。也可以用商品化的细胞分离液，按照说明书的方法得到纯化的细胞。
用于本发明实施方案中的血液可以选用任何含有白细胞的人或动物的血液，例如鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的血液。其中优选哺乳动物，例如鼠、猪、羊、牛的血液和人的血液。在本发明的实施方案中，可以对直接处理白细胞的全血或含白细胞的血细胞混合物(例如白细胞和红细胞的混合物)，也可以处理经过纯化的白细胞或者白细胞亚群，如粒细胞或淋巴细胞。
将所得的细胞悬浮于包含荧光染色抑制剂的细胞处理液中，温育一段时间，使抑制剂与细胞的细胞核或核酸稳定结合。
本发明的实施方案使用一种或多种荧光染色抑制剂处理白细胞或白细胞亚群，使细胞结合检测用荧光染料的能力降低。这样，经过处理的白细胞或白细胞亚群，在被检测用荧光染料染色之后，其荧光强度比未经处理的白细胞更低，从而可以模拟有核红细胞的荧光特性。另一方面，白细胞的散射光特性与有核红细胞的接近，荧光染色抑制剂与细胞内的核酸结合，对细胞内的颗粒，细胞大小形态没有影响，保持了细胞的散射光特性。经过处理的细胞模拟了有核红细胞的荧光特性和散射光特性，能够作为质控物中的有核红细胞模拟粒子使用。
下面就以血液细胞分析仪中应用较广泛的核酸荧光染料为例，详细说明本发明的一种实施方式。
核酸荧光染料与细胞中的核酸成分(包括DNA和RNA)相结合，从而使细胞能在激发光照射下发射荧光。针对这类荧光染料，可以选择具有以下特性的荧光染料抑制剂用于白细胞的降荧光处理：它们可以与核酸或细胞核内其他成分(如蛋白质)结合，预先占据检测用荧光染料的结合位点，或者占据这些结合位点附近的位点，形成空间位阻，阻挡检测用荧光染料进入结合位点，从而在一定程度上抑制检测用荧光染料与核酸结合。本领域技术人员能够理解，只要具备以下两个特性的化合物都能用作荧光染色抑制剂：
1、能够与细胞内的细胞核或核酸结合，并且在结合后能够在一定程度上阻止细胞与血液细胞分析仪中的检测用荧光染料结合；
2、这种化合物与细胞结合后，本身不能发射荧光或荧光强度比较弱；或虽然能发射荧光，但其荧光光谱与血液细胞分析仪中使用的荧光染料的差异较大，其荧光信号不能被仪器激发或检测。
这种荧光染色抑制剂可以是一些对细胞核进行染色的非荧光染料，包括单一成分的染料如：次甲基蓝、甲苯胺蓝O、台盼蓝、藏红T、苏木精等；或含有多种成分的混合型染料，如瑞氏染料、姬姆萨染料等。
这种荧光染色抑制剂也可以是一些荧光染料，包括：
1、可对细胞核或核酸进行染色的荧光染料，只要是其荧光量子产率较低，不干扰检测用荧光信号，例如中性红。中性红是一种荧光染料，与核酸结合后，一定条件下，其荧光发生淬灭，量子产率较低，可以使用中性红作为荧光染色抑制剂制备有核红细胞模拟粒子，常规细胞染色使用的中性红浓度即可。
2、可对细胞核或核酸进行染色的荧光染料，只要是其荧光光谱与血液细胞分析仪中使用的荧光染料差异足够大，以至其荧光信号不能被仪器激发或检测。例如：某血液细胞分析仪采用波长为630nm的红色光作为激发光，使用的荧光染料激发波长为630nm，发射波长为660nm，则可以选择的荧光染料包括但不限于：吖啶橙(激发波长约488nm，其发射波长约515nm)、Hoechst 33342(激发波长350nm，发射波长461nm)、YO-PRO-1(激发波长491nm，发射波长509nm)、碘化丙啶(PI，propidium iodide，激发波长530nm，发射波长625nm)等；
这种荧光染色抑制剂还可以是一些可与核甘结合的化合物，如放线菌素D。放线菌素D嵌合于DNA双链内与其鸟嘌呤基团结合，它能与核酸稳定结合，占据了检测用荧光染料的结合位点，会在一定程度上抑制检测时荧光染料与核酸的结合。
将细胞悬浮在溶液中，加入核酸染料(核酸染料可先预溶于合适溶剂中配制成母液)，将细胞染色。也可以将所述核酸染料溶解于其合适的溶剂中，配制成细胞处理液，然后将细胞悬浮于细胞处理液中，将细胞染色。核酸染料母液可按照常规染液的配制方法进行配制。染色时间根据具体所用的染料及其浓度而变化，通常是为15分钟-1小时。染料的浓度因染料种类不同有差异，使用常规浓度即可，例如甲苯胺蓝O染液0.01～1g/L，瑞氏染液0.2～2g/L，中性红染色液0.1～10g/L。本领域技术人员能够理解，染色时间与染液浓度、染色温度有关，在较高浓度下，染色时间较短，温度较高，染色时间较短。染色的程度与染料的种类、浓度、染色温度、染色时间对细胞染色程度均有影响，这些要素之间相互影响。本发明实施方案的染色程度以对白细胞或白细胞亚群部分染色，以保留细胞部分结合检测用荧光染料的能力为好。借助荧光法为检测原理的血液细胞分析仪的检测，本领域技术人员经过常规的实验手段，就能找到某种染料合适的染色浓度、染色问题和染色时间，使处理后的细胞在出现在SFL-FSC散点图上有核红细胞的位置。
对细胞染色后，洗涤细胞除去多余的染料。本领域技术人员常用的中性等渗缓冲液均可用于本发明实施方案的洗涤液。例如，常用的洗涤液有中性等渗磷酸盐缓冲液、中性等渗硼酸盐缓冲液、中性等渗柠檬酸缓冲液、生理盐水。通常将细胞离心或静置去上清后，在悬浮于洗涤液中，可以反复几次，洗去多余的染料。
洗涤后的细胞任选加入适宜的固定剂，对染色后的细胞的细胞膜进行固定，以增强其稳定性。按本领域技术人员公知的常规方法进行固定即可。常用的细胞固定剂有醇类、醛类、汞盐、锇酸、重铬酸钾等。也可以染色后先不洗涤，固定后再进行细胞洗涤。
在本发明的实施方案中任选将制备好的有核红细胞模拟粒子保存于细胞保存液中。本领域技术人员熟知的细胞保存液都可以使用。此外，将制备好的有核红细胞模拟粒子悬浮于细胞保存液中也便于将所述粒子注入血液细胞分析仪。
血液质控物
本发明再一个实施方案提供了包含所公开的有核红细胞模拟粒子的血液质控物。所公开的方法制得的有核红细胞模拟粒子可以与红细胞、白细胞、血小板等其他细胞模拟物相混合，组成以荧光染色为检测原理的多参数血液细胞分析仪的质控物，其中有核红细胞相对与白细胞的比例可进行有效的调整。
其他方面
本发明再一个实施方案提供了所公开的有核红细胞模拟粒子和含所述有核红细胞模拟粒子血液质控物在以荧光-散射光法为检测原理的血液细胞分析仪的质量控制中的应用。在本发明实施方案中，将所述有核红细胞模拟粒子定量悬浮于细胞悬浮液中，制备已知浓度的有核红细胞模拟粒子悬浮液，注入血液细胞分析仪；或者将含有本发明的血液质控物，注入血液细胞分析仪；检测散射光和荧光信号，报告有核红细胞分类计数结果，与已知浓度进行对比。
本发明再一实施方案涉及所公开的荧光染色抑制剂在制备有核红细胞模拟粒子中用途。
实施例
以下将通过具体实施例对本发明作出进一步的描述。所述实施例仅对本发明作出示例性说明，并非对本发明作出任何意义上的限定。
除非另有声明，否则以下实施例中所用的血液细胞检测设备为深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产的BC系列流式细胞分析仪，检测波长640nm。检测具体方法和试剂配方可参见申请号为200810218267.2的中国发明专利申请实施例1。该专利申请通过引用结合到本文中。
除非另有说明，以下实施例中使用的试剂纯度为分析纯。
实施例中用到的试剂：
PBS：称取NaH2PO4·2H2O 0.4g，Na2HPO4·12H2O 2.2g，NaCl8.5g，溶解在蒸馏水中，定容至1L。
淋巴细胞分离液：购自天津灏洋生物制品科技有限公司。
甲苯胺蓝O染液：1克甲苯胺蓝O染料溶于100毫升70％乙醇。
瑞氏染液：0.1克瑞氏染料溶于60毫升甲醇。
中性红染色液：1g中性红染料溶解在1L PBS中。
吖啶橙染液：吖啶橙染料用PBS溶液配成5mg/ml的贮存液，使用时按1％比例添加。
实施例1：
取新鲜牛抗凝血，用0.9％氯化铵溶液溶解红细胞。3000转/分离心分离牛白细胞，弃上清(含红细胞碎片、血红蛋白等)。用PBS悬浮沉淀的白细胞，并调节细胞密度至大约1×1010个/升。取10毫升上述白细胞悬液，加入1毫升甲苯胺蓝O染液，充分混匀。30℃染色30分钟。3000转/分离心分离染色的白细胞，用PBS洗涤细胞并重新悬浮。
取一份经染色的白细胞悬液和一份作为对照的未经染色的白细胞悬液，均调节细胞密度至大约1010个/升，分别加入适当浓度的甲醛对细胞进行固定。3000转/分离心分离固定的白细胞，用PBS洗涤细胞并重新悬浮。使用申请号为200810218267.2的中国发明专利申请实施例1的试剂和方法对固定的细胞进行检测，获得SFL-FSC散点图(NRBC通道)。
未经染色的白细胞的散点图，如图2。A区域为白细胞。
经甲苯胺蓝O染色的白细胞散点图，如图3。经过甲苯胺蓝O染色后，图3中的白细胞荧光强度相对2下降。不同亚群的白细胞荧光信号下降幅度不同，因此在散点图上分为2群：A区域仍表现为白细胞特征；B区域可模拟有核红细胞。
实施例1中使用的白细胞含有粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等多种不同成分，因此染色后在SFL-FSC散点图中呈现2分群。这样不用加入其他质控物成分就可以直接模拟白细胞和有核红细胞这两类细胞。但如果要将有核红细胞模拟粒子与其他细胞模拟粒子混合制备全血质控物，图3A区域细胞可能对其他检测通道(例如白细胞分类)的计数产生干扰。因此最好能够制备单纯的有核红细胞模拟粒子。实施例2、3通过对白细胞进行分离纯化达到此目的。
实施例2：
取新鲜猪抗凝血，静置一段时间沉淀红细胞。吸富含白细胞的上清，3000转/分离心分离其中的细胞，弃上清。用0.9％氯化铵溶液重新悬浮沉淀的红细胞和白细胞，溶解红细胞。3000转/分离心分离猪白细胞，弃上清(含红细胞碎片、血红蛋白等)用PBS悬浮沉淀的白细胞。用淋巴细胞分离液，按产品说明书方法分离出猪粒细胞。用PBS洗涤猪粒细胞。然后对猪粒细胞悬液进行离心(1200转/分)，弃去上清，保留猪粒细胞沉淀。向猪粒细胞沉淀中加入10ml瑞氏染液，吹打染液使猪粒细胞悬浮；立即加入与瑞氏染液体积相等的PBS，混合均匀，使混合均匀后的细胞密度为2～3×1010个/升。30℃染色30分钟。1200转/分离心分离染色的白细胞，用PBS洗涤细胞并重新悬浮。
取一份经过染色的猪粒细胞悬液和一份作为对照的未经染色的猪粒细胞悬液(均调节细胞密度至大约2～3×1010个/升)，分别加入1％的甲醛对细胞进行固定。1200转/分离心分离固定的粒细胞，用PBS洗涤细胞并重新悬浮。使用上面实施例1的试剂和方法对固定的细胞进行检测，获得SFL-FSC散点图。
未经染色的猪粒细胞散点图，如图4。A区域为粒细胞。
经瑞氏染色的猪粒细胞散点图，如图5。经过瑞氏染色后，图5中的粒细胞荧光强度相对图4下降，且下降程度较均一，均落入图B区域，可模拟有核红细胞。将这种猪粒细胞配成一定密度的细胞悬液，可作为有核红细胞模拟粒子方便的与其他质控物成分(如白细胞、红细胞、血小板等)混合制备全血质控物。
将未经染色的猪粒细胞和经瑞氏的猪粒细胞混合，其散点图如图6。A区域为粒细胞区域，B区域为有核红细胞区域。
实施例3：
取新鲜牛抗凝血，用0.9％氯化铵溶液溶解红细胞。3000转/分离心分离牛白细胞，弃上清(含红细胞碎片、血红蛋白等)。用PBS悬浮沉淀的白细胞。用淋巴细胞分离液，按产品说明书的方法分离出牛粒细胞。用PBS洗涤牛粒细胞。然后对牛粒细胞悬液进行离心(1200转/分)，弃去上清，保留牛粒细胞沉淀。用中性红染色液悬浮沉淀的牛粒细胞，调节细胞密度至大约2～3×1010个/升，加入1％的甲醛对细胞进行固定。同时用不加染料直接用含1％甲醛的PBS固定的牛粒细胞作为对照。1200转/分离心分离固定的白细胞，用PBS洗涤细胞并重新悬浮。使用上面实施例1的试剂和方法对固定的细胞进行检测，获得SFL-FSC散点图。
经中性红染色的牛粒细胞散点图如图7。将未经染色的牛粒细胞和经中性红染色的牛粒细胞混合，其散点图如图8。图7和图8中，A区域为粒细胞区域，B区域为有核红细胞区域。
实施例4：
按照实施例3的方法提取牛粒细胞，将牛粒细胞悬浮在PBS中，调节细胞密度至大约2～3×1010个/升。在牛粒细胞悬液中加入吖啶橙染液至终浓度50μg/mL，室温下染色15分钟。1200转/分离心分离粒细胞，用PBS洗涤细胞并重新悬浮，调节细胞密度至大约2～3×1010个/升，加入1％的甲醛对细胞进行固定。1200转/分离心分离固定的粒细胞，用PBS洗涤细胞并重新悬浮，即制得有核红细胞模拟粒子。
同时用不经吖啶橙染色，直接用甲醛固定的粒细胞做对照，与上述有核红细胞模拟粒子混合，使用上面实施例1的试剂和方法对固定的细胞进行检测，获得SFL-FSC散点图如图9，A区域为粒细胞区域，B区域为有核红细胞区域。
实施例5：多组分质控物的配制
将本发明实施例制备的有核红细胞模拟粒子按照下表配制方法，与红细胞模拟物、血小板模拟物、白细胞模拟物用适量的保存液进行混合，配制成不同水平的多组份质控物，即可用于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司所生产的检测波长640nm的BC系列流式细胞分析仪的日常质量控制。
  参数项目   低值质控物   中值质控物   高值质控物
  WBC(109/L)   4.0～5.0   7.0～8.0   18.0～20.0
  RBC(1012/L)   2.0～3.0   4.0～5.0   5.2～5.8
  NRBC％   5％～10％   5％～10％   5％～10％
  PLT(109/L)   50～100   200～300   400～500
由以上实施例的附图可见，本发明各实施例制得的有核红细胞模拟粒子在SLF-FSC散点图上，显示在有核红细胞区，和白细胞区明显区分，很好地模拟了有核红细胞的荧光和散射光特性。可以用于对有核红细胞分类计数的质量控制。
本文中的所有数据、图像、仪器、试剂和步骤应理解为说明性而非限制性的。虽然已结合上述具体实施方案描述了本发明，许多修改和其它变化对于本领域技术人员是显而易见的。所有这种修改和其它变化也落入本发明的精神和范围内。

Claims (24)

1.一种有核红细胞模拟粒子，其特征在于：所述粒子为结合了荧光染色抑制剂的白细胞或白细胞亚群，所述抑制剂与细胞的细胞核或核酸稳定结合，降低所述粒子在检测时与荧光染料的结合能力，所述荧光染色抑制剂选自：
非荧光的染料，
荧光量子产率比检测用荧光染料的荧光量子产率低的荧光染料，荧光光谱与检测用荧光染料的荧光光谱差别大的荧光染料，或能与核苷结合的化合物。
2.如权利要求1所述的有核红细胞模拟粒子，其特征在于：所述非荧光染料选自次甲基蓝、甲苯胺蓝O、台盼蓝、藏红T、苏木精、瑞氏染料和姬姆萨染料。
3.如权利要求1-2任一项权利要求所述的有核红细胞模拟粒子，其特征在于：所述荧光量子产率比检测用荧光染料的荧光量子产率低的荧光染料选自中性红。
4.如权利要求1所述的有核红细胞模拟粒子，其特征在于：所述荧光光谱与检测用荧光染料的荧光光谱差别大的荧光染料选自吖啶橙、Hoechst33342、YO-PRO-1、碘化丙啶中的至少一种。
5.如权利要求1所述的有核红细胞模拟粒子，其特征在于：所述能与核苷结合的化合物选自放线菌素D。
6.如权利要求1所述的有核红细胞模拟粒子，其特征在于：所述白细胞亚群为粒细胞或淋巴细胞。
7.如权利要求1所述的有核红细胞模拟粒子，其特征在于：所述白细胞或白细胞亚群来自哺乳动物的血液。
8.如权利要求7所述的有核红细胞模拟粒子，其特征在于：所述的哺乳动物选自鼠、猪、羊、牛。
9.如权利要求1所述的有核红细胞模拟粒子，其特征在于：所述白细胞或白细胞亚群来自人的血液。
10.一种血液质控物，其特征在于：所述质控物含有权利要求1-9任一项权利要求所述的有核红细胞模拟粒子。
11.一种有核红细胞模拟粒子的制备方法，所述方法包括，
富集含有白细胞的血液中的白细胞或白细胞亚群，
将得到的白细胞或白细胞亚群悬浮于含有荧光染色抑制剂的细胞处理液中，所述抑制剂与细胞的细胞核或核酸稳定结合，
对所得产物进行洗涤，所述荧光染色抑制剂选自非荧光染料、荧光量子产率比检测用荧光染料的荧光量子产率低的荧光染料、荧光光谱与检测用荧光染料的荧光光谱差别大的荧光染料和能与核苷结合的化合物。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述非荧光染料选自次甲基蓝、甲苯胺蓝O、台盼蓝、藏红T、苏木精、瑞氏染料和姬姆萨染料。
13.如权利要求11-12任一项权利要求所述的方法，其特征在于：所述荧光量子产率比检测用荧光染料的荧光量子产率低的荧光染料选自中性红。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述荧光光谱与检测用荧光染料的荧光光谱差别大的荧光染料选自吖啶橙、Hoechst33342、YO-PRO-1、碘化丙啶中的至少一种。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述能与核苷结合的化合物选自放线菌素D。
16.如权利要求114所述的方法，其特征在于：其特征在于：所述白细胞亚群为粒细胞或淋巴细胞。
17.如权利要求11所述的方法，其中所述白细胞或白细胞亚群来自哺乳动物的血液。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述的哺乳动物选自鼠、猪、羊、牛。
19.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述白细胞或白细胞亚群来自人的血液。
20.如权利要求11所述的方法，其特征在于：还包括细胞固定和/或保存步骤。
21.一种血液质控物的制备方法，所述方法包含将权利要求1-9任一项的有核红细胞模拟粒子与其他血液细胞模拟物混合于细胞保存液中。
22.权利要求1-9任一项权利要求的有核红细胞模拟粒子在血液细胞分析仪质量控制中的应用。
23.权利要求10的血液质控物在血液细胞分析仪质量控制中的应用。
24.权利要求1-5中的荧光染色抑制剂在制备有核红细胞模拟粒子中的应用。
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